Procédures légères

Amputés d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, baignés deux nuits dans un colorant sans nourriture, anesthésiés chaque semaine pendant trois semaines pour des séances d'imagerie, 1 832 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Tous seront tués à la fin du projet. Les poissons porteurs de la mutation étudiée développeront des malformations du crâne et de la colonne, que le porteur annonce sans en faire un critère d'exclusion, l'objectif étant de vérifier qu'une mutation repérée chez des enfants de petite taille cause bien la maladie. Il présente pourtant le poisson comme permettant des approches "largement non-invasives", tout en indiquant que le prélèvement de nageoire à trois jours entraîne aujourd'hui une importante létalité.

Objectifs

En étudiant 400 enfants de petite taille, il a été identifié une nouvelle mutation génétique responsable d'une maladie caractérisée par une petite taille et des malformations du squelette de la tête. Si le rôle de ce gène dans le développement squelettique a déjà été décrit, il n'a jamais été associé à une maladie humaine. Le développement d'un modèle animal est indispensable à la fois pour confirmer la pathogénicité de cette mutation et pour déterminer les mécanismes responsable de cette maladie. Par conséquent l’objectif de ce projet consiste à l’établissement et à la caractérisation d’un modèle de poisson-zèbre exprimant cette mutation afin d’étudier l’impact de la mutation sur le développement du squelette de la tête.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir le rôle d'une protéine au cours du développement squelettique. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies entrainant des défaut de la croissance osseuse . La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des pathologies osseuses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Un prélèvement d'un bout de nageoire, sera réalisé sous anesthésie (1 minute) sera effectué sur certains poissons. Certains poissons seront baignés 2 fois dans un colorant pendant une nuit à chaque fois hors flux sans nourrissage Certains poissons seront imagés 1fois/semaine pendant 3 semaines (3 minutes environs). Certains poissons subiront une injection intrapéritonéale sous anesthesie (5 minutes maximum).

Impact sur les animaux

Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d'intérêt, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. D'autre part, les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs 1/ aux anesthésies répétées lors de l’acquisition d’images hebdomadaires, 2/ aux colorations in vivo, 3/ aux isolements nécessaires pour les acquisitions d’images et pour le génotypage des poissons, 4/au prélèvement d’un fragment de 1mm de la nageoire caudale sous anesthésie générale et 5/ à une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale.

Devenir

L'ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été réalisées soit au court des procédures soit seront réalysees en post mortem.

Remplacement

Le développement du squelette est un mécanisme complexe impliquant différent types cellulaires interconnectés. Son développement est une suite d’évènements influencé par de multiples paramètres physiologiques et environnementaux. De ce fait, il est pour le moment impossible de modéliser parfaitement son développement in vitro, et le recours à l’expérimentation in vivo reste incontournable. Néanmoins l'utilisation du poisson comme espèce modèle permet cependant des approches largement non-invasives sans nécessité d’intervention chirurgicale.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire. Ce nombre a été pour chaque protocole déterminé afin d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour l’obtention de résultats significatifs en prenant compte de la variabilité de la croissance des poissons observé au cours de précédents projets du laboratoire. Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Au cours de la procédure 3 afin d’une part d’augmenter la puissance statistique et d’autre part de réduire le nombre d’animaux utilisé, les acquisitions d’image seront réalisées sur le même animal à différents temps. Nous mettons en place actuellement le prélèvement de la nageoire des poissons pour génotypage à 3 jours post fécondation au sein de l'animalerie. A l'heure actuelle ce geste entraine une importante léthalité et nécessite une amélioration. Néanmoins au cours de ces 5 prochaines années, la mise en place de cette technique permettra de réduire le nombre d'animaux par procédure.

Raffinement

Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d’interet, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. Dans le cas d’un défaut mandibulaire trop important, l’analyse des poissons se limitera à l’analyse des premières étapes du développement crâniofacial jusqu’à 5 jours post fecondation). Dans le cas d’un défaut mandibulaire modéré à faible, Les bacs à surveiller seront indiqués, le comportement des animaux face à la nourriture sera analysé quotidiennement lors du nourrissage par les animaliers. D’autre part l’apparition de symptômes morphologiques ou comportementaux sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Seuls les poissons nécessaires à la création, au maintien des lignées et à l’analyse du squelette post mortem aux stades adultes seront génotypés à 3mois post fécondation sous anesthésie générale en présence d’un analgésique. A la suite du génotypage, les poissons sont mis sous analgésiques pendant 48h. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un microscope permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie. Le milieu aqueux utilisé pour maintenir les poissons dans la bonne position pendant l’acquisition permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette dela tête. Le squelette de la tête présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de poissons exprimant des protéines fluorescences dans les cellules participant à la formation osseuse permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. L’analyse du squelette se fera du stade larvaire (7jours post fécondation (jpf) ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 1 semaines, 2 semaines, 3 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois).

33 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacun subissant soit huit prélèvements sanguins sous anesthésie après une injection intraveineuse, soit deux séances d'IRM d'une heure. Tous seront tués en fin de procédure pour prélever leurs organes. Le porteur justifie le choix du rat plutôt que de la souris par la possibilité de prélever davantage de sang sur un même individu, ce qui divise par huit le nombre d'animaux utilisés. Le bénéfice annoncé se limite à mieux comprendre comment influencer le comportement de nanoparticules d'oxyde de fer dans le sang, un usage en médecine humaine étant renvoyé au long terme.

Objectifs

Les nanoparticules à base de fer sont en plein développement et possèdent de nombreuses propriétés pour des applications en médecine : en effet, 1/ elles pourraient aider au diagnostic par imagerie IRM (imagerie par résonance magnétique) car le fer est visible en IRM mais aussi 2/ elles pourraient servir pour traiter des pathologies: i) sous un champ magnétique le fer peut dégager de la chaleur et détruire les cellules à proximité, ii) le fer peut également aider à augmenter les effets de radiothérapie (traitement par rayons) et enfin, iii) les nanoparticules peuvent jouer le rôle de transporteur de médicaments. Un élément indispensable avant de développer des nanoparticules est de contrôler leur comportement dans l’organisme afin de les amener sur leur lieu d’action. Le principal problème de la plupart des nanoparticules est qu’elles sont vite éliminées de la circulation sans avoir le temps de rejoindre leur cible et qu’elles s’accumulent dans le foie qui est l’organe qui permet leur élimination. Dans de précédents travaux nous avons identifié que certaines protéines présentes dans la circulation sanguine pouvaient influencer le comportement biologique de nanoparticules d’oxyde de fer aussi appelées Spions (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles). Dans ce projet, nous souhaitons maintenant greffer ces protéines sur les Spions et évaluer leur comportement biologique : temps de circulation sanguine et élimination.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre comment influencer le comportement biologique de nanoparticules d’oxyde de fer pour à terme permettre leur utilisation en médecine humaine.

Procédures

Procédure 1 : Une injection intraveineuse (1minute) puis 8 prélèvements sanguins (2 minutes chacun) sous anesthésie. Procédure 2 : deux sessions d’imagerie par IRM (1h maximum chacune) seront réalisées ainsi qu’une injection intraveineuse (1 minute) sous anesthésie.

Impact sur les animaux

L’injection intraveineuse et les prélèvements sanguins répétés sous anesthésie pourraient présenter un léger inconfort et des lésions locales si le geste est mal maîtrisé. Un stress associé à la mise sous anesthésie peut également intervenir. Les composés administrés ne devraient avoir aucun effet.

Devenir

Des analyses complémentaires sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de l’étude. La totalité des animaux seront euthanasiés en fin de procédure

Remplacement

L’étude du devenir d’une molécule dans l’organisme rend la règle de remplacement difficilement applicable puisqu’il est nécessaire de l’étudier dans son contexte global avec une interaction entre les différents organes préservée.

Réduction

Une sélection de 6 Spions, préalablement testés in vitro pour l’étude de leur pharmacocinétique puis par la suite des 3 meilleurs Spions pour l’étude de biodistribution permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant ceux avec les moins bonnes propriétés physiologiques. L’effectif de chaque groupe expérimental a été réduit à son minimum dans chaque procédure afin d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents sur la base des études menées précédemment. L’utilisation du rat permet également de réduire les effectifs car il est possible de réaliser des prélèvements sanguins répétés compatibles avec nos analyses biologiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes sociaux de 2 ou 3 avec accès illimité à l’eau et la nourriture. L’enrichissement des cages sera composé de 2 pad de sizzle-dri (frisottis de carton). Un temps d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respecté avant le début de la procédure. La réalisation d’une imagerie IRM dans cette étude, qui est une méthode non invasive, permet de réduire la douleur et l’inconfort à son niveau minimum. La totalité des procédures est réalisée sous anesthésie et sur plaque/lit chauffant afin de réduire l’inconfort de l’animal. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance et également à la bonne réalisation des gestes techniques.

Choix des espèces

Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever de façon répétée des volumes de sang pour nos analyses qui demanderaient l’utilisation de nombreuses souris. Dans un but de réduction du nombre d’animaux nous utiliserons le rat qui permet de diminuer le nombre d’animaux par 8 mais également l’imagerie par IRM. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (250g) afin qu’ils aient atteints leur maturité physiologique

Jusqu'à douze séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie générale, six prélèvements sanguins à la veine caudale et douze mesures de tumeur au pied à coulisse par animal. 1 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 150 d'entre elles et modéré pour 900, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau ou dans la veine de la queue, et font la navette entre le site d'élevage et celui des expériences, l'objet étant d'améliorer la persistance de lymphocytes T modifiés utilisés en thérapie cellulaire. Le porteur reconnaît que certaines pourraient souffrir de voir disparaître leurs congénères à mesure que les points limites sont atteints, jusqu'à se retrouver seules dans leur cage.

Objectifs

Les thérapies cellulaires basées sur l’utilisation des propres cellules immunitaires du patient révolutionnent le traitement de certaines leucémies et lymphomes. Cependant, une fraction des patients ne répond toujours pas efficacement à ces thérapies qui s'avèrent pour l'instant moins efficaces contre les tumeurs solides. Les essais cliniques ont montré que le principal facteur prédictif d'une faible efficacité thérapeutique est la faible persistance de ces cellules immunitaires, une fois génétiquement modifiées et ré-infusées chez les patients. Ces travaux de recherche devraient permettre d’améliorer la persistance et donc l’efficacité de ces thérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes responsables de l’efficacité de thérapies cellulaires anticancéreuses utilisant des lymphocytes T. Des bénéfices thérapeutiques importants sont attendus concernent le traitement de certains lymphomes, de leucémies, mais aussi de plusieurs tumeurs solides. En effet, la modification que nous proposons devrait permettre de lever certains mécanismes de résistance à ces thérapies en confèrent aux cellules immunitaires des propriétés fonctionnelles particulières leur permettant d'éradiquer plus efficacement des tumeurs à l'interieur d'un organisme . De plus, même au-delà du domaine du Cancer, les innovations thérapeutiques que nous proposons devraient aussi, à terme, améliorer l'efficacité de ces thérapies cellulaires qui commencent à être utilisées dans d’autres pathologies humaines comme les maladies auto-immunes. L’amélioration que nous proposons pourrait aussi éviter le besoin de recourir à des injections répétées

Procédures

Les animaux de ce projet seront élevés dans l’établissement 1 et toute expérience se déroulera dans l’établissement 2. Tous les animaux seront soumis à : -selon la durée de l’expérience, jusqu’à 12 séances d'imagerie hebdomadaires, comprenant aussi l'injection intraperitoneale d'un liquide traceur, (sous anesthésie générale) la durée de ce geste est évaluée à 7 minutes. - selon la durée de l’expérience, jusqu’à 6 prélèvements sanguins, une fois chaque deux semaines. Ce prélèvement sera réalisé par ponction de la veine caudale latérale sur souris vigile la durée de ce geste est évaluée à moins de deux minutes. En plus, selon les expériences, les animaux sauront soumis alternativement à : - Une séance de rasage du flanc droit la durée de ce geste est évaluée à moins de d’une minute. -Une injection sous-cutanée sur souris vigile de cellules tumorales, la durée de ce geste est évaluée à moins d’une minute. - jusqu’à 12 mesures de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse, sur animal vigile, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute. Ou à: -Une injection intraveineuse(veine caudale) de cellules tumorales, sur des souris vigiles, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les souris subiront un stress consécutif à la manipulation hebdomadaire des animaux pour l’ensemble des expériences. Elles subiront aussi un stress lié au transport entre les 2 sites, au moment du rasage des poils avant les injections en sous-cutanée et de l’immobilisation pendant les injections et lors des prises de sang. Elles subiront de plus une douleur légère lors des injections en sous cutanée et lors des injections intraveineuses et des prises de sang à la veine caudale. Les souris subiront une douleur du au développement de la tumeur. Enfin, certains animaux pourraient subir un stress de voir disparaitre leurs congénères en particulier en fin d’expérience (points limites atteints) jusqu’au point de se retrouver eux-mêmes isolés dans la cage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyses

Remplacement

Un grand nombre d’expériences de culture cellulaire a été realisé, montrant une amélioration des fonctions antitumorales des cellules immunitaires humaines invalidées pour un gène decrit auparavant. En effet, cette invalidation améliore les capacités d’expansion, de survie, et de prolifération de ces cellules immunitaires. Le recours aux modèles animaux est maintenant incontournable car ils permettront de valider dans des modèles précliniques pertinents et reconnus de la communauté scientifique, ces différentes observations au sein d’un même organisme vivant.

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base des travaux antérieurs et de la littérature scientifique montrant que 18 à 24 souris par groupe permettent de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés. La croissance tumorale sera suivie par imagerie, permettant un suivi dynamique de ce paramètre sans faire recours à la mise à mort des souris, ainsi réduisant le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec un nombre de 6 souris maximum par cage contenant un enrichissement constitué de cotons et de maisonnettes en cartons. Lors du transfert entre les 2 sites, les souris seront dans des boites de transport avec de la nourriture et de l’enrichissement. Certaines interventions (imagerie) seront précédées d'une anesthésie générale, afin de prévenir la douleur ou le stress de l’expérience. Les souris seront surveillées pendant toute la durée des expériences afin de déceler et notifier précocement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entrainera une mise à mort anticipée.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix et de référence pour les études des réponses immunitaires contre la tumeur à l’intérieur de l’organisme. Les souris utilisées pour la reproduction seront mis en accouplement à partir de 7 semaines un stade de développement auquel ces souris sont considérées comme sexuellement matures. Les souris utilisées pour les expériences d’étude de la réponse immunitaire contre la tumeur seront âgées de 7 à 12 semaines en début d’expérience (au moment de l’injection tumorale), une tranche d’âge correspondant au jeune adulte, de choix pour ce genre d’études en vertu de la bonne forme physique et de l’absence de biais éventuels dûs aux changements physiques et hormonaux liés au développement autant qu’au vieillissement.

Une piqûre ou une incision de la veine caudale chaque semaine pendant huit semaines, un gavage, une injection, douze heures sans nourriture, deux mois de régime gras et une biopsie de queue à six jours. 537 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 220 d'entre elles et modéré pour 317, toutes tuées pour prélèvement. Le porteur indique établir des organoïdes intestinaux à partir de ces mêmes souris pour traiter ex vivo une partie des questions, tout en concluant qu'aucun modèle de remplacement n'existe à ce jour. Les champs du résumé désignent l'objet de l'étude comme "un gène" sans jamais le nommer, et ne disent pas ce que les souris développeront réellement.

Objectifs

Il s’agira de comprendre précisément le rôle d’un gène dans le métabolisme digestif et de déterminer les conséquences de son absence pour des maladies affectant l’intestin (cancer du côlon, maladies inflammatoires chroniques de l’intestin comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique). Ces deux objectifs nécessitent l’utilisation de modèles murins à même de récapituler la complexité de l’intestin et d’intégrer l’interrelation fonctionnelle des organes du système digestif en contexte physiopathologique.

Bénéfices attendus

Le projet apportera d'importants bénéfices en termes de compréhension de la biologie, de développement de traitements et d'étude des maladies humaines. En effet, il permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui garantissent le fonctionnement du système digestif et sont dérégulés lors de maladies (ex. cancer colorectal, maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, diabète, obésité). A terme, les nouvelles connaissances générées par le projet contribueront à améliorer la santé humaine en fournissant des pistes innovantes pour la prévention, le diagnostic et la prise en charge thérapeutique des maladies du système digestif.

Procédures

- Prélèvements sanguing : piqûre veine caudale sur animaux vigiles une fois par semaine pendant 8 semaines ou par incision veine caudale sur animaux vigiles une seule fois ou trois fois avec 20 jours d’intervalle. - Injection : 1 injection unique sur animaux vigiles. - Gavage : une seule fois sur animaux vigiles avec une canule de gavage. - Diète : pas de croquettes pendant 12 h, réalisé une seule fois. - Régime riche en graisse (20 %) : réalisé pendant 2 mois, une seule fois. - Biopsie de queue : une seule fois sur animaux vigiles âgés d’environ 6 jours.

Impact sur les animaux

Les procédures sont susceptibles d’entrainer un stress, des modifications du poids (gain/perte) et la douleur chez les animaux soumis aux expérimentations, mais elles ont été réfléchies afin de réduire au maximum ces effets indésirables. Les animaux seront surveillés très régulièrement durant les procédures pour détecter le plus précocement possible la douleur chez les animaux et y remédier. En cas d’apparition de signes de souffrance au cours des protocoles (ex. perte de poids importante, pelage dégradé, prostration), les animaux seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Des observations faites chez les malades, ainsi que des expériences effectuées avec des cellules cultivées in vitro, suggèrent fortement que la disparition d’un gène étudié par l’équipe perturbe le fonctionnement du système digestif et conduit à des pathologies intestinales. Pour confirmer ces hypothèses et comprendre le rôle de ce gène, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal : la perturbation du métabolisme digestif, l’apparition de lésions tumorales ou d’un syndrome inflammatoire intestinal ne peuvent survenir que dans un organisme entier, pourvu de l’interconnexion fonctionnelle des différentes acteurs (ex. organes, système immunitaire, microbiote), et sur le long terme. Il n’existe pas de modèle alternatif de remplacement disponible à ce jour pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure a été défini sur la base de la littérature scientifique et de façon à permettre des analyses statistiques (calculs de puissance statistique). Pour ne pas utiliser des groupes d’animaux supplémentaires, les prélèvements seront stockés et pourront être utilisés par la suite s’il est nécessaire d’examiner des paramètres complémentaires. En outre, des organoïdes intestinaux seront établis à partir des animaux pour étudier lorsque cela est possible certaines questions scientifiques ex vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions sanitaires contrôlées et permettant un bien-être optimal (ex. groupes sociaux, carrés de coton pour la fabrication des nids, bâtonnets à ronger). Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. En outre, des points limites ont été prédéfinis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux seront surveillés très régulièrement durant les procédures pour détecter le plus précocement possible la douleur (ex. perte de poids, pelage dégradé, prostration, mimiques faciales) et y remédier. En cas d’apparition de signes de souffrance, les protocoles seront soit allégés (dose ou durée) si cela est possible, soit immédiatement arrêtés.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus) qui permet de générer des modèles d’étude des maladies humaines pertinents et bien caractérisés. Les lignées de souris transgéniques nécessaires à la réalisation du projet ont été décrites dans la littérature scientifique comme n’ayant aucune altération grave de leur bien-être et de leur santé. En particulier, elles ne développent pas spontanément des tumeurs ou une inflammation intestinale. Certaines de ces lignées de souris produisent des selles d’aspect graisseux et développent un surpoids en vieillissant, mais leur espérance de vie, ainsi que leur comportement, sont similaires à ceux des souris normales. Les expériences seront réalisées avec des souris adultes au moins âgées de 8 semaines.

Isolées seize jours en cage individuelle, 60 rattes gestantes reçoivent chaque jour une injection du principe actif du cannabis sous la peau. Avec leur descendance, 452 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 168 d'entre eux et modéré pour 284. À partir du sevrage, 224 petits enchaînent trente-cinq séances quotidiennes d'une heure, réparties entre tests de mémoire de travail, de flexibilité, d'impulsivité et de compulsivité, avec un stimulus électrique aux pattes que le porteur dit évitable à tout moment et deux contentions d'une heure. Tous les rats seront tués pour analyse de leur cerveau, le bénéfice annoncé se limitant à informer la population des risques psychiatriques liés à une consommation de cannabis pendant la grossesse.

Objectifs

Le cannabis est la drogue illégale la plus souvent consommée durant la grossesse. Dans l’ensemble, la littérature scientifique est faible sur l’usage de cannabis durant la grossesse. Ce projet a pour but d’étudier les conséquences comportementales et neurobiologiques de l’exposition prénatale au principe actif du cannabis, chez le rat dont l'utilisation a considérablement augmenté dans le monde entier. Cette étude repose sur 2 objectifs principaux : 1) Étudier les conséquences sur la mémoire, la flexibilité (capacité de changer de comportement), l’impulsivité (capacité à attendre pour obtenir une grande récompense) et la compulsivité (incapacité d’éviter de réaliser une action) qui sont des composantes de l’addiction 2) Étudier les conséquences sur le système de communication neuronale médié par la dopamine (messager impliqué dans la mémoire, la fléxibilité, l’impulsivité et la compulsion).

Bénéfices attendus

Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les effets de l’exposition prénatale au principe actif du cannabis sur la descendance. Notamment, nous allons étudier si cette exposition prénatale produit des déficits cognitifs à l’adolescence. De plus, nous allons étudier si l’exposition in utero au cannabis produit des altérations au niveau du cerveau et notamment du système de la dopamine chez l’adolescent. Ces informations seront importantes pour informer la population des éventuels risques de développement de maladies psychiatriques à l'adolescence associés à l’utilisation du cannabis pendant la grossesse.

Procédures

60 rattes vigiles seront hébergées individuellement pendant 16 jours et vont recevoir 16 injections : 1 injection par jour en sous-cutanée pendant la gestation. Pour 224 rats descendants des mères, 1 test comportemental par animal au cours duquel le rat reçoit une récompense sucrée, d'une durée de 1h sera réalisé pendant 5 semaines, à raison d'un test par jour, 7 jours par semaine (35 sessions) avec 2 séances uniques de contention d'1heure en amont des tests comportementaux en début et en fin de projet. 4 tests comportementaux différents sont étudiés (sur 56 rats par test) : 1) le test de mémoire de travail pour évaluer la capacité de garder une information en mémoire pour pouvoir l’utiliser dans le futur. 2) le test de flexibilité comportementale pour étudier la capacité de changer le comportement en fonction des conditions environnementales. 3) le test d'impulsivité pour analyser l’incapacité d’attendre pour obtenir une grande récompense mais, au contraire, préférer des récompenses plus petites mais immédiates. 4) le test de compulsivité pour évaluer l’incapacité d’éviter d’exécuter une action. Pour 168 rats descendants des mères, un suivi de la population sur 22, 41 et 60 jours postnatal sans acte invasif sera réalisé.

Impact sur les animaux

-Isolement des mères : léger stress minimisé par l’apport d’enrichissement -Traitement prénatal : léger stress des mères lors de la manipulation et légère douleur transitoire due à l’introduction de l’aiguille pour les injections sous-cutanées ainsi qu'un léger risque d'agressivité chez les mères traitées mais pas chez les descendants (relevé dans la littérature). -Stimulus électrique : douleur très légère et transitoire au niveau des pattes pouvant être évitée à tous moments. -Stress par contention : léger stress transitoire qui peut entrainer une augmentation du rythme respiratoire, attendue dans les premières minutes du test.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements et analyse des cerveaux.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les effets comportementaux sur la descendance des drogues d’abus prises par les mères, peut-être uniquement menée sur un animal vivant et non sur un modèle in vitro ou in silico. En effet, l’étude du comportement nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques. Le nombre d’animaux requis par groupe expérimental a été calculé par un test de puissance. Ainsi, nous avons trouvé que 14 animaux par lot seront nécessaires à notre étude. De plus nous mettrons en place une stratégie d’accouplement restreinte au juste nécessaire en réalisant les accouplements par étapes successives jusqu’à obtention du nombre d’animaux nécessaires à nos études.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites stricts et précis et des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, avec une pesée 2 fois par semaine. Dès leur arrivée à l’animalerie, les parents seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Les procédures d’accouplement débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Les mères seront hébergées de facon individuelle lors du traitement avec un enrichissement fourni par l'animalerie. Après leur naissance, les petits resteront avec leur mère jusqu’au sevrage (J21), hébergés en conditions normales avec un enrichissement dans la cage fournie par l’animalerie (matériel de nidification et des tunnels pour leur permettre de se cacher) avec accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Les rats seront observés jusqu’au sevrage, puis seront hébergés par groupe de même sexe de 2 à 3 animaux issus de la même portée pour le reste du projet.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude du comportement dans les modèles animaux. En effet, les rats ont des réponses cognitives qui sont similaires à celles de l’Homme, ce qui n’est pas aussi évident avec d’autres espèces. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 8 semaines au début du projet pour réaliser les accouplements à 10 semaines. La descendance sera incluse dans le projet dès la naissance et jusqu'à leurs 60 jours, ce qui correspond à l'âge de la puberté.

Six animaux sortiront vivants de ce projet pour être réutilisés ailleurs, les dix autres seront tués pour prélèvements. 13 souris et 3 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour six d'entre eux et modéré pour dix. La première partie du projet consiste à caler des séquences d'IRM, avec plusieurs heures d'anesthésie par animal, la seconde à reproduire des symptômes de schizophrénie par quatorze injections quotidiennes sous la peau, suivies de trois séances d'imagerie et de tests d'activité locomotrice, de mémoire de travail et d'inhibition du réflexe de sursaut. Le porteur qualifie l'effet de ces injections de déstabilisation du fonctionnement du cerveau pouvant induire de l'angoisse, et conclut à l'"absolue nécessité" d'utiliser des animaux vivants.

Objectifs

L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technique aujourd’hui incontournable lorsqu’on souhaite étudier l’intérieur du corps d’un individu de façon non invasive. Ses applications biomédicales se sont multipliées en quelques dizaines d’années et continuent d’évoluer rapidement, en particulier pour l’étude du cerveau. Chaque séquence d’imagerie permet d’observer des structures anatomiques ou des processus physiologiques différents. Elles doivent cependant être adaptées au cas par cas, selon le modèle animal et la pathologie étudiée mais aussi en fonction du matériel et de son évolution (nouvelle antenne, nouvelle séquence, …). Au sein de notre équipe de recherche, de nombreux projets présents et futurs en neurosciences pourraient bénéficier de cette technique, en particulier afin de permettre un suivi longitudinal des animaux et de réduire ainsi le recours aux méthodes ex vivo. Cette technique présente cependant le défaut d’être complexe à utiliser et de nécessiter une anesthésie générale. Il est donc nécessaire d’optimiser le protocole expérimental séquence par séquence sur des groupes d’animaux restreints avant débuter des cohortes plus importantes, afin de limiter la durée d’acquisition au strict nécessaire permettant d’obtenir des données de bonne qualité tout en minimisant les risques d’incidents d’anesthésie. L’objectif de cette demande est de donc mettre en place une série de séquences IRM (anatomiques, de diffusion, de perfusion, de spectroscopie, …) applicables à nos différentes thématiques de recherche en neurosciences. Nous nous limiterons aux séquences ne nécessitant pas l’utilisation d’agents de contrastes injectables. Le premier projet qui bénéficiera de cette technique d’imagerie est dédié à l’étude de l’intérêt d’associer activité physique et traitement pharmacologique dans la prise en charge de la schizophrénie. Cette demande d’autorisation inclura donc deux procédures expérimentales, à savoir « mise au point » et « application à un modèle de schizophrénie ». Nous disposerons ainsi d’une bonne base de travail pour nos futurs projets.

Bénéfices attendus

Le bon déroulement de ce projet permettra à notre équipe de disposer de séquences d’imagerie appropriées pour les études longitudinales (suivi séquentiel in vivo de l’évolution de notre modèle de schizophrénie) et minimisera le recours aux approches ex vivo (par exemple l’histologie). Ce projet vient en complémentarité d’un essai clinique en cours visant à démontrer les effets bénéfiques (cérébraux, métaboliques, cognitifs, circadiens) de l’activité physique adaptée chez les patients souffrant de schizophrénie. Les données recueillies chez l’animal permettront d’apporter des arguments scientifiques supplémentaires sur les bienfaits de l’activité physique sur le cerveau et sur la prévention des effets secondaires des antipsychotiques. Réduire la sédentarité, les comorbidités métaboliques (diabète, obésité) et cardiovasculaires chez les patients schizophrènes est un enjeu sociétal majeur. La longévité de ces patients est en effet réduite d’environ 20 ans en grande partie due à la sédentarité et aux comorbidités liées à la pathologie elle-même mais aussi aux antipsychotiques. Améliorer la longévité, c’est aussi diminuer le coût de cette maladie. En 2015, la schizophrénie se classait au 10ème rang des principales causes d’incapacités de par le monde chez les 15-39 ans. L’Organisation Mondiale pour la Santé a estimé le coût direct de la schizophrénie dans les pays occidentaux à environ 2% des dépenses totales de santé. Apporter des résultats et arguments scientifiques supplémentaires démontrant les effets bénéfiques de l’activité physique dans la schizophrénie permettra d’étayer la nécessité d’instaurer ce type d’activité comme thérapeutique adjuvante chez ces patients et d’étendre les dispositifs tel que ‘Sport sur Ordonnance’. Les domaines scientifiques dans lesquels les résultats de ce projet auront un impact bénéfique sont, outre la neurobiologie et les sciences des activités physiques et sportives (aspects fondamentaux), le domaine de la santé mentale et de la prise en charge psychiatrique. En effet, ce travail apportera une caution scientifique concernant les effets bénéfiques du sport sur la santé mentale, ce qui permettra de rendre plus aisée la communication et la diffusion de programmes adaptés permettant d’améliorer les conditions de vie des patients.

Procédures

Pour la première partie du projet, les animaux subiront quelques heures d’anesthésie générale pour l’imagerie, avec maximum 1h consécutive. Pour la seconde partie du projet, les animaux seront soumis à une administration chronique quotidienne (durée : 1 minute) durant 14 jours par voie sous cutanée. Les injections seront réalisées le matin, toujours à la même heure, toujours par la même personne, formée et compétente. A cela s’ajoute 1h maximum d’anesthésie pour l’imagerie à trois reprises ainsi que des tests comportementaux non aversifs permettant d’évaluer l’activité locomotrice, la mémoire de travail et l'inhibition du réflexe de sursaut. Avant le début de la seconde partie du projet, les animaux seront identifiés par une puce électronique qui sera implantée sous anesthésie générale (durée de la manipulation : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Pour les 2 procédures, l’utilisation d’isoflurane par voie inhalée pour l’anesthésie est à prendre en considération par son effet relativement désagréable durant quelques instants au niveau des muqueuses, et par la perte de connaissance qu’il induit (nuisances légères). Pour le modèle de schizophrénie, outre les aspects stressants d'injections sous-cutanées quotidiennes (durée d’injection : environ 1 minute), ces administrations induisent des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.) et qui sont la base du modèle de cette pathologie. Il ne s’agit pas à proprement parler de douleur mais d’une certaine déstabilisation du fonctionnement du cerveau qui peut induire une certaine angoisse (nuisance modérée). Enfin, pour les tests comportementaux, le test d’inhibition du réflexe de sursaut peut générer un certain niveau de stress chez l‘animal mais pas de douleur (nuisances légères).

Devenir

Pour la première partie du projet, les animaux seront gardés en vie. Pour la seconde partie du projet, les animaux seront mis à mort avant prélèvement d’échantillons biologiques.

Remplacement

Dans la mesure où le projet présenté ici concerne une pathologie psychiatrique très complexe mettant en jeu de multiples facteurs liés au fonctionnement du cerveau, facteurs qui ne sont pas tous connus, ni maitrisés, il y a absolue nécessité d’utiliser des animaux vivants. Enfin, les aspects comportementaux qui seront étudiés et qui miment les symptômes très invalidants que vivent les patients, ne peuvent à l’heure actuelle pas être modélisés d’une autre manière.

Réduction

Le but du projet est de réduire le nombre d’animaux utilisé dans nos futurs projets en permettant de réaliser des études longitudinales par imagerie. La première partie du projet servira à la mise en place du protocole expérimental, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux pathologiques utilisés par la suite. Le nombre d’animaux de la seconde partie du projet a été calculé au plus juste en fonction du niveau d’effet attendu (réduction du volume de certaines structures cérébrales) pour obtenir une puissance statistique suffisante. Les données seront comparées par des tests non-paramétriques et/ou paramétriques en fonction de leur distribution. Un seul sexe sera testé (mâles) afin de limiter le nombre de groupes d’animaux. Il est indéniable qu’une comparaison mâle / femelle serait idéale, cependant, cette étude est une preuve de concept et la pathologie cible, la schizophrénie, connue pour présenter des symptômes plus graves chez les patients masculins.

Raffinement

Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé et ayant un livret de compétences à jour. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages avec un igloo en papier mâché et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement minimum, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine, puis seront manipulés régulièrement durant la durée totale du projet afin de les habituer au contact humain. L’utilisation d’anesthésiques volatils sera effectuée pour l’implantation des puces, l’imagerie et la mise à mort.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les deux espèces actuellement utilisées dans nos protocoles expérimentaux. Cette DAP permettra de disposer de séquences d’imagerie adaptées à chacune d’elle. La souche de souris C57BL/6JRj est le fond génétique de nombreux modèles animaux, comme le modèle PCP mais aussi les modèles génétiquement modifiés de schizophrénie et de la maladie d’Alzheimer que nous utilisons. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, à un âge auquel les grands systèmes physiologiques sont matures.

Anesthésiées pour une ovariectomie d'une trentaine de minutes, puis saignées à la veine jugulaire douze fois pour les opérées et trente et une fois pour celles laissées entières, 82 chèvres sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 70 d'entre elles et modéré pour 12. Quinze reçoivent en plus une éponge vaginale imprégnée d'une hormone de synthèse, l'objet du projet étant justement de remplacer ces molécules de synthèse par de la progestérone extraite d'une plante. Le porteur écrit que les expérimentations n'occasionneront aucune invalidité permanente, alors que l'ablation des ovaires en est une. Les 82 chèvres retournent ensuite à l'unité expérimentale, où elles pourront servir à d'autres protocoles.

Objectifs

Mise au point, pour l'élevage caprin et ovin, d'une technique de synchronisation des oestrus et des ovulations à partir de progestérone et molécules associées, issues de plantes, en remplacement des techniques actuelles qui utilisent des substances de synthèse issues de l'industrie du médicament. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

1. Mise au point d'une technique durable de synchronisation des oestrus et des ovulations chez la chèvre et la brebis. 2. Fin de l'utilisation de substances chimiques de synthèse, remplacées par des molécules naturelles issues de plantes 3. Meilleure connaissance des contenus de certaines plantes en progestérone et molécules associées et du déterminisme génétique de ces contenus

Procédures

1. Ovariectomies réalisées en une seule fois sous 1 anesthésie générale dans l'EU1. L'opération dure une trentaine de minutes. Elle est réalisée par un chirurgien expérimenté. 2. Prélèvements sanguins à la veine jugulaire réalisés par des techniciens expérimentés. Chacun de ces animaux fera l'objet de 12 (ovx) ou 31 (entières) prélèvements ponctuels. Chaque prélèvement dure quelques secondes et sera réalisé dans l'EU2. 3. Pose d'une éponge intra vaginale contenant du FGA sur 15 chèvres de la partie 2 (chèvres entières) réalisée dans l'EU 02.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations, de la phase pre opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible, ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthsie, une irritation de l'appareil respiratoire supérieur (lié à lintubation) peut apparaître, mais c'est rare. Un hématome peut apparaître suite aux prises de sang à la veine jugulaire, ainsi qu'aux injections intramusculaires, mais c'est rare. Du fait que la progestérone, au contraire d'autres stéroïdes comme l'oestradiol, est plutôt connue par ses effets protecteurs que néfastes sur le fonctionnement cellulaire et sur le système nerveux central, nous n'attendons pas de nuisances ou d'effets indésirables sur les animaux liés à l'administration de progestérone. Toutefois, compte-tenu du fait qu'il y a des molécules associées à la progestérone et d'autres composés encore inconnus dans la plante étudiée, nous mettrons en place au cours de l'expérimentation, des observations précises (troubles comportementaux, digestifs ou autres manifestations visibles) sur les animaux recevant les préparations testées.

Devenir

Les expérimentations prévues n'occasionneront aucun désordre de long terme ni aucune invalidité permanente. Les animaux retourneront donc dans l'unité expérimentale où ils seront potentiellement réutilisables.

Remplacement

Nous nous intéressons à une réponse physiologique complexe. Des méthodes de remplacement, telles que des cultures de cellules ou une modélisation mathématique, ne peuvent, du fait de cette complexité extrême, être utilisées.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été rationalisé afin de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire, tout en conservant une bonne mise en évidence statistique. Sur la base d’un test-t et avec les concentrations de P4 attendues et des effectifs de 15 (contrôle) et 15 (P4), on obtient une puissance de test de 100% .

Raffinement

Les animaux ovariectomisés recevront un traitement anti-douleur ; tous les animaux seront hébergés en groupe social sur paille et avec enrichissement (caisse en bois pour grimper). Le nombre de prises de sang a été réduit au minimum (ovx: 4 pour le premier jour et 2 par jour ensuite pendant 5 jours; entières : 1 par semaine pendant 3 semaines, puis 1 par jour pendant 4 semaines). Le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, distants de 300 mètres, sera réalisé dans une bétaillère agréée, conduite par un chauffeur et un animalier diplômés et expérimentés. La vitesse sur le centre est limitée à 30 kms/heure et, de ce fait, n'occasionnera pas de trouble supplémenaire aux animaux. De la paille fraîche sera répandue sur le sol du véhicule prélablement nettoyé, ocassionnant ainsi un confort certain aux animaux transportés.

Choix des espèces

Les caprins sont une des espèces qui utilisent ces traitements en ferme sur le terrain. Aucun traitement de synchronisation analogue n’existe sur des espèces modèles de type souris, rat, poisson-zèbre ou C. elegans et l’effet mâle n’existe pas dans ces dernières espèces, ce qui justifie l’utilisation de l’espèce caprine choisie qui est, en même temps, l’espèce modèle et celle à qui s’adressera la technique si celle-ci débouche sur le terrain. Animaux adultes femelles et mâles (pour l'induction des ovulations), donc âgés de deux ans ou plus et qui sont choisis pour être dans la moyenne des âges des chèvres et boucs en production susceptibles, dans les élevages cibles, de recevoir le traitement utilisant la la plante de nos campagnes contenant de la progestérone naturelle.

Trois gavages intragastriques à 24 heures d'intervalle, jusqu'à trois prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, un régime gras et sucré, des antibiotiques dans l'eau de boisson et des isolements répétés pour récolter les fèces. 2 874 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 694 d'entre elles et modéré pour 1 180, après colonisation intestinale par des bactéries associées à la maladie de Crohn. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne rend compte de la complexité d'une réponse immunitaire, tout en décrivant des modèles gut-on-chip disponibles chez des laboratoires collaborateurs qu'il envisage d'utiliser plus tard. Une partie des souris sera tuée pour prélever la rate et l'intestin, d'autres seront gardées comme reproductrices, et celles dont le génotype ne sert pas au projet iront à la formation des manipulateurs ou seront tuées.

Objectifs

Les bactéries pathogènes Escherichia coli adhérentes et invasives (Adherent Invasive Escherichia coli, AIEC) ont été isolées dans l’intestin de patients atteints de la maladie de Crohn mais sont absentes chez les sujets sains. La maladie de Crohn est caractérisée par une dérégulation de la réponse immunitaire au sein de la muqueuse intestinale, notamment des réponses lymphocytaires, conduisant à l’installation d’une inflammation chronique. Ce projet vise à étudier comment les bactéries AIEC pourraient contribuer à initier et/ou à entretenir une réponse lymphocytaire T et/ou B intestinale anormale similaire à celle observé dans la maladie de Crohn. Plus précisément, les objectifs du projet sont les suivants : 1. Etablir dans notre animalerie la lignée de souris nécessaire au projet 2. Tester chez la souris plusieurs modèles de colonisation intestinale par les bactéries AIEC afin de déterminer le meilleur modèle pour l’étude. 3. Caractériser la réponse des lymphocytes B et T aux AIEC dans le modèle choisi, en comparaison avec une E. coli contrôle non-AIEC. 4. Valider les résultats obtenus avec plusieurs autres souches AIEC issues de notre collection. 5. Etudier le rôle de gènes bactériens dans l'induction de la réponse immunitaire pathologique par les bactéries AIEC. 6. Evaluer le potentiel vaccinal d’antigènes-candidats pour limiter la colonisation et la réponse immunitaire pathologique aux bactéries AIEC.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet fera progresser les connaissances sur la physiopathologie de la colonisation par les bactéries AIEC et leur position dans le déclenchement ou l’entretien de l’inflammation intestinale caractérisant la maladie de Crohn. Le rôle de gènes de virulence ou d’antigènes d’intérêt sera également étudié, ce qui permettra d’élucider les mécanismes sous-jacents. A moyen terme, ce projet inclut l’exploration du potentiel vaccinal des antigènes en question : si l’expérimentation confirme un intérêt vaccinal, cela constituerait une preuve de concept pour un projet plus ambitieux en vaccinologie qui portera ses fruits à plus long terme pour les patients. D’une manière générale, quels que soient les résultats, la compréhension des mécanismes de pathogénicité de AIEC à l’échelle moléculaire et cellulaire est indispensable pour identifier de nouvelles pistes de diagnostic et/ou thérapeutiques pour les patients.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront subir les gestes et contraintes suivants (tous les gestes seront réalisés par des personnels formés) : - consommation d'un régime riche en graisse et en sucres provoquant une prise de poids plus rapide. - contentions et gavages intragastriques (stress, éventuellement douleur légère, extrêmement rarement complications septicémiques; trois gavages par animal à 24h d'intervalle) - injection intraveineuse au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie - prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie dans le respect des volumes recommandés (jusqu'à trois prélèvements par animal, espacés d'une semaine au minimum). - injections sous-cutanée ou intramusculaire (administration d’antalgiques pour garantir le bien-être animal dans les cas décrits dans les procédures, essai vaccinal dans la procédure 7). - traitement antibiotique dans l’eau du biberon pouvant provoquer une légère inflammation intestinale associée à une légère perte de poids. - isolement bref (inférieur à une heure) dans une enceinte fermée permettant la collecte de fèces fraîches (répété jusqu'à trois fois par semaine)

Impact sur les animaux

Les gestes et contraintes nécessaires à la réalisation de ce projet peuvent occasionner chez les animaux du stress et une douleur légère (contention, gavage, isolement, injections sous-cutanées ou intramusculaires) voire une douleur modérée (inflammation liée au régime occidental, aux antibiotiques et à l'administration de bactéries; douleur consécutive aux prélèvements au sinus rétro-orbitaire).

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont transgéniques et ne peuvent donc pas être replacés. Les animaux de génotype de non-intérêt mentionnés en procédure 1 seront utilisés pour la formation des manipulateurs (procédure 7) ou euthanasiés. En effet, ces animaux étant transgéniques, il ne sera a priori pas possible de les réutiliser dans d'autres projets. Parmi les animaux de génotype d'intérêt, certains seront utilisés pour l'expérimentation pour obtenir des splénocytes nécessaires aux procédures 2 à 6. Les autres animaux seront conservés comme reproducteurs pour entretenir la lignée. Concernant les procédures 2 à 6, les animaux de génotype de non-intérêt seront soit conservés pour d'autres projets faisant l'objet de leur propre DAP, soit utilisés pour la formation des manipulateurs (procédure 7) soit euthanasiés. Les animaux de génotype d'intérêt générés dans le cadre de ce projet seront soit conservés comme reproducteurs pour une part d'entre eux, soit utilisés dans les procédures expérimentales décrites et mis à mort pour permettre les prélèvements nécessaires pour le projet.

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet : en effet, il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de rendre compte de la complexité d’une réponse immunitaire, qu’elle soit mucosale ou systémique. Si la procédure 5 est réalisée et permet d’identifier des souches bactériennes n’induisant pas la même réponse immunitaire pathologique que la souche de référence AIEC, nous pourrons envisager de tester ces souches dans des modèles de gut-on-chip disponibles dans des laboratoires collaborateurs (Bioaster, Lyon) afin d’établir des corrélats de réponse et de non-réponse dans ce modèle in vitro. A terme, cela pourrait nous aider à nous affranchir du modèle in vivo pour cribler d’autres mutants par la suite, mais pour l’instant nous ne disposons pas de données suffisantes.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué en fonction de la littérature et de l’expertise du laboratoire sur les modèles proposés de sorte à favoriser des résultats fiables et statistiquement significatifs (en particulier, implantation intestinale hétérogène des AIEC justifiant le recours à des lots de 10 animaux). Un maximum de prélèvements seront réalisés sur chaque animal après la mise à mort ; toutefois, certaines analyses prévues requièrent le traitement de l’intestin entier, augmentant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. La procédure 5 ne sera réalisée que si nos travaux en cours ou ceux de nos collaborateurs identifient des gènes d’intérêt : nous prévoyons de limiter les tests aux cinq gènes les plus intéressants, mais il est possible que finalement il n’y ait pas autant de gènes testés. Les procédures 4, 5 et 6 ne seront réalisées que pour les paramètres expérimentaux donnant les résultats les plus significatifs (paramètres identifiés à l’issue de la procédure 3).

Raffinement

L’entretien des lignées transgéniques sera réalisé dans les conditions standard d’hébergement (4 à 7 souris par cage, libre accès à l’eau et à la nourriture, enrichissement par des igloos de cellulose vierge densifiée et apport de matériel de nidification). Pour l’expérimentation, les animaux seront transférés dans des cages ventilées en condition standard. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début du protocole d’infection. Un enrichissement est apporté dans les cages : cachettes en polycarbonate teinté rouge préalablement lavées et stérilisées, et galets de lanières de papier compactées. Le bien-être des animaux sera régulièrement évalué par du personnel formé grâce à une grille de score tenant compte de l'apparence de l'animal, de son poids, des signes d'inflammation digestive et du comportement. La surveillance sera quotidienne et les animaux seront pesés chaque jour à partir du début de l'expérimentation. Des mesures simples telles que le dépôt de croquettes directement dans la cage ou le changement de biberon pour un biberon à tétine longue pourront être prises en cas de signes de douleur abdominale chez certaines souris. Un animal présentant un score alarmant recevra un traitement contre la douleur. Si le score atteint le point limite, les souris seront euthanasiées immédiatement (selon l’avancement de l’expérimentation, des prélèvements pourront être réalisés juste avant la mise à mort sous anesthésie et/ou en post-mortem).

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est lié à cinq paramètres essentiels : - Existence des lignées transgénique nécessaire au projet - Modèle validé pour étudier les réponses immunitaires - Disponibilité des outils moléculaires pour cette espèce (anticorps, cytokines recombinantes…) - Importance des données bibliographiques déjà publiées sur la réponse immunitaire mucosale - Importance des données déjà acquises par notre laboratoire sur l'infection des souris par les AIEC La maladie de Crohn est une pathologie se déclarant chez le jeune adulte (pic de diagnostic entre 15 et 30 ans). En conséquence, nous utiliserons les souris à un âge équivalent. Pour les souris sous régime alimentaire conventionnel, les expérimentations débuteront sur des animaux âgés de 6 semaines (5 semaines + 1 semaine d’acclimations) et pourront se poursuivre jusqu’à l’âge de 10-11 semaines (pour les plus longs temps post-infection). Pour les souris sous régime riche en graisse et en sucre, le régime sera donné à l’âge de 4 semaines, le protocole d’infection débutera à l’âge de 10 semaines et pourra se poursuivre jusqu’à 14 semaines pour les plus longs temps post-infection.