Procédures légères

Tous relâchés à l'endroit exact de leur capture, les femelles gestantes après un mois de captivité et les nouveau-nés dans les quatre jours suivant la mise bas, 5 700 lézards vivipares vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque individu non marqué est amputé d'une phalange et perd l'extrémité de sa queue, moins d'un centimètre chez l'adulte, deux millimètres chez le juvénile. Les expérimentateurs les font ensuite courir, à tous les stades, sur une piste de sprint et sur un tapis roulant pour mesurer leurs performances locomotrices. Le porteur écrit qu'il n'existe "pas d'alternative préférable" pour marquer les juvéniles, les marquages externes étant impossibles et les transpondeurs trop volumineux, et il cite des travaux montrant que la puce électronique stresse davantage que l'amputation.

Objectifs

Un point clé de la persistance des populations face aux impacts des activités humaines sur l'environnement est de prédire leur capacité à changer leurs caractéristiques face à ces nouvelles conditions environnementales, que ce soit par l’acclimatation (via la modification directe de ces caractéristiques), ou par l’adaptation (processus génétique et évolutif). Pour étudier ces phénomènes et leurs mécanismes, la meilleure méthode consiste à mettre en place un suivi individuel de populations particulières, sur lesquelles il est possible d’obtenir la filiation de tous les individus au cours du temps. Malheureusement, peu d’espèces se prêtent à l’exercice, et parmi celles étudiées par cette méthode, les endothermes (oiseaux et mammifères) sont de très loin surreprésentés. Cette demande concerne la poursuite d’un suivi de populations naturelles d’un reptile ectotherme, le lézard vivipare (Zootoca vivipara), étudiées depuis 30 ans. Ce suivi profite de la viviparité de cette espèce, qui permet l’accès aux juvéniles, pour mettre en place une étude approfondie des relations d’apparentement entre individus, ce qui permet d’étudier la sélection naturelle dans cette population, et d’en étudier la réponse évolutive. Un objectif secondaire est d'étudier plus directement comment le réchauffement climatique accélère le rythme de vie des individus (plus forte croissance, reproduction et mortalité, pour un résultat net généralement négatif) en mettant en lien les performances des individus, notamment locomotive avec la température de leur environnement et leur vieillissement biologique.

Bénéfices attendus

La connaissance des maternités grâce à l'hébergement des femelles gestantes jusqu’au terme, complétée par la reconstruction des paternités par l’analyse de l'ADN contenu dans les prélèvements de queue, permet (1) d'obtenir le succès reproducteur des individus mâles et femelles dans la population, ouvrant la voie à l'étude de la sélection naturelle ; (2) l'établissement de l'ensemble des liens de parentés des individus dans toute la population, ouvrant la voie aux études de génétique quantitative ; et (3) des analyses génomiques pour étudier les bases génétiques des traits étudiés et mieux prévoir leur évolution. Les mesures de performances locomotrices de tous les individus, des mesures moléculaires du vieillissement biologique et une caractérisation thermique de la population permettent de relier la dynamique de la condition physique des individus au cours de leur vie et leur environnement thermique, pour mieux comprendre les mécanismes de l'accélération du rythme de vie mentionnée plus haut. Ces données permettent d'étudier très finement les processus liés à la sélection naturelle, à l'adaptation et aux réponses génétiques (évolution) et plastiques (acclimatation) des différents traits phénotypiques face à ces pressions évolutives, notamment celles liées au changement climatique. Ces travaux permettent par ailleurs d’anticiper les pressions environnementales liées au changement climatique auxquelles sont confrontés ces populations en marge sud de répartition du lézard vivipare, et leur capacité à répondre quasi immédiatement par des mécanismes d’acclimatation ou à moyen terme par des mécanismes évolutifs. Des études de ce type et de cette ampleur sont extrêmement rares sur des populations naturelles de reptiles ectothermes, entraînant un manque profond d'appréhension de leur capacité à s'adapter aux défis auxquels ils sont confrontés. Les bénéfices informationnels pour la conservation s’étendent donc aux autres espèces de reptiles ectothermes de milieux froids plus difficiles à étudier.

Procédures

Après capture sur le terrain, les individus non-marqués seront marqués de façon permanente par amputation de phalange (pas d’alternative préférable permettant le marquage des juvéniles) et un prélèvement de tissu caudal sera effectué (maximum 150 individus par an, soit 750 individus sur 5 ans) pour les études génétiques, puis relâchés au lieu exact de capture. Les femelles gestantes capturées (qu’elles soient déjà marquées ou non) seront mises en hébergement temporaire (maximum 150 femelles par an, soit 750 femelles, pour une durée maximale inférieure à 2 mois) jusqu’à la mise bas des juvéniles. Les juvéniles sont marqués par amputation de phalange et un prélèvement de tissu caudal effectué 24h après la naissance (maximum 650 individus par an, soit 3250 individus). Les femelles et leurs juvéniles sont relâchés au lieu exact de capture dans les 4 jours suivants la naissance. Les performances locomotrices de tous les individus, à tous les stades seront évaluées les faisant courir sur une piste de sprint et une piste d'endurance (tapis roulant pour les adultes, arènes circulaires pour les juvéniles).

Impact sur les animaux

La source de nuisance la plus importante est liée au stress de contention lors des captures et diverses manipulations. Une autre source de nuisances est liée à l'amputation de phalange sont une faible douleur. Les études en populations naturelles et semi-naturelles de lézard vivipare montrent que ce marquage individuel n’a pas d’effet détectable sur la survie annuelle, la croissance corporelle annuelle, la reproduction annuelle et sur la mobilité des individus. Le nombre de phalanges amputées n’affectent pas l’activité locomotrice à la naissance, l’anxiété comportementale, la survie lors du premier été ou la condition corporelle (masse à taille égale) à la fin de celui-ci. Aucun impact comportemental n’est observé non plus, avec une reprise rapide de la mobilité (< 20 secondes) et de l’alimentation. Une étude de 2006 ne montre pas de différence significative de stress entre des individus non marqués et amputés, alors que le marquage par insertion d’une puce électronique provoque un stress important et chronique(augmentation de corticostérone dans le sang). Il n’existe pas de méthode d’identification alternative qui puisse s’appliquer aux juvéniles (marquages externes impossible à cause de la mélanisation juvénile et de la mue de croissance ; et transpondeurs de trop gros volumes pour un juvénile). En ce qui concerne le prélèvement de tissu caudal par section de l’extrémité de la queue (

Devenir

Les animaux sont tous relâchés dans leur population d'origine à l'emplacement exact de leur capture, immédiatement après les mesures phénotypiques sur le terrain pour les sub-adultes et les adultes mâles, et après une période d'hébergement temporaire d'environ 1 mois (maximum 2 mois) pour les femelles et au maximum 4 jours après la mise-bas pour les juvéniles.

Remplacement

Nous ne pouvons par essence pas remplacer ce modèle par un modèle non-vivant, car nous ne connaissons pas les paramètres, notamment sélectifs, génétiques et liés à la plasticité phénotypique, permettant de modéliser l’évolution des populations de reptiles face aux changements de leur environnement. Les suivis de long-terme comme celui-ci sur une espèce de reptiles se comptent au mieux sur le doigt d’une main et sa poursuite est donc essentielle.

Réduction

Le suivi demande la plus grande exhaustivité du marquage individuel par rapport à la taille de la population, permettant d’identifier en moyenne 80 à 90 % de la population chaque année. La non-exhaustivité sur la population rendrait le projet caduc suite notamment à de trop nombreux apparentements inconnus. En revanche, la taille de population permet de dégager la puissance suffisante pour les analyses, notamment grâce à l’accumulation d’année en année. Le nombre total maximum d’individus mobilisés est de 1200 chaque année (durée du projet de 5 ans, 4 ans à partir de l'AVENANT 2024, soit 5700 individus au maximum).

Raffinement

La période d’hébergement est réduite à la seule fin de pouvoir suivre les mises-bas. Les animaux sont hébergés dans des terrariums adaptés à leur espèce avec source de chaleur, support, cache et litière tourbée. Les animaux reçoivent également une alimentation à base d’insectes et de larves. Cet enrichissement de milieu spécifique permet de répondre à leurs besoins biologiques, physiologiques et comportementaux et de garantir les meilleures conditions de vie en captivité, avant la remise en liberté. Les critères d’arrêt pour ce projet sont l’incompatibilité éventuelle à la captivité ou des problèmes de santé non réversibles. L'évaluation des performances locomotrices sont basés sur des protocoles connus et adaptés à l'espèce. Les animaux sont soumis à un contrôle régulier de leur santé, de leur poids et de leur comportement. En cas de problème de santé (lésions ou infections), ils reçoivent des traitements adaptés sous la supervision d’un vétérinaire. Des tests de raffinement à base de gel de lidocaïne (anesthésique local) pour l'amputation de phalanges chez les adultes seront poursuivis au cours de ce projet.

Choix des espèces

Le lézard vivipare (Zootoca vivipara) est étudié depuis plus de 30 ans dans les populations naturelles et dans différents dispositifs expérimentaux. Cette espèce est intéressante pour comprendre l’écologie de vertébrés terrestres ectothermes. Son écologie est bien connue, les populations étudiées forment le plus long suivi chez une espèce de reptile et son génome a été séquencé, ce qui en fait un modèle unique pour les vertébrés terrestres ectothermes. Il a donc une forte valeur pour l’écologie fondamentale mais aussi appliquée. L’espèce n’est pas menacée en Europe (préoccupation mineure - UICN) mais elle est sensible aux dégradations anthropiques de son milieu, y compris climatiques, et de ce fait, protégée au titre de l’article 3 de l’arrêté du 8 janvier 2021 « fixant la liste des amphibiens et des reptiles représentés sur le territoire métropolitain protégés sur l'ensemble du territoire national et les modalités de leur protection ». Son groupe comprend également de nombreuses espèces menacées d’extinction en Europe et à forte valeur écologique. Il devient donc urgent de mieux comprendre la dynamique écologique et évolutive de ces espèces face aux changements globaux.

Trente-deux semaines de régime hypercalorique, un bout de queue coupé sous anesthésie pour le génotypage, huit prélèvements de sang à la queue lors du test métabolique : 945 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles est gardée vivante pour l'élevage ou pour la seconde procédure, les autres sont tuées pour prélèvement des tissus. Le projet cherche à savoir si le dérèglement de l'horloge biologique aggrave la stéatose hépatique et le cancer du foie, en laissant les souris devenir obèses puis malades. Le porteur affirme que "la stéatose hépatique n'induit pas de nuisance" et que "le cancer du foie n'est pas douloureux", tout en décrivant l'ascite et l'encéphalopathie hépatique qui peuvent survenir, avec prostration, arrêt de l'alimentation et pelage négligé.

Objectifs

Le cancer du foie est une maladie en pleine expansion avec actuellement plus de 8500 nouveaux cas par an en France et plus de 7000 morts par an. En dehors des causes classiques provoquant une inflammation du foie comme les virus, l’inflammation sur foie surchargé en lipides (stéatose) est une maladie qui prend de plus en plus d’importance dans les pays développés. Cette maladie est due à l’association de plusieurs facteurs comme l’obésité, le diabète, ou le manque d’oxygène résultant de la maladie de l’apnée du sommeil. Lorsque l’on regarde de plus près ces facteurs, il a été montré que le dysfonctionnement de l’horloge biologique, aussi appelée horloge circadienne, est impliquée. L’horloge circadienne, permet aux organismes de régler leur activité en fonction du cycle journalier. De plus, à ce jour un seul traitement médicamenteux est approuvé pour le cancer du foie (carcinome hépatocellulaire). Cependant, ce traitement ne permet qu’une modeste amélioration de la survie et entraine souvent des effets secondaires qui altèrent la qualité de vie du patient. Il existe un besoin urgent de thérapies nouvelles, efficaces et sûres. Puisque les désordres métaboliques et l’horloge circadienne impliquent plusieurs organes, il est essentiel d'utiliser un modèle d'animal avec un carcinome hépatocellulaire qui associe tous les désordres sous-jacents observés chez le patient. Cela permet d'étudier l'efficacité des médicaments sur les tumeurs, mais aussi la tolérance du traitement. Cette étude permettra d’étudier l’influence et le rôle de l’horloge circadienne sur le développement du cancer du foie sur un foie stéatosé. Des études antérieures ont permis d’identifier des protéines qui régulent l’horloge. L’objectif de cette demande est maintenant de caractériser le rôle ces protéines dans le foie, pendant le développement de la stéatose, fibrose hépatique et les complications ultérieures, en combinant approches génétiques chez la souris, et analyses à grande échelle des gènes et protéines. Le modèle permettra aussi de déterminer les mécanismes moléculaires sous-jacents.

Bénéfices attendus

Les maladies de foie gras représentent une part importante des consultations chez le médecin et la prise en charge globale du patient représente un coût important pour le système de santé. Dans le cadre de cette étude, nous pourrons établir l’influence et le rôle de l’horloge circadienne dans l’établissement et le fonctionnement des maladies de foie gras. En conséquence, ce projet sera bénéfique à plusieurs échelles : démontrer des mécanismes de régulation importants des gènes de l'horloge, et de comprendre le mécanisme épigénétique de l’établissement de la stéatose hépatique et éventuellement le cancer du foie ; identifier un nouveau facteur de risque des maladies du foie gras, et donc les populations à risque de mauvais pronostic ; enfin de mettre en évidence la nécessité d’une prévention et surveillance plus étroite au niveau hépatique des personnes ayant un cycle journalier perturbé comme le jet-lag ou le travail de nuit

Procédures

Toutes les souris sont vigiles sauf indication contraire. Pour faire des analyses génétiques, un prélèvement unique du bout de la queue est réalisé à 17-21 jours de vie sous anesthésie (3min d’anesthésie,

Impact sur les animaux

Les prélèvements à la queue, ainsi que les injections dans le ventre lors des tests métaboliques provoquent une douleur légère et transitoire. La mise à jeun avant le test métabolique peut générer de l'incofort transitoire (période de jeun 6h). Le régime alimentaire va induire une réduction de la prise alimentaire car il est riche en graisse. Cependant des résultats antérieurs montrent que en terme d'apport calorique, des souris nourris avec ce régime là ont la même consommation calorique que des souris nourris avec un régime standard. La stéatose hépatique n’induit pas de nuisance. Nous n’attendons pas de décompensation de cirrhose. Si tel est le cas, cela se traduira par une ascite (abdomen distendu) ou des signes d’encéphalopathie hépatique qui correspond à une détérioration de la fonction du cerveau à cause de substances toxiques qui s'est accumulé dans le sang car le foie est trop atteint pour pouvoir correctement éliminer ces substances du sang (critères d’évaluation spécifiques : prostration, absence d’alimentation, pelage mal entretenue) Le cancer du foie n’est pas douloureux et des métastases ne sont pas attendues avec notre protocole d’induction des maladies métaboliques du foie. Les mâles de certaines lignées de souris peuvent montrer des signes d’agressivités.

Devenir

Une partie des animaux de la première procédure est gardé en vie pour être inclus dans la seconde procédure ou pour l’élevage. Les autres animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus. Tous les animaux de la deuxième procédure sont mis à mort pour prélèvements des tissus à analyser

Remplacement

Le développement du cancer du foie est un processus qui implique différents types de cellules au sein du foie et la maladie du foie stéatosé associe plusieurs facteurs, dont des perturbations métaboliques systémiques. Les lignées de cellules cancéreuses humaines du foie ne permettent pas de reproduire tous ces processus, en partie multi-organes. L’utilisation du modèle animal n’est donc pas pour l’instant remplaçable dans ce type d’étude.

Réduction

Un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (augmentation de 20% des scores qui permettent le diagnostique des différentes maladies : stéatose, la maladie métabolique du foie et le carcinome hépatocellulaire) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux. Notre approche statistique est basée sur la comparaison de deux moyennes. 7 animaux mâles par condition expérimentale en fin d’expérience sont nécessaires. En effet les stades de la pathologie peuvent être variable d’un animal à l’autre. Compte tenu du risque de perte de matériel biologique pendant l'expérience (mort inexpliquée d'un animal avant la fin de l'expérience ou atteintes des points limites), nous prévoyons un maximum de 9 souris mâles par groupe d’analyse. Les animaux produits mais qui n'entrent pas dans le projet pour des raisons génétiques, pourront être utilisés pour la mise au point d'autres études grâce à des prélèvements d'organes post-mortem

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’étude. Les animaux seront pesés une fois par semaine pour suivre l’évolution de la maladie et détectés tous signes précoces de souffrance. L'établissement des scores pour les points limites aura lieu à ce moment là, une fois par semaine. En cas d'apparition de signe de souffrance, la fréquence des observations pourra être augmentée jusqu'à trois fois par jour. La nourriture sera renouvelée deux fois par semaines. Un anesthésiant sera utilisé au moment du prélèvement à la queue afin de prévenir et/ou réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse dans le cas où elles surviendraient. En cas d’agressivité les mâles sont séparés. En cas de blessure la plaie est désinfectée. Si elle devient trop invalidante, la souris est mise à mort.

Choix des espèces

Du fait de sa grande similitude avec l’homme en terme de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris présente un modèle expérimental privilégié pour les investigations des maladies circadiennes et métaboliques survenant chez l’homme. De plus les mécanismes impliqués sont pour la plupart identiques chez l'homme et la souris. Il est possible aujourd'hui d'étudier les conséquences directes de la perturbation fonctionnelle d'un gène ou d'une protéine chez la souris dans un contexte de fibrose ou stéatose hépatique qui reproduit très précisément les caractéristiques des lésions hépatiques humaines. Les souris seront incluses dans le protocole dès l’âge de 17-21 jours pour l’étape d’analyse génétique. L’apparition des pathologies que l’on étudie chez le patient se développent à l’âge adulte. C’est pourquoi les souris mâles seront mises au régime alimentaire dès 7 semaines, et mises à mort entre 7 et 39 semaines.

48 protées, amphibiens cavernicoles qui vivent plus de quatre-vingts ans sans jamais se métamorphoser, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis remis en élevage avec leurs congénères après cicatrisation. Chaque animal est baigné six heures dans des hormones thyroïdiennes, puis un fragment de peau lui est coupé au bistouri, sous anesthésie, à l'extrémité de la queue. D'autres sont enfermés dans un récipient hermétique le temps que leur consommation d'oxygène soit mesurée. La plaie met plusieurs semaines à cicatriser et plusieurs mois à se régénérer, et le porteur conclut qu'aucune culture de cellules ne remplacerait cette espèce, trop singulière biologiquement et phylogénétiquement.

Objectifs

L'objectif est d'apporter des connaissances nouvelles concernant la biologie de l'amphibien Protée (Proteus anguinus) cavernicole obligatoire. C'est un animal remarquable sur plusieurs points : contrairement à l'immense majorité des amphibiens, il n’entreprend jamais de métamorphose qui permet de passer de la forme larvaire au stade adulte (c’est comme si il restait bloqué au stade têtard), et atteint par contre une longévité hors du commun (plus de 80 ans). Les hormones produites par les glandes thyroïdiennes sont cruciales dans le déclenchement de la métamorphose et le contrôle de l'activité métabolique (ensemble des transformations chimiques et biologiques qui s'accomplissent dans l'organisme) qui peut jouer par ailleurs sur la longévité (en théorie plus le métabolisme est lent, plus la longévité est importante). Le projet consiste donc ici à mesurer la réponse aux hormones thyroïdiennes par deux types de mesures complémentaires : d'une part quels gènes sont exprimés (dite réponse transcriptionnelle), et d'autre part les variations d'activité métabolique. Les variations d'expression des gènes seront mesurées sur un tissu connu pour répondre très fortement aux hormones thyroïdiennes chez les autres espèces d'amphibiens : la nageoire présente au niveau de la queue. L'activité métabolique sera mesurée dans une enceinte équipée d'un capteur à oxygène permettant de mesurer la consommation de l'oxygène par l'individu lors de sa respiration.

Bénéfices attendus

Le projet vise à établir clairement si le Protée est sensible ou non aux hormones thyroïdiennes. Si on ne s’attend pas à une réponse en termes de déclenchement de la métamorphose chez cette espèce d’amphibien chez qui ce processus ne se déroule jamais, on pourrait mesurer cependant des changements au niveau de l’expression de ses gènes et au niveau métabolique, qui pourrait expliquer en partie le ralentissement de son développement, de son activité basale et son extrême longévité, en réponse adaptative à la vie en milieu souterrain.

Procédures

Une première procédure consiste à traiter les animaux sont par un bain d’hormones thyroïdiennes pendant 6 heures. Un prélèvement de peau à l’extrémité de la queue est pratiqué sous anesthésie générale par coupe au bistouri. Après le prélèvement, on coagule la plaie, et on applique localement un anti-douleur et un désinfectant. Les animaux sont remis dans de l'eau désinfectée jusqu'au réveil. Au réveil, ils sont baignés dans une solution antiseptique, puis remis en élevage jusqu’à complète cicatrisation. Une autre procédure consiste à placer les animaux dans un récipient fermé hermétiquement rempli d’eau très oxygénée à température optimale. Leur consommation en oxygène sera suivie pendant quelques heures à l’obscurité et au calme. La durée de la mesure pourra variée en fonction de la vitesse de consommation de l’oxygène qui dépend de la masse de l’individu, mais pour se donner une marge de sécurité, l’expérience sera arrêtée si la concentration en oxygène descend à un seuil fixé très supérieur à la condition susceptible de provoquer des difficultés respiratoires. Ces mêmes individus seront ultérieurement (plusieurs semaines après) traités aux hormones thyroïdiennes, puis la mesure sera répétée et comparer à la première. Ce même protocole sera réalisé avec des individus différentes de ceux qui auront subi un prélèvement de peau.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de peau au niveau de la nageoire de la queue qui est très fine à son extrémité occasionnera une légère blessure amenée à se cicatriser lentement sur plusieurs semaines dans des conditions optimales (température de 12°C, eau à saturation en oxygène et dépourvue de pathogènes, alimentation régulière, obscurité constante, sans nuisance sonore). Puis, le tissu devrait se régénérer également très lentement sur plusieurs mois. En cas de problème de cicatrisation et/ou d’infection, l’animal recevra un traitement local d’analgésique et d’antiseptique. En cas de persistance d’une infection jusqu’à une nécrose associée à une souffrance (refus de s’alimenter, absence de réaction, posture anormale) qui ne laisse pas de doute sur l’évolution défavorable de la santé de l’animal, celui-ci sera euthanasié par surdose d’anesthésique. Après cicatrisation, l’animal sera remis en élevage avec ses congénères. Il ne sera pas utilisé dans une autre procédure.

Devenir

Tous les animaux seront remis en élevage avec leurs congénères après cicatrisation.

Remplacement

Il s’agit de recherche fondamentale visant à étudier les effets des hormones thyroïdiennes sur un organisme tout à fait particulier qui semble rester tout sa vie avec des caractères larvaires, et qui plus est cavernicole obligatoire (le seul d’Europe) et à longévité remarquable (plus de 80 ans). Les effets sont attendus chez l'individu dans sa globalité (réactions de nombreux tissus) aux niveaux métaboliques et de l’expression de gènes, ce qui ne peut être abordé par des alternatives faisant appel à des cultures d’organes ou de cellules isolées ou un chez un autre modèle du fait de la spécificité de l’espèce considérée aux niveaux biologique, écologique, phylogénétique (relation de parenté entre les espèces en fonction de leur similitude génétique).

Réduction

Nous avons choisi de limiter les interventions à une seule biopsie par individu. Le nombre d’animaux prévu pour subir le prélèvement est réduit à 3 individus par lot (3 juvéniles non traités, 3 autres juvéniles traités aux hormones thyroïdiennes, 3 femelles non traitées, 3 autres femelles traitées aux hormones thyroïdiennes, 3 mâles non traités, 3 autres mâles traités aux hormones thyroïdiennes), ce chiffre de 3 étant le standard pour les études portant sur l’expression et la régulation des gènes. En outre, ce qui est recherché ici, ce sont uniquement des réponses contrastées, entre les stades juvénile et adulte d’une part, et entre les sexes femelle et mâle d’autre part.

Raffinement

Les étapes de la procédure seront pratiquées en laboratoire en conditions optimales pour l’espèce c’est-à-dire dans une eau osmosée stérilisée, à température contrôlée (12°C), à saturation d’oxygène et au calme à l’obscurité constante, jusqu'à complète cicatrisation qui devrait durer plusieurs semaines. Un abri en verre facilement nettoyable et stérilisable sera proposé à ces animaux qui apprécient de se réfugier dans les anfractuosités.

Choix des espèces

Le Protée est un amphibien qui ne se métamorphose jamais c’est-à-dire qu’il semble bloqué dans son développement au stade larvaire, caractéristique longtemps interprétée comme un défaut d'activité de la glande thyroïde (ou du moins atténuée). Il dispose pourtant d'une glande thyroïde qui mature graduellement. Les traitements aux hormones thyroïdiennes sont restés sans effets apparents sur les tissus habituellement cibles, fortement modifiés lors de la métamorphose chez les autres amphibiens (disparition des branchies et développement d’un poumon, modification de la peau, du squelette, du système digestif etc.). Les approches moléculaires promettent d'être beaucoup plus sensibles et résolutives pour mettre en évidence des effets sur la régulation des gènes et le métabolisme. En outre, c’est un animal européen disponible en captivité, en environnement contrôlé, sans besoin de prélèvement in natura. L'élevage a permis de décrire le cycle de développement inconnu en nature, et de démontrer l'absence de métamorphose à maturité sexuelle (15 ans, âge maximal pour l'instant en captivité 52 ans, longévité estimée à plus de 80 ans). L’obtention de transcriptomes c’est-à-dire de l’ensemble des gènes exprimés chez des juvéniles et adultes des deux sexes vise à déterminer un transcriptome de référence pré et post maturité sexuelle chez cette espèce qui semble pourtant bloquée tout au long de sa vie dans son développement au stade larvaire.

1 450 souris subissent une greffe chirurgicale de cellules pancréatiques humaines, 780 sont rendues diabétiques par cinq injections, et 50 passent six semaines sous régime hyperlipidique. 2 850 souris immunodéficientes vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec des prélèvements sanguins tous les quinze jours sur animal vigile. Le porteur écrit pourtant que 1 450 animaux "sont prévus dans ce projet général", chiffre qu'il obtient en multipliant dix souris par groupe par cinq répétitions, sans expliquer d'où viennent les 1 400 autres. Toutes sont tuées à la fin pour explanter les greffons et récupérer les organes.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de déterminer l’effet du GABA, de la Sitagliptin et de l’Omeprazole et d'autres molécules qualifiées "d'antidiabétiques" pour la transformation des cellules humaines non-Beta (qui ne secrétent pas l'insuline) en cellules Beta (cellules qui secrètent l'insuline) et sur la fonctionnalité de ces cellules Beta pancréatiques nouvellement formées greffées chez des souris immunodéficientes. Cela permettrait à terme de déboucher sur un traitement des patients diabétiques en rétablissant une sécrétion d'insuline jusqu'alors réduites ou inexistantes et aisni rétablir une glycémie normale (taux de sucre dans le sang).

Bénéfices attendus

La thérapie cellulaire du diabete reste freinée par le manque de matériel issu de donneur, la nécessité de médicaments immunosuppresseurs et ne conviennent qu'à une niche de patients atteints de formes sévères de diabète (

Procédures

Les animaux seront soumis à : - chirurgie de transplantation de cellules pancréatiques humaines (1450 souris) - 1 fois - prélèvements sanguins sur animaux vigiles (1450 souris) - 1 fois par 15 jours. - induction du diabete ( 780 souris) - 5 injections - diabete traité par les traitements et/ou greffe de cellules. - régime hyperlipidique (50 souris) - 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances induites :sont de plusieurs types mais dans tous les cas seront paliées par des tratiements adaptés. Pour la procédure chirurgicale (modérée), des traitements anti-douleur locaux et systémiques seront utilisés. Dans le cas d'utilisation de souris diabètiques (classe modérée), ce diabète sera modéré et un traitement à l'insuline pourra être prévu si besoin. Un change plus régulier des cages sera également effectué. Pour les traitements (classe légere), aucun effet délétère n'est attendu.

Devenir

Les 1450 animaux controles ou diabétiques recevront une greffe d'ilots, 750 rendus diabétiques puis seront traités pour la plupart (1400). A la fin des procédures, les animaux seront tous mis à mort afin d'explanter les greffons cellulaires et récupérer des organes post-mortem.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe pas de moyen permettant le remplacement de l'animal pour l'étude des cellules humaines au long court, qui plus est sous traitement médicamenteux. De rares modeles de culture 3D existent mais ne permettent de reproduirent l'impact de molecules sur un organisme entier (y compris les organoïdes, et les organ-on-a-chip). De plus, il s'agit ici d'étudier les cellules dans le contexte de la transplantation pour être au plus près des effets cliniques, seul le recours à l'a nimal permet d'en étudier la question. Enfin, les molécules ici tester seront "qualifiées" par des études in vitro préalables (toxicité cellulaire, potentiel sécrétoire amélioré). Seules les plus prometteuses seront testées in vivo. EN parallèle, nous essayons de développer un modele de périfusion cellulaire (cellules humaines ex vivo) seulement à ce jour, elle ne permet des etudes en continue sur le long teme.

Réduction

1450 animaux sont prévus dans ce projet général. Nous avons estimé avec les moyens statistiques le nombre de souris par groupe à 10 afin d'obtenir des résultats robustes. L'expérience sera fait 5 fois soit 1450 animaux au total.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages de 5 animaux maximum dans un portoir ventilé. Ils auront accés ad libitum a l'eau et nourriture et traités avec soin (visite quotidienne, cycle jour/nuit régulier, enrichissement par nid+tunnel). La chirurgie sera pratiquée sous anesthésie gazeuse et traitement de la douleur (local+systémique). De plus, un complément alimentaire sous forme gélifié est prévu juste après la chirurgie pour une meilleure récupération. Le bien être animal sera observé au quotidien, et tout constat de mal-être pourra être traité à l'aide d'un arbre décisionnel construit pour ce projet. Il permettra le traitement des douleurs/mal être de façon gradée pour éviter d'atteindre un point-limite.

Choix des espèces

Nous avons en possession l'ensemble du materiel adequat pour l'exploitation des données issues de la souris (anticorps). De plus, sa petite taille permet un hébergement compact dans une structure avec un statut sanitaire type SPF à minima.

Produire des lignées de souris transgéniques, importées de banques internationales ou créées sur place par CRISPR-Cas9 : 2 185 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 450 d'entre elles et modéré pour les 735 autres. Des femelles reçoivent deux injections hormonales à 48 heures d'intervalle pour être superovulées, d'autres sont opérées sous anesthésie de trente à quarante-cinq minutes pour qu'on leur réimplante des embryons dans l'utérus, et des mâles sont vasectomisés par section des canaux qui transportent les spermatozoïdes. Le porteur attend des douleurs après l'opération abdominale et des complications de cicatrisation, infection, gonflement ou ouverture de la plaie. Les femelles superovulées sont tuées pour recueillir leurs embryons, les receveuses après gestation et allaitement faute d'appareil reproducteur intact, et les mâles vasectomisés lorsque leur capacité d'accouplement est jugée nulle, constatée après huit accouplements sans résultat.

Objectifs

Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste - À introduire au sein de notre animalerie des lignées de souris transgéniques déjà existantes dans des laboratoires extérieurs ou dans des banques internationales, par des techniques de reproduction assistée (ART). - En cas d’indisponibilité de ces modèles, créer de nouvelles lignées de souris transgéniques par des techniques de transgénèse notamment en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 , prix Nobel 2020

Bénéfices attendus

Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour tester les concepts permettant de développer de futures thérapies innovantes.

Procédures

Certaines femelles seront injectées 2 fois à 48H d’intervalle. Le geste ne dure que quelques secondes. D’autres femelles seront anesthésiées en vue d’être opérées pour une réimplantation d’embryons dans la cavité utérine (durée de l’anesthésie 30 à 45 minutes) Enfin, des mâles seront anesthésiés avant d’être opérés. L’opération consiste à couper les canaux qui transportent les spermatozoïdes (durée de l’anesthésie 30 à 45 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues après les injections sont des douleurs liées à la piqûre elle-même. Les femelles réimplantées avec les embryons ainsi que les mâles vasectomisés subissent une chirurgie. Une douleur est attendue à la suite de l’opération abdominale. Aussi la cicatrisation peut rencontrer certains problèmes : infection, gonflement, ouverture de la plaie

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les femelles superovulées pour recueillir les embryons à une cellule. Les mâles vasectomisés sont utilisés pour leur capacité d’accouplement. Ils sont mis à mort lorsque cette capacité est nulle, établie après 8 accouplements sans femelle accouplée. Nous transférons des embryons chez des femelles receveuses en effectuant une incision au niveau de l’appareil reproducteur. Ces souris ne présentent donc pas d’appareil reproducteur intact pour pouvoir être réutilisées pour une deuxième expérience. Elles sont mises à mort après avoir mené à terme leur gestation et allaitement

Remplacement

En amont du projet, les chercheurs effectuent systématiquement des analyses préalables in-vitro quand cela est possible (culture de cellules, organoïdes…). Cependant, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche). Nous favoriserons l'importation de modèles transgéniques déjà répertoriés et caractérisés dans des bases de données. Cependant, si le modèle n'est pas disponible, nous créerons un modèle innovant par les approches de transgénèse ou de FIV

Réduction

Nous avons optimisé nos procédures pour générer des modèles innovants de souris génétiquement modifiées. Nous associons la technologie CRISPR/Cas9 (Prix Nobel de chimie 2020) à la technologie d’électroporation d’embryons pour le transfert de matériel génétique dans le noyau des embryons à une cellule. De nombreuses améliorations ont été apportées : • Optimisation des outils CRISPR/Cas9 grâce à des analyse in-silico • Choix des souches de femelles receveuses les plus adaptées pour recevoir ces embryons et mener à bien les gestations et les allaitements. Ces optimisations nous ont permis de diminuer d’un facteur 2 le nombre de souris donneuses et receveuses nécessaires à la création d’un modèle génétiquement modifié Nous avons également développé la technique de Fécondation In-Vitro (FIV), permettant la production de cohortes d'animaux de même âge tout en diminuant fortement le nombre d’animaux utilisé. Les approches de transgénèse et de reproduction assistée n’utilisent pas d’approche statistique.

Raffinement

L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale, par ailleurs des analgésiques permettent de prendre en charge la douleur liée à ces chirurgies. Un fluide réhydratant chauffé à 37°C est systématiquement injecté en fin de chirurgie afin d’éviter des problèmes de déshydration et permettre un réveil de qualité. Les souris opérées sont placées sur un tapis chauffant et reçoivent de la nourriture riche en graisses (9.9%) ainsi que des graines de tournesol disposées au fond de la cage. Cette disposition leur permet de se nourrir sans avoir à se mettre sur leurs pattes arrière et tirer sur leurs cicatrices. Les animaux seront surveillés pendant les 2 jours suivant l’opération pour vérifier que la cicatrisation se passe bien Il est extrêmement rare d’observer des complications dans ce types d’expériences. Néanmoins, la grille de score permettra l’arrêt l’expérience en cas d’observation d’une souffrance chez l’animal

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée - superovulation efficace et embryons faciles à injecter Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. Les femelles sont utilisées jusqu'à l'âge de 6 mois, tandis que les mâles sont utilisés jusqu'à l'âge de 12 mois.

1 550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 60 d'entre elles et modéré pour les 1 490 autres. Chacune reçoit une injection de bactéries, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus, destinée à provoquer une septicémie généralisée qui, sans traitement efficace, conduit à la mise à mort dans les 24 heures suivant l'inoculation. S'y ajoutent jusqu'à deux injections par jour pendant huit jours, des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire, à la veine caudale ou à la veine mandibulaire, et des séances d'imagerie de bioluminescence sous anesthésie. Le porteur annonce une surveillance jusqu'à trois fois par jour pour éviter toute souffrance inutile, et écarte dans le même texte les analgésiques anti-inflammatoires, qui biaiseraient le développement du modèle.

Objectifs

D’après le site de l’Organisation Mondiale de la Santé et des données scientifiques, en 2017, près de 50 millions de cas de septicémie et 11 millions de décès liés à cette maladie ont été recensés dans le monde. Cela représente encore près de 20% de l’ensemble des décès dans le monde dont près de la moitié ont été enregistrés chez les enfants de moins de 5 ans. Le sepsis est généralement causée par des bactéries nosocomiales, bien souvent résistantes aux traitements disponibles sur le marché, induisant rapidement un choc septique généralisé conduisant au décès du patient. Il y a donc une urgence dans la recherche et dans la découverte de nouveaux traitements efficaces contre ces bactéries multi-résistantes aux traitements. Ce projet consiste à développer et caractériser de nouveaux modèles murins de sepsis générés par infection avec des bactéries bioluminescentes ou non de type E. Coli, K. Pneumoniae, A. Baumannii, P. Aeruginosa ou encore S. Aureus. Ces modèles serontensuite utilisés dans le cadre du développement de nouveaux traitements des infections septicémiques non traitables et causées par des souches multirésistantes aux traitements (MDR).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traitements antibiotiques permettant de mieux contrôler et d’améliorer la prise en charge des infections bactériennes responsables de septicémies rencontrées notamment dans les hôpitaux.

Procédures

Les animaux recevront des injections par voie intraveineuse dans la veine caudale, intrapéritonéale, par gavage ou sous cutané en interscapulaire sur animal vigile. Les injections sur animal vigile seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute).Des injections en intramusculaires pourront être réalisées sur animaux sous anesthésie légère et dureront (en comptant l’anesthésie) environ 5 minutes. En cas de doses répétées, la fréquence des injections ne pourra dépasser 2 injections par jour et la dose de 5mL/kg par jour pour les intraveineuses, 10mL/kg par jour pour les intrapéritonéales, 5mL/kg par jour et ce pendant maximum 5 jours pour les injections sous-cutanées, 20mL/kg par jour pour le gavage et enfin 0.1mL/kg par site et par jour avec au maximum 2 sites par jour. La durée du traitement pourra s’étendre sur toute la durée de l’étude soit jusqu’à 8 jours. En cas d’utilisation de souches bactériennes bioluminescentes, des suivi de la bioluminescence seront réalisés sur animaux anesthésiés afin d’éviter tout mouvement des animaux pendant les phases d’acquisition des images. La durée de l’acquisition de bioluminescence, en comptant l’anesthésie, sera d’environ 10 minutes par animal. Des prélèvements (de sang à différents délais et d’organes uniquement après euthanasie) pourront être réalisés sous anesthésie en respectant les volumes et les fréquences de prélèvements classiquement décrits. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie et pourront être effectués au niveau du sinus rétro-orbitaire (SRO) en respectant une alternance entre les deux yeux entre deux prélèvements et un délai de 14 jours avant d’effectuer un nouveau prélèvement sur un même oeil, au niveau de la veine caudale, de la veine mandibulaire en respectant une alternance entre la veine gauche et droite entre deux prélèvements ou intracardiaque (uniquement à euthanasie et sous anesthésie de l’animal). Le choix d’une voie par rapport à l’autre se fera en fonction de la quantité des prélèvements ou injections prévus via cette voie. Les prélèvements d’organes (comme le cerveau, le cœur, les poumons, le foie, la rate, les intestins, les reins etc) ne seront effectués qu’après euthanasie des animaux afin de les peser, de réaliser des quantifications bactériennes ou tout autre analyse qui serait jugée utile à l’étude.

Impact sur les animaux

Les modèles de septicémies testés ici sont attendus comme étant des modèles d'infection généralisée pouvant induire, en l’absence de traitement efficace, l’euthanasie des animaux dans les 24 heures post-inoculation. Ainsi, un suivi extrêmement réguliers et vigilants de l’état de santé des animaux (jusqu’à trois fois par jour) sera mis en place pour éviter toute souffrance inutile de l’animal et une réaction rapide en cas de dégradation brutale et irréversible de son état de santé. Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress : pesées, suivi clinique, injections et acquisition d’imagerie optique. Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration choisies pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques et/ou une perte de poids.

Devenir

Le modèle d’infection étant généralisé (septicémie) et les études d’efficacité ou de biodistribution d’un traitement nécessitant des prélèvements d’organes afin de réaliser des analyses, les animaux seront systématiquement euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Malheureusement à ce jour, malgré les évolutions constantes des modèles in-vitro et in-silico, aucun modèle ne permet de remplacer totalement le modèle animal d’autant plus dans le cas d’une infection généralisée comme celui de la septicémie.

Réduction

L’utilisation de bactéries auto-bioluminescentes permettra de réaliser un suivi au cours du temps le niveau de charge bactérienne sur les mêmes animaux (sans nécessiter d’euthanasie) et donc de diminuer le nombre d'animaux utiles au projet. De plus, le nombre d’animaux inclus dans chaque étude fera l’objet d’une évaluation afin d’adapter le nombre d’animaux par groupe en fonction de l’état d’avancement du développement du candidat médicament. Pour les études pilotes permettant de déterminer la charge de l’inoculum bactérien, en fonction de la souche de bactéries utilisées et du modèle murin, à minima trois groupes de 5 souris seront constitués afin de déterminer la dose bactérienne appropriée à la souche de souris utilisée. A l’inverse, si des résultats préliminaires de dose infectieuse d’un inoculum bactérien auraient été obtenus par exemple sur une autre souche de souris et nécessiterait une confirmation afin de choisir la dose la plus appropriée pour la nouvelle souche de souris testée, seulement deux groupes de 5 souris pourraient alors être utilisés aux deux doses en balance. Pour les études de biodistribution à minima deux groupes de 5 souris seront nécessaires afin de comparer la localisation du traitement en présence et en absence d’une infection bactérienne. Ce nombre de groupe pourrait être augmenté dans le cas où la biodistribution du traitement d’essai serait évalué en plusieurs modèles d’infection ou comparé avec la biodistribution d’un traitement de référence. De même, pour les candidats médicaments testés en primo-attention des groupes de 5 souris minimum seront constitués. A l’inverse, pour les traitements ayant déjà été préalablement testés et dont les résultats seraient encourageants, le nombre de souris inclus dans chaque groupe pourrait être augmentée afin de mettre en évidence une ou des différence(s) statistique(s). Si un test paramétrique peut être utilisé, un test t de student sera utilisé pour comparer 2 groupes et une Anova avec test de Dunett sera utilisé pour comparer un groupe versus un groupe contrôle ou test de Newman-Keuls pour comparer des groupes entre eux 2 à 2. Si un test non paramétrique doit être utilisé, un test de Wilcoxon sera choisi pour comparer 2 groupes et un test de Kruskall-Wallis sera utilisé pour comparer n groupes versus un groupe contrôle et un test de Friedman pour comparer n groupes entre eux 2 à 2.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilés autant que possible en groupes sociaux, seule la souris BKG non infectée (contrôle du bruit de fond de bioluminescence) sera isolée dès le début de l’étude, afin d’éviter une contamination par ses congénères. En cas d’agressivité, des enrichissements supplémentaires (cachette supplémentaire ainsi qu’un morceau de papier en cellulose de bois) seront ajoutés dans la cage afin de limiter au maximum l’agressivité et de ne pas avoir recours à l’isolement de l’animal agressif en première instance. En cas d’hébergement individuel, les cages seront organisées de manière à permettre à minima un contact visuel avec les animaux des cages adjacentes et un enrichissement supplémentaire pourra être apporté. Les actes techniques, en particulier ceux nécessitant une anesthésie des animaux seront, autant que possible, regroupés et limités à une fois par jour. Dans le cas où, toutefois, dans la même journée plusieurs anesthésie devraient avoir lieu, un gel oculaire serait appliqué afin de limiter le dessèchement cornéen. Au cours de ces études, pour éviter toute souffrance animale inutile, les animaux pourront être suivi par du personnel formé et qualifié jusqu’à trois fois par jour (poids, suivi clinique avec grille de scoring (décrites dans le § 3.3.2.2) et mesure de la température par puce implantée en sous-cutanée) en fonction de la virulence de la souche bactérienne inoculée ainsi que des stades de progression de l’infection. Cela permettra de détecter les stades précoces d’un état de santé dégradé et irrémédiable justifiant le recours à l’euthanasie éthique. Ce suivi renforcé pourra être complété par une visite vétérinaire. Le modèle voulant le développement d’une infection généralisée accompagnée d’une réaction inflammatoire, le recours aux analgésiques limitant l’inflammation ne pourra malheureusement pas être envisagé afin de ne pas biaiser le développement du modèle.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car c’est un modèle standard et polyvalent (multiplicité des souches disponibles dont certaines sans poils), régulièrement utilisé dans les études d’infections bactériennes. De plus, sa taille réduite permet l’utilisation de technique d’imagerie optique corps entier ce qui est cruciale pour le suivi d’une infection généralisée. Les souches de souris sans poils (immunocompétentes ou immunodéficientes) seront privilégiées dans le cas d’utilisation de souches bactériennes OGM bioluminescentes afin d’obtenir les résultats les plus pertinents (absence de la bioluminescence naturelle des poils donc augmentation de la sensibilité). Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes d’environ 6 à 7 semaines au moment du démarrage d’une étude. Ce stade de développement est celui habituellement utilisé pour ce type d’étude (pas de contrainte spécifique liée à l’âge) et permet d’avoir des animaux d’un poids d’environ 20g en s’affranchissant de la période de croissance.

Apporter une preuve de concept avant transfert en clinique d'un radiotraceur ciblant l'intégrine αvβ3 : 112 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit sous la peau une greffe de cellules de médulloblastome, une tumeur du cervelet, puis des injections de produit radioactif dans la veine de la queue sans anesthésie, suivies de séances d'imagerie nucléaire de quarante à soixante minutes sous anesthésie, jusqu'à six semaines consécutives. Un transport routier de cinq heures peut intervenir dans les jours suivant la greffe. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de mener ces études avant tout essai humain, et qualifie la méthode d'imagerie de non invasive.

Objectifs

La médecine nucléaire utilise des molécules marquées avec des éléments radioactifs pour aider à diagnostiquer et traiter le cancer. Ces molécules, appelées radiotraceurs, sont injectées dans le corps et peuvent être détectées à l'aide de caméras spéciales. Elles permettent de voir où ces molécules se distribuent dans l’organisme, y compris dans les tumeurs. Certaines de ces molécules peuvent également être utilisées pour détruire les cellules cancéreuses. Dans ce projet, nous étudions l'efficacité d'un radiotraceur sur des souris porteuses de tumeurs cérébrales (greffes sous-cutanée). Nous examinerons comment le radiotraceur se répartit dans l’organisme des animaux après son injection à différents temps. Nous évaluerons également si le traitement avec ce radiotraceur peut ralentir la croissance des tumeurs au fil du temps. Nous choisissons uniquement des types de tumeurs qui se développent facilement chez les souris pour minimiser l'utilisation d'animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider l'approche permettant la combinaison de diagnostic et de thérapie(théranostique) ciblant l'intégrine αvβ3 dans les tumeurs du cervelet(médulloblastomes), et servira de preuve de concept pour le transfert en clinique du radiotraceur. Ensuite, un essai clinique déterminera la place de ce traceur dans la prise en charge des médulloblastomes.

Procédures

Les animaux auront tous une implantation sous cutanée de cellules tumorales,

Impact sur les animaux

L’étude sera conduite chez des animaux immunodéprimés mais hébergés et manipulés dans des conditions stériles et la méthode d’imagerie utilisée est non invasive. Un stress bref et léger pourra survenir au moment de l’injection intraveineuse du radiotraceur. L’implantation tumorale en sous cutanée sous anesthésie ne doit pas entrainer de douleur. De plus, les animaux seront étroitement surveillés suite à cette implantation et si le point limite est atteint, l’animal est mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des deux procédures de ce projet :soit une étude de biodistribution par prélèvements d’organes et comptage de la radioactivité sera réalisée, soit des prélèvements de tissus sont réalisés post mortem pour des études d’histologie.

Remplacement

Cette étude d’expérimentation animale fait suite à une validation en laboratoire du médicament candidat ainsi qu'à des tests préliminaires effectués sur animaux lors de projets précédents. La recherche sur l'utilisation de radiotraceurs ou de médicaments, ainsi que la confirmation des profils pharmacocinétiques, nécessite l'utilisation de modèles animaux précliniques en laboratoire. Ces modèles doivent refléter les différents organes impliqués dans l'élimination naturelle des molécules administrées. C'est pourquoi il est indispensable de mener des études sur des modèles animaux précliniques avant de pouvoir passer à des essais cliniques sur des êtres humains. De plus, les modèles cellulaires utilisés dans ces études représentent la pathologie étudiée, en l'occurrence le médulloblastome.

Réduction

L’imagerie non invasive permet de suivre un même animal au cours du temps, ce qui permet d’obtenir des données statistiques en minimisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le raffinement implique de prendre toutes les mesures nécessaires pour limiter au maximum la souffrance animale. Le projet sera mené dans deux établissements autorisés, avec un personnel qualifié pour manipuler les animaux. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi adapté à leur espèce, et des mesures seront prises pour réduire le stress et la souffrance, y compris l'utilisation de points de référence appropriés. Leur bien-être sera surveillé quotidiennement. Pendant les procédures d'implantation des cellules tumorales, les animaux seront placés sous anesthésie. De même, lors des procédures d'imagerie, ils seront anesthésiés et leur température sera contrôlée. De plus, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter tout dessèchement oculaire.

Choix des espèces

Les modèles de souris constituent une référence pour la recherche in vivo en cancérologie et sont très fréquemment utilisés pour les modèles de greffes de tumeurs sous-cutanée Les souris seront implantées au stade jeune adulte, à l’âge de 8 semaines environ afin d’optimiser la prise tumorale (absence de cellules NK + stade du développement du cervelet). Les injections des composés radiomarqués seront effectuées lorsque la tumeur aura atteint un volume de 100 mm3 environ.

Les souris dont la tumeur atteint le volume limite sont mises à mort avant terme. 3 376 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines de myélome multiple ou d'amylose sous la peau ou dans le sang, elles subissent des prises de sang une à trois fois par semaine pendant 86 jours, des injections de luciférase deux à trois fois par semaine sur la même durée, jusqu'à quinze administrations de composés et des anesthésies gazeuses de quarante minutes une à deux fois par semaine pendant un mois. Le porteur cherche de petites molécules reproduisant l'effet d'une toxine bactérienne, et affirme que les traitements retenus ne devraient pas induire de souffrance particulière puisqu'ils auront été sélectionnés sur l'absence de toxicité.

Objectifs

Le myélome multiple (MM) et l’amylose (AM) sont des pathologies associées à des anomalies des plasmocytes, cellules du système immunitaire produisant les anticorps. L'introduction de nouvelles approches thérapeutiques de chimiothérapies basées,entre autres, sur le blocage de complexes cellulaires qui assurent l’élimination des déchets protéiques dans les cellules a considérablement amélioré la survie des patients atteints. Cependant, ces traitements induisent souvent des effets indésirables graves ou des résistances aux traitements et les patients traités rechutent systématiquement Ces pathologies restent donc incurables et entrainent dans la majorité des cas le décès des patients. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de vaincre la résistance aux chimiothérapies et de réduire leur toxicité. Il a été montré qu’une toxine bactérienne capable d’inhiber la synthèse et l’expression de certaines protéines secrétées ou exprimées à la surface des cellules induisait un stress cellulaire associé à la production accrue de déchets protéiques qui, s’il est maintenu, évolue vers un suicide cellulaire. Cette inhibition permet à cette toxine de potentialiser l’efficacité thérapeutique des traitements du MM et permet de réduire efficacement la croissance tumorale dans un modèle animal murin immunodéficient. Ces résultats ont permis de démontrer l’intérêt thérapeutique de ce type d’inhibiteur dans le MM, et éventuellement pour l’AM car il bloquerait la production de la protéine responsable de la pathologie de l’amylose. Cependant la synthèse de cette toxine n’est pas compatible avec le développement de médicaments et ne peut donc pas être utilisée comme telle en tant que molécule thérapeutique. Le but de notre de projet est donc de caractériser de petites molécules possédant les propriétés inhibitrices de la toxine bactérienne mais facilement synthétisable, peu toxique et facilement administrable. Ces molécules seront sélectionnées par des tests in vitro sur leur capacité inhibitrice de la synthèse de protéines et plus particulièrement de la chaine légère anormale des immunoglobulines responsable de la pathologie de l’amylose et de leur capacité à induire la mort cellulaire sélective de cellules cancéreuses du MM tout en ne présentant pas ou peu d’effets secondaires délétères.

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, le projet devrait aboutir à l’identification de médicaments permettant de traiter l’amylose et le myélome multiple chez l’homme qui sont aujourd’hui, dans la plupart des cas, incurables. Le projet consiste au développement de molécules thérapeutiques contre ces pathologies et l’obtention de résultats positifs dans le cadre du traitement chez la souris selon les critères définis devraient permettre de valider la stratégie de l’approche thérapeutique basée sur l’inhibition de la sécrétion et l’expression de protéine. Les molécules donnant les résultats les plus prometteurs seront alors testées lors d’essais cliniques chez l’homme permettant d’aboutir à un développement de médicaments pour traiter ces maladies.

Procédures

Prises de sang (quelques secondes) 1 à 3 fois par semaines pendant 86 jours. Greffe de cellules humaines en sous cutané ou en intraveineuse, 30 secondes pour une injection, une greffe par animal. Administration de composés par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse, ou sous cutanée ;10 secondes par administration ; maximum 15 administrations / animal. Injections de luciférase par voie intrapéritonéale (10 secondes), 2 à 3 fois par semaine pendant 86 jours. Anesthésie gazeuse de 40 minutes 1 à 2 fois par semaine pendant 1 mois.

Impact sur les animaux

Les souris seront injectées avec des lignées humaines de myélome multiple ou d’amylose en sous cutané ou par voie intraveineuse. L’injection des cellules pourra occasionner une douleur de courte durée au niveau du site d’injection. La croissance de ces cellules sera suivie et les souris dont la croissance aura atteint un point limite seront mises à mort. Ainsi la croissance de ces cellules dans les limites imposées dans le projet ne devrait pas générer de douleur particulière mais les souris pourraient subir une gêne dû à la croissance des cellules et devenir léthargiques et subir une perte de poids. La croissance des cellules pourrait être associée à des pathologies particulières, telles que celles observées chez l’homme et pourraient générer inconfort, stress et douleur. Les souris seront donc suivies périodiquement et si des symptômes révélateurs de souffrance, d’inconfort ou de stress étaient observés, les animaux seront mis à mort afin de réduire la souffrance en accord avec les points limites définis. Les traitements, quant à eux, ne devraient pas induire de souffrance particulière car ils auront été sélectionnés sur des critères d’absence de toxicité et d’effets secondaires. Mais la manipulation fréquente et périodique des souris pour l’administration des traitements et du suivi pourrait aussi générer un stress plus ou moins important en fonction de la voie d’administration choisie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous devrons prélever en fin de procédures certains organes vitaux pour analyse (effets des traitements sur la croissance tumorale et sur les pathologies étudiées).

Remplacement

Il s’agit ici de tester différentes molécules de synthèses possédant les propriétés inhibitrices de la sécrétion et de l’expression de protéine similaire à la toxine bactérienne. Toutes les questions pouvant être apportées par l’utilisation de lignées cellulaires sur cette inhibition seront réalisées in vitro pour les caractériser et définir leurs propriétés biologiques. Cependant, le projet a pour objectif d’utiliser finalement ces molécules dans le traitement de pathologies chez l’homme et viseront donc à caractériser les effets thérapeutiques de ces molécules sur la prévention et le développement de ces pathologies. Il doit être réalisé dans un modèle expérimental physiologique de ces pathologies et doit donc être analysée et validée sur un organisme entier permettant d’analyser tous les organes cibles.

Réduction

Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur la forte expérience de nos conceptions d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé. Les expériences passées ont montré que le nombre d’animaux par groupe utilisé ici (6) est le minimum requis pour obtenir des résultats pertinents et statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable du fait d’un manque de puissance des données générées. La répétition de l’expérience pourrait être nécessaire pour la robustesse des données établies. Par ailleurs, nous utiliserons des techniques expérimentales nous permettant d’analyser sur un seul individu de multiple facteurs caractérisant la pathologie pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé. Les groupes expérimentaux de souris seront mélangés dans les cages afin de minimiser au maximum les conséquences de l’effet cage sur les résultats, permettant ainsi d’utiliser moins d’animaux et de réduire le nombre de répétition des expériences. Si possible, les molécules seront testées au sein d’une même expériences afin d’utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs molécules et donc réduire le nombre de souris.

Raffinement

Les souris immunodéficientes seront maintenues dans un environnement protégé sans pathogène opportuniste sous armoires ventilées et hébergées en groupe, avec une litière appropriée, des matériaux de nidification, et une nourriture adaptée. La nourriture sera irradiée, l’eau de boisson autoclavée et le matériel en contact avec l’animal sera autoclavé ou décontaminé. La durée et les doses des traitements sont calculées pour ne pas induire d’effet indésirable, tout en atteignant les objectifs scientifiques. Pendant la durée de l’expérience, les animaux restent dans leur environnement habituel. La plupart des gestes opératoires susceptibles d’être douloureux ou nécessitant un temps de plus d’une minute générateurs de stress seront effectués sous anesthésie. Des observations régulières des animaux seront effectuées tout au long des expériences pour détecter les animaux qui seront en éventuellement souffrance. Dès que le point limite sera atteint, les animaux concernés seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris présente le meilleur compromis éthique entre modèle mammifère, résultats le plus proches de l’humain tout en utilisant un nombre suffisant pour l’obtention de résultats fiables. Les métabolismes sont bien caractérisés et largement comparables à ceux de l’homme. En conséquence, les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. D’autre part, la disponibilité de souris immunodéficientes nous permet d’envisager la greffe de cellules humaines sans rejet de celles-ci par le système immunitaire nous permettant d’analyser l’effet du traitement seul. Nous étudions des pathologies de l’adulte, des individus adultes de 6 à 8 semaines seront donc utilisés. Pour les xénogreffes des animaux immunodéficients, cet âge est requis car au-delà de 8 semaines une irradiation est nécessaire avant implantation des xénogreffes.