Procédures légères

336 000 souris et 12 600 rats, quinze secondes de contention chacun : voilà l'échelle du génotypage par poinçon d'oreille demandé pour cinq ans dans un seul établissement. Ces 348 600 rongeurs, dont certains âgés de dix jours, subissent le prélèvement d'un morceau d'oreille sur animal vigile, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec une douleur brève et un risque d'infection du site. Aucun calcul d'effectif n'accompagne la demande, le porteur se fondant sur ses chiffres de production des cinq dernières années. Les animaux restent vivants à l'issue et rejoignent d'autres projets ou les colonies d'élevage, ceux dont le génotype ne convient pas étant tués, en nombre que le porteur ne chiffre pas.

Objectifs

Les animaux transgéniques des élevages de souris génétiquement modifiés doivent être génotypés afin de pouvoir être utilisés dans les projets de recherche préalablement autorisés. L’objectif de ce projet est de décrire le prélèvement nécessaire pour le génotypage, au sein de notre structure. Cette demande couvrira l’élevage de toutes les lignées élevées au sein de notre établissement en dehors des projets de recherche. Les thématiques/domaines de recherche de l’établissement concernent la pathophysiologie des organes, la cancérologie, l’immunologie et le métabolisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont d’assurer une bonne traçabilité des animaux, connaître leur génotype pour les intégrer dans les projets de recherche validés. Ce projet nous permettra d’identifier génétiquement de façon correcte et efficace les animaux de notre établissement. Cette traçabilité nous aidera à maintenir un élevage raisonné en identifiant génétiquement au plus vite et efficacement les animaux d’intérêt.

Procédures

Tous les animaux issus de nos élevages transgéniques internes seront soumis à un poinçon d’oreille afin d’assurer son identification génétique. Cet acte est effectué sur animal vigile par simple contention manuelle et dure 15 secondes par animal (couplé à l'identification de l'animal - hors champ).

Impact sur les animaux

Tous les animaux seront soumis, vigiles, à une contention pour le prélèvement d’un bout d’oreille (à l’aide d’un poinçon d'oreille). Une légère et brève douleur au moment du prélèvement est envisagée. Le site de prélèvement peut s’infecter. La manipulation des animaux peut induire un stress.

Devenir

Les animaux seront en vie à la fin de la procédure. Les animaux maintenus en vie seront soit inclus dans les projets préalablement autorisés (utilisation continue) soit conservés pour l’entretien des colonies. Les animaux avec un génotype non souhaités seront euthanasiés (nombre non défini avec précision car dépendant des naissances).

Remplacement

Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes artificiels, un système vivant est nécessaire dans de nombreux projets de recherche, car à l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs environnementaux rentrant en jeu. Un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable. L’utilisation des animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet. Nous avons besoin de réaliser cet acte de génotypage in vivo chez la souris et le rat afin de pouvoir utiliser ces animaux. Cette procédure ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas d’autres possibilités pour identifier génétiquement un animal au sein d’un établissement.

Réduction

Basé sur les données de production des dernières 5 ans au sein de notre établissement, ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 336.000 souris et 12.600 rats sur 5 ans. Les élevages seront raisonnés afin d’éviter la naissance d’animaux non utilisés dans les projets. Compte-tenu de la nature du projet, il n’y aura pas de calculs de puissance et/ou de tests statistiques appliqués à la présente demande. La biopsie sera couplée à une identification individuel effectué par puçage réalisés lors de la même contention. Il est important de préciser que bien que l'identification soit hors champ d'application, le choix de la méthode revêt une importance dans un contexte de réduction. En effet, nous utilisons des puces électroniques afin de ne pas avoir de redondance dans les numéros et de pouvoir assurer une meilleure traçabilité (2 animaux ne peuvent pas avoir la même numérotation). Ce système évite les risques d’erreur qui pourrait entrainer l’éventuelle euthanasie d’un animal mal identifié. La lecture du numéro est facile, rapide et sans risque d’erreur et ne nécessite pas l’utilisation d’un schéma d’identification qui pourrait éventuellement varier d’une animalerie à l’autre.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, maisonnettes, ou bâtons à ronger, etc). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Le comportement général des animaux sera suivi. A la moindre anomalie qui est observée un suivi et des conseils sont données par la structure chargée du bien-être animal (SBEA) de manière à assurer une prise en charge rapide et optimale des animaux. Des points limites sont définis et sont respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux notamment en ce qui concerne le nombre de portées par femelle et le temps de reproduction des géniteurs. Le prélèvement tissulaire est réalisé au même moment que l’identification pour limiter le nombre de manipulations des souriceaux. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un re-prélevèment est demandé sur un adulte pour une vérification de son génome, sa légitimité sera vérifiée par le personnel de la structure. De plus, le personnel impliqué est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’élevage et expérimentation animale. Au sein de notre animalerie, le génotypage était réalisé sur un échantillon de queue, nous avons changé pour un prélèvement d’oreille considéré moins impactant pour l’animal. Actuellement, d’autres techniques sont testées pour un génotypage moins invasif (comme avec les poils), mais les résultats actuels ne nous permettent pas de remplacer la technique éprouvée utilisée en routine.

Choix des espèces

Le choix de la souris et du rat se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques: - Notre centre de recherche utilise des rongeurs (souris, rats) ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris et le rat sont les animaux de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ces types d’animaux et nous avons acquis une pratique expérimentale sur ces espèces. Les animaux seront utilisés à partir de 10j afin de minimiser l’impact de la procédure.

Sédatés à distance au moyen d'une perche, anesthésiés vingt à quarante-cinq minutes, équipés d'une balise collée sur la fourrure, 20 phoques crabiers subissent une prise de sang de 18 millilitres et le prélèvement d'une vibrisse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit que l'anesthésie à distance comporte plus de risques de surdosage ou de sous-dosage que la contention, mais qu'elle stresse moins l'animal, le phoque crabier étant décrit comme agressif et difficile à maintenir. Les balises resteront en place huit à onze mois, jusqu'à tomber avec la mue, sans recapture. Les animaux sont relâchés dans leur habitat une fois équipés, pour documenter la distribution du krill dans une zone que des navires norvégiens et chinois commencent à convoiter.

Objectifs

Les zones englacées sont particulièrement sensibles au réchauffement global. Pour prédire la capacité d’adaptation de prédateurs dépendant de la banquise dans ce contexte de changement climatique dans les différentes régions antarctiques, il est important de déterminer au préalable comment ils utilisent leur environnement physique et biologique. Ces prédateurs consomment de grandes quantités de ressources marines, parmi lesquelles le krill (Euphausia superba) occupe une place prépondérante. Cette espèce — dépendante de la banquise pour son développement larvaire — consomme du phytoplancton et est consommée par des prédateurs, elle assure ainsi une large part du transfert de carbone des producteurs primaires (vivant sous la banquise) vers les maillons trophiques supérieurs. Les futurs changements de l’étendue de la banquise antarctique dans un climat plus chaud pourraient affecter de manière négative les populations de krill, et par conséquence celles de leurs prédateurs. Toutefois, l’évolution future de l’ensemble du réseau trophique reste difficile à prévoir tant la compréhension des différentes composantes de l’écosystème antarctique et de leurs interactions est incomplète, voire approximative. A titre d’exemple, la connaissance de la distribution et de l’abondance du krill en hiver ainsi que des zones d’alimentation des prédateurs du krill sont à ce jour très limitées, notamment dans les régions encore peu touchées par les variations de la banquise, telles que l’Antarctique de l’Est. En effet, les études dans ces zones englacées sont difficiles car peu accessibles. Le présent projet a pour but de combler ce déficit de connaissances, en étudiant l’écologie des phoques crabiers et des écosystèmes dans lesquels ils évoluent, ainsi que de documenter l’évolution au cours du temps de ces systèmes et prédire le devenir des populations de ce prédateur marin. Les phoques crabiers sont les plus grands consommateurs de krill (60 à 70 millions de tonnes de krill par an) et les plus abondants au monde (7 à 30 millions), ainsi les changements dans son écologie, sa distribution et son comportement reflètent les changements dans la population de krill de l’Antarctique. Grâce à des techniques de bio-télémétrie, on enregistre les plongées des phoques, les phases d'accélération et leur position, on pourra déterminer les zones d’alimentation clés et la distribution du krill très importante pour l’écosystème.

Bénéfices attendus

Ces résultats appuieront la consolidation de la base scientifique d'une gestion écosystémique de la pêche au krill par la Commission pour la conservation de la faune et la flore marines de l'Antarctique. En effet, il n'y a pour le moment pas de pêche significative de krill dans l'Antarctique de l’Est, mais des notifications récentes de navires norvégiens et chinois suggèrent un intérêt croissant de l'industrie pour cette région et pour cette ressource. Cette étude permettra la mise en place d'une surveillance sur la distribution du krill et des zones d'alimentation des prédateurs du krill en l'absence de pression de pêche afin d'anticiper les éventuelles menaces pour l'écosystème centré sur le krill. Ce projet remplira de fait 1) un des objectifs du programme de contrôle de l'écosystème de la Commission pour la conservation de la faune et la flore marines de l'Antarctique, c'est-à-dire distinguer les changements dus à l'exploitation des ressources marines des changements dus à la variabilité environnementale. Ce projet contribuera également à 2) "l'évaluation des risques" dans la zone afin d'essayer de comprendre l'impact possible de la pêche sur l'écosystème. Enfin les modèles d'habitat du krill utilisés pour élaborer les projections des populations de krill et les stocks comportent des limitations spatiales et temporelles importantes et connues en raison du manque de données disponibles, en particulier pendant la saison hivernale. Cette recherche fournira 3) des informations sur la distribution et l'abondance de cette espèce sous la glace de mer et pendant l'hiver, mais aussi sur son importance cruciale pour ses prédateurs, les phoques crabiers (dans le cadre de ce projet) et les relations fonctionnelles qu'ils entretiennent, en surveillant les changements dans les interactions trophiques.

Procédures

Les interventions sur les phoques crabiers se feront après la période de mue entre février et avril 2025, 20 individus maximum seront équipés et garderont leur balise entre 8 à 11 mois jusqu'à la mue suivante ou jusqu’à ce que la balise se décolle. On procèdera à une sédation sans contention à l’aide d’une perche (10 à 20 min), puis une anesthésie (20 à 45 min) durant laquelle aura lieu l’équipement de l'appareil (contenant l'accéléromètre, le capteur de profondeur, de température et le système de localisation via Argos) par collage sur la fourrure, ainsi qu’une prise de sang (18 ml une fois) et le prélèvement d'une vibrisse pour étudier le régime alimentaire des phoques crabiers (utilisation des isotopes stables du carbone et de l'azote par analyse chimique). Le matériel tombera à la mue sans recapture de l’animal.

Impact sur les animaux

L’induction de l’anesthésie sera faite à l’aide d’une perche à proche distance de l’animal mais sans contention donc les phoques subiront un stress de courte durée durant la procédure (~3 min). L’anesthésie à distance présente plus de risques chez certaines espèces de phoques que la contention et l’injection par voie intra- veineuse or, le phoque crabier est un animal agressif et sa contention est particulièrement difficile ; elle rallongerait le temps de stress auquel l’animal est exposé. Il existe des risques plus fréquents de surdosage ou sous dosage mais la procédure est en revanche moins stressante pour l’animal. La prise de sang et le prélèvement de vibrisse auront lieu durant l'anesthésie de l'animal et n'auront pas d'effet significatif sur l'animal (prélèvement de 0,036% du volume sanguin d’un individu de 300 kg et repousse de la vibrisse prélevée). Les instruments sont collés sur la tête à l’aide de colle epoxy bi-composants selon un protocole éprouvé. Nous nous attendons à ne pas observer d’effet mesurable des instruments sur le comportement alimentaire des phoques car il a été montré qu’une caméra de section deux fois plus grande que celle utilisée ici n’avait pas d’impact significatif sur la durée moyenne des plongée, la dépense énergétique, et la fréquence des mouvements de nage des phoques de Weddell. De plus, lors d’une autre étude qui a comparé le gain de masse et le taux de survie d’éléphants de mer équipés et non équipés, aucun effet de la pose, même répétée, d’équipement n’a été détecté. Enfin une étude récente de l’effet de la pose d’instruments sur des phoques de Weddell et des éléphants de mer par la méthode de la colle epoxy a montré que cette dernière n’avait pas d’impact biologique détectable sur les animaux.

Devenir

Les individus étudiés seront libérés dans leur habitat naturel une fois équipés, le matériel sera récupéré à distance sans recapture. Application de la règle des «trois R».

Remplacement

L’objectif étant d’étudier le phoque crabier et son écologie en mer dans leur milieu naturel, il ne peut pas être remplacé par une autre espèce, par des animaux d’élevage, ou encore par des expérimentations en captivité. Le phoque crabier a seulement fait l'objet d'une étude dans cette zone de l'Antarctique et on ne peut donc pas le remplacer par une autre espèce.

Réduction

La réduction est appliquée, puisque le nombre d’animaux capturés est limité à un nombre maximum de 20 individus (objectif autour de 15 individus) pour une campagne dû aux contraintes des déploiements à bord d'un brise-glace (déploiement du personnel sur la banquise pendant une durée limitée pour laquelle les conditions météorologiques doivent être optimales). Ce nombre correspond à 20 individus sur un effectif total de la population de phoques crabiers en Antarctique estimée à ~7 à 30 millions. L'estimation statistique de nombre d'individus nécessaires pour comprendre les variations de leur comportement en fonction des variations de la distribution du krill n'est pas envisageable, car l'effet mesuré est variable et se caractérise par des changements d'habitats ou de stratégies d'alimentation pas toujours facilement quantifiables, et nous ne savons pas en avance les comportements que nous allons observer. Dans un schéma idéal, nous souhaiterions avoir le plus de déploiements possibles (avec des stades d'âge et sexes différents) pour avoir le plus de diversité dans les relations entre l'écologie en mer de ces animaux, leur proie (le krill) et les conditions environnementales. En revanche nous essayons d'équiper le plus d'animaux possibles en prenant en compte les contraintes climatiques extrêmes du terrain, la disponibilité des animaux, les contraintes liés à leur cycle de vie (phase sur la banquise, lactation, mue) et les coûts très importants des instruments. Nos analyses multivariées à effets mixtes ne visent pas à comparer les sexes ou les stades d'âge, et le nombre d'individus défini est suffisant pour diversifier les traits individuels car chaque individu « bio- échantillonnent » leur environnement dans plusieurs zones différentes.

Raffinement

Les points limites de la procédure et leur raffinement sont les suivant: 1) L’état général de l’animal est évalué avant sa capture (embonpoint, absence de malformation et de plaie) ; 2) Stress lié à la capture : l'animal est anesthésié à distance à l'aide d'une perche, le stress est minimisé et la contention est absente ; 3) Surveillance de l'anesthésie: les paramètres cardiaques et respiratoires de l’individu sont surveillés ainsi que le degré d’anesthésie: protocole de gestion de complications éventuelles lors de l’anesthésie joint à cette demande. 4) Récupération du matériel : pas de récupération possible dans la zone de banquise dite dérivante avec le brise-glace (les animaux sont constamment en mouvement), les balises tomberont avec le poil des phocidés au cours de la période de mue l'année d''après qui se déroule entre janvier et février. 5) Taille de l'instrument : Nous nous attendons à ne pas observer d’effet mesurable des instruments sur le comportement alimentaire des phoques car il a été montré qu’une caméra de section deux fois plus grande que celle utilisée ici n’avait pas d’impact significatif sur la durée moyenne des plongée, la dépense énergétique, et la fréquence des mouvements de nage des phoques de Weddell. De plus, lors d’une autre étude qui a comparé le gain de masse et le taux de survie d’éléphants de mer équipés et non équipés, aucun effet de la pose, même répétée, d’équipement n’a été détecté. Enfin une étude récente de l’effet de la pose d’instruments sur des phoques de Weddell et des éléphants de mer par la méthode de la colle epoxy a montré que cette dernière n’avait pas d’impact biologique détectable sur les animaux.

Choix des espèces

Ce projet vise à améliorer notre compréhension de l’écologie des phoques crabiers et des écosystèmes dans lesquels ils évoluent, ainsi que de documenter l’évolution au cours du temps de ces systèmes et prédire le devenir des populations de ce prédateur marin. Les phoques crabiers sont les plus grands consommateurs de krill (60 à 70 millions de tonnes de krill par an) et les plus abondants au monde (7 à 30 millions), ainsi les changements dans son écologie, sa distribution et son comportement reflètent les changements dans la population de krill de l’Antarctique. Grâce à des techniques de bio-télémétrie, on enregistre les plongées des phoques, les phases d'accélération et leur position, on pourra déterminer les zones d’alimentation clés et la distribution du krill très importante pour l’écosystème. Cette procédure concerne des animaux adultes car ce sont les individus présents sur la banquise, les juvéniles sont plus fréquemment en mer jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade reproducteur.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Entre le septième et le dixième jour de vie, chaque souriceau a une phalange amputée aux ciseaux, en une dizaine de secondes, avec un point de compression en cas de saignement, à la fois pour l'identifier et pour le génotyper. Ces souris naissent dépourvues de lymphocytes T, et leur rate est prélevée pour fournir des cellules à des expériences menées in vitro. Le porteur écrit qu'"aucune nuisance n'est décrite ou attendue", l'amputation intervenant à un âge où les fibres nerveuses ne sont pas myélinisées, ce qui selon lui "minimise très fortement le risque potentiel de douleur".

Objectifs

Les lymphocytes T participent activement dans la défense de notre organisme contre des pathogènes. le pathogène est présenté par des cellules spécifiques qui possèdent une dizaine de molécules co-stimulatrices, qui ne peuvent pas être récapitulées par des approches in vitro. L'objectif de notre projet est de récupérer les cellules présentatrices à partir de rate de souris ne possédant plus de lymphocytes T et les utiliser dans des expériences d'activation de lymphocytes T normaux ou mutés in vitro. Cela permettra de 1) d'avoir une source "pure" de cellules présentatrices d'antigène et 2) de fournir toutes les molécules co-stimulatrices nécessaires à une activation optimale de lymphocytes T.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre les mécanismes qui contrôlent l'activation et la polarisation des lymphocytes T, acteurs principaux dans le développement de pathologies autoimmunes et inflammatoires. Cela permettra d'établir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.

Procédures

La technique d'identification utilisée actuellement dans notre EU est la phalangectomie. Cette procédure est la seule technique permettant d'assurer l'identification des animaux et également de les caractériser génétiquement en une seule étape. Cette procédure sera réalisée entre les 7ème et 10ème jours postpartum, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées, conformément aux recommandations de la CNREEA. L'amputation s'effectue en une dizaine de secondes et sera réalisée par du personnel dument formé et habitué à ces gestes à l'aide d'une paire de ciseau aiguisé suivi d'un point de compression en cas de saignement.

Impact sur les animaux

De par les conditions d'hébergement optimale, aucune nuisance n'est décrite ou attendue pour les souris en animalerie EOPS ou conventionnelle. Cependant, comme les animaux ne possèdent plus de cellules T, ils seraient susceptibles de développer des infections si les conditions d'hébergement ne sont pas adéquates, ce qui n'est pas le cas dans les conditions d’hébergement que nous leur offrons. Pour la phalangectomie, une douleur de courte durée pourrait survenir. Cependant, le prélèvement d'effectuant entre le 7ème et le 10ème jour, un stade où les gaines de myéline ne sont pas encore mises en place chez ces animaux, ce qui ne permet pas la transmission d'influx nerveux et minimise donc très fortement le risque potentiel de douleur.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement d'organe

Remplacement

À l'état physiologique, l'activation optimale des lymphocytes T par les cellules présentatrices d'antigène met en jeu une dizaine de molécules de co-stimulation. In vitro, il n'est pas possible de mimer la stimulation de toutes ces molécules en même temps. C'est pourquoi il est nécessaire d'utiliser les cellules présentatrice d'antigène issues d'animaux. Il est donc impossible de remplacer l'utilisation d'animaux dans ce projet. Néanmoins, au cours de notre expérimentation, nous nous réservons la possibilité d'employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible afin de limiter au maximum l'utilisation d'animaux.

Réduction

Le but de ce projet est d'élever des animaux afin de purifier des cellules spécifiques de la rate pour des études d'activation de lymphocytes T in vitro. Le nombre d'animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre nos objectifs. Au total, 420 souris seront utilisées sur 5 ans.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans une zone d'élevage spécifique seulement accessible par des zootechniciens. Cette zone protège les animaux de pathogènes spécifiques. Les animaux sont élevés dans des cages ventilées, avec de l'eau et de la nourriture à volonté. Des barrières physiques bloquent l'entrée de pathogènes et des contrôles sanitaires sont effectués régulièrement sur animaux sentinelles afin de s'assurer qu'aucune contamination par des pathogènes éventuels ne soit en cours. Aucun phénotype dommageable n'est décrit dans la littérature et attendu dans cette zone d'élevage spécifique. Afin de récupérer la rate, les animaux seront transférés dans une animalerie au statut sanitaire conventionnel. Les animaux seront élevés en groupe, dans des cages ventilées avec le matériel nécessaire pour qu'elles créent leur nid et leur permettre des conditions d'hébergement optimales. Un suivi règlementaire quotidien sera effectué. Dans ces conditions d'hébergement, nous n'attendons aucun phénotype dommageable.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris se rapproche de l'Homme, ce qui permet de travailler dans un modèle de référence pour l'étude des cellules T et de certaines pathologies comme les maladies auto-immunes associées à une dérégulation des cellules T. Pour ces raisons, les souris représentent un modèle de référence dans l'étude des mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des maladies auto-immunes, ce qui est l'objet de notre recherche. accouplement : Les animaux seront utilisés de 7 à 40 semaines maximum (âge maximum auquel nous avons observé qu'ils ne font plus de portées). élevage : Certaines fonctions des cellules présentatrices d'antigène peuvent être altérées pendant le vieillissement. Pour s'assurer que ces cellules, que nous utiliserons, ne subissent pas de modifications de leurs fonctions, nous utiliserons des animaux entre 4 et 15 semaines, ce qui correspond à un âge jeune à adulte.

Pour comprendre comment la température fait basculer le sexe des poissons, 920 poissons zèbres sont élevés à des températures modifiées puis tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur ne décrit ni chirurgie ni prélèvement sur animal vigile : les atteintes tiennent à l'enrichissement limité, à la vie en milieu contraint et aux variations de température imposées. Les individus sont analysés à cinq stades, de l'œuf fécondé au poisson adulte de 135 jours, pour établir le sex-ratio de chaque groupe. La mise à mort sert à cette détermination et à constituer une banque d'échantillons, dans un projet rattaché à la protection de l'environnement naturel.

Objectifs

Bien que le sex-ratio représente un paramètre démographique simple et basique, il fournit une information essentielle sur le futur potentiel reproducteur d'une population et donc, sur sa viabilité. Chez la plupart des espèces, le sex-ratio est approximativement de 1:1 (ie autant de mâles que de femelles). Cependant, ce dernier peut être biaisé sous l’effet de facteurs environnementaux. Depuis plusieurs décennies les scientifiques alarment sur le fait que le changement global entraine des biais dans les sex-ratios des populations. L’exemple le plus frappant est celui de la température chez les tortues. Chez la plupart des tortues, la détermination sexuelle (le fait de devenir mâle ou femelle) est dépendante de la température d'incubation des œufs. En-dessous d’un certaine température d'incubation, des bébés mâles sortent de leurs œufs ; au-delà, ce sont des bébés femelles. Ainsi, avec le réchauffement climatique, on observe une féminisation progressive des populations de tortues et on estime que d’ici 2100, le sex-ratio de certaines populations atteindra 93 % de femelles, ce qui risque de mener à l’extinction de l’espèce. Si l’on suspecte que beaucoup de facteurs peuvent agir sur la détermination sexuelle et biaiser les sex-ratios des populations chez les reptiles, amphibiens et poissons, les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Comprendre ces mécanismes revêt une importance cruciale et constitue un défi de longue date en biologie avec des implications importantes pour les populations et la biodiversité. Nous avons récemment mis en évidence chez le poisson zèbre (Danio rerio) que la température, les radionucléides ou le cadmium (un métal non essentiel issu de l’extraction minière) peut entrainer de manière directe ou à la génération suivante des biais importants dans le sex-ratio des populations. Le présent projet a pour objectif d’apporter des données nouvelles sur le déterminisme sexuel sous influence environnementale chez cette espèce en étudiant plus particulièrement les effets d’une hausse des températures et en étudiant à la fois les effets directs et transgénérationnels. L’objectif à terme sera de développer un outil moléculaire (basé sur des modifications épigénétiques) permettant d’apprécier l’effet de divers facteurs en lien avec l’activité humaine (réchauffement, pollution chimique, lumineuse ou sonore, …) sur la détermination sexuelle et le sex-ratio des populations en utilisant le danio comme modèle de poisson.

Bénéfices attendus

Les preuves s’accumulent pour démontrer que le changement global affecte le sex-ratio des populations sauvages de poissons, reptiles et amphibiens, fragilisant et menaçant ainsi le futur des espèces. Si de nombreux facteurs environnementaux ont été identifiés comme affectant le processus de différentiation sexuelle (ie le fait de devenir mâle ou femelle), les mécanismes biologiques sous-jacents demeurent largement inconnus. Les résultats obtenus permettront d’acquérir des données nouvelles et originales sur (i) l’impact de l’environnement dans le processus de différentiation sexuelle chez les poissons (ie le fait qu’un poisson devienne mâle ou femelle au cours de son développement précoce), (ii) l’évolution des mécanismes impliqués dans la différentiation sexuelle et (iii) sur comment l’expérience environnementale vécue par les parents peut affecter le sex-ratio de leur descendance (appelé sex-ratio à la naissance et qui correspond à la proportion de mâles et de femelles dans une ponte). In fine, la compréhension des mécanismes impliqués dans le sex-ratio à la naissance permettra le développement d’outils moléculaires permettant d’évaluer et prédire l’impact des facteurs environnementaux, notamment une hausse des températures et des contaminants, sur le sex-ratio des populations (effet reprotoxique et perturbateur endocrinien). Alors que la majorité des outils utilisés à l’heure actuelle pour évaluer l’impact des activités humaines sur l’environnement ne donnent que peu d’indications sur l’état de santé des animaux et reflètent une exposition/effet à un instant donné, un tel outil permettrait (i) de relier un évènement moléculaire à un effet à l’échelle de l’individu (sexe) et de la population (sex-ratio), un défi de longue date en biologie et (ii) d’évaluer de potentiels effets transgénérationnels, ie effets à long terme sur les populations (en rupture par rapport aux approches classiques).

Procédures

Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de procédure chirurgicale

Impact sur les animaux

Enrichissement limité, Vie en milieu contraint, Variation de la température

Devenir

L'ensemble des individus seront euthanasiés à l'issue de l'expérience pour analyse, détermination du sex-ratio des populations et création d'un banque d'échantillons.

Remplacement

Le présent projet a pour objectif majeur de développer des outils permettant d’évaluer et prédire l’effet de divers facteurs environnementaux (une hausse de la température étant étudié comme facteur masculinisant) sur le processus de détermination sexuelle chez le poisson et conjointement sur le sex-ratio des populations ainsi que de comprendre et décrire les mécanismes moléculaires sous-jacents. Un tel projet ne peut s’effectuer sur des modèles in vitro.

Réduction

Le sex-ratio pouvant fortement varier d’une famille à une autre (effet génétique) et d’un aquarium à un autre (effet environnemental), notre étude nécessite de recourir à au moins 3 aquariums et 3 familles par condition expérimentale pour obtenir des résultats scientifiquement pertinents et statiquement exploitables. Par ailleurs, une augmentation de la température entrainant une masculinisation de la population (90 % des poissons élevés à la plus forte température seront des mâles), le nombre de poissons utilisé correspond au minimum d’individus nécessaires pour obtenir un nombre suffisant de femelles matures pour assurer les analyses ( n = 6 par condition) et la reproduction.

Raffinement

La qualité de l’eau est un point fondamental pour assurer le bien-être des poissons. Les conditions d’élevage seront optimales. Chaque aquarium sera équipé d’une pompe assurant la filtration mécanique et biologique. La température et le pH seront suivis quotidiennement. Le bullage dans les unités sera contrôlé visuellement et quotidiennement. Les individus seront nourris 3 fois par jour afin de nourrir les poissons ad libitum tout en conservant une bonne qualité de l'eau (en évitant l'accumulation de nourriture non consommée dans les aquariums). En accord avec les préconisations et les études réalisées chez le poisson zèbre, l’enrichissement reposera sur (i) le maintien des individus en groupe (le danio étant un poisson grégaire), (ii) l’utilisation de photos de graviers placés sous les aquariums afin de créer un substrat et (iii) l’utilisation d’aliments vivants (les animaux seront nourris quotidiennement avec des artémies vivantes). Pendant toute la durée de l’expérimentation, des observations quotidiennes permettront de suivre l’état de santé des individus. Les potentielles atteintes au bien-être des animaux seront évaluées par des modifications comportementales et physiques en utilisant une grille de score. Dans le cas où les animaux présenteraient des signes de stress, la fréquence des observations serait augmentée. Dans le cas où plusieurs individus seraient affectés en même temps, un vétérinaire serait immédiatement contacté. En cas de signe de souffrance ou de prolongement de comportements anormaux, les individus seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le poisson zèbre (Danio rerio) est utilisé comme modèle biologique en recherche depuis de très nombreuses années. Ainsi, il existe beaucoup de littérature et de protocoles disponibles pour assurer son élevage et le maintien du bien-être des animaux. Dans le cas particulier de notre projet, les avantages du Danio sont : (i) il présente une fécondité élevée, un temps de génération rapide (3,5 mois) et une petite taille (3.5 cm à l’âge adulte), ce qui en fait un modèle idéal pour des études transgénérationnelles ; (ii) il possède un génome complètement séquencé et de haute qualité, ce qui en fait un modèle idéal pour des études de génétique et d’épigénétique et (iii) il est facile d'identifier le sexe des individus par des caractères sexuels externes à l'âge adulte ce qui en fait un modèle idéal pour des études sur la détermination du sexe. Pour répondre à nos objectifs de recherche, des individus adultes mâles et femelles ainsi que des juvéniles (sexe encore non établi) seront étudiés. En effet, chez le danio, l’ensemble des individus sont initialement femelles et présentent des ovocytes non matures de l’âge de 11 à 21 jours (post fertilisation). Entre les jours 21 et 50, en fonction de la génétique, de l’environnement ou de l’expérience environnementale vécue par les parents, ces ovocytes vont, soit se maintenir, soit dégénérer, permettant le développement de spermatozoïdes et donc de mâles. Après le 50ème jour de vie, le sexe est fixé et tout inversion est impossible. Afin de balayer la période de détermination sexuelle (appelée fenêtre critique), les individus seront analysés à J0 (œufs fécondés, pour analyser la relation parents-enfants), J18 (juvéniles femelles), J25 (début de la différentiation sexuelle), J40 (juvéniles mâles ou femelles) et J135 (adultes matures mâles et femelles).

Capturés dans la rivière où ils vivent, 150 truites et 250 anguilles, chevesnes et vandoises vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis remis à l'eau. Chacun reçoit une marque RFID implantée dans la cavité ventrale par une incision au scalpel d'une à deux minutes, sans que l'anesthésie employée soit précisée. Le suivi doit établir si deux passes à poissons récemment construites sont franchissables, un maître d'ouvrage et des riverains attendant de constater le gain écologique des travaux. Le porteur prévoit de tuer par surdosage d'anesthésiant tout poisson qui, dix minutes après le marquage, ne retrouve ni respiration régulière ni nage stable.

Objectifs

L'objectif du projet est de suivre par télémétrie passive RFID (marquage de poissons avec des petits tags sans batterie, qui sont détectés individuellement lors du passage dans une antenne) un contingent de poissons marqués, afin d'évaluer l'efficacité (franchissement) de passes à poissons (dispositif permettant aux poissons effectuant des migrations dans les rivières, de contourner ou franchir un obstacle comme un barrage ou un seuil, afin d’atteindre l’amont de la rivière pour grandir et/ou se reproduire) récemment aménagées dans une rivière.

Bénéfices attendus

La conception et la réalisation des passes à poissons à mobiliser d'énormes moyens et suciter l'intérêt des habitants des communes concernées. Aujourd'hui, les travaux sont terminés et l'ensemble des parties prenantes (riverains, maître d'Ouvrage, services de l'état, police de l'environnement) souhaite pouvoir constater l'efficacité réelle de ces dispositifs, et ainsi acter le gain écologique permis grâce à la réaliser de ces travaux ambitieux. L'observation de bons taux de franchissement par les poissons marqués permettra de confirmer la fonctionnalité des dispositifs et servira de "vitrine" pour la réalisation de projets similaires dans la Région, l'efficacité de ces derniers étant parfois contestés sans réels fondements.Les deux dispositifs de franchissement étudiés sont aménagés sur un linéaire d’environ 350 m : 1/Une passe à ralentisseurs d’une longueur de 7,80 m et 2/ Une passe à bassins successifs d’une longueur de 87 m et composée de 25 bassins Ces deux dispositifs ont été conçu pour correspondre théoriquement aux exigences de franchissement des différentes espèces piscicoles étudiées (capacité de saut, vitesse de sprint, vitesse d’endurance), cependant on s’aperçoit couramment grâces aux suivi télémétrique (de type RFID comme celui qui va être mis en place) qu’elles restent parfois sélectives. Des reprises d’aménagement peuvent alors être suggérées pour optimiser leur fonctionnalité (gestion des débits entrants, concentration de l’attractivité, reprise de génie civil…).

Procédures

Marquage intra-ventrale par inscicion au scalpel. Une seule fois par poisson. La durée de la chirurgie est estimée entre 1 et 2 min maximum.

Impact sur les animaux

La marque PIT-tag est relativement petite mais reste intrusive car implantée dans la cavité ventrale. Ce sont des marques biocompatibles totalement conçues pour ce type de marquage. Le poisson marqué doit respecter un poids minimal en fonction du poids du tag, afin de s’assurer qu’aucune modification comportementale ne sera susceptible d’entrainer des biais.Le poids du tag ne doit pas dépasser 2% du poids du poisson. Le dépassement du poids d’une marque supérieure à 2% du poids total du poisson peut entrainer des modifications comportementales (inhibition de la migration, de la reproduction) et/ou affecter les capacités de nage de l’individu.

Devenir

Poissons remis en liberté dans la rivière pour pouvoir réaliser le projet (étude de la franchissabilité des passe à poissons).

Remplacement

Afin d'étudier les espèces cibles (poissons concernés par le besoin de migration entre l'aval et l'amont sur la rivière), il est nécessaire d'étudier directement les espèces présentes dans le milieu. Chaque espèce cible doit être étudiée, car chacune posséde ses propres capacité de franchissement des dispositifs (vitesse de sprint, capacité de saut...).

Réduction

Afin d'optimiser le nombre de poissons marqués, nous nous sommes inspirés d'autre suivi télémétriques réalisés par notre bureau d'études, ou des partenaires. Il ressort ainsi qu'en fonction des suivis, 20 à 40% des poissons marqués franchissent les dispositifs de montaison si ces derniers sont fonctionnels. Ainsi, afin d'obtenir un échantillon statistiquement robuste de 30 truites et 30 anguilles franchissant, nous avons fixé un objectif de 150 poissons pour ces espèces (objectif de 20% de "migrants"). Pour les chevesnes et les vandoises, cet objectif a été revu à la baisse (50 poissons) car il s'agit ici d'espèce accompagnatrices jugées non prioritaires, mais pertinentes pour enrichir l'analyse de la franchissabilité des différentes passes.

Raffinement

Afin d'optimiser la méthodologie de marquage, nous avons choisi d'utiliser des PIT-tag de 23mm, alors qu’il existe des tags plus intrusifs mais avec une meilleure détectabilité par les antennes. Nous considérons que le gain de détectabilité par les antennes est négligeable au regard du poids et de la taille supplémentaire de tag à supporter par les poissons. Nous avons optimisé notre atelier de biométrie/marquage/réveil afin de garantir que les poissons seront manipulés le moins de temps possible, afin qu'il puisse rejoindre la rivière au plus vite. Nous utilisons également des dispositifs de viviers obscurci avec couvercle, afin de limiter le stress des poissons au maximum. Des opérateurs aguerris à la prise de note et à la gestion des poissons seront affectés à l’assistance des opérateurs responsables du marquage des poissons. En cas de difficulté de reprise d’activité comportementale normale d’un poisson dans le vivier après marquage au-delà de 10 minutes (pas de reprise régulière d’activité operculaire, incapacité du poisson à retrouver un comportement de nage régulier, à se tenir droit sans basculement sur le flanc), une mise à mort par surdosage progressif d'anesthésiant (solution de méthane-sulfonate de tricaïne MS-222) sera mis en application.

Choix des espèces

Il s'agit des espèces piscicoles naturellement présentes dans la rivière, il n'est donc pas pertinent d'utiliser un autre modêle biologique. Tous les poissons seront arrivés au stade d'adulte. Les truites, chevesnes et vandoises seront des reproducteurs, stimulant ainsi leur comportement de migration génésique et donc d'emprunt des dispositifs de franchissement. Les anguilles seront de taille supérieure à 300mm. En provoquant un effet "surdensitaire" au niveau du site de relâcher des poissons, l'objectif est de stimuler la dispersion des anguilles vers l'amont, afin qu'elles empruntent les dispositifs de franchissement.

2 700 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Souriceaux d'une et deux semaines et adultes de six à huit semaines reçoivent chacun deux injections intrapéritonéales d'immunostimulants, en contention et sans anesthésie, pour tester si une stimulation précoce laisse une mémoire immunitaire durable. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est observée lors de ces injections, avant d'admettre dans la même phrase qu'elles peuvent causer des douleurs légères, et qu'il ne peut pas anticiper les effets de certains immunostimulants. Il indique aussi mettre en reproduction 20 à 30 % d'animaux en plus, le stress de certaines lignées poussant les mères au cannibalisme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité de divers immunostimulants à induire une réponse immunitaire innée mémoire lorsqu’ils sont administrés en début de vie de l’animal. L’implication du microbiote intestinal sera également étudiée dans la modulation et la mise en place de l’immunité innée mémoire. La stimulation et la modulation des cellules de l’immunité innée en période néonatale pourraient permettre d’induire une réponse durable, avec une mise en place de la mémoire immunitaire innée pour favoriser le contrôle d’infections futures à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Les stratégies de contrôle pour lutter contre les infections sont parfois limitées et trop spécifiques d’un agent (ex : vaccin). L’idée ici est de proposer une nouvelle stratégie prophylactique qui cible l'hôte lui-même et plus spécifiquement son système immunitaire inné. Il repose sur l'utilisation d’immunostimulant favorisant la stimulation des récepteurs de l’immunité, et ainsi booster la réponse immunitaire innée pour mieux contrôler une infection zoonotique présente ou ultérieure (d’où les essais d’induction de mémoire innée).

Procédures

Les souriceaux seront soumis à deux administrations intra-péritonéales des immunostimulants : une fois à l’âge d’une semaine, puis à l’âge de deux semaines. Les souris adultes seront soumises à deux administrations intra-péritonéales des immunostimulants sur la période de 6-8 semaine à une semaine d’intervalle. Cette administration est réalisée sur animaux vigiles sous contention. Pour évaluer l’implication du microbiote intestinal, les souris adultes gestantes ou non recevront des antibiotiques dans l’eau de boisson.

Impact sur les animaux

Il est impossible d’anticiper, mais il est possible que des effets indésirables altérant l’état général de l‘animal puissent être remarqués avec certains immunostimulants. Concernant l’injection intra-péritonéale aucune nuisances n’est observée, en effet, nous utilisons des seringues adaptées (seringue insuline, 30G pour les souriceaux, et aiguille 29G pour les adultes), neamoins des douleurs légères peuvent être liées à l’injection intra-péritonéale.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, …).

Réduction

Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par l’établissement). Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. L’étude de l’immunité innée mémoire s’effectuera dans différents organes. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans l’expérimentation, les différents organes prélevés sur un même animal seront utilisés autant que possible pour réaliser différents types d’analyse. Pour analyser les données, nous utiliserons des modèles statistiques mixtes adaptés qui tiennent compte à la fois des traitements immunostimulants et de la répétition des expériences.

Raffinement

Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis 2 fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas

Choix des espèces

Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra d’étudier et décrire très précisément les mécanismes d’induction des réponses immunitaires innées mémoires après l’administration d’immunostimulants. 1. Des souriceaux entre 0 jours et 3 semaines seront utilisés car c’est la fenêtre que nous souhaitons étudier pour l’induction de l’immunité innée mémoire. Des souris gestantes fourniront les souriceaux 2. Des adultes seront utilisés dans le cadre de l’étude de l’immunité innée mémoire, afin de comparer ces évènements entre la période néonatale (premières semaines de vie) et la période adulte (6-8 semaines).