Procédures légères

Remis à l'eau sur leur lieu de capture, 9 070 des 9 200 poissons annoncés dans ce projet sont déclarés rendus vivants au milieu, l'écart de 130 individus restant sans explication dans le résumé. Les procédures impliquent un niveau de souffrance légère pour 9 150 poissons et modéré pour 50 d'entre eux, capturés par 126 traits de chalut de fond de trente minutes par an. Les esturgeons européens, espèce en danger critique d'extinction, sont anesthésiés puis marqués par pit-tag intramusculaire et marque transmusculaire, biopsiés à la nageoire, échographiés, photographiés et, pour 70 à 75 % d'entre eux, soumis à un lavage gastrique provoquant des spasmes pour faire régurgiter leur contenu stomacal. Le porteur estime à une cinquantaine par an les esturgeons capturés et juge cet effectif "raisonnable pour une espèce en danger critique".

Objectifs

Le projet consiste à réaliser un suivi des populations de poissons en milieu estuarien et plus particulièrement, celui d’une espèce de poisson en danger critique d’extinction, qui a bénéficié d’un plan de sauvegarde national et de soutiens via des programmes européens, l’esturgeon européen. Ces mesures ont permis de maîtriser la reproduction en captivité de ce dernier et de lâcher dans le milieu naturel des juvéniles issus de ces reproductions pour soutenir la population sauvage. Afin de connaître l’évolution de cette nouvelle population dans son milieu naturel et d’évaluer le succès de ces pratiques de repeuplement, un suivi régulier doit être mis en place. Celui-ci sera réalisé dans le milieu estuarien puisque c’est là que ces poissons vont séjourner plusieurs années avant de partir grossir en mer et de revenir en estuaire pour entamer leur migration de reproduction jusqu’aux frayères fluviales. Les possibilités de trouver des individus seront donc beaucoup plus importantes dans ces endroits qu’en pleine mer. L’espèce ayant décliné avant l’acquisition de connaissances la concernant, il est nécessaire de mieux documenter son écologie en milieu naturel (régime alimentaire, croissance, structure en âge, préférences environnementales, migrations). Lors de précédentes campagnes d’échantillonnage, une procédure-pilote de marquage et de monitoring de quelques spécimens par marque satellite a permis de documenter pour la première fois leur comportement en mer ainsi que leurs migrations entre l’estuaire et la mer. Depuis ces dernières années, quelques grands spécimens adultes ont été observés dans les fleuves (déclarations de pêcheurs professionnels), mais il n’y a aucun signe de reproduction naturelle à ce jour. Mis à part la description de sites de frayères historiques potentiels, le comportement de reproduction de l’espèce reste inconnu. Pour l’étudier, nous nous proposons de remplacer la procédure de marquage satellite par des marquages acoustiques chez quelques grands spécimens, ce qui permettra de suivre par télémétrie leurs trajectoires pour la reproduction jusque dans les fleuves.

Bénéfices attendus

L’esturgeon européen (A. sturio) ayant décliné avant l’acquisition de connaissances, il est important de mieux documenter son écologie en milieu naturel. Ce projet permettra la collecte de données sur les régimes alimentaires, structures en âge des populations, croissance, préférences environnementales, migrations. Outre leur intérêt fondamental, les résultats informeront sur l’évolution, dans son milieu, de cette population soutenue et permettront d’évaluer le succès des pratiques de repeuplement. Suite au repeuplement dans le bassin versant de plus de 1.7 M de juvéniles d’esturgeon européen entre 2007 et 2015, les individus sont actuellement en âge de se reproduire. Durant les campagnes d’échantillonnages précédentes, le marquage de grands spécimens avec des marques satellites a documenté pour la 1ère fois leur comportement en mer et leurs migrations trophiques entre l’estuaire et la mer. Cette procédure-pilote s’est avérée très informative. La modélisation des données est en cours pour reconstituer les trajectoires maritimes a posteriori ; les 1ers résultats sont encourageants mais nécessitent une analyse approfondie avant d’envisager la pose de nouvelles marques satellites. Ces dernières années, quelques grands spécimens adultes ont été observés dans les fleuves par des pêcheurs professionnels, mais il n’y a aucun signe de reproduction naturelle. Nous supposons qu’il s’agissait d’individus mâles en exploration et qu’il n’y a pas encore eu de remontée d’individus femelles. Excepté la description de frayères historiques potentielles suite aux concentrations d’individus observées par le passé, le comportement de reproduction de l’espèce reste inconnu. Le marquage par télémétrie acoustique d’une dizaine d’autres grands spécimens entre septembre 2024 et juin 2025 permettra de suivre en continu sur les prochaines années leurs trajectoires jusqu’aux fleuves. Grâce au monitoring dans les fleuves et à l’embouchure de l’estuaire, nous disposerons d’informations sur la migration de reproduction et le retour en mer des individus (trajets, périodes, vitesses). L’intérêt est l’obtention de données individuelles 1/ complémentaires, indépendantes des captures accidentelles déclarées sur la base du volontariat car l’espèce est protégée, 2/ sans avoir besoin de recapturer le poisson et 3/ sur le long terme (jusqu’à 6 ans), certains individus pouvant se reproduire chaque année ou tous les deux ans.

Procédures

Tous les 2 mois (6 campagnes/an), un échantillonnage piscicole par chalutage de fond est réalisé dans des secteurs estuariens adjacents aux fleuves dans lesquels les juvéniles d’A. sturio ont été déversés. Il s’agit de recapturer ces individus pour estimer l’évolution de leur abondance et connaître les autres populations de poissons présentes pour identifier les interactions possibles. Par campagne sont réalisés 21 traits de chalut, d’une durée de 30 min. A chaque trait, toutes les espèces présentes sont identifiées le plus rapidement possible, en les maintenant humides ou immergées (viviers), puis relâchés sur le lieu de capture. S’il s’agit d’A. sturio, on renseigne leur nombre, longueur, poids, état et numéro des marques d’identification s’ils en sont déjà dotés au moment de la capture. Si ce n’est pas le cas, les individus sont marqués pour identification (Pit-tag interne et marque numérotée externe) et de petits morceaux de nageoire sont prélevés pour réaliser des analyses génétiques (origine repeuplement ou sauvage) et isotopiques (utilisation des habitats) et estimer leur âge (durée de ces marquages et prélèvements : 2 à 3 min). En fonction de leur état, on réalise une échographie (maturité, sexage), une photographie (morphologie générale) et un lavage gastrique (exploration du régime alimentaire) (durée totale de ces 3 manipulations moins de 10 min). S’ils ont un poids suffisant, une marque à mémoire externe enregistrant température, oxygène et salinité du milieu est fixée à la base des écussons dorsaux pour documenter leurs préférences environnementales (moins de 5 min pour la pose de cette marque). Les plus gros spécimens sont aussi dotés d’une marque acoustique pour suivre leurs trajectoires, posée en interne (cavité abdominale) ou externe (à la base des écussons dorsaux) selon la date de capture et l’avancée présupposée de la maturation (environ 5 min pour cette manipulation). Pour toutes les manipulations, les esturgeons européens sont anesthésiés.

Impact sur les animaux

Ces effets sont liés au stress de capture, voire de stabulation et biométrie (confinement, émersion). La durée de chalutage est de 30 min pour limiter les blessures des poissons prélevés. Les esturgeons européens peuvent aussi subir du stress et/ou blessures occasionnés par les actes expérimentaux successifs suivants : 1) marquage individuel (Pit-tag en intramusculaire et marque numérotée en transmusculaire) et 2) prélèvements de tissus de nageoires, qui peuvent entrainer des blessures tissulaires de type plaie cutanée, mais qui ne sont pratiqués que si nécessaire (i.e. individu échantillonné pour la 1ère fois) ; 3) échographie (état de maturité, sexage) et photographie (morphologie générale), qui bien que non invasives, ne sont opérées qu’en fonction de l’état du poisson ; 4) lavage gastrique provoquant des spasmes transitoires facilitant la régurgitation du bol alimentaire, fait seulement si l’individu est en bon état ; 5) selon sa taille, pose d’une marque DST externe (fixée à la base des écussons dorsaux pour éviter d’endommager la musculature) et 6) pour les plus gros poissons, pose d’une marque acoustique interne (intra-abdominale) ou externe (à la base des écussons dorsaux) si l’individu est en période de reproduction et auquel cas, il n’est pas doté d’une DST.

Devenir

Etant donné que le projet porte sur le suivi des espèces piscicoles de l’estuaire et notamment sur le suivi, dans son milieu, de la population soutenue d’esturgeon européen, l’objectif de l’étude ne peut pas être atteint en dehors du milieu naturel. A l’issue des procédures, les poissons sont remis en liberté dans leur secteur de capture, ce qui est couvert par une autorisation préfectorale. Les esturgeons européens sont traités à part en priorité (biométrie, échographie, marquage d’identification, prélèvements tissulaires et lavage gastrique). Ils sont ensuite conservés en vie. Ceux dont l’état ou la taille ne permet pas un marquage supplémentaire (avec marque à mémoire et/ou marque acoustique), seront remis à l’eau rapidement sur leur lieu de capture. Il en sera de même pour les plus gros individus qui auront été marqués. De par l’objectif de l’étude, il est nécessaire de relâcher les esturgeons européens marqués au niveau de leur secteur de capture afin d’étudier la population en milieu naturel. La décision du moment du lâcher est prise par les intervenants qui sont formés à l’expérimentation animale et à la pratique de la chirurgie expérimentale. Ce moment sera fonction de l’état du poisson au réveil (reprise d’un comportement de nage normal). Nous bénéficions de toutes les autorisations réglementaires pour impliquer dans ce projet cette espèce d’esturgeon qui est protégée.

Remplacement

Aucun remplacement des poissons étudiés ne peut être effectué puisque les données recherchées ne peuvent être fournies que par les espèces elles-mêmes vivant dans le milieu naturel. Comme indiqué précédemment, afin de connaître l’évolution, dans son milieu, de la population soutenue d’A. sturio et d’évaluer le succès des pratiques de repeuplement mises en place dans le cadre du PNA, un suivi régulier doit être réalisé dans des secteurs estuariens adjacents aux fleuves dans lesquels les juvéniles d’esturgeons européens ont été déversés. Il s’agit de recapturer ces individus pour estimer l’évolution de leur abondance et connaître également les autres populations de poissons présentes dans l’estuaire pour identifier les interactions possibles. Par conséquent, pour réaliser le suivi des populations piscicoles estuariennes et en particulier, de l’état de la population soutenue d’esturgeons européens, il est nécessaire de capturer les poissons pour pouvoir les dénombrer (estimer les abondances), les mesurer, les marquer (suivi individuel de croissance), les équiper de marques spécifiques (étude des déplacements et des préférences environnementales).

Réduction

D’après les échantillonnages historiques, on peut s’attendre à capturer en moyenne une cinquantaine d’esturgeons européens par an au grand maximum. Tous seront marqués individuellement pour identification afin d’avoir un suivi le plus exhaustif possible de la population. En effet, étant donné la faible abondance de l’espèce (soutien de population) et de l’effort de capture ciblant l’espèce relativement faible (campagnes bimestrielles en estuaire, captures accidentelles par des pêcheurs), le taux de recapture attendu est faible (150 cm pour les marquages acoustiques de géniteurs). Cela représente sur l’année environ 10-15 individus marqués avec une DST dont une dizaine par acoustique. Les effectifs capturés dans l’estuaire peuvent varier d’une année à l’autre en fonction notamment des actions de repeuplement. D’après nos estimations, l’effectif envisagé correspond en moyenne, à l’échelle de l’année, au nombre d’animaux qui ont un poids supérieur au poids minimal requis pour le marquage sur le maximum d’individus possible, et il peut être considéré comme raisonnable pour une espèce en danger critique telle que l’esturgeon européen.

Raffinement

- 21 traits de chalut de fond par campagne (soit 126 traits/an) sont effectués dans des secteurs médian et aval chalutables de l’estuaire en suivant 2 grilles d’échantillonnages légèrement décalées alternativement d’une campagne à l’autre. Cela représente environ 1 % de la surface totale de l’estuaire subtidal (i.e. les secteurs non soumis au marnage), soit un impact sur le fond de l’estuaire qui nous parait négligeable sachant que ce dernier est par ailleurs soumis à des dragages réguliers et importants pour les besoins de la navigation. - La durée de chalutage de 30 min est fixée sur la base d’échantillonnages historiques qui mettaient en évidence qu’elle limitait les blessures des poissons prélevés. A la remontée du chalut, les poissons sont réceptionnés sur un matelas, et transférés dans un ou des viviers alimentés en circuit ouvert. - Quelle que soit l’intervention, l’A. sturio est anesthésié au préalable pour limiter stress et douleur (les dosages du produit anesthésiant sont adaptés à sa taille et au type d’intervention). Durant les manipulations, il est immergé, ou alimenté, via un tuyau, d’anesthésique à dose sédative ou arrosé d’eau claire de l’estuaire (maintien humidité cutanée). L’ensemble est réalisé avec le plus grand soin par des intervenants ayant une bonne expérience de ces pratiques et parfaitement conscients de la fragilité de l’espèce. Après son réveil dans un vivier alimenté en eau courante de l’estuaire bien oxygénée et sa reprise d’un comportement de nage normal, l’A. sturio est relâché sur le lieu de capture à l’aide d’un toboggan. Les procédures seront adaptées à la situation : réduction si l’individu est blessé ou maigre et/ou s’il y a beaucoup d’individus, pas de lavage gastrique chez ceux marqués par acoustique.

Choix des espèces

- Etant donné que l’étude porte sur le suivi des espèces piscicoles de l’estuaire, l’ensemble des espèces capturées sont identifiées et traitées. En plus des esturgeons européens (Acipenser sturio), on s’attend à capturer en majorité les espèces suivantes : mulet-porc (Chelon ramada), maigre (Argyrosomus regius), anguille européenne (Anguilla anguilla), bar franc (Dicentrarchus labrax) et bar moucheté (Dicentrarchus punctatus), flet (Platichthys flesus), merlan (Merlangius melangus), sole (Solea solea), sprat (Sprattus sprattus), anchois (Engraulis encrasicolus), gobies (Pomatoschistus spp.), raie bouclée (Raja clavata), alose feinte (Alosa fallax) et grande alose (Alosa alosa), congre (Conger conger), lamproie marine (Petromyzon marinus), ainsi que 2 espèces d’esturgeons exotiques suite à des échappements de piscicultures : l’esturgeon sibérien (Acipenser baeri) et l’osciètre (Acipenser gueldenstaedti). - En fonction des espèces capturées et de la saison, il s’agira de poissons de stades juvéniles ou adultes. Pour l’esturgeon européen, il s’agira de juvéniles de plus d’un an. Il est également possible que des adultes en migration de reproduction (âge> 12 ans) soient capturés.

Les souris de cette lignée transgénique perdent spontanément leurs synapses à partir de six mois, dégénérescence construite pour reproduire la maladie d'Alzheimer. 700 vont être utilisées, 620 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 80 un niveau modéré, toutes tuées. Un fragment de queue est prélevé sur les souriceaux de 7 à 10 jours pour lire leur génotype, une partie subit une injection intracérébrale sous anesthésie d'une heure, une autre une injection intrapéritonéale. Les reproducteurs sont gardés jusqu'à six mois puis tués, le porteur indiquant qu'il ne sera possible ni de les placer ni de les réutiliser du fait de leur modification génétique.

Objectifs

Au cours de la maladie d’Alzheimer, des pertes de synapses, les connexions entre les neurones, se produisent dans le cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Ainsi, des traitements visant à réduire ces pertes pourraient protéger contre les déficits cognitifs. Un contrôle local des quantités de calcium au niveau des synapses est indispensable à leur maintien. Notre objectif est de déterminer si les pertes de synapses dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer pourraient être dues à des altérations de la régulation du calcium au niveau des synapses.

Bénéfices attendus

On estime que plus de 850 000 personnes sont affectées par la maladie d’Alzheimer en France, avec une espérance de vie de 8 à 12 ans à partir du moment où le diagnostic est établi. Le mécanisme des pertes de synapses dans la maladie d'Alzheimer est encore très mal connu. Ce projet a pour objectif de tester l’implication d’altérations du contrôle des niveaux de calcium au niveau des synapses dans ces pertes. La preuve de l’implication de telles altérations pourrait, à plus long terme, orienter vers une nouvelle piste thérapeutique.

Procédures

Un élevage de souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer présentant des pertes de synapses sera effectué. Cela nécessitera de prélever un fragment de queue à l’âge de 7 à 10 jours (une fois, durée de moins d’une minute par animal) pour déterminer leur patrimoine génétique. Des souris auront une chirurgie consistant en une injection intracérébrale unique sous anesthésie générale, avec une prise en charge analgésique adaptée. Cette procédure durera une heure et sera faite une seule fois. D’autres souris recevront une injection intrapéritonéale unique d’un traitement pharmacologique (une fois, durée de moins d’une minute par animal). Les souris seront euthanasiées en fin de période de maintien par une méthode réglementaire pour prélèvement et analyses.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une légère et brève douleur lors du prélèvement de l’extrémité de la queue pour déterminer leur patrimoine génétique. Les souris génétiquement modifiées que nous utilisons dans ce projet développent spontanément une perte de synapses avec l'âge, mais elles seront euthanasiées au début de cette perte. La contention des souris nécessaire pour les manipulations et notamment pour les injections peut entrainer du stress.. Les injections peuvent entrainer une légère douleur au point d’injection. La chirurgie effectuée sous anesthésie générale comporte des risques rares associés à l'anesthésie (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire). De plus, les souris pourraient ressentir un inconfort et des douleurs post-opératoires suite à la chirurgie.

Devenir

A la fin des procédures les souris seront euthanasiées afin de prélever leur cerveau pour analyser l'effet des traitements. Les animaux reproducteurs seront maintenus jusqu’à 6 mois pour garder des facultés de reproduction optimales. Ils seront ensuite euthanasiés car il ne sera pas possible de les replacer ou les réutiliser du fait de leurs modification génétique.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet le mécanisme de la neuro-dégénérescence dans la maladie d’Alzheimer n’est pas connu. Or les modèles animaux de la maladie d’Alzheimer sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de synapses adultes au sein d’un organisme où les voies de signalisation sont interconnectées.

Réduction

Au cours du projet nous estimons que nous produirons au maximum 700 souris. Les animaux générés permettront de renouveler les reproducteurs de notre élevage, de réaliser les procédures expérimentales, et de réaliser des analyses nécessitant uniquement la collecte de tissus post-mortem. Nous ne produirons que le nombre strictement nécessaire d’animaux. De plus, le nombre d’animaux utilisés pour les procédures expérimentales (320) est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux ayant été établie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Le prélèvement d’un fragment de queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera limité à une taille minimale et sera réalisée en même temps que l’identification pour limiter le nombre de manipulations des souriceaux. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un reprélèvement était nécessaire il sera réalisé au niveau de l’oreille de l’animal et n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. Pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse : (i) les souris ont à disposition, comme élément d’enrichissement, des composants de nidification et des batonnets ; (ii) une surveillance quotidienne des paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie) est réalisée ; (iii) une surveillance quotidienne des animaux est effectuée, afin de détecter un état de stress ou de douleur. Des points limites sont définis pour chaque procédure et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie avec une analgésie adaptée. Nous réaliserons un suivi rapproché en post-opératoire afin de détecter tout signe de douleur de l’animal. Les souris que nous utilisons dans ce projet présentent une perte de synapses à partir de l’âge de 6 mois, elles seront euthanasiées à ce moment là donc au début de la perte de synapses, et donc avant que cela n’engendre un impact visible sur leur état général.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que ces souris pour atteindre les objectifs du projet. Le traitement visant à prévenir les pertes de synapses sera effectué à 3 mois, avant que les pertes de synapses ne soient observées chez les souris, et ses effets seront analysés 3 mois après injection, quand ces pertes sont significatives. Le traitement pharmacologique visant à réverser la perte de synapses sera effectué à 6 mois, quand cette perte est significative. Ses effets seront analysés après 1 jour, 1 semaine et 1 mois pour déterminer s’il y a un effet, et combien de temps il persiste. Les géniteurs seront utilisés entre 2 et 6 mois d'âge, période optimale pour la reproduction des souris.

1 590 souris sont utilisées dans cet établissement, l'un des deux du projet, dont 935 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Injections de la cible vaccinale, saignées répétées des veines mandibulaire et saphène, ponctions cardiaques au terme de l'immunisation, exposition à des moustiques infectés : toutes sont tuées à l'issue. Le porteur annonce un vaccin universel protégeant contre plusieurs flavivirus, tout en situant le projet au stade de l'optimisation du protocole d'immunisation. Sur le remplacement, il écrit que "le modèle animal est incontournable" et qu'aucun autre modèle ne permet ce test, après avoir produit ses données préliminaires in vitro.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de développer une nouvelle stratégie de vaccination contre tous les flavivirus. Les flavivirus sont un groupe de virus transmis par les moustiques et causant différents types de symptômes pouvant entraîner la mort. La stratégie consiste à inhiber la transmission de ces virus lors d’une piqûre de moustique. L’avantage de cette nouvelle stratégie est qu’elle sera universelle et pourra protéger contre plusieurs maladies causées par plusieurs flavivirus avec un seul vaccin. Le projet se déroulera dans 2 EU.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) la caractérisation d'un candidat vaccin contre plusieurs maladies transmises par les moustiques, ii) une augmentation de la compréhension fondamentale de l’infection lors d’une piqûre de moustique. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin à large spectre contre plusieurs maladies à fort potentiel épidémique dans le monde et en Europe. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de centaines de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique des maladies transmises par les moustiques.

Procédures

Dans la procédure 1 (P1), nous optimiserons l’immunisation contre la cible vaccinale. Nous injecterons les souris avec la cible vaccinale à 0 et 14j et ferons des prélèvements sanguins à 0, 14 et 28j au niveau des veines mandibulaire/saphène par alternance. Les injections et prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P2, nous testerons l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur l’infection par piqûre de moustiques infectés. Les souris seront injectées avec la cible vaccinale comme dans la P1, puis exposées aux moustiques infectés sous anesthésie générale. L’exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30 min. Nous effectuerons ensuite des prélèvements sanguins tous les 2j par les veines mandibulaire/saphène par alternance pendant 14j. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P3, nous collecterons le sérum de souris immuniser pour identifier les antigènes (Ag) de la cible vaccinale. Après immunisation comme dans la P1, le sang des souris sera collecté par ponction cardiaque sous anesthésie générale à 14j après la dernière immunisation. La ponction cardiaque sous anesthésie durera 10 min. Dans la P4, nous déterminerons si la protection contre l’infection est liée aux anticorps. Nous collecterons le sérum de souris immunisées comme dans la P3 par ponction cardiaque. La ponction cardiaque sous anesthésie générale durera 10 min. Nous injecterons ensuite le sérum dans des souris, exposerons les souris anesthésiées à la piqûre de moustiques infectés, et collecterons le sang des souris par ponction des veine mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pour évaluer l’infection pendant 14j. L’exposition aux moustiques durera moins de 30 min. Les prélèvements sanguins sous anesthésie dureront quelques min. Dans la P5, nous testerons les différents Ag identifiés dans la P3. Nous injecterons les souris avec chacun des Ag comme dans la P1. Nous exposerons ensuite les souris aux moustiques infectés sous anesthésie, et réaliseront des prélèvements sanguins par ponction des veines mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pendant 14j. L'injection des Ag durera quelques min. L'exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30min. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans l’EU2 seront réalisées les protocoles d’injection d’Ag et le prélèvement avant infection. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur animaux infectés.

Impact sur les animaux

Douleur passagère au niveau du site d’injection de la cible vaccinale, des antigènes et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendu aux points de piqûres des moustiques. Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, fièvre, stress, comportement anormal, troubles neurologiques, liés à l’infection.

Devenir

A la fin des expériences ou lors d’une souffrance sévère, les souris seront mises à mort sous anesthésie.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur l’infection par exposition à une piqûre de moustique infectés. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris, nous optimiserons le protocole de vaccination et ne reproduiront que le protocole optimisé dans les autres expériences.

Raffinement

Les souris seront maintenues 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. L’eau et la nourriture seront à volonté. Elles seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffant pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et dessèchement de la cornée (nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée). En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera chaque jour. Les animaux seront transportés entre les EU dans leur cage en couvrant la cage d’un tissu opaque pour ne pas stresser les animaux.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris de type sauvage avec un système immunitaire complet. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. Nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter ces souris par piqûre de moustique. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 à 8 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate et une piqûre par plusieurs moustiques simultanément.

Immunisées à J0 puis à J14, saignées par la veine mandibulaire ou saphène tous les deux jours pendant quatorze jours, 1 590 souris sont ensuite exposées sous anesthésie à des moustiques porteurs de flavivirus, trente minutes par séance. Le protocole en déclare 655 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 935 un niveau modéré, avec perte de poids, fièvre, troubles neurologiques et comportement anormal liés à l'infection. Une partie est saignée par ponction cardiaque sous anesthésie pour récupérer le sérum. Toutes sont tuées, à la fin des expériences ou plus tôt si la souffrance devient sévère.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de développer une nouvelle stratégie de vaccination contre tous les flavivirus. Les flavivirus sont un groupe de virus transmis par les moustiques et causant différents types de symptômes pouvant entraîner la mort. La stratégie consiste à inhiber la transmission de ces virus lors d’une piqûre de moustique. L’avantage de cette nouvelle stratégie est qu’elle sera universelle et pourra protéger contre plusieurs maladies causées par plusieurs flavivirus avec un seul vaccin. Le projet se déroulera dans 2 EU.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) la caractérisation d'un candidat vaccin contre plusieurs maladies transmises par les moustiques, ii) une augmentation de la compréhension fondamentale de l’infection lors d’une piqûre de moustique. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin à large spectre contre plusieurs maladies à fort potentiel épidémique dans le monde et en Europe. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de centaines de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique des maladies transmises par les moustiques.

Procédures

Dans la procédure 1 (P1), nous optimiserons l’immunisation contre la cible vaccinale. Nous injecterons les souris avec la cible vaccinale à 0 et 14j et ferons des prélèvements sanguins à 0, 14 et 28j au niveau des veines mandibulaire/saphène par alternance. Les injections et prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P2, nous testerons l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur l’infection par piqûre de moustiques infectés. Les souris seront injectées avec la cible vaccinale comme dans la P1, puis exposées aux moustiques infectés sous anesthésie générale. L’exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30 min. Nous effectuerons ensuite des prélèvements sanguins tous les 2j par les veines mandibulaire/saphène par alternance pendant 14j. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P3, nous collecterons le sérum de souris immuniser pour identifier les antigènes (Ag) de la cible vaccinale. Après immunisation comme dans la P1, le sang des souris sera collecté par ponction cardiaque sous anesthésie générale à 14j après la dernière immunisation. La ponction cardiaque sous anesthésie durera 10 min. Dans la P4, nous déterminerons si la protection contre l’infection est liée aux anticorps. Nous collecterons le sérum de souris immunisées comme dans la P3 par ponction cardiaque. La ponction cardiaque sous anesthésie générale durera 10 min. Nous injecterons ensuite le sérum dans des souris, exposerons les souris anesthésiées à la piqûre de moustiques infectés, et collecterons le sang des souris par ponction des veine mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pour évaluer l’infection pendant 14j. L’exposition aux moustiques durera moins de 30 min. Les prélèvements sanguins sous anesthésie dureront quelques min. Dans la P5, nous testerons les différents Ag identifiés dans la P3. Nous injecterons les souris avec chacun des Ag comme dans la P1. Nous exposerons ensuite les souris aux moustiques infectés sous anesthésie, et réaliseront des prélèvements sanguins par ponction des veines mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pendant 14j. L'injection des Ag durera quelques min. L'exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30min. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans l’EU2 seront réalisées les protocoles d’injection d’Ag et le prélèvement avant infection. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur animaux infectés.

Impact sur les animaux

Douleur passagère au niveau du site d’injection de la cible vaccinale, des antigènes et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendu aux points de piqûres des moustiques. Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, fièvre, stress, comportement anormal, troubles neurologiques, liés à l’infection.

Devenir

A la fin des expériences ou lors d’une souffrance sévère, les souris seront mises à mort sous anesthésie.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur l’infection par exposition à une piqûre de moustique infectés. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris, nous optimiserons le protocole de vaccination et ne reproduiront que le protocole optimisé dans les autres expériences.

Raffinement

Les souris seront maintenues 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. L’eau et la nourriture seront à volonté. Elles seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffant pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et dessèchement de la cornée (nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée). En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera chaque jour. Les animaux seront transportés entre les EU dans leur cage en couvrant la cage d’un tissu opaque pour ne pas stresser les animaux.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris de type sauvage avec un système immunitaire complet. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. Nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter ces souris par piqûre de moustique. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 à 8 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate et une piqûre par plusieurs moustiques simultanément.

Jusqu'à quatre instillations d'un virus respiratoire dans le nez, sous anesthésie, complétées pour certaines par des gavages ou des injections d'antiviraux deux fois par jour sur animal vigile. 900 souris vont être utilisées, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus, 500 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 400 un niveau léger. L'objectif déclaré porte sur les défenses immunitaires de la muqueuse nasale face au virus responsable de la bronchiolite du nourrisson. Le porteur annonce des tests olfactifs de moins de sept minutes sur 500 animaux sans préciser en quoi ils consistent, et affirme que l'infection ne provoque chez la souris ni symptôme respiratoire ni changement de comportement visible.

Objectifs

Le présent projet vise à mieux comprendre les défenses immunitaires précoces au niveau de la cavité nasale lors d'une infection par un virus respiratoire en utilisant la souris comme modèle d'étude (des lignées sauvages et des lignées génétiquement modifiées). Les expériences réalisées permettront également de valider des approches anti-virales contre les infections par des virus respiratoires, en utilisant le virus respiratoire syncytial comme modèle (responsable de la bronchiolite du nourrisson).

Bénéfices attendus

Ce projet vise donc à développer des nouvelles stratégies antivirales contre les virus respiratoires en s’appuyant sur une meilleure connaissance de l’immunité intranasale

Procédures

Au cours de ce projet, les 900 animaux seront soumis à des instillations nasales sous anesthésie (jusqu’à 4 par animal d’une durée d’une minute maximum) ). Les animaux pourront également subir des gavages ou des injections ainsi que des tests olfactifs. Au cours de ces interventions, en dehors des tests olfactifs, la procédure par animal est inférieure à 5 min sauf pour les traitements antiviraux qui seront réalisés sur animal vigile si biquotidien et durent moins de 2 min. Les tests olfactifs (concernant 500 animaux) durent moins de 7 min par animal.

Impact sur les animaux

L’infection par le virus respiratoire syncytial induit très peu de symptômes chez la souris, pas de symptômes respiratoires ni de changement de température corporelle ni changement de comportement visible. Les instillations nasales, les gavages et les injections ne génèrent que peu de nuisance. En effet, l’instillation nasale peut engendrer un stress chez l’animal et une fausse déglutition. Le gavage peut engendrer une fausse route. Les modifications génétiques des lignées ne sont dommageables qu’après 6 mois. Les animaux seront anesthésiés avant instillations nasales qui ne provoqueront alors pas de stress. Les gavages et injection d’antiviraux seront réalisés sur animal en contention ce qui provoque un stress léger et très court. Les antiviraux ont été validés au préalable pour leur très faible toxicité et sont bien tolérés.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélèvements de tissus qui seront utilisés pour étudier les infections virales et la réponse immunitaire de l'hôte.

Remplacement

Les rongeurs sont couramment utilisés pour les études des interactions virus-hôte. De telles expériences ne peuvent être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes avec un système immunitaire fonctionnel. Les lignées transgéniques permettront de spécifiquement étudier le rôle du mucus dans l’élimination des virus respiratoires dans la cavité nasale.

Réduction

Le nombre d'animaux est limité par des expériences pilotes déjà réalisées ainsi que des effectifs adaptés de 10 animaux des deux sexes par groupe pour obtenir des différences statistiques en se basant sur nos précédentes expériences.

Raffinement

Les animaux sont gardés en groupe sociaux pour éviter le stress lié à l’isolement, ils disposent également d’un enrichissement de leur environnement notamment pour créer un nid à l’abri d’une maison en carton de type igloo ainsi que de bout de bois à ronger. Les animaux feront l'objet d'une surveillance accrue en cas de risques liés aux infections respiratoires (prise de température et de poids journalier). Des points limites sont déterminés pour éviter la douleur des animaux. Les lignées transgéniques à phénotype dommageable seront utilisées à un âge où ces symptômes n’apparaissent pas.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d'un système immunitaire mature permettant d’étudier les relations hôtes-pathogènes. Le choix de la souris repose sur sa capacité à être infectée par le VRS. Les lignées transgéniques permettront de spécifiquement étudier le rôle de deux composants du mucus dans la capacité de la cavité nasale à évacuer ce dernier.

14 305 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux dans l'oreille interne, certaines in utero au quatorzième jour de gestation, puis un suivi auditif toutes les deux semaines pendant six à neuf mois. 972 d'entre elles subissent en plus un test de réflexe de sursaut d'une heure par jour, et d'autres une pièce de maintien posée sous anesthésie suivie de quatre semaines de restriction hydrique, avec deux heures de test quotidien. Le porteur indique qu'il n'existe ni lignée cellulaire ni cellule souche de l'oreille interne et conclut que le modèle murin reste "l'outil indispensable".

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de développer des thérapies géniques pour restaurer l'audition et l'équilibre dans des modèles murins de pathologie de l'oreille interne humaine, applicables aux patients. Les fonctions d'audition et d'équilibre des mammifères reposent respectivement sur la cochlée et le vestibule, organes sensoriels spécialisés dans l'oreille interne. La surdité et les défauts de l'équilibre sont les troubles sensoriels héréditaires les plus répandus chez l'homme. Environ 1 nouveau-né sur 700 est affecté par une surdité congénitale, dont 80 % ont une cause génétique, avec 30 % de ces cas associés à des troubles de l'équilibre. A ce jour, il n’existe aucune approche thérapeutique pour soigner la surdité et les troubles de l’équilibre. Cependant, les virus adéno-associés (AAV) sont récemment apparus comme des vecteurs prometteurs pour la thérapie génique (TG). Bien qu’elle se soit révélée encourageante dans les essais précliniques et cliniques pour divers troubles héréditaires, la TG n’a pas encore été utilisée pour traiter la perte auditive. Au cours de la dernière décennie, nos recherches se sont concentrées sur le développement de la TG virale pour restaurer l'audition et l'équilibre chez des modèles murins de surdité humaine. Récemment, nous avons rapporté la première preuve de principe selon laquelle la TG peut inverser le phénotype de surdité profonde d’un modèle murin, suscitant l'espoir de futurs essais cliniques chez certains patients. Néanmoins, de nombreux défis persistent. Premièrement, le début de l'audition se produit après la naissance chez la souris et in utero chez l'homme, ce qui rend difficile la transposition des fenêtres temporelles thérapeutiques murines aux patients. Cela implique que la TG doit être administrée à l'oreille interne de souris (mâles et femelles sans distinction) presque adultes. Cependant, le taux de transduction des cellules sensorielles auditives et vestibulaires par les AAV diminue considérablement avec l'âge, soulignant le besoin crucial d'identifier de nouveaux variants AAV avec un fort tropisme pour ces cellules. Deuxièmement, il est essentiel de déterminer si la TG périphérique restaure une perception auditive centrale normale étant donné qu’il existe une période critique (PC) de plasticité, au cours de laquelle les circuits auditifs centraux perdent progressivement leur capacité à encoder correctement de nouveaux signaux acoustiques.

Bénéfices attendus

Notre projet de recherche vise à apporter une contribution significative à la compréhension de la physiopathologie de l'oreille interne et des voies auditives. Les résultats de notre étude devraient non seulement avoir un impact décisif sur le développement d'approches thérapeutiques pour les surdités humaines héréditaires, mais aussi mettre en lumière le rôle crucial de la thérapie génique dans la restauration de la perception auditive et des troubles de l'équilibre dans les modèles animaux de déficiences de l'oreille interne chez l'homme. En étudiant la faisabilité et la fiabilité de la thérapie génique pour restaurer l'audition et l'équilibre dans des modèles murins de surdité humaine, dans une fenêtre temporelle transposable à l’homme, nous espérons avoir un impact significatif sur la santé et la société. En effet, l'acquisition anticipée de connaissances sur l'impact de la fenêtre temporelle et de la période critique sur la thérapie génique pour la surdité, ainsi que l'identification de vecteurs spécifiques à l'oreille interne, seront cruciales pour la conception des futurs essais précliniques. Ces avancées auront à leur tour des répercussions médicales, sociales et économiques majeures, étant donné le fardeau considérable que représente la surdité pour la santé publique et les interactions sociales.

Procédures

- Une biopsie (30 secondes) sera effectuée sur tous les animaux du projet afin de les marquer et de les génotyper. - Nous effectuerons des injections (environ 20 minutes) à différents niveaux du système auditif via différentes voies d’administration. - Un suivi audiologique (environ 20 minutes) sera réalisé sur nos modèles souris ayant reçu une injection de vecteurs Cette procédure sera répétée tous les 2 semaines pendant 6 à 9 mois de vie de l’animal. - Nous effectuerons un suivi comportemental des modèles souris de surdité humaines ou de synaptopathies. Un test de réflexe de sursaut sera effectué une fois par jour (environ une heure) pendant 2 à 3 jours par intervalle de deux semaines sur une période de 2 à 3 mois (n= 972 animaux. Un autre test impliquant la pose au préalable d’une pièce de maintien (sous anesthésie, durée une heure) puis l’application d’un protocole de restriction hydrique, aura lieu tous les jours (environ 2 heures) pendant 4 semaines. Enfin, des tests locomoteurs vestibulaires (30 minutes pour l’ensemble des tests) auront lieu tous les 15 jours sur une période de 1 à 5 mois.

Impact sur les animaux

A l’exception du modèle murin du syndrome d’Usher de type 1G qui présente un défaut vestibulaire bilatéral, se caractérisant par un hochement de tête et une tendance à tourner en rond en permanence, nos autres modèles murins ne manifestent, outre la surdité, aucun autre symptôme et leur phénotype est indiscernable de celui des souris sauvages. Pour les mesures perceptuelles, les souris peuvent être soumises à du stress et de l’angoisse pendant les épisodes de contention. De plus, le protocole de restriction hydrique peut entraîner une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés empêchant tout replacement ou adoption. Par ailleurs, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations de physiologie, ou d’immunohistochimie. Les autres procédures impliquent des interventions comme des injections ou des entraînements comportementaux auditifs ou des chirurgies. On ne peut donc pas considérer ces animaux comme naïfs expérimentalement. De plus, la plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par exemple par d’autres équipes, encore plus difficile. Leur réutilisation pourrait donc mettre en péril les conclusions des nouvelles expériences car trop de paramètres pourraient ne pas être contrôlés. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles. Ces partages se font typiquement à l’échelle de l’Institut au-delà de notre équipe de recherche.

Remplacement

Près de 100 gènes responsables de surdité chez l’Homme ont été identifiés, mais autant restent à découvrir. La restauration de l’audition par thérapie génique chez des souris modèles de surdités humaines représente une étape cruciale pour ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme. A ce jour, nous ne disposons ni de lignées cellulaires ni de cellules souches de l’oreille interne, en raison de la complexité anatomique et histologique de l’organe de l’audition. Dans ce contexte, le modèle murin reste l’outil indispensable pour étudier la physiopathologie des surdités et mettre au point des traitements curatifs. Afin de réduire le nombre de souris utilisées, l’expression de la totalité des gènes thérapeutiques utilisés dans ce projet a été testée préalablement sur des lignées cellulaires.

Réduction

Afin de minimiser l’utilisation des animaux, nous adopterons une stratégie d’expérimentation et de statistiques visant à obtenir des résultats significatifs tout en réduisant au strict minimum le nombre d’animaux impliqués. Pour chaque modèle murin, nous réaliserons une injection de vecteur à différents stades du développement. Les souris ainsi injectées seront ensuite utilisées dans plusieurs protocoles distincts, incluant des tests auditifs, comportementaux, des analyses électrophysiologiques et des marquages immunohistochimiques. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons dans la mesure du possible un nombre équivalent de mâles (50%) et de femelles (50%), et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage recevront au moins 2 traitements différents. Enfin, les groupes d’animaux sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10% minimum. Cette approche statistique rigoureuse vise à minimiser le nombre d'animaux tout en garantissant une évaluation fiable et significative des résultats.

Raffinement

Dans le souci du bien-être optimal des animaux tout au long des procédures expérimentales, des traitements analgésiques et antalgiques seront mis en œuvre et adaptés au stade de développement des animaux en pré-opératoire et post-opératoire afin d’assurer une analgésie optimale pour chaque procédure. Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sera soigneusement réalisée. Des tapis chauffants seront utilisés pour limiter le risque d’hypothermie lors des chirurgies. Les souris gestantes seront placées dans des cages isolées après la chirurgie, assurant ainsi un rétablissement dans un environnement calme. De plus, un gel buvable et de la nourriture humidifiée seront disposés sur la litière de leur cage pour permettre aux souris d’accéder à la nourriture sans exercer de tension sur les sutures. Durant une période minimale de 5 jours suivant la chirurgie, une surveillance attentive de la plaie sera effectuée afin de détecter tout signe éventuel d’infection. Le suivi systématique de l’état général de santé des souris sera suivi pendant une semaine après la procédure afin de détecter d’éventuels signes de souffrance ou d’inconfort, tels que les changements de posture, les yeux plissés ou manque de toilettage. Enfin, en vue d’enrichir leur environnement, un igloo en plastique sera ajouté à chaque cage.

Choix des espèces

Près de 95% du génome de la souris est identique à celui de l’Homme. De plus, les modèles murins utilisés dans ce projet miment fidèlement les formes de la surdité humaine. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’Homme, nos résultats devraient faire progresser de manière significative notre compréhension de la fonction de la synapse auditive et accélérer le développement de la thérapie génique en tant qu’alternative prometteuse pour un traitement curatif des surdités génétiques chez l’Homme. Preuve en est, les résultats antérieurs provenant d’une étude sur un modèle murin de surdité humaine, ont jeté les bases du premier essai clinique en cours. Nous proposons d’injecter les préparations virales à différents stades clés du développement et de la maturation du système auditif : afin de déterminer la fenêtre temporelle qui permet une meilleure restauration des fonctions auditive et/ou vestibulaire pour chaque surdité traitée. 1) Dans l’hypothèse où l’apport du gène serait trop tardif par rapport à la mise en place de la machinerie de mécano-transduction des cellules sensorielles auditives (à E15), une solution possible serait d’effectuer la thérapie génique avant la mise en place de la touffe ciliaire. Nous allons donc effectuer des injections in utero dans l’otocyste à l’age de 14 jours embryonnaires (E14). 2) immédiatement après la naissance, entre le premier et le troisième jour postnatal (P1 à P3) 3) à un stade mature de l’audition (entre P15-P30) Les tests auditifs seront réalisés chez des souris âgées de 21 jours à 30 semaines afin de pouvoir évaluer la restauration de l’audition dans le temps. Les mesures de patch-clamp sont effectuées sur des cochlées de souris âgées entre P20 et P35. Les tests comportementaux seront réalisés 30 à 45 jours post-traitement.

Quatre injections dans le muscle à sept jours de vie, sous anesthésie, puis pour une partie des souris une mesure de l'activité électrique du nerf de trente minutes et une mesure de contractilité musculaire de vingt-cinq minutes. 812 souris vont être utilisées, 584 porteuses de la dystrophie musculaire de Duchenne et 228 témoins, toutes tuées à l'issue pour les prélèvements. Le porteur décrit chez les souris malades de l'anxiété, une crise inflammatoire de trois semaines, une faiblesse musculaire à deux mois, un pelage terne et le dos vouté à trois mois, une atteinte de l'audition à cinq mois, et déclare pourtant 776 de ces 812 animaux en niveau de souffrance légère. Le facteur de croissance testé pourrait, à long terme, compléter les thérapies géniques en cours de développement chez les patients.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, nous envisageons de poursuivre nos investigations sur les mécanismes moléculaires mis en jeu suite à l’injection d’un facteur de croissance qui possède un réel potentiel thérapeutique en améliorant l’intégrité du muscle dystrophique.

Bénéfices attendus

Nous attendons, comme bénéfices à court terme, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec le facteur de croissance d’intérêt. A long terme, cette molécule pourrait être utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions telles que : 1/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce suivies d’une euthanasie par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses. 2/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce (10 minutes) associés à deux injections intrapéritonéales sur animal vigile espacées de 24h (1 minute/injection) suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses. 3/ Quatre injections intramusculaires (10 minutes) effectuées sous anesthésie et analgésie à un stade précoce suivies d’une mesure ayant pour but de mesurer l'activité électrique des nerfs et des muscles effectuée sous anesthésie et analgésique (30 minutes) et enfin une mesure de la contractilité musculaire sous anesthésie et analgésie (25 minutes) après laquelle les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

La souris mdx présente un phénotype dommageable pouvant s'expliquer par un phénotype anxieux, l'apparition d'une crise inflammatoire d'une durée de 3 semaines à 3 semaines de vie et d'une faiblesse musculaire à 2 mois de vie. Certains animaux peuvent avoir un pelage terne et le dos vouté à partir de 3 mois de vie et des problèmes d'audition à partir de 5 mois de vie. Lors du transport entre l'animalerie fournisseur et notre animalerie et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lors de leur transfert dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Au moment des injections intramusculaires et des procédures d’analyse fonctionnelle, les animaux subissent un stress lorsqu’ils sont placés dans la cage à induction pour l’anesthésie gazeuse et une douleur/inconfort équivalent à l'introduction d'une aiguille lors des injections en intrapéritonéal. Suite à l’injection intramusculaire, une gêne et/ou une anomalie au niveau du site d’injection pourrait éventuellement apparaître. De même, lors de la procédure permettant la mesure de l'influx nerveux, des électrodes sont placées en sous-cutané dans le tibialis anterieur, ce qui peut induire une gêne au réveil de l’animal. Au cours de l’anesthésie profonde, les animaux pourraient être victimes d’hypothermie ou d’arrêt cardio-respiratoire suite à l’administration de l’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses prévues. Les géniteurs seront euthanasiés après 8 mois de vie ou après la génération de 4 portées pour les femelles.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. Il s'agit du modèle le plus approprié car il est bien caractérisé, avec un phénotype connu et avec beaucoup de littérature à l'appui. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.

Réduction

Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 8 animaux est un nombre d'échantillons minimum pour obtenir des résultats statistiquement analysables. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 6 à 12 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. Au total, nous prévoyons d'utiliser 812 animaux (584 souris dystrophiques et 228 souris contrôles). La taille des effectifs sera établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Nous respecterons une période d’acclimatation de 2 semaines pour les animaux sauvages provenant d’un éleveur extérieur. Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et de tunnels de carton dans les cages d'accouplement. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante thermorégulée à 37 degrés. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l’euthanasie compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le but de notre projet est la caractérisation de nouvelles voies moléculaires et l’identification de cibles thérapeutiques potentielles pour le maintien de la masse musculaire du muscle dystrophique. La souris présente l’avantage de permettre des études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. Ce modèle est le plus approprié car il est bien caractérisé, avec un phénotype connu et avec beaucoup de littérature à l'appui. Nous utiliserons des souris âgées de 7 jours car nous souhaitons étudier l’impact de la sur-expression de notre facteur de croissance d'intérêt sur le processus de nécrose régénération qui a lieu à 4 semaines de vie. Et nous utiliserons des géniteurs âgés de 2 à 8 mois.