Procédures légères

548 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 264 opérées une heure sous anesthésie générale pour l'implantation d'électrodes sur les muscles abdominaux, puis hébergées seules dès le réveil. Sur ces souris maintenues éveillées, une pression est appliquée dans le côlon pendant dix secondes et répétée par paliers croissants pendant qu'on compte leurs contractions abdominales, stimulus que le porteur qualifie lui-même de douloureux. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 284 animaux et modéré pour 264, d'autres souris passant 23 heures en cage à métabolisme, d'autres étant mises à reproduire pour étudier l'effet du régime maternel sur la descendance. L'objet est de savoir si le fer héminique de la viande rouge, de la charcuterie ou d'un substitut végétal à base de léghémoglobine de soja aggrave la sensibilité du côlon, les retombées annoncées pour les patients atteints du syndrome de l'intestin irritable se limitant à des recommandations nutritionnelles à préciser.

Objectifs

Le syndrome de l’intestin irritable est une pathologie intestinale chronique répandue (5-10% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées. C’est également une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Le diagnostic pour ces patients repose en partie sur l’évaluation de leur sensibilité viscérale, qui se trouve exacerbée en réponse à l’application d’une pression appliquée sur la paroi du côlon par rapport à la sensibilité perçue par une personne saine. Bien que les causes de ce syndrome restent peu comprises, il est établi que la composition du régime alimentaire influence fortement l’aggravation des symptômes. Les viandes rouges et charcuteries ne sont actuellement pas connues comme des aliments associés à l’exacerbation des symptômes de sensibilité viscérale chez ces patients, mais une étude chez la souris montre que la consommation d’un régime riche en fer héminique engendre une sensibilité viscérale accrue en réponse à un stimulus douloureux. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de répondre à 3 questions : 1- La sensibilité accrue induite est-elle équivalente quelle que soit la forme du fer héminique consommé ? La sensibilité viscérale induite sera mesurée chez des souris chez lesquelles le fer héminique du régime sera apporté sous forme (i) purifiée, (ii) d’hémoglobine ou (iii) de viande. 2- La mise sur le marché d’une préparation à base de léghémoglobine de soja, à savoir une molécule de la même famille que l'hémoglobine de la viande, mais d'origine strictement végétale, est envisagée en Europe pour produire des substituts de viande. Au regard de la proximité de ces deux molécules, ce produit destiné à végétaliser davantage nos régimes est-il susceptible d’engendrer des effets sur la physiologie et la sensibilité du côlon ? 3- Sur le plan nutritionnel pendant la gestation et la lactation, un apport suffisant en fer, même héminique, est crucial. Une consommation maternelle excessive en produits carnés riches en fer héminique (environ 20% des femmes) est-elle susceptible de prédisposer sa descendance à des troubles digestifs tels qu’une sensibilité viscérale augmentée ?

Bénéfices attendus

En termes de santé publique, ces études permettront de mettre en lumière un nouveau facteur alimentaire à prendre en compte dans le régime des patients atteints du syndrome de l’intestin irritable, à savoir la consommation de viandes rouges et charcuteries, ou encore la consommation de substituts de viandes préparés à base de léghémoglobine. Ces données contribueront par ailleurs à préciser les bénéfices/risques et les recommandations nutritionnelles en fer au sein de la population générale, et chez la femme enceinte et allaitante, pour qui durant ces périodes, l’apport en fer est essentiel.

Procédures

Sur les 548 souris nécessaires à la réalisation de ce projet, 152 d’entre elles seront dédiées à la reproduction pour une exposition nutritionnelle périnatale. 228 souris nourries avec un régime dont la source de fer consommée (ou celle consommée par leur mère) sera contrôlée, seront placées chacune 23 heures en cage à métabolisme en fin d’étude. 264 souris nourries en parallèle avec ces mêmes régimes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h maximum par intervention pour placer un dispositif de mesure des contractions abdominales. Pour la mesure de sensibilité viscérale, le nombre de contractions sera compté en réponse à l’application d’une pression intra-colique pendant 10 secondes et répétée 4 fois par palier croissant.

Impact sur les animaux

Des groupes de souris, dont la source du fer consommé (ou consommé par leur mère selon la fenêtre d’exposition concernée) sera contrôlée, seront placés 23 heures en cage à métabolisme en fin d’étude. Le stress modéré induit par la stabulation sur grille et l’isolement transitoire, pourrait modifier la mesure de la sensibilité viscérale, c’est pourquoi ces groupes de souris seront uniquement destinés à la collecte des échantillons fécaux et urinaires. En parallèle, pour la mesure de la sensibilité viscérale, les souris exposées à ces différentes sources de fer seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h par intervention pour implanter le dispositif de mesure sur les muscles abdominaux, ce qui suppose un inconfort lors de la phase de réveil, de récupération et lors des contentions effectuées pour l'administration des traitements post-opératoires (injections sous cutanées) et la vérification des points de suture. La préservation de ce dispositif implique un hébergement en cage individuelle à partir du réveil, et donc un stress lié à un isolement transitoire. La mesure de sensibilité viscérale requière que la souris reste vigile. Le stimulus douloureux ressenti résultera d’une augmentation de la pression intra-colique appliquée pendant 10 secondes à 5 reprises par palier espacés chacun de 10 minutes. Cette mesure est donc associée à un inconfort, un stress et une mobilité réduite de la souris.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.

Remplacement

Les modèles cellulaires ont montré que des molécules formées dans le côlon lors de la consommation d’un régime riche en produit carné, pouvaient induire une cytotoxicité différente selon que la cellule exposée soit saine ou pré-tumorale. Cependant, aucune étude in vitro ou ex-vivo à ce stade du projet nous permet d’évaluer les conséquences d’un régime sur la physiologie digestive et plus particulièrement sur la sensibilité viscérale, que ce soit chez la souris adulte ou chez sa descendance. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité des répercussions de cette exposition directe ou indirecte à ces contaminants d’origine alimentaire néoformés dans le contenu du côlon. La mesure de la sensibilité viscérale en réponse à l’application d’une pression intra-colique reste par ailleurs la méthode employée chez les patients pour fiabiliser le diagnostic du syndrome de l’intestin irritable.

Réduction

Les études antérieures associées à ce projet nous ont permis d’améliorer la procédure de sensibilité viscérale sur le plan technique (expérience de l’expérimentateur) et du bien-être de l’animal. Ces améliorations ont permis de diminuer le nombre d’animaux requis pour aboutir à des résultats significatifs et fiables : de 15 souris initialement par groupe, 12 souris par groupe sont aujourd’hui considérées comme nécessaire. Ce nombre sera réduit à 6 pour les lots parallèles destinés aux prélèvements fécaux et urinaires. Par ailleurs, le nombre minimum requis de souris utilisées pour la reproduction afin d'étudier l’impact des régimes maternels sur la santé digestive de la descendance est calculé au plus juste selon une convention établie dans le cadre des études développementales (concept du DoHAD). Malgré tout, cette phase d’élevage occasionne parfois des individus surnuméraires : les femelles restées non gestantes, les mâles après la phase de reproduction ainsi que les nouveaux nés surnuméraires. Ils serviront de témoin d’exposition pour la collecte d’échantillons, préservant ainsi les femelles gestantes et leur descendance d’un cumul d’interventions. Une saisine a déjà été anticipée en parallèle pour réaffecter ces souris surnuméraires à d’autres mesures complémentaires comme la mesure de la motricité intestinale. La reproductibilité et fiabilité des résultats sera assurée par une répétition indépendante des expérimentations. Une analyse statistique univariée par facteur sera réalisée et des approches multivariées couplées à des analyses de corrélations permettront d'exploiter au maximum l'ensemble des données qui seront générées.

Raffinement

Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être des souris et de leurs conditions d’hébergement : des manipulations douces d’habituation lors des pesées hebdomadaires seront effectuées, et pour minimiser le stress lié aux périodes d’hébergement en cage individuelle, les cages transparentes seront alignées et laissées sans couvercle filtrant pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Des planches de fibre de coton déchiquetables (nestlets) leur seront distribuées pour satisfaire leur besoin de nidification et d’exercice, facilitant leur thermorégulation au sein du nid et celle de leur portée dans le cas de l’étude périnatale. Des buchettes en peuplier disposées sur la litière (ou sur la grille en cage à métabolisme) leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Une observation des souris à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra de détecter à temps toute anomalie éventuelle et de minimiser la durée de toute souffrance constatée par des soins appropriés. Toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application (anesthésie, prise en charge de la douleur post opératoire, tapis chauffant, hébergement transitoire en armoire chauffée en période post-opératoire, réhydratation).

Choix des espèces

La souris est un modèle courant pour la mesure de la sensibilité viscérale. Nous avons retenu une souche pour laquelle nous avons une grande expérience et une bonne base de connaissance à propos de sa physiologie digestive (barrière intestinale, système immunitaire, microbiote et sensibilité viscérale), comme de son comportement face aux produits d’anesthésie. En outre, le modèle choisi présente l’avantage d’être particulièrement sociable, la souche de souris choisie ne nécéssite pas en effet de contention pour la manipuler, et les femelles portent une grande attention envers leur descendance, ce qui limite le cannibalisme. Quelle que soit l’étude considérée, la mesure de la sensibilité viscérale requiert un tractus digestif mature. Des animaux adultes âgés de 9-11 semaines seront donc utilisés. En amont et pour permettre d’avoir des phases d’exposition aux différents régimes, nous réceptionnerons donc des souris âgées de 6 semaines pour les études chez l’adulte et des souris en âge de procréer (7-8 semaines) pour l’étude dédiée à une exposition maternelle pendant la gestation et la lactation.

Deux cent soixante-quatre souris échapperont à la mise à mort pour être replacées dans un autre projet, faute de porter la modification génétique voulue, les 576 autres seront tuées, reproductrices comprises. 840 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 324 d'entre elles et modéré pour 516. Tatouées et amputées d'un fragment de queue vers sept jours, elles reçoivent un traitement oral, et une partie subit la destruction des cellules immunitaires de ses pattes arrière suivie d'une greffe qui la laisse quinze jours avec un système immunitaire incomplet, quand d'autres passent douze semaines sous régime gras avec des tests de tolérance au glucose faits à partir d'une incision de la queue. Le porteur calcule ses effectifs sur des groupes de cinq à huit souris, sans expliquer comment il parvient à 840.

Objectifs

Ce projet vise à étudier le rôle des macrophages pancréatiques dans l’homéostasie du pancréas et durant le diabète de type 2. Les macrophages sont des cellules immunitaires innées présentes dans tous les tissus, jouant un rôle crucial dans la défense contre les infections, la résolution de l'inflammation et la régulation de la réponse immunitaire. Ces cellules peuvent être trouvées dans tous les tissus et organes, où elles remplissent des fonctions spécifiques adaptées à leur environnement local. Dans le contexte du pancréas, les macrophages pancréatiques peuvent jouer un rôle crucial dans la régulation de l'inflammation, de la réponse immunitaire et de la fonction des cellules bêta productrices d'insuline. Le diabète de type 2 est une maladie métabolique chronique caractérisée par une résistance à l'insuline et une production insuffisante d'insuline par le pancréas entrainant une hyperglycémie chronique. La survie des macrophages dans les tissus dépend de la présence de Csf1, ou facteur de stimulation des colonies 1, une protéine qui permet aux macrophages de survivre, se développer et fonctionner correctement. Le Csf1 est produit par les cellules du micro-environnement des macrophages. Des résultats préliminaires obtenus dans un projet précédent suggèrent une dépendance de certains macrophages pancréatiques à l'égard du Csf1 produit par les fibroblastes, des cellules de soutien du tissu. Comprendre la fonction des macrophages et leur interaction avec d'autres cellules pancréatiques est essentiel pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le diabète de type 2. Notre projet a 3 objectifs principaux : 1/ Étudier l’impact de la délétion fibroblastique de Csf1 sur les macrophages pancréatiques 2/ Etudier le renouvellement des macrophages au sein du pancréas 3/ Déterminer si les macrophages pancréatiques jouent -un rôle clé au cours de l’évolution du diabète de type 2.

Bénéfices attendus

Le pancréas, un organe vital du système digestif et endocrinien, joue un rôle crucial dans la régulation du métabolisme glucidique et la production d'insuline. Son dysfonctionnement est intimement lié à des pathologies telles que le diabète de type 2, une maladie métabolique chronique en constante augmentation dans le monde. Comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans le développement du diabète de type 2 est essentiel pour améliorer sa prise en charge. Ce projet présente plusieurs bénéfices potentiels. Tout d'abord, en examinant l'impact de la délétion de Csf1 dans les fibroblastes sur les macrophages pancréatiques et la physiologie du pancréas, nous pourrions identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour moduler la réponse immunitaire dans le pancréas et potentiellement prévenir ou traiter le diabète de type 2. De plus, en étudiant comment les cellules immunitaires appelées macrophages sont recrutées dans le pancréas à l’état physiologique, nous pourrions mieux comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans le maintien de l'équilibre immunitaire dans cet organe crucial. En comprenant le rôle des macrophages pancréatiques dans la tolérance au glucose et l'insulinémie à l'état physiologique, nous pourrions développer des approches plus précises pour réguler la glycémie et améliorer la sensibilité à l'insuline. Enfin, en déterminant si les macrophages pancréatiques jouent un rôle crucial dans l'évolution du diabète de type 2, nous pourrions ouvrir de nouvelles perspectives pour la prévention et le traitement de cette maladie complexe. En somme, ce projet offre un potentiel significatif pour une meilleure compréhension du diabète de type 2 et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Procédure 1 : En générant les lignées d’intérêt pour cette étude nous obtiendrons des accouplements avec une descendance que nous aurons besoin d’identifier afin d’obtenir les souris avec la modification génétique voulue. Pour ce faire les souris seront tatouées et un morceau de queue sera prélevé 7 à 10 jours après leur naissance. Procédure 2 : Les souris seront traitées avec une molécule permettant à notre modèle murin de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine puis mises à mort après un mois. Procédure 3 : Les souris seront traitées avec la molécule permettant au modèle de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. Un mois après, pour laisser le temps aux effets d’avoir lieu, les cellules immunitaires des pattes arrière seront éliminées. Cette procédure se fera sous anesthésie afin de pouvoir toucher uniquement la zone souhaitée (pattes arrière). Par la suite, les animaux seront injectés de nouvelles cellules immunitaires d’une souris d’intérêt pour reconstituer les cellules précédemment éliminées. Enfin 2 mois après la reconstitution nous suivrons le renouvellement des macrophages provenant des cellules immunitaires nouvellement injectées. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur ces mêmes souris par voie rétro-orbitale 1 fois avant la mise à mort. Procédure 4 : Les souris seront traitées avec la molécule permettant à notre modèle murin de fonctionner, par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. 1 mois après, les souris seront mises soit sous régime riche en graisses soit sous régime standard (contrôle) et ce pendant 12 semaines. Aux semaines 4 et 8 (deux groupes de souris différents), un test de tolérance au glucose sera réalisé, pour cela, les souris seront mises à jeun 6h puis gavées avec une solution de glucose et la concentration de glucose sera suivie par prélèvement de sang au bout de la queue pendant 2h. Avant la mise à mort, les souris seront mises à jeun sur la nuit pour déterminer la glycémie et le taux d’insuline par prélèvement de sang au bout de la queue.

Impact sur les animaux

- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé (nuisances légères). - L'administration d’une molécule permettant à notre modèle de fonctionner par voie orale peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes (nuisances légères). - Les animaux subiront une délétion des cellules immunitaire au niveau des pattes arrière ainsi qu'une injection intraveineuse pour réintroduire des cellules immunitaires au niveau des pattes arrière. Pendant toute la durée de la délétion ainsi que l'injection de cellules immunitaires, les animaux seront maintenus sous anesthésie (environ 15min au total) et ne ressentiront donc aucune douleur. L'anesthésie des animaux engendrera un stress à court terme des animaux, de plus, après la délétion des cellules immunitaire au niveau des pattes arrière, les animaux se retrouvent avec un système immunitaire incomplet pendant 15 jours augmentant ainsi le risque d'infection durant cette période. Les animaux seront ainsi plus vulnérables. Enfin l'injection intraveineuse, bien que faite sous anesthésie, entrainera une légère lésion pouvant entrainer un inconfort à court terme de la souris. L'ensemble de ces actes entraineront donc des nuisances considérées comme modérées. - Une petite incision de la queue sera réalisé avant le test de tolérance au glucose et le sang sera prélevé par cette unique incision tout au long du test (nuisances modérées). L’administration de glucose par voie orale peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes (nuisances légères). - Les souris seront soumises à un régime riche en graisses pendant 12 semaines engendrant ainsi des maladies métaboliques (nuisances modérées).

Devenir

Tous les animaux reproducteurs seront mis à mort à l’issue de la période d’accouplement. A l'issue de la procédure 1, les animaux avec la modification génétique voulue seront utilisés dans les procédures 2, 3 et 4 et mis à mort afin de prélever les organes. Les animaux avec une modification génétique non voulue pourront être replacés dans un autre projet.

Remplacement

La complexité des interactions entre les cellules stromales des organes, tel que le pancréas, et les macrophages ne peut être étudiée efficacement à l'aide de modèles in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des modèles animaux pour ce projet. En effet, comprendre comment l'absence des macrophages peut affecter la fonction du pancréas à l'état physiologique mais aussi au cours du diabète de type 2 met en jeu de nombreux types cellulaires présents dans ce microenvironnement. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permet pas de refléter la complexité et la dynamique de cet environnement, qui joue un rôle crucial dans la fonction des macrophages pancréatiques.

Réduction

De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos expérimentations. Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé sur http://Biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (Probabilité d’obtenir un résultat significatif même avec une faible différence = 80%), le niveau de risque acceptable (probabilité de se tromper et de conclure à une différence significative alors qu'il n'y en a pas = 5%) et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles (différence attendue entre les groupes = 40%). Une taille de groupe égale à 5 devrait permettre de produire des résultats statistiquement exploitables. La taille du groupe sera élevée à 8 souris dans le cas des transplantations de moelle osseuse, cette expérience entrainant des variabilités plus élevées entre les échantillons. Dans le cadre de cette étude, pour les souris génétiquement modifiées (mutants conditionnels pour le facteur Csf1 et leurs contrôles), les accouplements seront faits pour permettre que tous les animaux générés dans les élevages soient utilisés pour les expériences.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des environnements enrichis afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Les conditions d'hébergement des souris respectent la directive 2010/63/UE : - Les cages utilisées permettent l'hébergement de 5 souris adultes d'un poids supérieur ou égal à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Dans chaque cage du coton pour confectionner des nids et des igloos seront introduits. Enfin, le statut EOPS de notre animalerie permet de minimaliser les variabilités dues au stress ou à des infections. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux.

Choix des espèces

L'espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est cruciale pour répondre aux questions scientifiques posées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte à partir de 6 semaines car nous nous intéressons aux fonctions des macrophages pancréatiques à l’âge adulte.

728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 440 d'entre elles et modéré pour 288. Le cerveau de 160 d'entre elles est irradié sous anesthésie à l'âge de 21 jours, 240 passent six tests comportementaux, 80 subissent deux heures d'imagerie par résonance magnétique, et toutes finissent par une chirurgie terminale destinée à prélever leur cerveau. La question posée est de savoir si le vieillissement prématuré des cellules cérébrales explique les séquelles cognitives des enfants irradiés pour une tumeur du cerveau. Le porteur retient la souris parce que sa neuro-anatomie lui paraît comparable à celle de l'être humain, et parce que le caractère social de l'espèce permet de mesurer un déficit d'interactions après irradiation.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales sont les tumeurs solides les plus fréquentes chez les enfants, qui sont traitées généralement par radiothérapie, souvent précédée d'une chirurgie et d'une chimiothérapie. Le taux de survie à cinq ans varie de 70 à 99 %, selon le type de tumeur. Les effets tardifs à long terme chez les enfants traités pour des tumeurs cérébrales sont préoccupants. Ces patients souffrent de graves handicaps physiques, fonctionnels et psychosociaux, notamment de la fatigue et des altérations de certaines fonctions cognitives spécifiques telles que des troubles de l'attention, de la mémoire de travail et de la vitesse de traitement de l’information. De nombreuses études, ont montré que l'exposition aux rayonnements ionisants induit la sénescence (processus de vieillissement prématuré) des cellules du cerveau. L'impact de la sénescence cellulaire sur les lésions cérébrales et les déficits cognitifs après la radiothérapie chez les enfants ayant survécu à des tumeurs cérébrales n'a jamais été étudié. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons la sénescence cellulaire dans le cerveau de jeunes souris irradiées, les déficits cognitifs induits par l’irradiation à l’aide de tests comportementaux et les lésions cérébrales, en utilisant des méthodes d’évaluation cognitives spécifiques telles que l’histologie (analyse des tissus) des cerveaux irradiés et l’imagerie par résonance magnétique. L’utilisation d’un modèle génétique permettant de bloquer ce processus de vieillissement prématuré sera utilisé pour étudier l’implication de la sénescence cellulaire dans les séquelles cérébrales induites par radiothérapie (RT) afin de les traiter. L’utilisation de molécules qui agissent sur les cellules sénescentes constitue une voie thérapeutique prometteuse et innovante dans la prévention et le traitement des tumeurs cérébrales. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Le projet permettra une meilleure compréhension de l'implication de la sénescence et du dysfonctionnement cellulaire dans la propagation des lésions cérébrales induites par la radiothérapie. L’équipe projet espère proposer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l'apparition de séquelles cérébrales hautement délétères lors de la radiothérapie chez l'enfant.

Procédures

Etablissement Ulitisateur (EU1) élevage et irradiation : Le génotypage par biopsie sera effectuée sur l’animal vigile (durée de 2 minutes, sur 360 souris). L’irradiation sera effectuée sous anesthésie (durée de 5 minutes par animal, sur 160 souris). Les injections seront réalisées sur des animaux vigiles (durée de 1 minute par animal, sur 160 souris). Chaque souris effectuera 6 tests de comportement différents (durée d’un test estimé à 5 à 15 minutes par animal, sur 240 souris) afin d’évaluer leur comportement social, leurs capacités motrices ainsi que leur mémoire. EU 2 imagerie: L’imagerie par résonance magnétique sera réalisée une seule fois par animal, sous anesthésie (durée de 120 minutes par animal, nombre de souris 80). EU1 mise à mort des souris: elle sera effectuée par chirurgie terminale sous anesthésie pour permettre le prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont : - des problèmes d’anesthésie entrainant la perte d’un animal, de l’hypothermie, des douleurs liées aux injections, des douleurs et des saignements liées au prélèvement pour le génotypage ; - un déficit mental et/ou social associé à un dysfonctionnement cognitif. Il est attendu que l’anxiété soit un peu augmentée et génère de l’agressivité ; - une perte de poids liée à un problème d’alimentation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre d’effectuer des analyses histologiques (analyses de tissus) ou moléculaires.

Remplacement

L’étude de l’impact de l’irradiation sur la sénescence au cours du développement nécessite d’irradier le cerveau de souriceaux et d’étudier les conséquences sur le cerveau à l’âge adulte au niveau histologique, imagerie par résonance magnétique et tests comportementaux. Il n’existe pas d’alternative non animale permettant étudier l’effet de l’irradiation sur la sénescence sur le cerveau de souris au cours du développement (équivalent de l’adolescence chez l’homme) et d’évaluer les altérations cognitives à l’âge adulte.

Réduction

Compte tenu de la variabilité des réponses des souris au sein d’un même groupe dans les tests de comportement, nos expériences précédentes (et celles d’autres laboratoires) montrent qu’un nombre de dix animaux par lot est un minimum requis pour assurer des résultats statistiquement significatifs. Cependant, nous prévoyons d’utiliser 15 souris par groupe afin d’assurer le nombre minimum d’animaux pour les analyses de comportement et réaliser des expériences complémentaires en : imagerie par résonance magnétique, histologie 2-3D et séquençage, de façon à corréler l’ensemble des résultats obtenus. Nous utiliserons également 5 souris par groupe pour des analyses en cytométrie en flux (méthode de tri des cellules en fonction de certaines propriétés).

Raffinement

Les animaux reçoivent un dispositif de nidification périssable chaque semaine au moment du change des cages. Les souris sont irradiées sous anesthésie générale afin de limiter le stress lié au confinement de l’animal dans l’irradiateur. Pour limiter la baisse de la température corporelle sous anesthésie, les animaux seront placés sur une couverture chauffante ou dans une cage elle-même placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Les animaux sont suivis pendant les 24h suivant l’anesthésie (irradiation, IRM). Avant les phases de tests de comportement, une phase d’adaptation des souris est effectuée pendant deux semaines. Pendant cette phase d’adaptation, les animaux sont familiarisés à la manipulation quotidiennement par l’expérimentateur dans la pièce où se dérouleront les tests. Les animaux sont transportés entre les deux EU concernés par un transporteur agrée. Afin de préserver le bien-être des souris pendant le transport, celles-ci sont placées dans des boîtes de transport jetables contenant de la litière, du coton, de l’eau gélifiée, des croquettes ainsi qu’un enrichissement de type tunnel. La taille des boîtes est adaptée au nombre d’animaux et permet de conserver leur répartition initiale par cage.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler chez la souris pour deux raisons majeures : 1) La souris est une espèce couramment utilisée en recherche fondamentale, qui possède une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain tout au moins pour notre approche, et qui permettra donc d’extrapoler les résultats. Les souris seront étudiées à l’âge de 21 jours, au moment du sevrage et de la première vague de spermatogenèse, avant la maturité sexuelle qui a lieu à 50 jours environ. Cet âge chez la souris correspond à la préadolescence chez l’homme qui marque une transition entre l’enfance et le début de la puberté. 2) La souris est une espèce sociale, qui présente notamment des niveaux élevés d’interactions sociales réciproques. Ceci permet d’utiliser des tests de comportement et de mettre en évidence un déficit social dans le modèle de souris transgénique qui permet de mettre en évidence facilement la sénescence.

Quarante-deux gavages, un par jour pendant quarante-deux jours, voilà ce que subissent 480 des souris de ce projet, 800 d'entre elles passant par ailleurs des tests comportementaux répétés jusqu'à cinq jours d'affilée. 872 souris vont être utilisées en tout, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 72 d'entre elles et modéré pour 800. La démyélinisation est provoquée par un produit ajouté à la nourriture, afin de tester si des molécules ciblant un récepteur de la sérotonine corrigent les troubles cognitifs et sensoriels associés à la sclérose en plaques. Le porteur retient la souris pour son homologie génétique de 90 % avec l'être humain et parce qu'il dispose déjà de lignées transgéniques dépourvues de ce récepteur, hébergées chez un prestataire d'élevage.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC) qui touche environ 2,5 millions de personnes dans le monde. La maladie se manifeste par une grande variété de symptômes qui se caractérisent par une atteinte des voies motrices, une baisse de la sensibilité et l'apparition de troubles cognitifs et émotionnels. Ces symptômes sont liés à la perte de la gaine de myéline (processus de démyélinisation) qui entoure les neurones et qui permet à l'information de voyager rapidement et efficacement le long des nerfs. De plus, plusieurs résultats de la littérature soulignent l'intérêt de cibler un récepteur de la sérotonine pour le traitement de maladies neurodégénératives. Sachant qu'il est connu que des molécules qui se lient à ce récepteur ont des effets bénéfiques pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques, l'idée principale de ce projet est de vérifier si ces molécules peuvent aider à traiter différentes facettes de la maladie, comme les problèmes de perte de myéline ainsi que des troubles cognitifs et sensoriels dans un modèle animal de maladie qui reproduit ses symptômes. Nous réaliserons des études comportementales et des analyses biochimiques et histologiques pour évaluer le rôle du récepteur dans cette maladie. Dans cette étude nous utiliserons 872 animaux.

Bénéfices attendus

Parmi les bénéfices attendus du projet, nous espérons l'identification d'une molécule qui permettra de réduire d'au moins 50% la demyélinisation et capable de restaurer les déficits sensoriels et cognitifs. Nous espérons faire progresser l'état des connaissances quant au rôle du récepteur de la sérotonine dans les effets cognitifs de la démyélinisation dans le modèle de sclérose en plaques .

Procédures

Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l'oreille sera effectué après l'âge de 14 jours. Cette intervention n'est réalisée qu'une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Le génotypage ne sera pas systématique puisque l'élevage sera maintenu avec des croisements homozygote x homozygote. Ainsi, seulement une partie des animaux sera prélevée pour le génotypage. Au total, 42 administrations (1 administration par jour pendant 42 jours) par voie orale (1 min/gavage/jour) seront réalisées sur 480 animaux vigiles. 800 animaux effectueront des tests de comportement n'excédant pas 10 minutes par test et deux tests maximum par jour. Une période d'habituation de 20 minutes pourra parfois être nécessaire soit de 5 à 30 min/jour/animal. Certains tests pourront être répétés tous les jours pendant maximum 5 jours pour mesurer les comportements sociaux. L'ensemble des animaux recevra une dose sublétale d'anesthésique/antalgique (1 min/injection intrapéritonéale) avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par les bagues à l'oreille et une partie est prélevée de l'autre oreille pour le génotypage (DAP générique pour les prélèvements pour le génotypage). Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due à ces prélèvements (douleur légère de courte durée). Contrairement au modèle EAE (Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale), le modèle de démyélinisation par la cuprizone n’induit pas de paralysie des animaux et n’engendre pas de perte de poids. Cependant, ce modèle est connu pour entrainer des déficits cognitifs et sensoriels. Nous ne nous attendons pas à l'apparition de douleur suite au traitement cuprizone qui est ajouté dans la nourriture. L'objectif de ce projet est essentiellement thérapeutique et a pour but de tester les propriétés des ligands du récepteur 5-HT7 synthétisés par nos collègues chimistes dans un modèle de sclérose en plaques. Nous avons déjà montré qu'une des molécules testées (Serodolin) possède des propriétés anti-inflammatoires et antalgiques. Cependant l'injection quotidienne de ligands du récepteur 5-HT7 peut induire un stress des animaux. Si nous n'avons pas observé d'effet indésirable après administration unique, l'administration répétée peut induire différents effets indésirables tels qu'un inconfort dû à l’injection ou des effets secondaires liés au composé (comme la sédation par exemple). De même, la manipulation des animaux dans plusieurs tests comportementaux peut induire un stress. Les procédures mises en œuvre seront de classes légères ou modérées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des trois procédures pour réaliser des dosages et analyses immunohichimiques.

Remplacement

Des études in vitro seront réalisées en parallèle des études in vivo afin d’obtenir plus d’informations sur les mécanismes d’action et les voies de signalisation impliquées. Les études in vitro nous permettent aussi de vérifier l’affinité des molécules pour le récepteur et ainsi de définir la dose utilisée in vivo. Cependant, l’évaluation de l’effet anti-inflammatoire et neuroprotecteur des ligands du récepteur de la sérotonine nécessite l’utilisation de l’animal afin de considérer un organisme entier et de confronter l'effet de nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeux dans la démyélinisation/remyélinisation induite par la cuprizone. L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement de médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet d’une molécule résulte de son action au niveau de l’ensemble de l’organisme. A ce jour aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de prédire et rendre compte de l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’action d’un médicament et en particulier ceux qui conditionnent le comportement.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Les approches décrites nécessitent des cohortes de 6 animaux minimum par groupe et 10 animaux maximum par groupe pour les études de comportement. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d’assurer la validité statistique des résultats. En ce qui concerne l’analyse des données comportementales, des procédures statistiques adaptées à l’analyse des variables dépendantes relevées seront utilisées.

Raffinement

Nous réaliserons une période d'acclimatation d'une semaine des animaux avant le début des expériences. Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec entre autres, des bâtons de bois à ronger de deux tailles différentes et/ou du celluron et/ou des disques de papier kraft compactés et/ou tunnels en carton ou dômes en cellulose et/ou une pyramide polycarbonate où sont placées les capsules de nourriture. Les animaux seront suivis tout au long des procédures quotidiennement (observation de l’aspect général extérieur de l’animal : posture, qualité du pelage, faciès, yeux). Un suivi deux fois par semaine avec la grille de scoring au moment de leur pesée permettra d’appliquer un point limite prédictif et aboutira à la décision de mise à mort par les responsables de bien-être animal si les points limites sont atteints. En fonction du score total, la grille de scoring pourra être appliquée quotidiennement. Dans le cas où un animal présente un ou des signe(s) clinique(s) lors des visites quotidiennes, nous effectuerons une surveillance renforcée. Le suivi des animaux est conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Des données de la littérature indiquent que des préparations de croquettes commercialisées n'induisent pas toutes une démyélinisation, aussi nous avons choisi de préparer notre nourriture. Une étude antérieure nous a permis de montrer que la nourriture faite maison induisait bien une démyélinisation. Cependant, sachant que la nourriture préparée ne permet pas aux animaux de ronger, dans ce projet et pour le confort des animaux, nous souhaitons évaluer si les croquettes commerciales induiront bien une démyélinisation. Si tel est le cas, les croquettes commerciales contenant l'agent de démyélinisant seront utilisées dans les procédures suivantes. Dans le cas où nous utilisons la nourriture faite maison, elle sera préparée tous les 3/4 jours et renouvelée 2 fois/sem et nous ajouterons des bâtons de bois à ronger dans la cage pour limiter la pousse continuelle des dents.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études précliniques. Nous utiliserons des souris C57BL/6 car nous disposons actuellement de souris transgéniques qui n'expriment pas le récepteur 5-HT7 sur ce même fond génétique. Ces souris sont actuellement hébergées dans un établissement prestataire d'élevage, ce qui donne de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est : - un mammifère proche de l'Homme (homologie de 90%) - l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique et pour les études précliniques Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 à 12 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature. Cet écart d'âge se justifie pour pouvoir constituer nos cohortes et réduire le nombre de portées nécessaires. Nous veillerons à ce que l'âge moyen des animaux par groupe soit homogène.

Greffées par voie intraveineuse de cellules cancéreuses puis traitées une à deux fois par jour pendant jusqu'à cent vingt jours, 3 330 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 95 d'entre elles et modéré pour 3 235. Certaines portent en plus une pompe implantée chirurgicalement, subissent jusqu'à six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et des injections d'imagerie deux à trois fois par semaine. L'objectif est de sélectionner un candidat médicament et de déterminer les cancers non solides qu'il pourrait traiter, le porteur présentant la sélection in vitro préalable comme un filtre qui limite le nombre d'animaux. Les 95 souris témoins, ni greffées ni traitées, ne seront pas tuées avec les autres, elles passeront dans un projet consacré à l'entraînement des expérimentateurs.

Objectifs

Le cancer est une maladie complexe qui peut prendre des formes extrêmement variées en fonction des organes et des tissus affectés. Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales ayant acquis, au cours du temps, un certain nombre de caractéristiques faisant qu’elles ne répondent plus au système de régulation de l’organisme. Celles-ci prolifèrent indéfiniment soit en formant une tumeur maligne et/ou des métastases dans un organe, on parle de tumeurs solides, soit en circulant dans le sang ou la lymphe, on parle de tumeurs liquides tels que les cancers hématologiques (lymphome hodgkinien ou non hodgkinien, leucémie lymphoblastiques ou myéloblastiques…). Il est donc primordial de développer de nouvelles thérapies innovantes ciblant ces cellules cancéreuses et ces métastases tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. Les phases d'étude et de développement des nouveaux composés sont validées dans un premier temps par des tests in vitro sur des cellules en culture, mimant artificiellement la pathologie de l’homme. Grâce à ces tests in vitro, des molécules actives sont sélectionnées avant d’être testées, en seconde intention, dans des modèles in vivo de souris porteuses de tumeurs afin de démontrer leur activité et leur efficacité anti-tumorale. C’est en effet dans un organisme vivant complet que l’on peut mesurer les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris. En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique et ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. L’objectif de ce projet est de sélectionner le meilleur candidat médicament et de déterminer la ou les pathologies qu’il peut traiter (indication thérapeutique), dans différents types de cancers « non solides » ou dans des métastases, en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules pour son développement clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en oncologie. Les bénéfices attendus du projet sont de sélectionner le meilleur candidat médicament et de déterminer son indication thérapeutique, dans différents types de cancers « non solides » ou dans des métastases, en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules pour son développement clinique.

Procédures

Injection en intraveineuse de cellules tumorales une seule fois sur animal vigile (contention d’une durée maximale de 30s) suivie d'une progression tumorale (selon les procédures maximum 120 jours sauf en cas de point limite) Administration intra-péritonéale ou per-os ou intraveineuse ou sous cutanée de candidats médicaments (entité biologique ou chimique) (contention d’une durée maximale de 15s quotidienne ou biquotidienne) sur 120 jours maximum Ou selon les procédures, possibilité d’implantation de pompe (osmotique durée de l’intervention 15 minutes, électronique 1 heure) permettant l’administration de candidats médicament. Pour les groupes suivis par imagerie, injection en intra-péritonéal de l'agent substrat nécessaire aux mesures par bioluminescence, 2 à 3 fois par semaine (la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi que l’injection (moins de 10s) maximum 2 fois par semaine sur 120 jours maximum En cours d'étude, des prélèvements sanguins (moins de 30 secondes) avec un maximum de 6 prélèvements de sang sur 24 h peuvent être réalisés sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress/douleur peut provenir : - De la greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse : la contention (d’une durée maximale de 30s) peut générer du stress ainsi qu’une douleur légère à l’injection (moins d’une minute). - De la progression tumorale liée au modèle pathologique recherché (douleur modérée) • De l’injection de l’agent substrat nécessaire aux mesures d’imagerie par bioluminescence : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi qu’une douleur légère à l’injection (moins de 10s) - De l’administration des traitements candidats (entité biologique ou chimique) en intra-péritonéal ou per-os, sous cutanée ou en intraveineuse : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi qu’une douleur légère à l’administration (max de 10 s) - Ou de l’implantation chirurgicale d’une pompe osmotique (15 min) ou électronique (1h) et du poids de la pompe (douleur légère à modérée) et de la potentielle gêne occasionnée pour la souris (durée de l’étude) - Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de tondre les pattes arrière de l’animal : la contention ainsi que le rasage de la patte d’une durée maximale de 30s peuvent générer du stress. - Du prélèvement de sang au niveau de la patte : la contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. - De l’induction de l’anesthésie (gazeuse) pour la mesure d’imagerie : l’induction qui est rapide peut générer du stress

Devenir

Les 5 souris contrôle négatif de chaque étude mettant en œuvre de l'imagerie (correspondant à des souris non greffées non traitées par l’agent biologique ou chimique) pourront être réutilisées à l'issue de ce projet dans le cadre d'un autre projet autorisé dédié à l'entrainement des expérimentateurs. Les autres souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude et les organes et le sang pourront être prélevés afin de vérifier l’envahissement tumoral et/ou métastatique via des analyses qualitatives

Remplacement

Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Ce projet est mis en œuvre après la validation in vitro des différentes nouvelles entités biologiques et chimiques. L’absence d’efficacité in vitro ne permet pas de justifier l’utilisation d’un modèle animal par conséquent ce projet s’inscrit en dernier lieu dans le processus de recherche d’un candidat médicament. C’est seulement sur la base de ces données que les études d’efficacité antitumorale sont ensuite réalisées : uniquement les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique.

Réduction

Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée tumorale à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié. Une collaboration avec le service bio-statistiques permet de consolider le design expérimental et l’effectif nécessaire par groupe, en intégrant de nombreux éléments comme l’influence environnementale, la répartition des points de cinétique, l’historique des données du modèle notamment sur les groupes véhicules des anciennes études, … Les doses de composé à administrer, définies au préalable dans un autre projet, sont non toxiques. La méthode de prélèvement sanguin par microsampling est privilégiée chaque fois que possible (puisqu’elle est extrêmement rapide, et réalisable plusieurs fois sur un même individu dans la limite des recommandations de la Structure du Bien Être Animal) L’imagerie optique est une technique non invasive de plus en plus utilisée en recherche qui permet d’évaluer la dissémination cancéreuse en temps réel sans nécessiter l’euthanasie de souris à chaque mesure, réduisant considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. Chaque souris est son propre témoin. A noter que si les méthodes de détection des cellules tumorales dans le sang prélevé par microsampling dans le cadre du projet préalable de mise au point des conditions de greffe tumorale sont validées et corrélées avec l’envahissement tumoral réel, alors cette méthode pourra permettre d’effectuer cette cinétique sur un même animal et réduira donc également considérablement le nombre d’animaux utilisés par rapport à celui théorique dans ce projet

Raffinement

Les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. Les études de pharmacocinétique (PK) réalisées en amont de l’étude pharmacologique permettent d’optimiser la dose à utiliser permettant d’avoir la meilleure exposition dans le modèle pharmacologique vivo. Des prélèvements de sang répétés par microsampling peuvent être mis en œuvre pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale et obtenir des informations sur des biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant dans ce cas les études de pharmacocinétique dédiées). Cette technique, peu invasive et rapide, permet de réduire le nombre d’animaux en prélevant plusieurs fois de faibles volumes sur un même individu, tout en respectant le bien-être animal et les limites de volémie physiologiques. L’imagerie optique est une technique non invasive qui permet d’évaluer la dissémination cancéreuse en temps réel. La mesure du poids corporel et le suivi du développement tumoral en imagerie seront effectués 2 à 3 fois/semaine, sous anesthésie gazeuse. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence couplé à une perte de poids ou tout autre signe d’altération de l’état général. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des conditions d’hébergement et de manipulations strictes afin de prévenir tout risque d’infection ou contamination. L’utilisation de pompes permet de ne pas intervenir sur l’animal plusieurs fois par jour ou semaine pour les administrations de candidats traitements, contrairement aux approches thérapeutiques par bolus répétés, en limitant ainsi le stress. Après la pose des pompes, des massages sont régulièrement effectués pour éviter tout phénomène d’adhérence. Les souris sont hébergées en groupes sociaux (sauf dans le cadre d’une administration par pompe électronique). Cependant, des études en amont seront effectuées afin d’évaluer la possibilité de laisser les souris en groupes sociaux tout au long des études. Un enrichissement de milieu par des éléments de nidification adaptés va également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de ces éléments.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat et le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie. Le choix du modèle est dicté par le type d’anti-cancéreux étudiés (souris immunocompétentes et/ou immunodéprimées) et le choix de la souche par les études de dissémination tumorale qui permettent de définir les conditions optimales de greffe. Dans la mesure du possible, la même souche est conservée pour l’ensemble des études in vivo pour un modèle tumoral donné (DMA/DMT, pharmacocinétique, pharmacodynamie, efficacité). En effet, il peut exister des différences importantes en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit fonction de la souche murine considérée, pouvant impacter les résultats. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés au cours de la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement, nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.

Génotypées par biopsie à l'état vigile, irradiées au cerveau sous anesthésie à l'âge de 21 jours, injectées, puis soumises à six tests comportementaux évaluant le comportement social, la motricité et la mémoire, 728 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 440 d'entre elles et modéré pour 288. Quatre-vingts passent en plus deux heures d'imagerie par résonance magnétique sous anesthésie. Le projet cherche à savoir si le vieillissement prématuré des cellules du cerveau explique les troubles de l'attention et de la mémoire dont souffrent les enfants traités par radiothérapie pour une tumeur cérébrale, et le porteur attend chez les souris irradiées une anxiété accrue et de l'agressivité. Toutes sont tuées par chirurgie terminale sous anesthésie, pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales sont les tumeurs solides les plus fréquentes chez les enfants, qui sont traitées généralement par radiothérapie, souvent précédée d'une chirurgie et d'une chimiothérapie. Le taux de survie à cinq ans varie de 70 à 99 %, selon le type de tumeur. Les effets tardifs à long terme chez les enfants traités pour des tumeurs cérébrales sont préoccupants. Ces patients souffrent de graves handicaps physiques, fonctionnels et psychosociaux, notamment de la fatigue et des altérations de certaines fonctions cognitives spécifiques telles que des troubles de l'attention, de la mémoire de travail et de la vitesse de traitement de l’information. De nombreuses études, ont montré que l'exposition aux rayonnements ionisants induit la sénescence (processus de vieillissement prématuré) des cellules du cerveau. L'impact de la sénescence cellulaire sur les lésions cérébrales et les déficits cognitifs après la radiothérapie chez les enfants ayant survécu à des tumeurs cérébrales n'a jamais été étudié. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons la sénescence cellulaire dans le cerveau de jeunes souris irradiées, les déficits cognitifs induits par l’irradiation à l’aide de tests comportementaux et les lésions cérébrales, en utilisant des méthodes d’évaluation cognitives spécifiques telles que l’histologie (analyse des tissus) des cerveaux irradiés et l’imagerie par résonance magnétique. L’utilisation d’un modèle génétique permettant de bloquer ce processus de vieillissement prématuré sera utilisé pour étudier l’implication de la sénescence cellulaire dans les séquelles cérébrales induites par radiothérapie (RT) afin de les traiter. L’utilisation de molécules qui agissent sur les cellules sénescentes constitue une voie thérapeutique prometteuse et innovante dans la prévention et le traitement des tumeurs cérébrales. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Le projet permettra une meilleure compréhension de l'implication de la sénescence et du dysfonctionnement cellulaire dans la propagation des lésions cérébrales induites par la radiothérapie. L’équipe projet espère proposer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l'apparition de séquelles cérébrales hautement délétères lors de la radiothérapie chez l'enfant.

Procédures

Etablissement Ulitisateur (EU1) élevage et irradiation : Le génotypage par biopsie sera effectuée sur l’animal vigile (durée de 2 minutes, sur 360 souris). L’irradiation sera effectuée sous anesthésie (durée de 5 minutes par animal, sur 160 souris). Les injections seront réalisées sur des animaux vigiles (durée de 1 minute par animal, sur 160 souris). Chaque souris effectuera 6 tests de comportement différents (durée d’un test estimé à 5 à 15 minutes par animal, sur 240 souris) afin d’évaluer leur comportement social, leurs capacités motrices ainsi que leur mémoire. EU 2 imagerie: L’imagerie par résonance magnétique sera réalisée une seule fois par animal, sous anesthésie (durée de 120 minutes par animal, nombre de souris 80). EU1 mise à mort des souris: elle sera effectuée par chirurgie terminale sous anesthésie pour permettre le prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont : - des problèmes d’anesthésie entrainant la perte d’un animal, de l’hypothermie, des douleurs liées aux injections, des douleurs et des saignements liées au prélèvement pour le génotypage ; - un déficit mental et/ou social associé à un dysfonctionnement cognitif. Il est attendu que l’anxiété soit un peu augmentée et génère de l’agressivité ; - une perte de poids liée à un problème d’alimentation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre d’effectuer des analyses histologiques (analyses de tissus) ou moléculaires.

Remplacement

L’étude de l’impact de l’irradiation sur la sénescence au cours du développement nécessite d’irradier le cerveau de souriceaux et d’étudier les conséquences sur le cerveau à l’âge adulte au niveau histologique, imagerie par résonance magnétique et tests comportementaux. Il n’existe pas d’alternative non animale permettant étudier l’effet de l’irradiation sur la sénescence sur le cerveau de souris au cours du développement (équivalent de l’adolescence chez l’homme) et d’évaluer les altérations cognitives à l’âge adulte.

Réduction

Compte tenu de la variabilité des réponses des souris au sein d’un même groupe dans les tests de comportement, nos expériences précédentes (et celles d’autres laboratoires) montrent qu’un nombre de dix animaux par lot est un minimum requis pour assurer des résultats statistiquement significatifs. Cependant, nous prévoyons d’utiliser 15 souris par groupe afin d’assurer le nombre minimum d’animaux pour les analyses de comportement et réaliser des expériences complémentaires en : imagerie par résonance magnétique, histologie 2-3D et séquençage, de façon à corréler l’ensemble des résultats obtenus. Nous utiliserons également 5 souris par groupe pour des analyses en cytométrie en flux (méthode de tri des cellules en fonction de certaines propriétés).

Raffinement

Les animaux reçoivent un dispositif de nidification périssable chaque semaine au moment du change des cages. Les souris sont irradiées sous anesthésie générale afin de limiter le stress lié au confinement de l’animal dans l’irradiateur. Pour limiter la baisse de la température corporelle sous anesthésie, les animaux seront placés sur une couverture chauffante ou dans une cage elle-même placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Les animaux sont suivis pendant les 24h suivant l’anesthésie (irradiation, IRM). Avant les phases de tests de comportement, une phase d’adaptation des souris est effectuée pendant deux semaines. Pendant cette phase d’adaptation, les animaux sont familiarisés à la manipulation quotidiennement par l’expérimentateur dans la pièce où se dérouleront les tests. Les animaux sont transportés entre les deux EU concernés par un transporteur agrée. Afin de préserver le bien-être des souris pendant le transport, celles-ci sont placées dans des boîtes de transport jetables contenant de la litière, du coton, de l’eau gélifiée, des croquettes ainsi qu’un enrichissement de type tunnel. La taille des boîtes est adaptée au nombre d’animaux et permet de conserver leur répartition initiale par cage.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler chez la souris pour deux raisons majeures : 1) La souris est une espèce couramment utilisée en recherche fondamentale, qui possède une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain tout au moins pour notre approche, et qui permettra donc d’extrapoler les résultats. Les souris seront étudiées à l’âge de 21 jours, au moment du sevrage et de la première vague de spermatogenèse, avant la maturité sexuelle qui a lieu à 50 jours environ. Cet âge chez la souris correspond à la préadolescence chez l’homme qui marque une transition entre l’enfance et le début de la puberté. 2) La souris est une espèce sociale, qui présente notamment des niveaux élevés d’interactions sociales réciproques. Ceci permet d’utiliser des tests de comportement et de mettre en évidence un déficit social dans le modèle de souris transgénique qui permet de mettre en évidence facilement la sénescence.