Procédures légères

2 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune buvant pendant quatre mois une eau additionnée des molécules testées, puis nageant dans la piscine de Morris quatre fois par jour pendant cinq jours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré. S'y ajoutent deux séjours de deux jours et deux nuits en cage individuelle munie d'une roue, pour mesurer l'activité de souris que le porteur décrit comme apathiques. Ces souris portent des mutations qui provoquent un déficit cognitif et des troubles de la mémoire s'aggravant avec l'âge, et le bénéfice annoncé, une future utilisation de ces molécules dans le traitement clinique de la maladie d'Alzheimer, reste au conditionnel.

Objectifs

Les patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA) présentent dans leur cerveau des aggrégats protéiques toxiques que sont d'une part les dégénérescences neurofibrillaires composée de protéine Tau et les plaques sénilescomposées en majorité du peptide amyloïde (Ab). Selon l'hypothèse amyloïde, l'Ab serait le principal responsable des dysfonctionnements liés à la MA or nos résultats montrent que son précurseur, le fragment C99 contribue aussi à la pathologie. Au laboratoire, nous avons mis en évidence une accumulation très précoce de ce fragment dans le cerveau de souris modèle de la MA ce qui conduit à des dysfonctionnements cellulaires et contribue à un deficit cognitif. En plus de la pathologie liée au peptide Ab et au fragment C99, l'aggrégation de la protéine Tau observée dans les cerveaux des patients Alzheimer conduit à un dysfunctionnement synaptique. De manière interéssante, de nouvelles molécules sont capables de diminuer à la fois la pathologie liée à Tau et celle liée à l'Ab. L'objectif de ce projet est d'explorer l'effet de ces nouvelles molécules sur la pathologie liée au fragment C99 dans plusieurs modèles murins de la MA.

Bénéfices attendus

Ces nouvelles molécules ont été décrites comme améliorant le déficit cognitif des souris en réduisant à la fois la pathologie liée à la protéine Tau et celle liée au peptide Ab. Ce projet a pour but non seulement de confirmer l'effet de ces nouvelles molécules sur un nouveau modèle murin de maladie d'Alzheimer combinant à la fois la pathologie Tau et celle d'Ab mais aussi d'étudier spécifiquement l'effet de ces molécules sur la pathologie liée au fragment C99. Ce projet de recherche fondamentale devrait apporter des informations importantes sur les mécanismes moléculaires que pourraient cibler ces molécules et déterminer si ces molécules sont capables de restaurer des phénotypes pathologiques liés au fragment C99. Il devrait également fournir des perspectives cruciales pour une future utilisation de ces molécules dans le traitement clinique de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les animaux subiront au plus 3 interventions: 1-Le traitement par une administration des molécules dans l'eau de boisson pendant 4 mois. 2-Les mesures d'activité et de distance parcourue dans la roue dans des cages métaboliques : pour chaque souris 2 passages sont prévus avant et après le traitement pendant 2jours et 2nuits consécutives. 3-Le test de mémoire qui consiste en 5 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour d'une minute, 2 tests d'une minute 24h et 72h après le dernier jour d'apprentissage et un test visible comportant 3 essais d'une minute le même jour .

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype dommageable avec un déficit cognitif, des défauts d’apprentissage et de mémorisation qui s’aggravent avec l’âge. Les molécules utilisées dans ce projet ont déja été administrées à des souris sauvages ou transgéniques pendant 4 mois à une concentration de 1mg/kg sans effet indésirable visible sur l'état physiologique des souris conservant un poids stable, une consommation d'eau et de nourriture stable et un comportement normal dans la cage. Au cours du test de la piscine de Morris, les souris sont contraintes à nager dans l’eau qui est un environnement stressant pour les souris mais la durée de chaque passage dans la piscine ne dure qu'une minute, 4 fois par jour pendant 5 jours durant la phase d'apprentissage et une minute pendant la phase de test. Les mesures d'activité dans les cages métaboliques consistent à isoler les souris dans des cages individuelles 2 jours et 2 nuits consécutifs pour comptabiliser les mouvements de chaque souris. Ce test peut éventuellement générer un léger état d’anxiété lié à l’isolement social mais nous estimons que la durée n'est pas suffisament longue pour avoir une quelconque conséquence pour le bien être des animaux. De plus cet isolement est compensé par la présence d'une roue dans la cage considérée comme un enrichissement de l'environnement. Pour les analyses histologiques, certaines souris seront profondément anesthésiés et pour éviter toute douleur à l'animal, avant toute intervention, la profondeur de l'anesthésie sera vérifiée au préalable par l'absence de réaction de l'animal au pincement de la membrane inter-digitale.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mises à mort afin de récupérer leur cerveau et effectuer les analyses biochimiques et histologiques nécéssaire au projet scientifique.

Remplacement

Les expériences de comportement de souris telles que la piscine de Morris ou les mesures d'activités ne peuvent malheureusement pas être remplacées par des expériences in vitro. Cependant toutes nos expériences biochimiques, immunohistologiques et nos analyses des mécanismes moléculaires sont étudiées en parallèle sur des modèles cellulaires exprimant les mêmes mutations ou le fragment C99.

Réduction

Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est ainsi déterminé par une méthode statistique adaptée. Les tests de comportement que nous utilisons ont déjà été testés sur nos modèles de souris et nous avons déjà établi un protocole bien déterminé ce qui évitera de réaliser des expériences préliminaires de mise au point. Notre étude comportementale requière des groupes de 30 à 33 animaux minimum. Cependant, pour réduire le nombre d’animaux, quand cela est possible, les mêmes groupes de souris seront utilisés pour plusieurs test comportementaux et pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques.

Raffinement

Nos modèles de souris sont utilisés en routine dans notre laboratoire et sont désormais très bien caractérisés et ont déjà fait l'objet de projet expérimentaux en 2014 et 2017. Ainsi pour chaque modèle, nous connaissons très bien la cinétique d'apparition et d'évolution de la pathologie pour déterminer les âges adéquats et pouvoir traiter nos souris en préventif (4 mois) ou en curatif (12mois). Pour évaluer au mieux le phénotype de type apathique des souris, nous utilisons des cages métaboliques munies d'une roue ce qui nous permet de mesurer leur activité dans la roue et ainsi d'évaluer au mieux le phénotype apathique. Pour atténuer au maximum le stress causé par le test de memoire pour lequel les souris sont contraintes de nager dans l'eau, une phase d’habituation sera réalisée avant le début du test. La température de l'eau utilisée permet un bon équilibre entre motivation et bien-être de l'animal et dès la sortie de l'eau, les souris seront séchées sur un papier absorbant et la cage placée sur un tapis chauffant. Pour limiter le stress, les souris sont hébergées dans des cages comportant une maisonnette ainsi que de la ouate favorisant la nidification. Pour définir le plus objectivement possible le bien être des souris et assurer au mieux leur survaillance tout au long de chaque procédure, nous utiliserons une grille de scores et nous nous référons aux points limites établis préalablement.

Choix des espèces

Pour déterminer in vivo si ces molécules sont bénéfiques dans le traitement contre la maladie d'Alzheimer au niveau comportemental, et pour étudier in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans l'effet bénéfique des molécules, nous sommes contraints d'utiliser des modèles de souris mimant la maladie et présentant des déficits cognitifs. Les données scientifiques générés dans ce projet seront cruciales pour une application thérapeutique future à un stade précoce de la maladie étant donné que le C99 intervient de manière beaucoup plus précoce que l'Ab dans la pathologie. En tenant compte de nos résulats antérieurs, nous avons choisi de tester l'effet des molécules à 2 âges : un âge précoce (2mois) pour voir si les molécules sont capables de retarder le comportement de type apathique; et un âge plus tardif (12mois) pour voir si les molécules sont capables de restaurer les déficits cognitifs et le retard d'apprentissage spatial présent à cet âge.

Injectées dans la veine de la queue, des cellules tumorales forment des tumeurs dans plusieurs organes chez 120 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit ensuite entre deux et cinq injections intrapéritonéales de cytokines et d'inhibiteurs, et jusqu'à trois tests d'agrippement consécutifs. L'objet déclaré est de comprendre comment les cytokines activent les cellules Natural Killer et ce qui régule cette activation, les retombées en santé humaine étant renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur écrit que le modèle est bien caractérisé, ce qui lui permet de limiter la souffrance des animaux, puis dans la phrase suivante que les tumeurs formées dans plusieurs organes sont source de souffrance pour l'animal.

Objectifs

Les cellules Natural Killer sont des cellules immunitaires spécialisées dans la lutte anti-tumorales. Elles peuvent être activées par des protéines appelées cytokines. L'objectif de ce projet est de mieux définir ce que permet l'activation par les cytokines lors d'une réponse antitumorale et de comprendre ce qui la régule. Dans un premier temps, nous étudierons l'effet d'un traitement cytokinique sur les cellules Natural Killer de différents organes. Dans un deuxième temps, nous étudierons l'impact de ce traitement sur la réponse antitumorale dépendante des cellules Natural Killer. Enfin, nous inhiberons un processus que nous supposons impliqué dans l’activation des cellules NK par les cytokines et nous mesurerons l'impact de cette inhibition sur la réponse antitumorale des cellules Natural Killer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir la régulation de l’activité anti-tumorale des cellules Natural Killer. Etant donné le rôle de ces cellules dans la réponse anti-tumorale, ces résultats pourraient à terme conduire à des développements en santé humaine.

Procédures

Les animaux seront greffés avec les cellules tumorales par injection intraveineuse dans la veine de la queue (1 injection par souris, 1 minute). Elles recevront aussi les cytokines et les inhibiteurs de la voie que nous étudions par injection intrapéritonéale (entre 2 et 5 injections par souris, moins de 10 secondes par injection). Des tests d'aggripement (jusqu'à 3 tests consécutifs) seront effectués.

Impact sur les animaux

Le modèle est bien caractérisé, ce qui nous permet de limiter la souffrance des animaux. Lors d'une injection intraveineuse, les cellules injectées forment des tumeurs dans plusieurs organes, ce qui est source de souffrance pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cellules Natural Killer en culture activées à l'aide des cytokines étudiées ont été effectuées. Elles ont mis en évidence une forte augmentation des fonctions antitumorales des cellules Natural Killer et une implication claire d'une voie de signalisation cellulaire dans ce processus. Ces modèles expérimentaux sont cependant limités, ne reproduisant qu’imparfaitement les conditions rencontrées in vivo, notamment la nécessaire migration au sein des organes infiltrés par la tumeur. Il est donc maintenant nécessaire de mettre en place un modèle animal.

Réduction

Des approches statistiques ont été choisies de façon a reduire le nombre d'animaux a minima pour avoir des résultats significatifs robustes. L'utilisation des animaux est optimisée par la réalisation d'analyses multiples sur différents organes d'un même animal. Lorsque cela est possible, la comparaison au sein d’une seule expérience des différentes conditions testées permettra de réduire 1) le nombre de souris utilisées et 2) la variation expérimentale inhérente à la réalisation d’expériences indépendantes. Enfin, les procédures se feront séquentiellement, le résultats des premières déterminant la conduite des suivantes.

Raffinement

Le modèle tumoral et les molécules utilisées sont bien definis et maitrisés par les expérimentateurs. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux. Les animaux seront surveillés individuellement et quotidiennement afin de vérifier leur bon état général sur des critères de signes cliniques, d’aspect et de comportement. Des points limites sont bien définis pour éviter toute souffrance animale. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et l’eau, des croquettes humidifiées seront déposés sur le sol de la cage aux stades terminaux de la pousse tumorale.

Choix des espèces

Les cellules Natural Killer ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8 à 28 semaines seront utilisées. En effet, c'est à partir de l'âge de 8 semaine que les souris ont un système immunitaire mature. D'autre part, la réponse anti-tumorale ne varie pas sur la tranche d'âge considérée. Nous serons de cette façon plus flexibles lors des commandes ou s'il est nécessaire de décaler le début d'une expérience, évitant ainsi la mise à mort d'animaux inutiles.

Deux heures d'anesthésie par mini-porc pour l'implantation, puis un suivi par IRM à un, trois, six et neuf mois et à un an : 840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des matrices en polymères et des hydrogels leur sont implantés sous la peau ou dans une chambre d'ingénierie tissulaire, avec un prélèvement sanguin pendant la chirurgie, pour mettre au point une reconstruction du sein et de l'hypoderme destinée à remplacer implants en silicone et transferts de graisse. Le porteur annonce des risques de rejet, d'inflammation locale et de toxicité, et prévoit l'explantation ou la mise à mort selon la gravité de l'état de l'animal. Le choix des espèces tient à la ressemblance de leur peau avec la peau humaine et à leur taille, qui permet de tester plusieurs conditions sur un même individu.

Objectifs

Actuellement, les solutions cliniques pour la reconstruction des couches profondes de la peau et du sein à l'aide de tissu adipeux présentent des limitations significatives. Les procédures de transfert de graisse autologue peuvent entraîner des complications au site donneur et ne garantissent pas des résultats prévisibles. L'introduction de corps étrangers comme les implants mammaires en silicone comporte des risques potentiels pour la santé et nécessite une surveillance à long terme. Les approches de reconstruction cutanée après une atteinte profonde se concentrent sur l'utilisation de greffes de peau, négligeant l'hypoderme et limitant ainsi la reconstruction complète. Ce projet vise à développer une approche novatrice et biocompatible pour la régénération du tissu adipeux. Cette solution repose sur l'utilisation synergique d’une matrice en polymères et d'hydrogels cellularisés, offrant ainsi une alternative esthétique et fonctionnelle prometteuse pour les patient(e)s. Le premier objectif est d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels utilisés dans cette approche. Il est essentiel de s'assurer que ces matériaux ne provoquent pas de réactions indésirables et qu'ils favorisent la régénération du tissu adipeux. Utilisant un modèle animal, nous chercherons à comprendre les interactions complexes entre les adipocytes, l'hydrogel, la matrice polymère, et l'organisme hôte. Cette étape est cruciale pour optimiser la compatibilité et l'intégration des matériaux dans le corps. Nous évaluerons également la possibilité d'utiliser des cellules souches humaines dans la combinaison hydrogel/matrice, en utilisant un modèle de souris immunodéprimées. Cette approche permettra de simuler au mieux les conditions humaines et d'évaluer l'efficacité de la régénération tissulaire. Afin d’étudier l’influence des matériaux sur un modèle de rongeur qui permet de tester des matériaux de taille moyenne, le rat sera employé pour une première comparaison des différentes combinaisons. Une fois la meilleure combinaison hydrogel/matrice sélectionnée, nous réaliserons des tests sur le porc, un modèle animal plus proche de l'homme en termes de physiologie et de composition cutanée. Cette étape sera cruciale pour valider l'efficacité clinique. Ce projet est porteur d'un potentiel majeur pour l'innovation en chirurgie plastique et reconstructrice, et il pourrait révolutionner les pratiques à l'échelle mondiale.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à déterminer les combinaisons optimales d'hydrogels et de matrices pour la régénération du tissu adipeux, avec des implications majeures à la fois sur le plan clinique et scientifique. Il offre la possibilité d'améliorer considérablement les options de reconstruction mammaire et cutanée actuellement disponibles, en limitant les inconvénients des méthodes traditionnelles et en garantissant une meilleure biocompatibilité et performance.

Procédures

Ce projet se déroule en plusieurs étapes. Après une période d'acclimatation d'au moins une semaine, tous les animaux (840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs) seront anesthésiés par inhalation (15 minutes pour les rongeurs et 1 heure pour les mini-porcs). Pour les rats, le pelage sera tondu dans les zones d'implantation (10 secondes). Pour tous les animaux, les zones d'implantation seront désinfectées à l'aide d'un désinfectant (10 secondes). Pour la procédure ayant pour but d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels, une injection en sous-cutanée sera effectuée (10 min, 130 souris et 130 rats). Pour obtenir un tissu adipeux vascularisé reconstruit, une combinaison de chambres d'ingénierie tissulaire (pour la reconstruction du sein, 250 souris, 250 rats, 80 porcs) ou de matrices 3D (pour la reconstruction de l'hypoderme, 250 souris, 250 rats, 24 porcs) sera associée à des hydrogels cellules ou à de la graisse (durée totale de l'anesthésie : 30 minutes par rongeur ou 2 heures par mini-porc). Pendant la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué. Afin d’avoir un applicatif clinique, il est nécessaire d’évaluer si la cryopréservation des construits permet d’obtenir la même performance que des construits préparés extemporanément, de ce fait 150 souris et 130 rats seront implantées avec des construits ayant bénéficié de différentes méthodes de cryopréservation. Toutefois, la procédure appliquée à ces animaux est identique à celles expliquées précédemment. Pour les souris et les rats, un essai de survie cellulaire in vivo sera suivi longitudinalement par bioluminescence. À cette fin, les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse (10 minutes). Pour les rats et les porcs (utilisant une chambre d'ingénierie tissulaire pour la reconstruction du sein), le suivi longitudinal de la croissance du lambeau sera effectué par IRM à 1, 3, 6, 9 mois et 1 an après l'implantation. Pour cela, les animaux seront sous anesthésie gazeuse (durée de la procédure : 30 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant être constatés sont une irritation ou une inflammation locale à proximité du matériau, des risques de rejet ou de toxicité locale et systémique. Afin de limiter les risques, de nombreuses expériences in vitro ont été effectuées, ne montrant pas de signe de toxicité. De plus, des mesures sont mises en place et les animaux feront l’objet d’une vigilance quotidienne et rigoureuse pour détecter tout signe de souffrance ou d’approchement de point limite. Un contrôle du site opératoire sera réalisé lors de chaque visite quotidienne. La prise pondérale sera évaluée deux fois par semaine. Un traitement antidouleur sera administré, et si nécessaire, des mesures telles que l'explantation ou la mise à mort de l'animal seront envisagées en fonction de la gravité de son état.

Devenir

Du fait de notre protocole, nos animaux ne peuvent pas être replacés. Il est nécessaire de mettre à mort nos animaux pour réaliser nos prélèvements histologiques.

Remplacement

Nous avons employé une variété de techniques in vitro pour évaluer l'impact de nos polymères sur le destin des cellules, y compris leur survie et leur différenciation ainsi que sur l'angiogenèse en utilisant la membrane chorioallantoïque de poulet comme modèle. Toutefois, afin de déterminer pleinement les performances de nos biomatériaux en matière de régénération tissulaire, il est impératif de procéder à des essais in vivo. Ces expériences permettront de prendre en compte la complexité d'un système physiologique réel, incluant notamment les réponses inflammatoires, la formation de tissu cicatriciel, et les processus naturels de guérison. Les études in vivo nous fourniront ainsi des données cruciales pour optimiser notre technique avant de franchir l'étape des études cliniques.

Réduction

Une étude pilote sera réalisée dans un premier temps afin de vérifier que les conditions expérimentales choisies sont adéquates. Les études in vitro précédemment réalisées ont démontré l’efficacité des différents polymères résorbables quant à leur influence sur la survie et la prolifération cellulaire ainsi que sur la différenciation adipocytaire. Elles ont permis une sélection des polymères permettant le maintien des adipocytes et favorisant la néovascularisation. Elles ont également pu donner une idée du temps de résorption des polymères dans un liquide physiologique reconstitué à 37°C. Les expériences seront réalisées de manière séquentielle, ce qui permettra de limiter le nombre de répétition en fonction des résultats des groupes précédents. En fonction des résultats, les tests statistiques adéquats seront utilisés pour analyser les résultats.

Raffinement

Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage pour les souris et en hébergement unique pour les rats et les mini-pigs. Cet environnement est enrichi (balle pour le mini-pig par exemple) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement, de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance (modification de l’apparence, prostration, poil hérissé, perte de poids…), un traitement analgésique sera envisagé. Des points limites adaptés pour chaque procédure seront définis avant l’expérimentation et dans le cas où ceux-ci seraient atteints ou que le traitement analgésique n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie (avec anesthésie au préalable). La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.

Choix des espèces

Le porc et le rat sont des espèces appropriées pour étudier les processus de régénération de la peau car les structures anatomiques et physiologiques de leurs peaux sont celles qui ressemblent le plus à celle des humains. Le rat est un animal que nous avons fréquemment utilisé dans nos études précédentes et dont le modèle est maitrisé. De plus, notre équipe maîtrise maintenant la levée des lambeaux chez ces espèces pour nos modèles de régénération du sein. La taille du porc et du rat nous permet de tester plusieurs conditions sur un seul animal et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre intérêt s’est porté sur les souris standards, immunodéprimées utilisées dans une étude de reconstruction de la peau humaine et humanisées qui permettent d’évaluer le comportement de cellules/tissus humains en présence de nos biomatériaux. Les souris sont âgées de 8 semaines et pesant 20 à 23 grammes afin que les souris aient atteint leur maturité sexuelle. Utiliser des souris matures permet d'avoir une taille adéquate pour réaliser l'implantation. Les rats adultes sont agêes de 15 semaines minimum afin d'avoir une réserve de graisse sous-cutanée suffisante pour réaliser les implantations et permettre de tester plusieurs conditions expérimentales sur un même animal. Pour les porcs, nous utiliserons deux types d'animaux : des porcs 45 à 55kg pour la reconstruction de la peau afin d’éviter d’avoir un hypoderme trop épais (car la zone à reconstruire serait trop importante et peu représentative d’un hypoderme humain) et des porcs de 70 kg pour la reconstruction du sein afin que la taille de l’animal soit compatible avec l’implantation de chambre équivalente à celle que l’on pourrait implanter chez l’humain.

Tuées pour l'analyse post-mortem de leur cerveau, 320 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre un niveau léger. Toutes reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant quatre jours, et une partie subit une chirurgie terminale de quinze minutes sous anesthésie pour le prélèvement d'organes. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer un léger retard de croissance chez les jeunes et rendre les femelles stériles, effets qu'il rapporte sans en tirer de conséquence sur le protocole. Il affirme le recours à la souris "essentiel", sans expliquer comment le nombre de 320 animaux a été établi pour les quatre stades de développement étudiés.

Objectifs

La forme familiale primaire de calcification cérébrale (PFBC) consiste en une calcification progressive des vaisseaux sanguins cérébraux provoquant leur dégénérescence. Les anomalies génétiques responsables de cette maladie ont principalement été trouvées sur la voie Pdgfb. Les modèles murins génétiques ciblant la voie Pdgfb reproduisent partiellement le phénotype de la maladie. Dans ces modèles murins génétiques, la perte totale soit du Pdgfb, soit de son récepteur, entraine la mort des souris avant la naissance, alors que la maladie humaine apparait après plusieurs mois de vie. Une altération partielle de cette voie, par des mutations ciblées soit du Pdgfb ou de son récepteur reproduisent une partie des anomalies de la maladie humaine. Cependant, ils présentent le désavantage de mélanger des mécanismes physiopathologiques différents (développementaux, inflammation, vieillissement), qui empêche une compréhension fine de cette maladie. Nous proposons ici de développer une nouvelle approche pharmacologique à différents stades de développement précis pour décortiquer les différentes composantes cellulaires impliquées à chaque stade. L’efficacité du traitement sera évaluée par le taux de perte des pericytes (une population cellulaire particulière présente sur les vaisseaux sanguins) sur le réseau capillaire cortical comme dans les autres modèles murins déjà étudiés. Ce projet nécessitera un total de 320 souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la PFBC et dans le développement de l’unité gliovasculaire du cerveau. Ce projet apportera des éléments de connaissances essentiels sur de nombreuses pathologies cérébrales dans lesquelles ces régulations sont altérées pour in fine proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

L’ensemble des animaux recevra 1 injection intrapéritonéale par jour pendant 4 jours, dont le volume et concentration dépend de l’âge étudié. Une partie des animaux sont soumis à une chirurgie terminale sans réveil pour le prélèvement d’organe, qui dure 15minutes.

Impact sur les animaux

En fonction de l’âge d’administration, et en se basant sur les données connues sur les modèles génétiques, les souris pourraient éventuellement souffrir d’un léger retard de croissance (injections aux stade jeunes) et une stérilité chez les femelles (injections chez les jeunes et les adultes)

Devenir

mise à mort pour des analyses post mortem des cerveaux

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Une première procédure a pour objectif d’établir la dose optimale sans utiliser trop d’animaux. Pour chaque stade développemental étudié, elle sera effectuée sur seulement 6 animaux/dose/protocole (temoin ou molécule effective). Ce nombre permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en vérifiant que l’effet obtenu est suffisamment robuste. Cela nous permettra de conclure sur la dose optimale à utiliser pour la suite de l’étude. Pour la suite, le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs.

Raffinement

Pour vérifier la bonne tolérance des animaux à l’injection répétée du produit chimique, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place adaptée à l’âge étudié. Elle est basée sur l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé), la mobilité des animaux (prostration), l'absence de lésion ou saignement, la présence d'un nid dans la cage. Ces points limites intermédiaires permettent la mise en place de soins des animaux évitant l'euthanasie des animaux. Pour la la chirurgie terminale sous anesthésie générale et antalgique efficace évite toute sensation douloureuse chez l’animal. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, injection intraperitonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme 4 stades de développement seront étudiés entre 5 et 60 jours après la naissance. Ces stades ont été choisis sur la base d’études préalables (en particulier dans notre laboratoire) qui montrent qu’il existe dès la naissance une altération du réseau vasculaire cérébral en absence de pericytes, mais que les mécanismes mis en jeux dans leur élimination/ remplacements pourraient être différents une fois passée la période développementale postnatale.

Tester cinq souches probiotiques candidates conduit ici à sevrer précocement des souriceaux, puis à les infecter par un germe intestinal ou extra-intestinal. 1 054 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal est gavé sous contention vingt et une ou vingt-deux fois, isolé dans un pot en plastique pour recueillir ses excréments jusqu'à huit fois, saigné à la joue, et pour une partie d'entre eux piqué dans l'œil sous anesthésie. Le porteur annonce une perte de poids, un pelage hérissé, une posture voûtée et des diarrhées liées aux infections, et justifie l'usage des rongeurs par l'impossibilité de reproduire les communications entre organes sur des cultures cellulaires.

Objectifs

Le microbiote intestinal est une communauté dynamique, composée de microorganismes (bactéries, champignons, virus…) influencée par de multiples facteurs tout au long de la vie d’un individu. La transmission du microbiote par la mère est le facteur le plus important qui conditionne le schéma de colonisation microbienne chez le nouveau-né (primocolonisation). Aujourd'hui, il y a une tendance dans les populations humaines occidentalisées à avancer la fin de l’allaitement (sevrage) du nourrisson ce qui a un impact sur la primocolonisation et qui pourrait avoir un impact direct sur la santé du nouveau-né. Au cours du développement précoce du nouveau-né, des perturbations dans les interactions entre le microbiote et l'hôte pourraient nuire de manière irréversible et durable à la maturation du système immunitaire, prédisposant l'hôte à développer des maladies inflammatoires et une altération de la fonction de la barrière intestinale. Cette fonction correspond à la capacité de la muqueuse intestinale à confiner des éléments indésirables (typiquement des bactéries pathogènes) dans la lumière intestinale tout en conservant sa capacité d’absorption des nutriments. Dans ce contexte, des interventions ciblées au tout début de la vie pourraient constituer des stratégies faciles à mettre en œuvre et à contrôler pour compenser les perturbations du microbiote dues à ces sevrages plus précoces. Dans ce projet, nous nous proposons d´utiliser un modèle de souris de sevrage précoce et d’étudier la capacité d’une supplémentation avec différents probiotiques candidats (5 candidats en tout), c’est-à-dire des microorganismes ayant des effets santé bénéfique, à restaurer le microbiote intestinal. Pour évaluer si cette restauration est bien fonctionnelle, nous allons soumettre les souris ayant subi un sevrage précoce à une infection. Cette infection sera causée soit par un pathogène intestinal soit par un pathogène extra-intestinal (2 pathogènes différents).

Bénéfices attendus

Le bénéfice essentiel de ce projet est d’évaluer la capacité de 5 bactéries potentiellement probiotiques à améliorer la récupération du microbiote intestinal et les conséquences physiologiques liées au sevrage précoce. Il s’agit donc d’améliorations de connaissances fondamentales et des perspectives potentielles d’utilisation de bactéries probiotiques pour aider à la restauration d’un microbiote altéré par le sevrage précoce.

Procédures

Contentions et gavage sur animal vigile: 21 contentions et gavages pour 969 souris + 1 contention avec gavage pour 486 souris (les animaux subiront donc ce geste 21 ou 22 fois, selon les cas) ; chaque contention/gavage dure environ 15 secondes. Prélèvement de fèces : 1 fois pour 1063 animaux + 7 fois pour 486 souris (les animaux subiront donc ce type de prélèvement 1 fois ou 8 fois selon les cas) ; chaque prélèvement dure quelques minutes. injections : 1 fois pour 483 animaux vigiles et 1 fois pour les mêmes animaux anesthésiés. Contention et piqûre réalisées en 15-20 secondes environ Prélèvement de sang : sur animal vigile, 969 animaux concernés (concerne une seule fois chaque animal). Un prélèvement = une durée totale de 1 minute environ.

Impact sur les animaux

Les nuisances de ce protocole proviennent majoritairement des infections. Les principaux symptômes visibles attendus sont : une perte de poids et des signes cliniques tels que pelage hérissé, posture voûtée. L’une des infections pourrait en outre générer des altérations du transit intestinal, de type diarrhée légère. Le sevrage précoce peut engendrer chez les souriceaux un retard dans leur prise de poids. Par ailleurs, un stress temporaire lié à l’hébergement individuel des mères peut survenir en fin de gestation. Il y aura besoin de contention pour certaines manipulations qui peuvent générer un inconfort et un stress transitoires pour les animaux. Il y aura des administrations qui nécessiteront une anesthésie et une piqûre au niveau de l’œil. L’anesthésie nécessite une piqûre qui génère une brève douleur. La piqûre au niveau de l’œil étant réalisé sur animal anesthésié ne génère pas de nuisance particulière. Par ailleurs, nous isolerons les animaux dans des pots en plastique transparents afin de collecter des fèces individuellement. Cet isolement dure quelques minutes et peut générer un léger stress. Enfin, en fin d´essai, nous réaliserons un prélèvement de sang à la joue. Cette opération nécessite une contention et une piqûre, ce qui peut occasionner un stress et une douleur brève.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. La survie des animaux (souriceaux puis adultes) est incompatible avec les différents prélèvements et procédures effectués.

Remplacement

Les rongeurs sont couramment utilisés pour les études des interactions microbiote-hôte, car de telles expériences ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes.

Réduction

Les bactéries testées seront issues d’un programme préalable de criblage in vitro afin de ne conserver , pour les études sur les animaux, que des bactéries ayant montré un potentiel dans ces modèles. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux seront séparés pour être manipulés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum), pour la récupération de fèces dans des pots. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton (sans encre) et des hamacs en plastique. Le matériel utilisé est adapté pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Les manipulateurs maitrisant les gestes, le temps d’intervention et donc le stress seront réduits. Nous utiliserons des anesthésies adaptées en temps et aux besoins des essais. Lors des anesthésies, un gel oculaire sera appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux des animaux. Des pads, avec une température stabilisée de 37°C, seront également placés sous les cages pour maintenir la température corporelle des animaux pendant l’anesthésie. Des tapis chauffants électriques seront aussi utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines, incluant les études sur le microbiote intestinal de par leurs similitudes fonctionnelles. La lignée retenue pour ce projet a été sélectionnée car elle a de fortes performances de fertilité et une bonne taille de portée (12 souriceaux en moyenne). Les souris seront utilisées du stade du nouveau-né au stade adulte.