Procédures légères
Reprogrammer les cellules immunitaires antitumorales pour les rendre plus efficaces chez la souris (1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Jusqu'à douze séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie générale, six prélèvements dans la veine de la queue et douze mesures de tumeur au pied à coulisse : 1 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau du flanc rasé ou dans la veine caudale, et sont transportées chaque semaine entre le site d'élevage et le site d'expérimentation. Parmi les atteintes, le porteur cite la douleur du développement tumoral et, plus rare dans un résumé de ce type, le stress de certaines souris à voir disparaître leurs congénères en fin d'expérience jusqu'à se retrouver seules en cage. Il affirme que le recours aux modèles animaux est devenu "incontournable" pour valider des résultats déjà obtenus en culture sur des cellules immunitaires humaines.
Objectifs
Les thérapies cellulaires basées sur l’utilisation des propres cellules immunitaires du patient révolutionnent le traitement de certaines leucémies et lymphomes. Cependant, une fraction des patients ne répond toujours pas efficacement à ces thérapies qui s'avèrent pour l'instant moins efficaces contre les tumeurs solides. Les essais cliniques ont montré que le principal facteur prédictif d'une faible efficacité thérapeutique est la faible persistance de ces cellules immunitaires, une fois génétiquement modifiées et ré-infusées chez les patients. Ces travaux de recherche devraient permettre d’améliorer la persistance et donc l’efficacité de ces thérapies.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes responsables de l’efficacité de thérapies cellulaires anticancéreuses utilisant des lymphocytes T. Des bénéfices thérapeutiques importants sont attendus concernent le traitement de certains lymphomes, de leucémies, mais aussi de plusieurs tumeurs solides. En effet, la modification que nous proposons devrait permettre de lever certains mécanismes de résistance à ces thérapies en confèrent aux cellules immunitaires des propriétés fonctionnelles particulières leur permettant d'éradiquer plus efficacement des tumeurs à l'interieur d'un organisme . De plus, même au-delà du domaine du Cancer, les innovations thérapeutiques que nous proposons devraient aussi, à terme, améliorer l'efficacité de ces thérapies cellulaires qui commencent à être utilisées dans d’autres pathologies humaines comme les maladies auto-immunes. L’amélioration que nous proposons pourrait aussi éviter le besoin de recourir à des injections répétées
Procédures
Les animaux de ce projet seront élevés dans l’établissement 1 et toute expérience se déroulera dans l’établissement 2. Tous les animaux seront soumis à : -selon la durée de l’expérience, jusqu’à 12 séances d'imagerie hebdomadaires, comprenant aussi l'injection intraperitoneale d'un liquide traceur, (sous anesthésie générale) la durée de ce geste est évaluée à 7 minutes. - selon la durée de l’expérience, jusqu’à 6 prélèvements sanguins, une fois chaque deux semaines. Ce prélèvement sera réalisé par ponction de la veine caudale latérale sur souris vigile la durée de ce geste est évaluée à moins de deux minutes. En plus, selon les expériences, les animaux sauront soumis alternativement à : - Une séance de rasage du flanc droit la durée de ce geste est évaluée à moins de d’une minute. -Une injection sous-cutanée sur souris vigile de cellules tumorales, la durée de ce geste est évaluée à moins d’une minute. - jusqu’à 12 mesures de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse, sur animal vigile, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute. Ou à: -Une injection intraveineuse(veine caudale) de cellules tumorales, sur des souris vigiles, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress consécutif à la manipulation hebdomadaire des animaux pour l’ensemble des expériences. Elles subiront aussi un stress lié au transport entre les 2 sites, au moment du rasage des poils avant les injections en sous-cutanée et de l’immobilisation pendant les injections et lors des prises de sang. Elles subiront de plus une douleur légère lors des injections en sous cutanée et lors des injections intraveineuses et des prises de sang à la veine caudale. Les souris subiront une douleur du au développement de la tumeur. Enfin, certains animaux pourraient subir un stress de voir disparaitre leurs congénères en particulier en fin d’expérience (points limites atteints) jusqu’au point de se retrouver eux-mêmes isolés dans la cage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyse.
Remplacement
Un grand nombre d’expériences de culture cellulaire a été realisé, montrant une amélioration des fonctions antitumorales des cellules immunitaires humaines invalidées pour un gène decrit auparavant. En effet, cette invalidation améliore les capacités d’expansion, de survie, et de prolifération de ces cellules immunitaires. Le recours aux modèles animaux est maintenant incontournable car ils permettront de valider dans des modèles précliniques pertinents et reconnus de la communauté scientifique, ces différentes observations au sein d’un même organisme vivant.
Réduction
Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base des travaux antérieurs et de la littérature scientifique montrant que 18 à 24 souris par groupe permettent de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés. La croissance tumorale sera suivie par imagerie, permettant un suivi dynamique de ce paramètre sans faire recours à la mise à mort des souris, ainsi réduisant le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les animaux sont hébergés avec un nombre de 6 souris maximum par cage contenant un enrichissement constitué de cotons et de maisonnettes en cartons. Lors du transfert entre les 2 sites, les souris seront dans des boites de transport avec de la nourriture et de l’enrichissement. Certaines interventions (imagerie) seront précédées d'une anesthésie générale, afin de prévenir la douleur ou le stress de l’expérience. Les souris seront surveillées pendant toute la durée des expériences afin de déceler et notifier précocement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entrainera une mise à mort anticipée.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix et de référence pour les études des réponses immunitaires contre la tumeur à l’intérieur de l’organisme. Les souris utilisées pour la reproduction seront mis en accouplement à partir de 7 semaines un stade de développement auquel ces souris sont considérées comme sexuellement matures. Les souris utilisées pour les expériences d’étude de la réponse immunitaire contre la tumeur seront âgées de 7 à 12 semaines en début d’expérience (au moment de l’injection tumorale), une tranche d’âge correspondant au jeune adulte, de choix pour ce genre d’études en vertu de la bonne forme physique et de l’absence de biais éventuels dûs aux changements physiques et hormonaux liés au développement autant qu’au vieillissement.
Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires de la myélopoïèse au cours du vieillissement
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie d'entre elles suivies jusqu'à 24 mois, soit toute leur vie. Tatouées aux doigts à trois semaines, elles passent tous les trois mois un test de force de préhension jusqu'à lâcher la grille, un test de mémoire spatiale de dix minutes et un suivi du transit au charbon, pour établir un score de fragilité calqué sur celui utilisé chez les personnes âgées. Vient ensuite l'infection fongique ou bactérienne, avec un risque de sepsis que le porteur reconnaît, puis un traitement quotidien pendant quinze jours à un mois et une pesée journalière sur sept jours. Le porteur retient la souris pour la complexité de la réponse immunitaire, puis ajoute des motifs d'un autre ordre, "faibles coûts", cycles de reproduction courts, croissance rapide et facilité de manipulation.
Objectifs
L’âge de la population mondiale augmente avec actuellement environ 8.5% de la population âgée de plus de 65 ans et cette proportion devrait approximativement doubler d’ici 2050. Cette augmentation massive de la population âgée s’accompagne d’une dégradation de l’état de santé et des pathologies associées au vieillissement. En particulier, le vieillissement est associé à un facteur de risque majeur d'infections. Les infections à Candida (candidoses) chez les personnes âgées constituent un problème clinique majeur et en expansion, avec une mortalité significativement plus élevée chez les personnes âgées que chez les plus jeunes. Ainsi, notre hypothèse serait que la différenciation des cellules de l’immunité innée, les cellules myéloïdes, au cours du vieillissement serait modifiée contribuant à l’installation de l’inflammation chronique liée à l’âge (inflammaging) et favorisant le développement d’infections. Ce projet va s’appuyer sur l’expertise acquise depuis de nombreuses années dans l’étude des mécanismes moléculaires et des voies de signalisation impliquant les récepteurs nucléaires dans la modulation du phénotype des cellules myéloïdes. Ce projet associera des modèles biologiques bien maîtrisés (infection par Candida, souris spécifiquement délétées au niveau de la lignée myéloïde pour divers récepteurs de reconnaissance des pathogènes ou des facteurs impliqués dans leurs recrutement et différenciation). Ainsi, ce projet nous permettra de définir de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques de l'inflammaging et du défaut de réponse vis-à-vis des infections observé avec le vieillissement.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de l’impact du vieillissement sur la fonction des cellules immunitaires semble essentiel pour déterminer leur importance dans l’installation de l’inflammaging (inflammation s’installant avec l’âge) et dans la modulation de la réponse anti-infectieuse chez les personnes âgées. Ces données approfondies nous permettront de définir des stratégies thérapeutiques ciblant ces cellules.
Procédures
Pour l’identification et permettre un suivi individuel, les souris seront tatouées aux doigts (tatouage permanent) à 3 semaines de vie. Uniquement pour les souris nécessitant une vérification de leur génotypage, un bout de queue sera prélevé. L'étude vise à étudier les mécanismes du vieillissement. Ainsi, différents tests seront pratiqués afin de déterminer la fragilité des animaux s'installant avec l’âge sur 24 mois maximum : test de force de préhension et de fatigue musculaire (l'animal s'agrippe à une grille et la force et le temps de prise sont évalués), test de mémoire spatiale (2 objets sont placés à proximité de l'animal et son interaction avec les objets est évalué pendant 10min 2 fois en 24h), motilité et perméabilité intestinale (le suivi d'une prise de charbon colorant les selles permet de suivre sur quelques heures l'activité du transit). Ces tests seront pratiqués une fois sur tous les animaux et tous les 3 mois pour ceux dont un suivi longitudinal sera mis en place. Ils permettront d’établir un score de fragilité comme il est pratiqué chez l’homme. Des prélèvements seront effectués 1 fois ou maximum 1x tous les 3 mois sur la durée de vie des animaux. Lors de la préhension des souris pour la pesée, l’urine ou les selles émises spontanément par la souris seront récupérées maximum avec une fréquence de 3 mois tous les 3 mois. Suite à l’étude de la fragilité, la réponse immunitaire anti-infectieuse fongique ou bactérienne des souris sera évaluée et l’effet de traitements de type nutraceutiques sera évalué. Certains animaux infectés recevront par voie orale tous les jours pendant 15 jours à 1 mois ou par injection intrapéritonéale 1x tous les 2 jours pendant 15 jours. Un suivi sera mis en place pendant maximum 7 jours avec la pesée, le prélèvement d’urine et de selles tous les jours pendant 7 jours. Du sang et différents organes seront prélevés en fin de vie.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux pour le prélèvement d’urine et les tests de force, de motricité et de cognition peuvent stresser les animaux. Une attention particulière sera portée sur la manipulation des cages de manière indépendante (changement de gants, nettoyage du matériels utilisés entre chaque cage). Bien que les prélèvements de sang soient effectués de manière très espacée, ils peuvent entrainer des lésions. Ces prélèvements, prévus au niveau mandibulaire, seront alternés d’un côté et de l’autre. Lors d’injection intrapéritonéale, le point d’injection sera désinfecté et surveillé journalièrement. Les modèles d’infection peuvent entrainer un sepsis et altérer la survie des animaux. Une surveillance journalière permettra d’intervenir au plus tôt.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de récupérer de nombreux tissus et acquérir le maximum de données biologiques.
Remplacement
Les mécanismes de la réponse immunitaire sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité qui ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Le modèle est bien maitrisé au laboratoire. Chaque animal est observé à différents temps (étude longitudinale) et devient son propre contrôle. Les groupes d’animaux seront constitués de 6 à 10 individus pour permettre une étude statistique. Des analyses post mortem sur différents organes seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possibles sur les animaux.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson, comportement...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, papier) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué si une modification de comportement ou des points limites ci-dessous étaient observés, ou tous les 3 mois au cours du suivi longitudinal pour certains animaux, et tous les jours au moment de l’infection, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse.
Choix des espèces
Les mécanismes de la réponse immunitaire sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité et ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Des souris adultes jeunes afin d'avoir des souris avec un système immunitaire mature et souris âgées pour l’étude du vieillissement seront étudiées. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nous permettront d’explorer l’implication de différentes voies de signalisation, cibles pertinentes pour des approches pharmacologiques dirigées.
Génération d’anticorps oncolytiques ciblant le cancer du pancréas chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les lapins reçoivent jusqu'à cinq injections d'immunisation en sous-cutané et en intraveineux sur 56 jours, sur animal vigile, plus des prélèvements de sang répétés. 100 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour produire des anticorps polyclonaux dirigés contre le cancer du pancréas. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu hors le stress de la contention, tout en prévoyant une surveillance de la rougeur, du gonflement et de la douleur après chaque injection et un traitement analgésique en cas de réaction inflammatoire. Les lapins sont tués en fin de procédure pour récupérer leur sérum hyper-immun, une lignée double KO ayant d'abord été créée pour l'occasion.
Objectifs
Le cancer du pancréas est une tumeur maligne très agressive et mortelle, avec un taux de survie global à 5 ans de 6 à 8 %. Actuellement, il n’existe pas d’immunothérapies effectives dans ce domaine. La plupart des chimiothérapies mises en œuvre dans les protocoles thérapeutiques ciblent la cellule tumorale, et le mécanisme d'action des composés utilisés consiste essentiellement à arrêter leur prolifération cellulaire incontrôlée. Il en résulte une exposition importante des cellules saines à ces substances cytotoxiques, avec pour conséquence une toxicité importante à court terme et une réelle implication à moyen terme dans le développement d'autres tumeurs ou "récidives".
Bénéfices attendus
Dans le cadre du pancréas cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de résistance qui se mettent en place dans ce cancer, de confirmer l’intérêt thérapeutique de nos anticorps polyclonaux et ainsi d’offrir une vrai alternative thérapeutique aux patients atteints d’adénocacinome pancréatique et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement.
Procédures
Le but de ce projet est de générer une lignée de lapins homozygotes double KO pour deux xéno-antigènes majeures. Une fois générés, les animaux seront soumis à une procédure d'immunisation c'est à dire des injections multiples en sous cutanée et en intraveineuse. CEtte procédure dure au maximum 56 jours et nécessite au maximum 5 injections (1 en sous cutanée et 3 à 4 en intraveineuses). Ces injections se feront sur animal vigile et durent moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Les protocoles d’immunisation chez le lapin sont standards et plutôt bien tolérés. Aucun n'effct indésirable n'est attendu à part le stress lié à la contention lors du prélèvement. Cependant, une observation des points d’injection sera effectuée après chaque injection de cellules et après chaque prélèvement de sang (détection rougeur, gonflement, douleur).
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récuperer le sérum hyper-immuns.
Remplacement
La génération d’anticorps polyclonaux ne peut se faire que par vaccinations répétées chez l’animal. Il n’existe à l’heure aucune technique in vitro permettant de s’affranchir de l’utilisation d’animaux dans ce contexte.
Réduction
Les protocoles d’immunisation chez le lapin sont bien standardisés et plutôt reproductibles chez les animaux. Un nombre de 3 lapins par groupe a été sélectionné afin de couvrir la totalité des besoins en serum nécessaire pour le projet pancréas global.
Raffinement
L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens animaliers. Les injections des cellules tumorales, et de prélèvements sanguins se dérouleront sans anesthésie, sur animaux vigiles. Le lapin reçoit sur chaque site d’injection une application de pommade anesthésique locale 5 minutes avant l’acte. Les points d’injection sont surveillés au cours du protocole (détection de rougeurs, gonflement, douleur) après chaque injection de cellules et après chaque prélèvement de sang. En cas de réaction inflammatoire locale, un traitement analgésique sera mis en place. Des enrichissements sont proposés aux animaux. L’environnement (bruit, odeurs, lumière, température, hygrométrie) est contrôlé et maintenu stable au cours du temps.
Choix des espèces
Le lapin est une espère communément utilisé pour la génération d’anticorps polyclonaux. Adulte pour l’immunisation
Évaluation de la sécurité de produits de thérapie génique optimisés dans des modèles de rats
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Le rat est retenu parce que son cœur réagit plus vite que celui de la souris à une modification de l'expression génique, ce qui rend une atteinte cardiaque plus lisible. 160 rats sains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent en une seule injection dans la veine de la queue des doses de vecteurs de thérapie génique montant jusqu'à dix fois la dose minimale efficace, pour chercher la dose maximale sans effet délétère, puis subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie gazeuse et une échocardiographie de vingt minutes. Tous sont tués en fin de protocole pour prélever les organes, le porteur ayant écarté les modèles pathologiques au motif que des signes de maladie pourraient masquer la toxicité recherchée.
Objectifs
Les dystrophies musculaires sont un ensemble de pathologies invalidantes présentant des atteintes fonctionnelles (réduction de la force musculaire, avec parfois atteinte cardiaque ou respiratoire, …) pour lesquelles il n’existe pas de traitement. Une option thérapeutique possible est la thérapie génique, qui consiste à apporter dans les cellules une copie normale du gène déficient en utilisant en particulier des vecteurs viraux dérivés du virus associés à l’Adenovirus (AAV). La thérapie génique clinique a connu un succès significatif ces dernières années. Cependant, le muscle squelettique représentant environ 40% de la masse corporelle, les doses thérapeutiques nécessaires sont extrêmement élevées. Des effets adverses allant jusqu’au décès ont pu être observés dans de récents essais cliniques. Par conséquent, il y a un grand intérêt à définir des stratégies permettant une efficacité aux doses les plus faibles possibles. Des travaux du laboratoire ont permis d’identifier de nouveaux AAV qui sont dix fois plus efficace pour transférer un gène dans le muscle. L’objectif de ce projet est d’évaluer la sécurité de produits de thérapie génique composés de ces nouveaux vecteurs en testant des doses allant jusqu’à au moins 10X la dose minimale efficace définie au préalable dans des modèles pathologiques, afin de déterminer la dose maximale sans effet délétère. Ce projet utilisera des rats de phénotype sauvage (non génétiquement altérés). En effet, il a été montré que cette espèce présente une sensibilité particulière à la modification de l’expression génique au niveau cardiaque. Le cœur étant un organe vital et susceptible d’être affecté par un transfert de gène, l’utilisation de cette espèce dans ce projet représente un contexte sensible pour l’évaluation de la sécurité des produits. De plus, il est à noter que des animaux normaux seront utilisés et non pas des modèles afin de pouvoir également révéler éventuellement des anomalies sans être confondus par des signes pathologiques.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous proposons de définir les meilleurs produits de thérapie génique, en particulier à partir de vecteurs viraux de nouvelle génération ayant un tropisme amélioré pour le muscle. Les résultats permettront l’établissement de traitements de thérapie génique ayant une meilleure efficacité et une plus grande tolérance pour de futures applications chez l'homme afin de traiter ces dystrophies musculaires qui n’ont pas de traitement à l’heure actuelle et qui sont très invalidantes et parfois léthales.
Procédures
Le traitement par transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois en moins de 5 minutes, sur animaux vigiles avec injection dans la veine caudale. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée moins de 5 minutes. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. Pour l’évaluation de la fonction cardiaque, les animaux sont soumis à une échocardiographie en fin de protocole. Les animaux sont anesthésiés et maintenus dans cet état tout au long de l’examen d’une durée de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : douleur de piqûres pour administration d’anesthésique, ou d’intraveineuse pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie gazeuse, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Les vecteurs de thérapie génique utilisés dans ce projet ont fait l’objet d’un ensemble d’études préalables qui ont conduit à leur sélection. La première étape de ces études a été réalisée in vitro sur des cultures cellulaires musculaires humaines afin de valider leur efficacité. Ce projet représente une des étapes finales de la validation de l’intérêt de ces vecteurs pour la thérapie humaine qui consiste à évaluer le niveau de dose maximale sans effet délétère sur l’animal et ses organes. Il n’existe pas de modèles autres que les animaux pour le faire.
Réduction
Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues avec un maximum d’analyses réalisées sur organes prélevés. Pour évaluer les effets potentiellement négatifs des produits de thérapie génique, l’espèce choisie est le rat car cette espèce est plus sensible aux atteintes cardiaques que la souris. Il est donc possible de réduire le nombre d’animaux par groupe de part cette plus grande sensibilité. Le nombre d’animaux utilisés par groupe (5) est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le critère choisi est le niveau de fibrose cardiaque.
Raffinement
Pour évaluer les effets potentiellement négatifs des produits de thérapie génique, l’espèce choisie est le rat car cette espèce est plus sensible aux atteintes cardiaques que la souris. De plus, nous utiliserons des animaux normaux et non pas des modèles de LGMD (=Limb-Girdle Muscular Dystrophy =Dystrophie musculaire des ceintures) pour éviter une interférence entre les signes pathologiques et les signes de toxicités potentielles liées à l’injection de vecteur de thérapie génique. Une phase d’adaptation des animaux à leur nouvel environnement après arrivée à l’animalerie sera mise en place avant l’entrée en protocole. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes) Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique si nécessaire.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce rat car elle est plus sensible au niveau cardiaque, ce qui nous permet d’avoir une meilleure sensibilité de l’expérience. Les animaux seront utilisés au stade adulte.
Etude des doses limites de l’essentialité de l’acide linoléique et de sa capacité à être remplacé par l’acide pentadécanoïque chez le rat Wistar
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
168 jeunes rates surnuméraires seront transférées vers d'autres projets de recherche et d'enseignement, les mères et les ratons mâles étant tués au terme des régimes pour prélever foie, tissus adipeux et cerveau. 403 rats vont être utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les rates sont soumises pendant la gestation puis l'allaitement à des régimes carencés ou surchargés en acide linoléique, leurs ratons continuant ces régimes jusqu'à 4 ou 5 mois, avec des prélèvements sanguins toutes les deux semaines et des tests comportementaux répétés vingt fois en cinq jours. Le porteur annonce chez les rats carencés une croissance ralentie et des troubles cognitifs, chez les rats en surcharge une inflammation et une stéatose hépatique, et affirme dans la même page que ces perturbations n'induiront ni mal-être ni anxiété ni douleur.
Objectifs
Cette étude de recherche fondamentale s'inscrit dans le domaine des liens entre consommation alimentaire de lipides et santé (lipides-nutrition-santé). L’objectif est de mieux définir les bonnes doses de consommation de certains acides gras, en prévention des pathologies nutritionnelles (obésité, diabète de type 2…). L’étude s’intéresse en particulier à l’acide linoléique, qui est un acide gras d’origine végétale uniquement, et que l’animal (dont l’homme) doit consommer de manière indispensable. Le caractère indispensable de cet acide gras dans l’alimentation humaine est démontré depuis longtemps, mais la dose optimale d’apport de cet acide gras reste très controversée. En fonction des modèles d’étude, des doses alimentaires utilisées et du temps de traitement, cet acide gras peut devenir délétère pour la santé et induire l’accumulation de graisses au niveau hépatique (stéatose ou foie gras) ou au niveau des tissus adipeux (obésité), et contribuer ainsi à une inflammation chronique, source de problèmes cardio-vasculaires à terme. Le 1er objectif de cette étude est donc de définir la limite maximale d’apport alimentaire de cet acide gras, au-dessus de laquelle ses effets deviennent délétères sur le long terme. Pour cela, des rates gestantes puis les ratons issus de ces mères seront nourris par des doses croissantes en acide linoléique, depuis la période gestationnelle chez la mère jusqu’à l’âge de 4-5 mois. Les effets potentiellement délétères de chaque dose seront observés. De plus, il est apparu récemment dans la littérature scientifique qu’un acide gras spécifiquement retrouvé dans les produits laitiers et principalement dans le lait, l’acide pentadécanoïque, montre un réel intérêt par sa “proximité biochimique et métabolique” à l’acide linoléique et son potentiel “rôle de remplacement” dans le cas d’une carence. Le second objectif de cette étude est donc de montrer la capacité potentielle de l’acide pentadécanoïque alimentaire à se substituer à l’acide linoléique (en situation de carence) et à assurer certaines fonctions structurales et physiologiques similaires. Pour cela, des rates gestantes puis les ratons issus de ces mères seront nourris par des régimes carencés en acide linoléique mais supplémentés en acide pentadécanoïque, depuis la période gestationnelle chez la mère jusqu’à l’âge de 4-5 mois.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus au terme de cette étude sont : (i) Définir un seuil limite d’excès nutritionnel d'acide linoléique (ii) De mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de la mise en place de la stéatose hépatique d’un excès nutritionnel d'acide linoléique. (iii) De caractériser les effets de l’acide pentadécanoïque en nutrition, effets potentiellement indispensables. (iv) De mettre en exergue le potentiel rôle de substitution de l’acide pentadécanoïque aux acides gras essentiels (acide linolénique, acide linoléique) et selon quelles doses. Ces bénéfices représentent de réels enjeux de santé publique d’un point de vue nutritionnel, dans la réévaluation des apports nutritionnels conseillés en acide linoléique mais également pour la consommation de produits laitiers. Le bénéfice attendu premièrement d’apport des connaissances sur l’apport de l’acide pentadécanoïque en nutrition et définir si cet acide gras peut être une voie de substitution d’acide gras essentiels historiques en situation de carence. Le second bénéfice est de découvrir lors d’une situation de surcharge en acide linoléique, à partir de quelle dose cet acide gras peut nuire à la santé en induisant une stéatose hépatique chez le rat.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à différents régimes supplémentés en divers acides gras pendant 5 mois. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur tous les animaux toutes les 2 semaines. Ces prélèvements seront rapides, de l'ordre de quelques secondes le temps de récolter les volumes nécessaires. Des tests comportementaux seront réalisés sur les animaux selon 2 période : (i) un premier test pendant 5 jours consécutifs, avec 4 essais par jour (avec 5 minutes d'intervalle entre les essais) chaque essai durant 60 secondes. (ii) Un deuxième test sur une semaine avec 3 répétitions du test : 1 test par jour, avec 2 jours d’intervalle entre chaque test, chaque essai durant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Chez les animaux carencés, une légère diminution de la croissance des ratons et l'apparition de troubles cognitifs en absence d’acides gras indispensables est possible. Ces perturbations (diminution croissance et trouble cognitifs) n'induiront pas de mal-être, anxiété ou douleur chez les animaux. Les animaux carencés subiront des tests comportementaux pouvant induire du stress, de l'anxiété et de la fatigue Chez les animaux en surcharge, la mise en place d'une inflammation de bas grade ainsi que d'une stéatose hépatique est possible. Ces perturbations (inflammation et stéatose) peuvent induire une hyperlipidémie et une hépatomégalie potentielle qui ne sont pas léthales et qui n'induiront pas de mal-être, anxiété ou douleur apparente chez les animaux.
Devenir
Les ratons femelles (surnuméraires) seront réutilisées par d’autres chercheurs pour d’autres projets, de recherche et d’enseignement. Les rates mères après gestation et sevrage ainsi que les ratons mâles seront euthanasiées au terme des régimes afin de récolter les échantillons biologiques nécessaires pour nos analyses (foie, tissus adipeux, cerveaux).
Remplacement
L’effet recherché dans cette étude est d’ordre nutritionnel et nécessite donc l’analyse d’un organisme dans son ensemble. En effet, les nutriments diffusent dans le « corps entier » après digestion-absorption des aliments et leurs impacts physiologiques ou physiopathologiques concernent de multiples organes qui interagissent entre eux pour former un système biologique complexe. La substitution totale et complète d'un tel système physiologique ou physiopathologique par d'autres méthodes alternatives n'est donc pas possible.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque condition (8 rats par condition) a été calculé par analyse de la puissance statistique nécessaire pour pouvoir comparer les paramètres étudiés, soit par des tests paramétriques (si la distribution des données le permet), soit par des tests non paramétriques. Ce nombre d’animaux représente la limite basse pour laquelle les effets induits au terme du projet permettront d’observer un effet statistiquement significatif. Dans un souci de bien-être animal, les ratons surnuméraires (femelles) obtenus seront réutilisés par d’autres chercheurs pour d’autres projets, de recherche et d’enseignement.
Raffinement
Les rats seront logés par 3 pour favoriser le lien social, dans des cages de tailles suffisantes pour réduire le stress et permettre l’expression d’un comportement normal des animaux. La supplémentation en acides gras s’effectuera par le biais du régime (ad libitum), contrairement à un gavage récurrent qui engendrerait un stress de l’animal. Un suivi quotidien des animaux sera mené durant toute le projet, afin de déceler tout signe d'angoisse, de douleur ou de souffrance. L'activité physique, la position de l'animal, l'aspect du pelage et le comportement vis-à-vis des congénères seront observés. Le suivi hebdomadaire du poids de l'animal et de la consommation de nourriture seront également utilisés pour déceler tout état de souffrance ou d'angoisse.
Choix des espèces
Historiquement, les expérimentations montrant le caractère indispensable d’acides gras ont été réalisé en utilisant le rat comme modèle et plus récemment d’autres études de carences ont été réalisé sur ce même modèle. De plus ce même modèle animal a été utilisé dans l’étude des effets induits par une surcharge en acide linoléique. Des études menées sur d’autres modèles notamment chez la souris, n’ont pas montré de résultats similaires. Le rat est donc un bon modèle pour étudier l’induction d’une carence ou d’une surcharge en acides gras. Ce modèle permet le prélèvement d’organes ou tissus suffisamment volumineux pour réaliser les analyses biochimiques prévues. Les rates soumises aux différents régimes seront gestantes puis allaitantes. Ensuite, les ratons seront nourris avec les différents régimes après la période de sevrage, soit environ 3-4 semaines après la naissance. Ils seront nourris avec ces régimes pendant 14 ou 17 semaines puis euthanasiés. L’induction de la surcharge ou de la carence doit débuter chez les rates gestantes afin d’observer un effet significatif chez les ratons issus de ces mères. L’âge final des ratons correspond au temps nécessaire pour observer la carence ou la surcharge.
Etude du rôle du système à peptide RFamide PrRP/GPR10 dans la modulation de la nociception et de la douleur à l’aide de souris génétiquement modifiées. (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une biopsie de la queue entre 5 et 7 jours de vie, puis pour 1 248 d'entre elles une injection de tamoxifène et un phénotypage comportemental : 1 754 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Selon le lot, elles subissent ensuite jusqu'à 84 tests de douleur répartis sur 42 jours, ou une chirurgie de la patte droite suivie de tests répétés pendant sept semaines. Le porteur indique que ces procédures peuvent abaisser le seuil douloureux et provoquer inflammation, œdème, infection des sutures et troubles de la locomotion, l'objectif étant de caractériser un récepteur impliqué dans l'hyperalgésie induite par les opiacés. Les souriceaux au mauvais génotype sont tués au sortir de l'élevage, les autres à l'issue de leur procédure, aucune réutilisation n'étant possible parce que la douleur infligée fausserait tout protocole ultérieur.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur, ce qui sous-entend des points communs entre l’hyperalgésie induite par les opiacés et le développement de l’hyperalgésie induite par les douleurs chroniques. Les données de la littérature ainsi que nos premiers résultats indiquent qu’un récepteur spécifique serait impliqué dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment généré une lignée de souris chez qui nous pouvons désactiver ce récepteur. L’étude de cette lignée nous permettra notamment de mieux comprendre l’implication de ce récepteur dans la modulation de la douleur et le développement de l’hyperalgésie, mais aussi d’envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Ce projet est un projet multi-site se déroulerant dans 2 Etablissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet, combinés aux résultats précédemment obtenus par une approche pharmacologique avec un ligand exogène (molécule synthétique pouvant se fixer au récepteur), permettront d’affiner le rôle de ce récepteur ainsi que de son ligand endogène (molécule naturellement synthétisée par les neurones et pouvant s’y fixer) dans la modulation de la nociception et le développement de l’hyperalgésie induite par les opiacés et les douleurs persistantes. Ce projet pourrait permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie unique sur animal vigil à l'âge de 5 à 7 jours afin de réaliser leur génotypage (réalisée dans l'EU1). 1248 animaux du projet subiront une injection de tamoxifène et un phénotypage comportemental (réalisée dans l'EU1). Un 1er lot d’animaux subira 1 à 2 tests nociceptifs d’une durée de 15 min environ par jour pendant 12 jours ; puis 2 tests de confort nociceptif d’une durée d’1h (1 test par jour dans ce cas)(EU2). Un 2nd lot d’animaux subira 4 injections à raison d’une injection toutes les 15 min. Ces animaux subiront au total 36 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 22 jours (EU2). Un 3ème lot d’animaux subira des injections pendant 11 jours. Ces animaux subiront au total 66 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 4 semaines (EU2). Un 4ème lot d’animaux subira une injection dans la queue. Ces animaux subiront également au total 48 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 25 jours (EU2). Un 5ème lot d’animaux subira une injection dans la queue. Ces animaux subiront également au total 84 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 42 jours. Un 6ème lot d’animaux subira deux tests nociceptifs d’une durée de 10 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une chirurgie de la patte droite avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 4 tests maximum (espacés de 4h minium) par semaine, pendant 7 semaines (EU2). Un 7ème lot d’animaux subira 2 tests nociceptifs d’une durée de 10 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une chirurgie de la patte droite avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 2 tests par jour (espacés de 4h minium) pendant 3 semaines. Un dernier lot d’animaux subira un test nociceptif d’une durée de 3 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une injection avant de réaliser le même test nociceptif, tous les 15 min pendant 90 min (EU2).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont une douleur modérée après la biopsie, l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, inconfort transitoire au point d’injection.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage ayant le génotype d'intérêt continue vers les procédures de phénotypage comportemental et ceux n'ayant pas le génotype d'intérêt sont mis à mort. Les animaux avec le génotype d'intérêt inclus dans les procédures sont mis à mort à l'issue de chacune d'elles. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, la caractérisation de la modulation de la nociception et de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons pu estimer par une analyse statistique que 12 animaux de chaque sexe/groupe sont requis pour obtenir des résultats exploitables. Ainsi chaque étude de base comportera un groupe transgénique témoin et un groupe transgénique invalidé pour la protéine d'intérêt sans avoir été soumis au traitement cet un groupe de souris transgéniques obtenues par traitement. Les animaux utilisés dans des études similaires n’étant pas disponibles, en cas de réussite avec ce nouveau modèle, les animaux prévus pour les deux autres études ne seront pas utilisés. De par notre expérience du maintien des lignée de souris transgéniques incluses dans le projet, nous connaissons aussi le nombre optimal de couples reproducteurs qu'il nous faut, pour pouvoir à la fois maintenir les lignées et fournir les animaux nécessaires au bon déroulé des expériences.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Pour le transport des animaux, vu la courte distance entre les 2 EU (5 km), celui-ci sera effectué par véhicule personnel. Les cages seront positionnées de manière à ce qu'elles ne puissent bouger ni se renverser pendant le transport. Les conditions environnementales seront maintenues pendant le transport (on vérifiera la température du véhicule avant le transport). Les cages de transport contiendront de l'eau et la nourriture gélifiés ainsi que des enrchissements (frissure et morceaux de bois à ronger). Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et les injections d'agent inflammatoire sous anesthésie gazeuse. Pour les tests comportementaux mesurant les seuils de douleur, les animaux gardent le contrôle sur le test: le retrait de la patte de l'animal ou de la queue met fin au test, ou l’animal change de compartiment. Le test est de toute façon toujours arrêté au seuil nociceptif de l’animal et des points limites spécifiques ont été défini pour éviter toute lésion des tissus. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour stopper tout signe de mal-être de l’animal.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier le rôle du récepteur GPR10 dans la modulation de la nociception et de la douleur. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. Par ailleurs, la souris permet des délétions conditionnelles qui est la base d’étude de ce projet. Des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g) car l’étude des comportements dans nos différents modèles nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures. Pour le génotypage, les souriceaux seront utilisés entre 5 et 7 jours car la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation ne sont pas encore complets, ce qui minimise la souffrance des petits.
Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
La queue plongée dans un bain-marie jusqu'à vingt secondes, les pattes posées sur une plaque chauffée jusqu'à trente secondes, la queue tirée par l'expérimentateur pour mesurer la force d'agrippement, la course sur tapis roulant puis sur cylindre rotatif : 720 souris passeront cette série de tests à six mois puis à un an. 1 246 souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth vont être utilisées au total, 1 104 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyse histologique. 584 reçoivent une injection de virus adéno-associés entre le premier et le vingt et unième jour après la naissance, et des femelles sont isolées une semaine pour que leurs ultrasons soient enregistrés. Le porteur écrit que ces lignées ne présentent aucun signe de douleur ni incapacité locomotrice, alors qu'il déclare lui-même 1 104 souris en gravité sévère.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d'atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l'injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Procédures
Pour réguler l'expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d'injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des virus adéno-associés) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d'un dynamomètre et la force d'agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d'enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chauffée et la latence de réaction sera notée avant de sortir l'animal avec un temps limite de 30 secondes.Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l'activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale. Amendement. Nous isolerons les femelles pendant 1 semaine puis nous les mettrons en contact avec des femelles wt plus jeunes pendant 10 minutes durant laquelles nous mesurerons les ultra-sons émis par les animaux isolés.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux modèles âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n'engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l'animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l'animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure. Amendement. Pour les tests de vocalisation, l'isolement des animaux pendant 1 semaine provoquera un stress de classe modérée mais l'isolement est le seul moyen de stimuler la vocalisation des femelles avant de faire le test.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements d'organes pour des études histologique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l'étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d'animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l'aide d'un score. L'étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D'une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d'administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l'apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s'aggravent avec l'âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d'une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.
Cibles cellulaires thérapeutiques dans une maladie du système immunitaire : le lupus
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Attrapées et immobilisées à la main pour recevoir jusqu'à cinq injections dans le ventre en quinze jours, certaines souris subissent en plus un prélèvement de sang sous anesthésie générale dont la cicatrisation prend vingt-quatre heures. 1 380 souris, dont une lignée génétiquement modifiée qui développe une pathologie lupique, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 900. Le porteur écrit que ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus, et qualifie lui-même de "dommageable" le génotype qu'il utilise. Toutes sont tuées en fin de procédure pour analyse des organes, ceux des souris témoins servant en plus à des cultures cellulaires.
Objectifs
Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles et les éosinophiles) dans le contrôle des facteurs immunitaires responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs médiateurs (des molécules qu'elles libèrent) dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de l'élimination de ces cellules ou de leur injection dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les éosinophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Un génotype (gène absent dans une lignée de souris) dit dommageable (souris LynKO) est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent une pathologie lupique légère mais cependant quantifiable. Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : 1- des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») qui induiront une douleur brève de piqûre. Ces injections sont aussi efficaces que des intraveineuses pour disperser le composé injecté dans tous le corps mais moins contraignantes pour les souris. 2- des contentions (souris attrapées et immobilisées dans une main) : cet acte induit un stress bref pour les souris, mais sont indispensables pour réaliser les injections. 3- certaines souris seront soumises à un prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Ce geste peut induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures). Ce prélèvement permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant le traitement et à la fin de la procédure. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois au maximum sur une période de 15 jours. Ces interventions seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables induits sur les animaux seront un stress bref et des douleurs brèves. La contention des animaux induira un stress bref passager chez les animaux. Les injections induiront une légère douleur de piqûre brève. Les prélèvements sanguins (une seule fois) peuvent induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures).
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés en fin de procédure afin d'en analyser les organes d'intérêts.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des approches in vivo (dans l’organisme vivant) verront leurs organes utilisés pour des cultures cellulaires et des expériences in vitro et les organes des souris malades traitées ou non serviront de contrôles positifs ou négatifs pour des expériences ultérieures. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé en fonction des besoins du projet afin de pouvoir conclure scientifiquement. Le nombre d’individus à analyser par groupe d’animaux sera gardé au minimum autant que faire se peut.
Raffinement
Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'ils soient contaminés par des agents infectieux, avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et avec un contrôle de la température, du cycle jour/nuit et de l’humidité. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, ne sont jamais isolés et sont toujours hébergés avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher). Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans le présent projet. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. La contention des animaux reste nécessaire aux injections par voie intrapéritonéale (dans le ventre) prévues ce qui engendrera un stress bref chez les animaux. Ces pratiques seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut. Les souris seront observées quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être.
Choix des espèces
Les études d’une approche thérapeutique innovante sur un modèle de pathologie humaine doivent être réalisées sur des modèles animaux afin de justifier le passage aux tests chez l’Homme. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et toutes les mesures permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés ainsi que les éventuelles souffrances subies par ces animaux seront entreprises. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 8 semaines (stade adulte). Tous les animaux seront utilisés avant 41 semaines d’âge pour éviter tout risque de souffrance des individus.
Traitement de modèles murins de la maladie d’Alzheimer par des mini-anticorps ciblant des protéines du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées dans le ventre ou dans le nez, puis soumises à des épreuves censées mesurer la mémoire, l'exploration et les comportements répétés, des souris porteuses de mutations modélisant la maladie d'Alzheimer reçoivent entre quatre et quarante injections espacées d'une semaine. 960 souris sont déclarées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélèvement de structures cérébrales. Le détail des procédures cite pourtant 540, puis 960, puis 2 880 souris, soit un total très supérieur à l'effectif déclaré. Aucun des tests comportementaux n'est nommé, et le porteur conclut à l'absence de souffrance attendue en s'appuyant sur des études déjà publiées.
Objectifs
La démence touche environ 50 millions de personnes dans le monde, et atteindrait 139 millions de personnes en 2050. La maladie d’Alzheimer représente 60 à 70% des démences et se classe 5ème cause de mortalité dans le monde. Seuls 4 médicaments ont été autorisés sur le marché, mais ne sont plus remboursés depuis 2018 en France dû à leur efficacité limitée. Récemment, des immunothérapies ciblant un des marqueurs de la pathologie ont été autorisées, mais leur approbation est controversée à cause de leurs effets secondaires. Il est donc urgent de mettre au point des stratégies thérapeutiques efficaces contre cette pathologie. Des anticorps produits chez les camélidés, appelés mini-anticorps et 10 fois plus petits qu’un anticorps classique, apparaissent comme outils prometteurs pour franchir les barrières entre le sang et le cerveau. Ils promettent également moins d’effets indésirables grâce à leur haute spécificité pour leur cible. Le laboratoire a ainsi développé, produit et optimisé plusieurs mini-anticorps ciblant des récepteurs connus pour être dérégulés et impliqués dans la maladie d’Alzheimer. Ce projet vise ainsi à évaluer les effets pharmacologiques des mini-anticorps dans différents modèles de la maladie d’Alzheimer. Pour cela, le projet se découpe en trois parties : (1) Evaluation de la spécificité des mini-anticorps pour les différentes cibles dans le cerveau. (2) Evaluation du passage de la barrière sang-cerveau par les différents mini-anticorps. (3) Evaluation de traitements chroniques sur des modèles de souris transgéniques Alzheimer.
Bénéfices attendus
Le projet permettrait d’évaluer les différents mini-anticorps produits et optimisés au laboratoire, et de sélectionner les mini-anticorps prometteurs dans le traitement de la maladie d’Alzheimer. Les principaux avantages de ces molécules sont leur haute spécificité, leur capacité à moduler uniquement les récepteurs impliqués dans la maladie d’Alzheimer, et peu ou pas d’effets secondaires. On souhaite donc mettre en place une nouvelle génération de stratégies thérapeutiques, qui engendreraient moins d’effets secondaires.
Procédures
L’intégralité des souris sera soumise à minima à une injection intra-péritonéale pour l’anesthésie en vue de la mise à mort, 540 souris ne seront que dans ce cas-ci. Pour étudier le passage des mini-anticorps dans le cerveau, 960 souris recevront une injection intra-péritonéale ou intra-nasale de mini-anticorps ou de tampon salin (480 souris pour chaque mode d’injection). Elles recevront aussi une injection intra-péritonéale pour l’anesthésie en vue de la mise à mort pour un temps total de 30min entre l'injection d'anesthésiques et la mise à mort. Concernant les traitements chroniques, les 2880 souris restantes recevront entre 4 et 40 injections intra-péritonéales de mini-anticorps ou de tampon salin, espacées d’une semaine. Ces mêmes souris seront également soumises à divers tests comportementaux évaluant les déficits cognitifs. Un test permettra d'évaluer la mémoire, un autre évaluera les capacités exploratoires de la souris, et un dernier test permettra de mesurer les comportements répétés. Elles recevront aussi une injection intra-péritonéale pour l’anesthésie en vue de la mise à mort pour un temps total de 30min entre l'injection d'anesthésiques et la mise à mort. Ponctuellement, une anesthésie gazeuse sera effectuée avant l’anesthésie médicamenteuse pour des prélèvements de fluides biologiques, pour une durée comprise entre 2 et 3h.
Impact sur les animaux
Une douleur légère produite par l’introduction d’une aiguille au cours de l’administration des mini-anticorps peut être attendues. L’injection par voie intra-nasale pourra induire un stress à l’animal, dû à la contention plus longue. D’après des études déjà publiées, aucune souffrance, douleur ou angoisse ne sont attendues après traitement avec des mini-anticorps.
Devenir
L’ensemble des animaux est destiné à être euthanasié afin de pouvoir prélever des structures d’intérêt pour analyse.
Remplacement
Le sujet de l’étude étant l’évaluation des effets pharmacologiques et comportementaux chez la souris, le remplacement de l’animal n’est pas envisageable. La maladie d'Alzheimer est une pathologie complexe à plusieurs échelles, moléculaire et comportementale. De même, l’évaluation d’une immunothérapie prend en compte divers critères qui doivent être translationnels à une immunothérapie sur l’Homme. En effet, il n’existe aucun modèle de recherche qui puisse mimer les effets thérapeutiques des mini-anticorps injectés et la complexité de l’organisme répondant à cette immunothérapie, d’un point de vue moléculaire et comportemental, d’où le besoin d’un modèle animal transgénique (Alzheimer).
Réduction
Les études préliminaires ont permis de réellement identifier et sélectionner les mini-anticorps prometteurs dans des traitements sur la souris, afin de réduire au maximum les études sur l’animal. Tout au long de ce projet, plusieurs étapes permettront d’affiner la sélection des mini-anticorps, ce qui diminuera le nombre de souris qui ne seront pas nécessaires pour les étapes suivantes. La dernière partie de l’étude sur l’évaluation d’un co-traitement pourra être réduite drastiquement, voire non réalisée, si les résultats n’y montrent pas un intérêt suffisant. De plus, l’utilisation de mâles et de femelles est une question de santé publique afin d’évaluer au mieux les effets du traitement qui peuvent différer entre les deux sexes, notamment dans la maladie d'Alzheimer.
Raffinement
Les données préliminaires obtenues au laboratoire et présentes dans la littérature scientifique n’indiquent aucune toxicité possible liée à l’injection de mini-anticorps. Il n’est donc pas attendu de souffrance chez les animaux qui seront injectés. Les animaux seront sous surveillance journalière par le personnel zootechnicien. Différents paramètres seront observés : les processus neuro-inflammatoires, suivi de paramètres comportementaux généraux et cognitifs, ainsi que le suivi de l’amélioration ou l’aggravation de la pathologie. Avant les tests comportementaux, les souris seront soumises à plusieurs séances d’habituation pour diminuer le stress. Au vu des données disponibles dans la littérature scientifique, aucun symptôme de douleur n’est attendu pour ces modèles de souris. Les souris seront hébergées en groupe dans un milieu enrichi, avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum.
Choix des espèces
Nous utilisons des modèles génétiques de souris qui développent la maladie d’Alzheimer. Ces modèles peuvent donc être utilisés pour évaluer l’évolution des déficits cognitifs lors des traitements avec les mini-anticorps. Les modèles de souris déficientes des récepteurs cibles sont indispensables pour avoir des contrôles fiables de la spécificité des mini-anticorps en vue des traitements chroniques. Les animaux seront traités à une dose unique entre 2 et 6 mois pour évaluer la spécificité des mini-anticorps et leur passage dans le cerveau. Ces âges-ci correspondent à un développement du cerveau bien achevé. D’autres animaux seront traités chroniquement à partir du sevrage et jusqu’à 11 mois d’âge au plus tard, là où les déficits cognitifs seront bien établis.
NIAGARA : Implication des noyaux paraventriculaires dans la neurogenèse hypothalamique et sensibilité au régime alimentaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélèvement de tissus. La moitié reçoit pendant trois jours un régime riche en graisses, une partie subit une injection dans le ventre chaque jour pendant une semaine, et des prélèvements sanguins sont faits au niveau de l'œil sous anesthésie locale. Le bénéfice annoncé reste interne à la recherche : identifier une population de cellules souches dans une région précise de l'hypothalamus et observer sa réaction au régime gras. Le porteur affirme que la flexibilité métabolique ne peut pas être reproduite en culture cellulaire et qu'il faut "utiliser l'organisme dans son ensemble".
Objectifs
Des cellules spécialisées, nommées tanycytes, se trouvent dans une partie du cerveau appelée l'hypothalamus, région qui contrôle la prise alimentaire et le métabolisme. Ces cellules agissent comme des cellules souches neurales : elles génèrent de nouveaux neurones et cellules cérébrales. Un régime riche en graisse peut perturber la formation des tanycytes et leur devenir, entraînant ainsi des problèmes métaboliques. Cependant, certains organismes ont développé des mécanismes pour s'adapter à ce type de régime et éviter l'obésité. Ce mécanisme, appelé flexibilité métabolique, est la capacité d'ajuster le métabolisme en fonction de la disponibilité des nutriments. De manière intéressante, des cellules similaires aux tanycytes ont été découvertes chez les souris résistantes à l'obésité dans une région de l’hypothalamus où ils n’ont pas encore été décrits, les noyaux paraventriculaires. Il s’agit de noyaux qui bordent le ventricule de part et d’autre de celui-ci, d’où leur nom de « paraventriculaire ». Ces cellules, renommées dans cette étude les tanycytes-like sont peu présentes voire inexistantes chez la souris de laboratoire sensibles à l'obésité. Cette découverte suscite des questions sur le rôle de ces cellules, similaires aux tanycytes, dans le contrôle du métabolisme. Cette étude a deux objectifs : 1) déterminer si les tanycyte-like, sont des cellules souches neurales et 2) déterminer si ces cellules se multiplient et produisent plus de neurones en réponse à un régime alimentaire riche en graisses uniquement chez les souris résistantes à l’obésité, (en comparaison avec de souris sensibles à l’obésité). Si c’est le cas, cela suggèrerait que les tanycyte-like donnent au cerveau de la souris résistante à l’obésité une capacité d'adaptation spéciale à des signaux extérieurs, tels que le régime alimentaire.
Bénéfices attendus
Cette recherche identifierait une nouvelle population de cellules souches neurales dans une partie spécifique du cerveau et évaluerait comment elles réagissent à différents régimes alimentaires. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles explorations sur le rôle des noyaux paraventriculaires et des tanycyte-like dans la capacité de l’organisme à s'adapter à des régimes variés. Les résultats pourraient également expliquer pourquoi certaines souris sont plus résistantes aux problèmes métaboliques que d'autres. En fin de compte, cette étude aiderait à comprendre les mécanismes liés à des maladies métaboliques et à mieux saisir comment l'hypothalamus fonctionne dans des conditions alimentaires changeantes.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à un régime riche en graisse pendant 3 jours. Une partie des animaux recevra également une injection intrapéritonéale par jour pendant 7 jours d’un traceur qui permet de marquer et suivre les cellules nouvellement formées. Cette intervention ne nécessite aucun anesthésiant, mais les animaux seront surveillés les heures suivants l’injection. Des prélèvements sanguins seront réalisés au niveau de l’œil, après anesthésie locale par gel d’oxybuprocaine 0,4%. Les souris seront euthanasiées à la fin de l'expérience.
Impact sur les animaux
Nos procédures ont été précédemment testées pour minimiser tout impact négatif sur les souris. Dans une étude antérieure, un régime riche en graisses administré pendant 3 jours a entraîné une augmentation de seulement 4% du poids corporel chez les souris. Cependant, chez les souris naturellement résistantes à l‘obésité, ce régime n'a eu aucun effet sur le poids corporel. Les injections répétées du traceur pendant une semaine ne semblent pas avoir d'effets nocifs ou toxiques sur les souris, ce qui rend ces deux interventions légères et sans effets indésirables sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car des prélèvements de tissus et analyses sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
Nous souhaitons combiner des approches in vitro et in vivo pour étudier la capacité de prolifération des tanycyte-like. Pour confirmer qu'une cellule est une cellule souche neurale, nous devons utiliser les deux approches, et il est crucial d'inclure une approche sur animal entier. Les études physiologiques liées au métabolisme ne peuvent être menées qu'avec des animaux vivants, car le métabolisme est un processus complexe qui nécessite un système intégré. Ainsi, les effets du régime riche en graisses sur les cellules des noyaux paraventriculaires ne peuvent être observés qu'en examinant les cerveaux des souris. Nous devons donc confirmer à la fois in vivo et in vitro la capacité des tanycyte-like à proliférer, ainsi que leur destin cellulaire. Cela nous permettra ensuite de comprendre leur rôle potentiel dans la flexibilité métabolique. De plus, la flexibilité métabolique ne peut pas être reproduite dans des expériences de culture cellulaire, c'est pourquoi nous devons utiliser l'organisme dans son ensemble pour étudier ce phénomène.
Réduction
Nous utiliserons cinq animaux par groupe et par expérience dans notre étude, ce qui est considéré comme le nombre minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Utiliser moins d'animaux serait préjudiciable à la qualité de nos données et conduirait à une utilisation inutile d'animaux. Au final, nous estimons qu'un total de 100 animaux est nécessaire pour atteindre les objectifs de notre étude, tout en maintenant une puissance statistique suffisante. Pour analyser nos résultats sans compromettre la précision statistique, nous utiliserons une méthode adaptée aux petits échantillons qui garantira la robustesse de nos conclusions.
Raffinement
Nous surveillerons de près le poids corporel et la consommation alimentaire des animaux chaque semaine. Si des effets négatifs tels que la prostration, la non-alimentation ou des blessures étaient observés, l'animal serait retiré du groupe expérimental et euthanasié si nécessaire. Pendant toute la durée de l'expérience, nous veillerons à enrichir l'environnement des animaux avec une maisonnette et un bâtonnet à ronger. De plus, les animaux auront la possibilité de construire leur nid avec du coton pour favoriser leur bien-être. Même si les souris doivent être isolés pour évaluer la quantité de nourriture consommée, les contacts olfactifs et visuels avec leurs congénères sont conservés. Chaque cage sera équipée d'un igloo pour offrir un refuge aux animaux, ainsi que de matériel de nidification (plusieurs bâtons de ouate) et des bâtonnets de bois à ronger pour les stimuler et enrichir leur environnement. Pour les prélèvements sanguins, un gel anesthésiant sera appliqué au niveau de l’œil pour éviter toute éventuelle douleur.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle biologique pour notre étude. Les souris sont largement utilisées en recherche scientifique, ce qui a permis d'accumuler des connaissances approfondies sur de nombreux aspects physiologiques et comportementaux liés à l'équilibre énergétique. Notre recherche se base sur la différence de contrôle métabolique entre deux souches de souris déjà bien caractérisées au laboratoire, ce qui constitue le fondement de notre étude. Tous les protocoles que nous utiliserons ont été spécifiquement adaptés et validés pour les souris, avec un contrôle rigoureux des paramètres vitaux. Nous travaillerons avec des souris jeunes adultes, c'est-à-dire des animaux âgés de 2 mois.
Création et maintien d’une lignée transgénique de poisson zèbre pour étudier une nouvelle mutation génétique impliquée dans une pathologie osseuse
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Amputés d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, baignés deux nuits dans un colorant sans nourriture, anesthésiés chaque semaine pendant trois semaines pour des séances d'imagerie, 1 832 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Tous seront tués à la fin du projet. Les poissons porteurs de la mutation étudiée développeront des malformations du crâne et de la colonne, que le porteur annonce sans en faire un critère d'exclusion, l'objectif étant de vérifier qu'une mutation repérée chez des enfants de petite taille cause bien la maladie. Il présente pourtant le poisson comme permettant des approches "largement non-invasives", tout en indiquant que le prélèvement de nageoire à trois jours entraîne aujourd'hui une importante létalité.
Objectifs
En étudiant 400 enfants de petite taille, il a été identifié une nouvelle mutation génétique responsable d'une maladie caractérisée par une petite taille et des malformations du squelette de la tête. Si le rôle de ce gène dans le développement squelettique a déjà été décrit, il n'a jamais été associé à une maladie humaine. Le développement d'un modèle animal est indispensable à la fois pour confirmer la pathogénicité de cette mutation et pour déterminer les mécanismes responsable de cette maladie. Par conséquent l’objectif de ce projet consiste à l’établissement et à la caractérisation d’un modèle de poisson-zèbre exprimant cette mutation afin d’étudier l’impact de la mutation sur le développement du squelette de la tête.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux définir le rôle d'une protéine au cours du développement squelettique. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies entrainant des défaut de la croissance osseuse . La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des pathologies osseuses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Un prélèvement d'un bout de nageoire, sera réalisé sous anesthésie (1 minute) sera effectué sur certains poissons. Certains poissons seront baignés 2 fois dans un colorant pendant une nuit à chaque fois hors flux sans nourrissage Certains poissons seront imagés 1fois/semaine pendant 3 semaines (3 minutes environs). Certains poissons subiront une injection intrapéritonéale sous anesthesie (5 minutes maximum).
Impact sur les animaux
Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d'intérêt, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. D'autre part, les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs 1/ aux anesthésies répétées lors de l’acquisition d’images hebdomadaires, 2/ aux colorations in vivo, 3/ aux isolements nécessaires pour les acquisitions d’images et pour le génotypage des poissons, 4/au prélèvement d’un fragment de 1mm de la nageoire caudale sous anesthésie générale et 5/ à une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale.
Devenir
L'ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été réalisées soit au court des procédures soit seront réalysees en post mortem.
Remplacement
Le développement du squelette est un mécanisme complexe impliquant différent types cellulaires interconnectés. Son développement est une suite d’évènements influencé par de multiples paramètres physiologiques et environnementaux. De ce fait, il est pour le moment impossible de modéliser parfaitement son développement in vitro, et le recours à l’expérimentation in vivo reste incontournable. Néanmoins l'utilisation du poisson comme espèce modèle permet cependant des approches largement non-invasives sans nécessité d’intervention chirurgicale.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire. Ce nombre a été pour chaque protocole déterminé afin d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour l’obtention de résultats significatifs en prenant compte de la variabilité de la croissance des poissons observé au cours de précédents projets du laboratoire. Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Au cours de la procédure 3 afin d’une part d’augmenter la puissance statistique et d’autre part de réduire le nombre d’animaux utilisé, les acquisitions d’image seront réalisées sur le même animal à différents temps. Nous mettons en place actuellement le prélèvement de la nageoire des poissons pour génotypage à 3 jours post fécondation au sein de l'animalerie. A l'heure actuelle ce geste entraine une importante léthalité et nécessite une amélioration. Néanmoins au cours de ces 5 prochaines années, la mise en place de cette technique permettra de réduire le nombre d'animaux par procédure.
Raffinement
Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d’interet, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. Dans le cas d’un défaut mandibulaire trop important, l’analyse des poissons se limitera à l’analyse des premières étapes du développement crâniofacial jusqu’à 5 jours post fecondation). Dans le cas d’un défaut mandibulaire modéré à faible, Les bacs à surveiller seront indiqués, le comportement des animaux face à la nourriture sera analysé quotidiennement lors du nourrissage par les animaliers. D’autre part l’apparition de symptômes morphologiques ou comportementaux sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Seuls les poissons nécessaires à la création, au maintien des lignées et à l’analyse du squelette post mortem aux stades adultes seront génotypés à 3mois post fécondation sous anesthésie générale en présence d’un analgésique. A la suite du génotypage, les poissons sont mis sous analgésiques pendant 48h. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un microscope permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie. Le milieu aqueux utilisé pour maintenir les poissons dans la bonne position pendant l’acquisition permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations.
Choix des espèces
Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette dela tête. Le squelette de la tête présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de poissons exprimant des protéines fluorescences dans les cellules participant à la formation osseuse permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. L’analyse du squelette se fera du stade larvaire (7jours post fécondation (jpf) ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 1 semaines, 2 semaines, 3 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois).
Etude de la pharmacocinétique et de la biodistribution de différentes nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPIONs) chez le rat sain
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
33 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacun subissant soit huit prélèvements sanguins sous anesthésie après une injection intraveineuse, soit deux séances d'IRM d'une heure. Tous seront tués en fin de procédure pour prélever leurs organes. Le porteur justifie le choix du rat plutôt que de la souris par la possibilité de prélever davantage de sang sur un même individu, ce qui divise par huit le nombre d'animaux utilisés. Le bénéfice annoncé se limite à mieux comprendre comment influencer le comportement de nanoparticules d'oxyde de fer dans le sang, un usage en médecine humaine étant renvoyé au long terme.
Objectifs
Les nanoparticules à base de fer sont en plein développement et possèdent de nombreuses propriétés pour des applications en médecine : en effet, 1/ elles pourraient aider au diagnostic par imagerie IRM (imagerie par résonance magnétique) car le fer est visible en IRM mais aussi 2/ elles pourraient servir pour traiter des pathologies: i) sous un champ magnétique le fer peut dégager de la chaleur et détruire les cellules à proximité, ii) le fer peut également aider à augmenter les effets de radiothérapie (traitement par rayons) et enfin, iii) les nanoparticules peuvent jouer le rôle de transporteur de médicaments. Un élément indispensable avant de développer des nanoparticules est de contrôler leur comportement dans l’organisme afin de les amener sur leur lieu d’action. Le principal problème de la plupart des nanoparticules est qu’elles sont vite éliminées de la circulation sans avoir le temps de rejoindre leur cible et qu’elles s’accumulent dans le foie qui est l’organe qui permet leur élimination. Dans de précédents travaux nous avons identifié que certaines protéines présentes dans la circulation sanguine pouvaient influencer le comportement biologique de nanoparticules d’oxyde de fer aussi appelées Spions (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles). Dans ce projet, nous souhaitons maintenant greffer ces protéines sur les Spions et évaluer leur comportement biologique : temps de circulation sanguine et élimination.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre comment influencer le comportement biologique de nanoparticules d’oxyde de fer pour à terme permettre leur utilisation en médecine humaine.
Procédures
Procédure 1 : Une injection intraveineuse (1minute) puis 8 prélèvements sanguins (2 minutes chacun) sous anesthésie. Procédure 2 : deux sessions d’imagerie par IRM (1h maximum chacune) seront réalisées ainsi qu’une injection intraveineuse (1 minute) sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L’injection intraveineuse et les prélèvements sanguins répétés sous anesthésie pourraient présenter un léger inconfort et des lésions locales si le geste est mal maîtrisé. Un stress associé à la mise sous anesthésie peut également intervenir. Les composés administrés ne devraient avoir aucun effet.
Devenir
Des analyses complémentaires sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de l’étude. La totalité des animaux seront euthanasiés en fin de procédure
Remplacement
L’étude du devenir d’une molécule dans l’organisme rend la règle de remplacement difficilement applicable puisqu’il est nécessaire de l’étudier dans son contexte global avec une interaction entre les différents organes préservée.
Réduction
Une sélection de 6 Spions, préalablement testés in vitro pour l’étude de leur pharmacocinétique puis par la suite des 3 meilleurs Spions pour l’étude de biodistribution permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant ceux avec les moins bonnes propriétés physiologiques. L’effectif de chaque groupe expérimental a été réduit à son minimum dans chaque procédure afin d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents sur la base des études menées précédemment. L’utilisation du rat permet également de réduire les effectifs car il est possible de réaliser des prélèvements sanguins répétés compatibles avec nos analyses biologiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes sociaux de 2 ou 3 avec accès illimité à l’eau et la nourriture. L’enrichissement des cages sera composé de 2 pad de sizzle-dri (frisottis de carton). Un temps d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respecté avant le début de la procédure. La réalisation d’une imagerie IRM dans cette étude, qui est une méthode non invasive, permet de réduire la douleur et l’inconfort à son niveau minimum. La totalité des procédures est réalisée sous anesthésie et sur plaque/lit chauffant afin de réduire l’inconfort de l’animal. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance et également à la bonne réalisation des gestes techniques.
Choix des espèces
Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever de façon répétée des volumes de sang pour nos analyses qui demanderaient l’utilisation de nombreuses souris. Dans un but de réduction du nombre d’animaux nous utiliserons le rat qui permet de diminuer le nombre d’animaux par 8 mais également l’imagerie par IRM. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (250g) afin qu’ils aient atteints leur maturité physiologique