Procédures légères

162 500 animaux non-humains vont être utilisés pour un seul geste chacun, trois millimètres de queue ou d'oreille coupés en cinq secondes chez 150 000 souris vigiles, quatre millimètres carrés de nageoire caudale prélevés sous anesthésie chez 12 500 poissons zèbres. Les procédures sont déclarées légères pour 156 750 d'entre eux et modérées pour 5 750, ce dernier niveau correspondant aux lignées dont les mutations provoquent, selon le porteur, "des douleurs, de l'inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités". Le projet relève de la gestion d'élevage, identifier génétiquement les animaux produits et repérer les lignées dont les mutations nuisent, pour constituer les lots destinés à d'autres projets. Le porteur écarte la pommade anesthésiante, qui allongerait l'intervention et pourrait gêner le génotypage, ainsi que l'analgésie par injection, et estime à 60 000 les animaux gardés vivants sur cinq ans pour renouveler les reproducteurs ou partir en expérimentation, les autres étant tués quand leur combinaison de gènes ne sert ni à l'élevage ni aux expériences.

Objectifs

L'établissement utilisateur est constitué de deux instituts de recherche qui s’intéressent à différents domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie,...). Dans le cadre des projets utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à des demandes d’autorisation de projet), des modèles animaux précliniques génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important de détecter et gérer les pathologies induites par les mutations dans les élevages (appelé phénotypes dommageables) de ces modèles et de bien caractériser génétiquement les animaux produits (appelé : le génotypage). L’ensemble permet un élevage adapté pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et optimisée aux besoins des scientifiques de ces instituts.

Bénéfices attendus

Pour le bénéfice direct, ce projet permet d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des chercheurs pour les expérimentations qui seront faites à l'issue de ce projet. Il permet également de prendre en charge rapidement et donc de minimiser les souffrances qui pourraient être induites par les mutations des modèles animaux. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines. Ce projet permet la caractérisation génétique ces modèles qui sont ensuite utilisés sur des projets dont l’objectif est la compréhension ou le traitement de ces pathologies et pour notre établissement dans de nombreux domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie, …)

Procédures

Les souris vigiles seront prélevées d’un petit bout de tissu à l’oreille ou à la queue (3mm maximum de tissu), l’intervention dure 5 secondes et se fait une seule fois par animal. Les poissons subiront une anesthésie par balnéation suivie d’un prélèvement d’une portion de 4mm² (5% maximum) de la partie cartilagineuse de la nageoire caudale, capable de régénération complète en 20 jours. Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. Elles apparaissent à différents temps de la vie de l’animal et sont directement pris en charge. Il y a également une procédure spécifique pour évaluer le bien-être des animaux lors de la création d'une lignée génétiquement altérée. Elle est non invasive et est basé sur l’observation de paramètres zootechniques et physiologiques en élevage.

Impact sur les animaux

Les nuisances lors d'un prélèvement de tissu pour le génotypage sont essentiellement du stress léger lors de la contention, de la pêche par épuisette ou de la sédation (poisson) et de la douleur légère lors de la coupe du tissu. En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable, induisent en général et à des degrés divers, des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est sans douleur sauf si un phénotype s'avère dommageable par cette évaluation. Cette demande de projet traite ces nuisances pour en minimiser aux maximum les souffrances animales.

Devenir

Les procédures d'évaluation et de gestion des phénotypes dommageables s'appliquent durant toute la vie des animaux. Les animaux pourront être mis à mort en élevage pour la gestion de la colonie ou bien partir en utilisation continue en expérimentation. Pour les procédures de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique des animaux le devenir peut-être soit la mise à mort car la combinaison de gènes n’est pas utilisable pour les expérimentations et l’élevage, soit les animaux sont gardés en vie pour renouveler les reproducteurs en élevage ou sont utilisés sur des projets expérimentaux prévus pour ces animaux (estimé à 60000 animaux sur 5 ans).

Remplacement

Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement altérés pour des projets scientifiques . Les modèles animaux sont justifiés par la nécessité de caractériser des mécanismes ou pathologies complexes qui font intervenir plusieurs grands systèmes biologiques entre eux (en neuroscience, cardiologie, oncologie par exemple). Les chercheurs des instituts développent ces modèles le plus souvent après avoir testé leurs hypothèses sur des systèmes moléculaires et cellulaires et justifié le remplacement dans leurs demandes d’autorisation de projet expérimentaux. Dans l’institut nous encourageons l’utilisation de modèles alternatifs. Par exemple une équipe a mis en place des organoïdes intestinaux qui leurs a permis de développer et consolider leurs hypothèses avant le passage sur leurs modèles de souris génétiquement modifiées. Des modèles cellulaires sont également utilisés. Enfin les projets des instituts explorent les mécanismes de pathologies complexes faisant intervenir de nombreux tissus et interactions cellulaires, le recours à l’animal dans son ensemble est indispensable.

Réduction

Les animaux produits, issus de ce projet, et utilisés en expérimentation font tous l’objet d’une analyse statistique pour permettre la détermination des lots expérimentaux et l’analyse des résultats. Chaque chercheur a défini ses outils et échantillons pour ses expérimentations qui sont évalués indépendamment. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Pour cela, les chercheurs définissent et mettent en place les accouplements avec les zootechniciens pour des objectifs de production adaptés aux projets scientifiques. La production est suivie avec des rapports trimestriels avec des indicateurs de productivité adaptés. Chaque trimestre, la production peut donc être revue et réajustée. Elle sera réduite au strict besoin, limitant le nombre de prélèvements de tissus pour génotypage. Nous cherchons au maximum à optimiser les schémas d’accouplements (mutations portées par les parents) pour réduire le génotypage ou éviter l’apparition d’un phénotype dommageable. Nous favorisons les élevages qui fournissent 100% d’animaux utiles ce qui permet de réduire le nombre d’animaux à produire d’une part et d’autre part permet de ne pas génotyper tous les individus. Pour le génotypage en gestion de colonie, nous recherchons systématiquement les lignées non ou peu utilisées. La production de ces lignées est soit fortement réduite, soit arrêtée. Elles sont en parallèle sécurisées par cryoconservation des gamètes ou des embryons. Il est compliqué d’apprécier l’impact de ces mesures sur la réduction mais il est aisé de comprendre qu’elles concourent toutes à l’optimisation de la production aux seuls animaux qui seront utilisés dans les projets scientifiques ou en gestion de colonies et donc de réduire le nombre d’animaux à génotyper ou exprimant le phénotype dommageable. Enfin, nous cherchons à améliorer nos pratiques. Tout d’abord, si le prélèvement invasif est indispensable, nous nous orienterons vers la coupe à l’oreille par rapport à la coupe de queue plus douloureuse et nous sommes en cours de mise au point de la technique de prélèvement de follicule de poil considérée sans douleur que nous espérons pouvoir mettre progressivement en place dans les années à venir. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est basée sur les recommandations du guide Européen sur les animaux génétiquement altérés soit 14 animaux sur 2 générations.

Raffinement

Les techniques de prélèvement de tissus pour le génotypage sont effectuées en routine et le geste est très court et précis. La douleur est légère. Le raffinement est de s’assurer d'un process cadré et éprouvé, appliqué par des zootechniciens expérimentés pour réduire le stress des animaux, l’intensité et la durée de la douleur induite. L’utilisation de pommade anesthésiante n’est pas envisagée pour éviter une intervention plus longue et le produit pourrait interférer avec la technique de génotypage. L’analgésie par injection n’est aussi pas recommandée car la piqûre augmente la nuisance sur l’animal. Toutefois, les éléments suivants sont mis en place : manipulation par un zootechnicien expérimenté, le poste de prélèvement est codifié et préparé en amont pour éviter les gestes parasites pendant le prélèvement pour réduire le stress des animaux. L’animal est pris en contention et la biopsie est rapidement et précisément effectuée avec un matériel désinfecté et aiguisé pour réduire le temps et intensité de douleur. L’animal, remis dans sa cage est observé. En cas de mauvaise reprise de l’activité ce qui constitue le principal point limite, il sera pris en charge. Les observations quotidiennes permettent de s’assurer de la bonne cicatrisation. En cas de mauvaise cicatrisation (point limite) des pommades cicatrisantes peuvent être utilisées. Chez le poisson un raffinement particulier est apporté aux conditions d’isolement maintenues dans le système d’hébergement en circulation, maintenant des paramètres d’eau stables. Le point limite est de s’assurer de la bonne nage des poissons. Pour le raffinement des phénotypes dommageables, les lignées sont aujourd’hui bien connues et le phénotype bien caractérisé. La stratégie de raffinement est de mettre en place le plus tôt possible une procédure de surveillance de l’apparition des nuisances (le caractère spécifique du phénotype ne nécessite pas l’utilisation d’une grille pour la détermination du point limite). Il peut s’agir également d’avoir une procédure d’hébergement adapté avec l’ajout d’un enrichissement ou des manipulations très douces pour les lignées modèles d’épilepsie par exemple. La procédure d’évaluation du bien-être animal est non invasive et sans douleur basée sur l’utilisation d’une grille de paramètres zootechniques et physiologiques. Le risque est la détection d‘un phénotype dommageable qui sera immédiatement pris en charge et classifié selon la procédure sur la gestion des phénotypes dommageables.

Choix des espèces

La création de modèles pour comprendre des pathologies humaines est très développée chez la souris car les outils pour générer ces modèles génétiquement modifiés sont très efficaces. D’autre part, la souris est un mammifère avec de nombreuses similitudes dans les processus biologiques avec l’homme. Son temps de génération est considéré court (3 mois) et son élevage simple en laboratoire. Le poisson-zèbre est un modèle incontournable pour la recherche : une fécondation et un développement embryonnaire externe rapide et transparent, la facilité d’accès au matériel génétique permettant le développement des techniques d’ingénierie génétique. Son génome présente 70% d’homologie avec celui de l’homme (85% pour les gènes impliqués dans des pathologies humaines), il présente également des capacités originales de régénération des tissus (système nerveux, rétine, cœur, etc.) qui en font un modèle idéal pour la compréhension de ces mécanismes, pouvant aboutir à l’identification de pistes thérapeutiques majeures transposables chez l’homme. Pour les biopsies : souris à partir de 14 jours jusqu'à 4 semaines maximum. L'essentiel des lignées sont génotypées à 14 jours pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte. La biopsie de nageoire : majoritairement jeune adulte entre 1 et 3 mois avant maturité sexuelle afin de ne conserver que les animaux de génotype d'intérêt à l'âge adulte, des animaux plus vieux peuvent être concernés en cas de doute ou erreur sur le génotype.

Trente-deux souris sont cathétérisées jusque dans le cœur par la veine jugulaire, sous anesthésie générale, et ne sont pas réveillées. 126 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 94 d'entre elles et modéré pour 32. Baguées et biopsiées à trois semaines pour vérifier leur statut génétique, elles reçoivent une injection de virus adéno-associé à sept semaines, puis de trois à cinq électrocardiogrammes et un examen échographique, certaines jusqu'à l'âge de soixante semaines. Le porteur justifie la mise à mort systématique après cathétérisme par l'impossibilité de suturer la veine jugulaire, qu'il faut donc ligaturer, et par le risque que le cathéter lèse les valves cardiaques et provoque une insuffisance cardiaque droite.

Objectifs

L'objectif général du projet est d'évaluer les effets thérapeutiques d'un virus adéno-associé sur un modèle de souris présentant des troubles de la conduction de l'influx électrique cardiaque liés à une perte de fonction d'un gène impliqué dans cette conduction. Chez les humains, les mutations conduisant à une perte de fonction de ce gène sont à l'origine de pathologies génétiques responsables de morts subites (syndrome de Brugada et troubles de la conduction cardiaque) pour lesquelles il n'existe pas de thérapie préventive. Le virus adéno-associé a été montré, dans un modèle cellulaire, comme étant susceptible d'avoir un intérêt thérapeutique. Les objectifs spécifiques du projet sont d'évaluer les effets du virus adéno-associé sur : 1. la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, à l'aide d'enregistrements de l'électrocardiogramme ; 2. la survenue d'arythmies ventriculaires ; 3. l'apparition de fibrose cardiaque secondaire à la perte de fonction du gène de la conduction au cours du vieillissement. Ces deux derniers objectifs ne seront réalisés que si le virus adéno-associé permet une amélioration de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du virus adéno-associé sont une amélioration significative, voire une restauration complète de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, et une disparition des arythmies ventriculaires et du remodelage fibrotique cardiaque.

Procédures

Trois semaines après la naissance, les souris seront baguées et biopsiées (afin de vérifier leur statut génétique) sous anesthésie générale. Dans une première étape du projet, 32 souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 3 enregistrements de l'électrocardiogramme à l'âge de 7 (durée de 3 min), 9 (3 min) puis 12 semaines (15 min), et un examen échocardiographique (15-20 min) à 12 semaines, réalisés sous anesthésie générale. En fonction des résultats obtenus dans la première étape, 32 autres souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines et 2 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7 puis 9 semaines, réalisés sous anesthésie générale, puis une exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque, d'une durée de 20-30 min, réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale, sans réveil. Enfin, en fonction des résultats obtenus dans l'étape 1, 20 souris supplémentaires seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 5 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7, 9, 30, 45 et 60 semaines et 1 examen échocardiographique (15-20 min) à 60 semaines, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet est étudié depuis de nombreuses années. Ces souris présentent un trouble de la conduction de l'influx électrique cardiaque qui augmente progressivement avec l'âge, comme les patients, mais qui ne conduisent pas à des blocs complets de la conduction comme observé chez certains patients ou à la survenue de tachycardies ventriculaires sévères et/ou fibrillation ventriculaire comme observé chez d'autres patients. Elles se développent normalement et ne présentent pas de signes notables de souffrance. L'injection des virus adéno-associés sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale au point d'injection afin d'éviter stress et douleur. Les examens réalisés pour étudier les effets cardiaques des virus adéno-associés (enregistrement de l'électrocardiogramme et échographie) ne sont pas des techniques générant de la douleur mais ils seront cependant réalisés sous anesthésie générale pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable. Pour les mêmes raisons, l'exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque sera également réalisée sous anesthésie. Cette procédure entraine une douleur au niveau du point de ponction cutanée pour cathétériser la veine jugulaire, qui sera prévenue par une anesthésie locale, comme cela est fait chez les patients. En ce qui concerne le virus adéno-associé, une étude antérieure a montré qu'il n'entraine pas d'effet indésirable chez des souris sauvages aux doses conduisant à un effet bénéfique dans le modèle cellulaire.

Devenir

A l'issue de la procédure 2 (effets du virus adéno-associé sur la fonction cardiaque), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens immunohistochimiques. A l'issue de la procédure 3 (exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque), les souris sont systématiquement mises à mort parce que cette procédure peut avoir des conséquences néfastes sur la souris. En effet, il est possible, mais difficile de suturer la veine jugulaire après avoir retiré le cathéter, ce qui nous oblige à la ligaturer pour éviter les hémorragies, perturbant ainsi le retour veineux depuis la tête de l'animal. Par ailleurs, bien que les cathéters aient un diamètre très faible (1/3-1/2 mm), ils sont suffisamment gros pour léser les valves cardiaques, ce qui peut induire une insuffisance cardiaque droite à plus ou moins long terme. La mise à mort des souris permet en outre de prélever le cœur pour des études biochimiques. A l'issue de la procédure 4 (effets à long terme du virus adéno-associé), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens histologiques.

Remplacement

Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée avec un modèle cellulaire, puis une étude in vivo chez la souris sauvage qui montrent que la surexpression du virus adéno-associé entraine une augmentation de l'expression du gène cible. Ces études sont à la base de ce projet réalisé sur un modèle pertinent pour la pathologie humaine. Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur la fonction cardiaque : l'observation d'un effet bénéfique sur un modèle cellulaire est un pré-requis mais ne préjuge en rien de l'efficacité in vivo. Très spécifiquement dans le cadre de ce projet, les effets protecteurs de ce traitement sur les anomalies structurales du myocarde (fibrose) apparaissant au cours du vieillissement ne peuvent être appréhendés que sur l'animal vivant.

Réduction

Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (électrocardiographie et échocardiographie), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le projet est organisé en deux étapes successives. La seconde étape ne sera réalisée que si la première démontre que les souris traitées avec le virus adéno-associé présentent une amélioration significative de leur conduction cardiaque. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. Leur taille a été déterminée à l'aide du logiciel de statistiques Sigmastat sur la base de notre expérience antérieure. Une analyse statistique des résultats sera réalisée avec le même logiciel.

Raffinement

Lors du sevrage, le prélèvement d'une biopsie pour déterminer le statut génétique des souris est réalisé sous anesthésie générale. Les souris sont hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels ou de cabanes pour se camoufler et/ou de frisottis pour fabriquer des nids. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale. L'exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié sous anesthésie.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du gène de la conduction. Ce modèle est bien caractérisé et représente un bon modèle des pathologies humaines résultant des mutations "perte de fonction" de ce gène. Les souris seront injectées avec les virus adéno-associés à l'âge de 7 semaines, puis étudiées jusqu'à l'âge de 12 semaines dans la première étape, et de 60 semaines dans la seconde, parce que ces pathologies ne touchent que très rarement les enfants et les adolescents. Les souris utilisées seront des mâles et des femelles dans des proportions comparables parce que les pathologies d'intérêt chez l'humain touchent tous les genres. L'injection du virus à l'âge de 7 semaines permet, d'une part, de réduire la quantité d'AAV9 injectée et, d'autre part, d'obtenir une expression optimale de l'AAV9 avant d'en étudier les effets cardiaques chez les jeunes souris adultes (9, puis 12 semaines). Si le traitement s'avère efficace sur la conduction de l'influx électrique cardiaque, l'étude réalisée à l'âge de 60 semaines permettra de déterminer ses effets à long terme sur l'apparition de fibrose cardiaque observé normalement chez ces souris.

7 260 larves de xénope vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 6 300 d'entre elles et modéré pour 960. Chacune est incubée jusqu'à une heure quinze dans des composés pharmacologiques, isolée jusqu'à une heure trente dans un appareil de comportement, soumise à six flashes lumineux d'une minute et transférée cinq fois entre milieux, avant d'être tuée par surdose d'anesthésique. Le porteur anticipe une paralysie ou une nage erratique selon les doses, un inconfort oculaire lié aux flashes, et la mort d'une partie des larves par toxicité des composés. Les 960 larves de la phase pilote servent précisément à repérer les concentrations toxiques, et les larves témoins sont tuées elles aussi parce qu'il préfère des animaux "naïfs" à chaque expérience.

Objectifs

Les neurones, cellules du cerveau, communiquent entre elles par le liais de protéines appelées récepteurs. Ces récepteurs jouent un rôle central dans les processus tels que l’apprentissage et de la mémoire. La dysfonction de ces récepteurs est impliquée dans de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, retard mental, autisme, schizophrénie). Il est donc important de développer des composés pharmacologiques à visée thérapeutique agissant sur ces récepteurs. Les composés pharmacologiques ciblant actuellement les nos récepteurs d’étude sont cependant limités par des problèmes d’effets secondaires importants chez l’animal et l’homme. L’utilisation de la lumière pour contrôler l’activité des molécules permet de s’affranchir de la plupart de ces effets secondaires. L’idée est d’administrer un composé photosensible dans sa forme inactive et de l’activer dans une région définie et pendant une durée précise afin d’éviter les effets secondaires liés à la présence prolongée du composé dans tout le corps. Le projet consiste à caractériser l’activité sur la locomotion des larves de Xénopes (Xenopus laevis) de composés pharmacologiques en fonction de différentes conditions de lumière. De par leur nombre, taille et transparence, les larves d’animaux aquatiques (poisson zèbre ou xénope) constituent en effet des modèles avantageux pour le criblage in vivo de molécules et les approches utilisant de la lumière. Ce projet devrait amener à la découverte de nouvelles molécules d’intérêt thérapeutique mieux tolérées ainsi qu’à la création d’outils pour l’étude de l’implication des récepteurs dans le fonctionnement du système nerveux.

Bénéfices attendus

Les récepteurs neuronaux jouent un rôle clé dans le développement du cerveau, ainsi que dans les processus de mémoire et d’apprentissage. Le developpement d’outils contôlables par la lumière ciblant des populations particulières de récepteurs neuronaux permettra de mieux comprendre les rôles de ces populations de récepteurs dans le cerveau, ainsi que l’intérêt thérapeutique de cibler ces populations. En effet, beaucoup de troubles neurologiques et psychiatriques (épilepsie, retards mentaux, schizophrénie, dépression) s’expliquent par un mauvais fonctionnement des récepteurs neuronaux. Actuellement, un grand nombre de molécules développées pour cibler les récepteurs neuronaux échouent en phase clinique à cause d’effets indésirables (somnolence, problèmes de mémoire, hallucinations, toxicité). Le développement de composés pharmacologiques dépendants de la lumière (photosensible), dont l’activité peut être contrôlée précisément dans l’espace et le temps grâce à leur illumination, devrait amener à de nouveaux médicaments mieux tolérés. En effet, l’idée serait d’administrer un medicament photosensible non actif au patient puis de l’activer temporairement au niveau de la zone concernée par la pathologie, limitant ainsi l’effet délétère que ce médicament pourrait avoir sur d’autres organes.

Procédures

IDurant la procédure, les larves de xénope (7260 animaux) seront soumises aux interventions suivantes : - Incubation dans des composés pharmacologiques. Durée : 1h15 maximum, 1 fois par animal - Isolement et nage libre dans l’appareil de comportement. Durée : 1h30 maximum, 1 fois par animal - Soumission à des flashes de lumière. Durée : 6 flashes de 1 minute au maximum, 1 fois par animal - Transfert des animaux vigiles entre leurs différentes conditions de milieux. Durée : quelques secondes, 5 fois par animal - Euthanasie par surdose d’anesthésique.

Impact sur les animaux

Nous anticipons les nuisances suivantes sur les larves de Xénope : - Potentielle toxicité des composés pharmacologiques appliqués entraînant la mort des animaux selon les doses appliquées - Potentielle paralysie ou nage erratique des larves en fonction de la dose/efficacité des composés testés, les récepteurs ionotropiques au glutamate jouant un rôle dans la locomotion des larves de Xénope. - Influence directe de certaines longueurs d’onde de lumière sur la nage des larves, léger inconfort oculaire lié à l’utilisation de flashes lumineux. - Potentielle légère gène des larves lors de leur transfert d’un contenant à un autre. - Potentiel léger stress lié à l’isolement durant l’expérience

Devenir

A l’issue de la procédure, les larves des groupes témoins ont été exposées à des composés pharmacologiques dont nous ne connaissons pas les effets à long-terme sur le développement. Nous ne pouvons donc pas laisser grandir ces animaux pour les replacer dans d’autres laboratoires. En outre l’expérience de comportement qu’ils ont subie est susceptible de modifier leur comportement futur (distance parcourue dans les puits, vitesse de nage, liée à une potentielle habituation). Pour une meilleure reproductibilité des expériences nous préférons donc utiliser des animaux « naïfs » à chaque fois, même pour les groupes contrôle. Enfin, nous serons éventuellement amenés à effectuer des prélèvements post-mortem sur certains animaux pour étudier la pénétration du composé dans le cerveau ou le type de toxicité induite. Tous les animaux seront donc euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

Un criblage in silico et des expériences de caractérisation in vitro seront réalisés en amont de ce projet afin de limiter le nombre de composés pharmacologiques à tester et donc limiter le nombre d’animaux à utiliser. La validation in vivo est indispensable pour apréhender les propriétés de toxicité, métabolisme, pénétration dans le cerveau et excrétion des composés pharmacologiques ainsi que d’évaluer leurs conséquences sur le comportement dans le cadre d’un système neuronal intégré. En effet les methodes in vitro et in silico ne prennent pas en compte la complexité du milieu biologique et l’influence possible de ce dernier sur l’activité des composés pharmacologiques.

Réduction

Un criblage in silico et des expériences de caractérisation in vitro seront réalisés en amont de ce projet afin de limiter le nombre de composés pharmacologiques à tester et de déterminer la fenêtre de concentration à tester, ainsi que les longueurs d’onde idéales pour la photomodulation. Cela permettra donc de limiter le nombre d’animaux à utiliser. L’étude du comportement des larves en plaques 12 puits avec, pour chaque expérience, deux groupes contrôle et un groupe témoin dans la même plaque permettra de diminuer la variabilité liée aux conditions d’expérimentation, permettant ainsi d’améliorer la puissance statistique des résultats. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet est de 7260 : (i) 960 animaux pour une phase pilote permettant d’évaluer les concentrations effectives des composés et leur potentielle toxicité, et (ii) 6300 animaux pour la phase expérimentale à proprement parler. Le calcul des effectifs a été établi par un calcul de puissance. Une analyse statistique sera nécessaire pour l’interprétation des résultats.

Raffinement

Hébergement : Les larves seront élevées en groupes d’individus (maximum 50 par boîte de Pétri) dans un milieu physiologique adapté à leur physiologie dans un incubateur à 23 dégrés jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade adéquat. Les larves seront nourries 2 fois par jours à partir du stade 45 avec de la spiruline en poudre. Leur eau sera nettoyée une heure après avoir nourri les larves. Après la procédure, les larves seront remises en groupes de plusieurs individus (correspondant aux groupes expérimentaux) dans un milieu physiologique adapté à leur espèce. L’isolement est évité au maximum. Procédure : Les larves seront habituées pendant 15 min dans l’appareil d’expérimentation avant réalisation de l’expérience. Les expérimentations seront réalisées dans une pièce climatisée à 19 degrés et de l’eau sera ajoutée entre les puits d’expérimentations pour limiter la chauffe du milieu des larves par les flashes de lumière. Les puissances des flashes de lumière seront réglées au minimum nécessaire pour la bonne conduction de l’expérience afin de diminuer un éventuel inconfort oculaire et des réactions parasites à la lumière. Des périodes sans illumination de trois minutes entre chaque flash lumineux sont prévues pour permettre aux larves de récupérer d’un éventuel inconfort lié à la stimulation lumineuse. La toxicité des composés pharmacologiques sera évaluée à deux moments : (1) en amont de l’expérience après une phase d’incubation (30 min) dans les composés photodépendants ; et (2) le lendemain : les larves exposées à nos composés photodépendants seront gardées en observation après l’expérience et leur comportement (nage, orientation du corps, couleur) sera étudiée le lendemain pour estimer le caractère délétère de l’expérience. Les larves seront gardées en groupes de plusieurs individus après la procédure (correspondant aux groupes expérimentaux) dans un milieu physiologique adapté à leur espèce. Les points limites suivants seront considérés : si la santé des larves se détériore après la phase d’incubation ou au cours de l’expérience de comportement (nage frénétique ou paralysie irréversible, décoloration, basculement sur le côté), ou si elles présentent des malformations, l'expérience est immédiatement arrêtée et les larves euthanasiées. Les conditions expérimentales (concentration de composés pharmacologiques, puissance des flashes lumineux) seront alors revues afin d'éviter une souffrance ou un stress aux animaux.

Choix des espèces

L’espèce Xenopus laevis est particulièrement adaptée à notre étude car les protéines que nous étudions sont très proches entre les xénopes et les humains. Ces protéines sont impliquées dans le mouvement des larves de Xénope : il est ainsi facile d’étudier l’effet d’un composé chimique sur la protéine en observant le comportement de l’animal. Les composés chimiques entrent directement par la peau des animaux et la transparence des larves permet une bonne pénétration de la lumière. On peut donc contrôler la locomotion des larves de xénopes grâce à des composés chimiques et de la lumière sans méthodes invasives. Enfin, La reproduction des xénopes produit des centaines de larves. Leur nombre et leur petite taille (1 cm) permettent des études de comportement impliquant beaucoup d’animaux à la fois ce qui augmente la robustesse des résultats et permet, in fine, de limiter le nombre d’expériences nécessaires. Nous utiliserons ces larves aux stades embryonaires 45 à 50 (4 à 15 jours après fécondation à température ambiante). En effet le stade 45 correspond au stade auquel les larves de xénope commencent à nager de manière spontanée, c’est-à-dire sans avoir besoin de les stimuler.

Tatouées aux phalanges à trois semaines puis biopsiées à la queue pour génotypage, les souris reçoivent à l'âge adulte une injection intrapéritonéale de cellules tumorales qui déclenche un adénocarcinome ovarien, colorectal ou pancréatique. 2 493 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 448 d'entre elles, avec des traitements administrés par gavage, dans l'eau de boisson ou par voie intrapéritonéale tous les quatre jours pendant soixante jours. Le porteur décrit une accumulation de liquide d'ascite dans le péritoine aux stades tardifs et une altération de l'état général, tout en affirmant que des résultats antérieurs ont permis de vérifier que ces points limites ne sont pas atteints, le seuil de mise à mort étant fixé à 40 % de prise de poids. Toutes sont tuées à la fin pour prélever le sang et les organes.

Objectifs

Il est reconnu que les cellules du microenvironnement tumoral, et plus particulièrement les macrophages, sont des acteurs clé dans le contrôle de la progression tumorale et de la réponse aux traitements. Plus récemment, d’autres cellules de la lignée des cellules myéloïdes, dont font partie les macrophages, ont été décrites et seraient recrutées au niveau de la tumeur. Au cours de la carcinogénèse, les macrophages, cellules de la défense immunitaire, basculent d’un phénotype anti-tumoral vers un phénotype favorisant la croissance tumorale. Ainsi, trouver des cibles et des traitements permettant de moduler le recrutement et le phénotype des cellules myéloïdes pourraient faire avancer les stratégies thérapeutiques du cancer. Nous avons en partie défini le rôle des macrophages, au cours de la progression tumorale dans différents cancers (adénocarcinome ovarien, carcinose péritonéale d’origine colorectale, cancer du pancréas). Pour la suite de ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité de différents traitements pharmacologiques. Nous disposons de souris délétées spécifiquement au niveau des cellules myéloïdes pour des facteurs clé de la polarisation (Récepteur nucléaire PPAR-γ, facteurs de transcription LRH-1). Ainsi nous pourrons identifier plus clairement les voies de signalisation impliquées dans l’effet de nos agents pharmacologiques sur le recrutement et la polarisation des cellules myéloïdes dans la progression tumorale. Ces agents pharmacologiques pourraient agir en synergie avec les traitements de chimiothérapie conventionnelle ou éviter une rechute due à l’acquisition d’une chimiorésistance. Ainsi, nous souhaitons en parallèle étudier l’association de ces agents pharmacologiques avec le traitement de référence. Nous utiliserons ensuite des modèles déplétés pour différentes populations immunitaires (macrophages, ou lymphocytes) afin d’évaluer la part respective des différents acteurs cellulaires dans l’effet des agents pharmacologiques testés. Une autre approche thérapeutique envisagée serait le transfert adoptif de cellules myéloïdes polarisées en vue de bloquer la progression tumorale.

Bénéfices attendus

La recherche des mécanismes modulant le recrutement et les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des cellules myéloïdes au cours de la progression tumorale dans des modèles expérimentaux de cancers chez la souris, nous permettra de définir des cibles thérapeutiques pertinentes. L’évaluation de l’effet de différents agents pharmacologiques dans différents modèles de cancers (ovarien, colorectal et pancréatique) de proposer des thérapies ciblées selon le type de cancers.

Procédures

Les souris seront identifiées au sevrage (à 3 semaines) par tatouage au niveau des phalanges afin de pouvoir suivre de manière individuelle chaque animal. Une biopsie de queue sera effectuée pour le génotypage. Lorsque les souris sont adultes, un adénocarcinome ovarien sera induit par une injection intra-péritonéale de cellules tumorales. les souris seront ensuite traitée à l’aide d’agents pharmacologiques avec un suivi sur 60 jours (observations, suivi du poids). Deux autres types de cancers seront étudiés, un adénocarcinome colorectal et cancer du pancréas induits par une injection intra-péritonéale de cellules tumorales avec un suivi de 15 jours. Les traitements seront administrés par voie orale (eau de boisson ou par gavage) ou par voie intrapéritonéale tous les 4 jours pendant 60 jours ou tous les jours pendant 15 jours selon le modèle. Les observations et suivi dupoids nous permettront de suivre l'évolution de la maladie. Au sacrifice, des prélèvements (sang, différents organes), nous permettront d'étudier le dévéloppement des cellues tumorales et l'effet des traitements.

Impact sur les animaux

Les modèles murins trangéniques dont nous disposons dans cette étudene présenta pas de phénotype dommageable. Des tests de cytotoxicité des agents pharmacologiques seront réalisés au préalable avant l’administration des traitements aux souris afin d’éviter toutes nuisances ou effets indésirables. Dans ces modèles murins de carcinose, un liquide d’ascite s’accumule dans le péritoine lors des stades tardifs de la progression tumorale. Le développement tumoral peut engendrer un gain de poids important des souris avec une altération de l’état général. Les animaux seront mis à mort si la prise de poids est supérieure à 40% du poids initial, si les animaux présentent des signes de mutilations, des difficultés respiratoires. La durée de l’étude est définie selon des résultats antérieurs qui ont permis de vérifier que ces points limites ne sont pas atteints. Pour le traitement par injection intrapéritonéale, le point d’injection sera désinfecté et surveillé journalièrement. Pour le traitement par gavage ou dans l’eau de boisson, la prise hydrique sera évaluée journalièrement.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront euthanasiés ce qui permettra de réaliser différents prélèvements d’organes

Remplacement

Nous testerons plusieurs types de molécules (agents pharmacologiques) qui sont susceptibles de pouvoir moduler les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des cellules myéloïdes au cours de la progression tumorale. Ces molécules, auront été présélectionnées via des résultats préliminaires basés sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels d’une molécule sur les processus tumoraux. Des tests de cytotoxicité de ces molécules seront réalisés au préalable avant l’administration des traitements aux souris afin d’éviter toutes nuisances ou effets indésirables. Ces tests seront réalisés sur des cellules myéloïdes, population cible des molécules, et sur les lignées tumorales utilisées pour les modèles tumoraux chez la souris. Cette étape est essentielle pour éliminer les molécules pouvant induire la prolifération des cellules tumorales et pour estimer la concentration à administrer aux souris. Cette démarche permet de sélectionner les molécules et de limiter le nombre d’animaux utilisé.

Réduction

Les résultats actuels ont permis de valider, en fonction des différents et nombreux paramètres évalués, qu’un nombre de 6 souris par lot est nécessaire afin d’acquérir des données suffisantes et permettre d’effectuer des tests statistiques fiables. L’expérience et les données déjà acquises sur des souris contrôles nous permettrons de comparer la fiabilité de nos données et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux (éviter le double emploi). Le projet sera conduit en progressant par étape afin de limiter le nombre d’animaux. Une étude pilote sera menée pour déterminer l’innocuité et le choix d’agents pharmacologiques et de la durée de traitement Le choix des modèles transgéniques sera également réduit en fonction des résultats obtenues dans les premières étapes de ce projet et les approches in vitro qui seront menées en parallèle.

Raffinement

L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux. Les conditions d’hébergement permettront de conserver le comportement social des souris et de limiter le stress par l’enrichissement (papier pour la nidification, tunnel). le développement tumoral des animaux sera surveillé ainsi que son état général. Un animal sera mis à mort s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Le prélèvement de sang sera effectué sous anesthésie générale et anesthésie locale. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux en collectant le plus de données possibles. Les mécanismes impliqués dans le développement des cancers sont complexes. Ainsi, cette étude permettra d’étudier dans leur contexte physiopathologique les cellules myéloïdes, cibles thérapeutiques potentielles, et ne peut pas être mimée par une approche de culture cellulaire.

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nous permettront d’explorer l’implication de différentes voies de signalisation, cibles pertinentes pour des approches pharmacologiques dirigées. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Adultes, souris âgées de 8 à 20 semaines afin d'avoir des souris avec un système immunitaire mature.

Réformées à un an et déjà destinées à la mise à mort, six rates sont utilisées pour former huit chercheurs au maniement d'une sonde d'échographie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour quatre d'entre elles et modéré pour deux. Quatre subissent deux jours de suite une anesthésie d'une heure quarante, avec dépilation à la crème, pendant que les apprenants s'exercent une heure trente. Deux autres passent auparavant près de quatre-vingts minutes en caisson hyperbare, dont une trentaine de minutes d'habituation avant la plongée simulée, un acte que le porteur classe lui-même en gravité modérée pour le stress et l'angoisse qu'il provoque. Toutes sont tuées ensuite, et servent à s'entraîner à des manipulations ex vivo et d'histologie, le porteur qualifiant cette formation d'"indispensable" pour ses futures procédures.

Objectifs

Une partie importante de nos travaux de recherche est en relation avec la fonction cardiovasculaire et pour étendre nos moyens d’investigation dans ce domaine, notre laboratoire a acquis récemment un échographe petit animal. L’objectif de cette demande est de former 8 chercheurs sur l’échographie de notre modèle animal utilisé au laboratoire : le rat. Cette formation sera réalisée par le commercial et les chercheurs-concepteurs en apprentissage apprendront les gestes techniques sur le rat anesthésié.

Bénéfices attendus

Cette procédure permettra aux membres du laboratoire de se former à l’échographie cardiovasculaire. A court terme, cette technique non invasive pourra être mise en œuvre dans les nombreux protocoles expérimentaux utilisés pour nos études précliniques visant à développer des programmes de prévention des pathologies cardiovasculaires par l’activité physique et/ou la nutrition, ou pour la prévention des accidents de décompression. A plus long terme, ces connaissances pourront ensuite être transférées à l’humain dans le cadre d’études cliniques utilisant aussi l’échographie.

Procédures

6 rates seront anesthésiées pour pouvoir raser les poils des zones d’intérêt pour réaliser l’échographie, la veille de la formation. Le premier jour de la formation (J1), 4 rates seront anesthésiées, pendant 1h40 d’affilée. Pendant l’anesthésie, les rats maintenus au chaud grâce à un tapis chauffant seront dépilés à la crème dépilatoire (durée 5 minutes environ) puis pour nous apprendrons à manier la sonde échographique pendant 1h30. A J2, les 6 rates sont utilisées : les mêmes actes qu’à J1 seront reproduit sur les 4 mêmes rates que la veille alors les deux rates restantes auront préalablement été placées dans un caisson hyperbare pendant 77’ 30s (30 min d’habituation + 47’30s de plongée simulée).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : - le stress lié à la contention et au temps d’induction de l’anesthésie : durée 5 minutes de gravité légère. - le stress et l’angoisse générées lors de la plongée simulée en caisson hyperbare : acte de gravité modérée, d’une durée totale de 1h18 correspondant à l’habituation dans le caisson hermétique (30 min), au temps de l’exposition hyperbare lui-même (48 min).

Devenir

Ces 6 animaux sont déjà des rates réformées de 1 an qui seront mis à mort de façon réglementaire afin de s’entraîner à la mise au point de manipulations ex-vivo et d’histologie.

Remplacement

La formation initiale des concepteurs à l’échographie sur petit animal est indispensable pour nos futures procédures. Nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale sur animal vigile.

Réduction

Nous avons pris contact avec notre SBEA pour utiliser des animaux reproducteurs-reproductrices réformés qui ne sont pas entrés en procédure expérimentale et qui sont prévus pour une mise à mort. 6 rates sont disponibles pour nos dates de formation. Ce nombre de rat nous permet de former 8 apprenants sur deux jours de formation. Aucune étude statistique n’est prévue car nous sommes dans le cadre d’une formation à une technique d’imagerie non invasive chez le rat.

Raffinement

Le protocole de plongée simulée ne génère pas de symptômes d’accident de décompression et dès la sortie du caisson hyperbare, le rat est anesthésié et analgésié. Tous les autres actes réalisés pendant la procédure se font sous anesthésie gazeuse ou chimique. Les rates sont placées sur tapis chauffant pour éviter la chute de température pendant la procédure mais aussi jusqu’au réveil des animaux concernés.

Choix des espèces

Le rat est un modèle préclinique que nous utilisons au laboratoire et sur lequel nous souhaitons maîtriser les explorations cardiovasculaires non invasives par échographie. Nous souhaitons utiliser des individus au stade adultes, matures sexuellement. Des animaux trop âgés ou trop lourds (dépassant 500g) présenteraient une taille incompatible avec la profondeur de pénétration du faisceau d’ultrasons, et ne permettraient pas d’obtenir des images cardiaques et vasculaires.

Instillations dans le nez ou la trachée sous anesthésie, gavages jusqu'à six fois dans la même journée, injections dans le ventre ou dans la veine, infections bactériennes du poumon ou de l'intestin : 14 416 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées, sans possibilité d'être réutilisées ni adoptées, parce qu'elles ont été infectées par une bactérie pathogène qu'elles pourraient porter et transmettre. Le projet vise à comprendre comment les bactériophages, virus qui n'infectent que des bactéries, se comportent chez un hôte vivant, en vue d'élargir leur usage thérapeutique face à l'antibiorésistance. Le porteur annonce des groupes de six souris au maximum et trois répétitions par expérience, sans expliquer comment on arrive à 14 416 souris.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries. Ils peuvent donc être utilisés pour tuer les bactéries résistantes aux antibiotiques. Ils présentent l’intérêt d’être très spécifiques des bactéries ciblées. D’autre part, les bactériophages font partie de la flore naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, nous étudierons les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans deux organes cibles : les poumons et les intestins. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors d’une phagothérapie. Ces mécanismes recouvrent non seulement les interactions entre les bactériophages et les bactéries mais aussi celles avec l’hôte et notamment son système immunitaire. La meilleure compréhension de l’utilisation thérapeutique des bactériophages permettra d’augmenter le nombre de patients traités dans des conditions optimales d’efficacité. Permettre à des patients d’accéder à ce type de traitement alors que les antibiotiques ne sont plus efficaces permettra de réduire le nombre d’impasses thérapeutiques et le coût des frais hospitaliers mais surtout d’améliorer les conditions de vie de ces patients.

Procédures

Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes), ou des prélèvements fécaux (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes et jusqu’à 2 fois par jour). Les administrations par gavage (quelques secondes) seront limitées à 2 par jour.

Impact sur les animaux

Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. Les expériences consistent essentiellement à - des injections intrapéritonéales ou intraveineuses une fois ou sur quelques jours. La piqure d'aiguille pour effectuer ces injections entraine une douleur légère de courte durée. - des gavages intragastriques jusqu’à six fois sur une journée qui nécessitent une contention brève - des installations intranasales ou intratrachéales sur animaux anesthésiés - des protocoles infectieux qui entraineront un inconfort et une douleur de sévérité modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront mis à mort pour analyser des organes vitaux.

Remplacement

L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbienne d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.

Réduction

D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Les animaux infectés seront observés 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation à 3 niveaux (0, 1, 2) permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 déclenchera l’ajout d’un diet gel pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avant d’être mise en place.

Choix des espèces

A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.