Procédures légères
Cibler les mégacaryocytes et les plaquettes hébergeant le virus du SARS-CoV-2 pour une restauration immunologique efficace
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par le SARS-CoV-2 par instillation nasale sous anesthésie, 1 704 souris subissent ensuite des prélèvements de sang derrière l'œil, jusqu'à un par semaine, et des prélèvements dans la bouche. Les procédures sont déclarées légères et sévères, aucun animal n'est gardé vivant et la durée de conservation après le début des expériences ne dépasse pas deux mois. L'infection fait perdre environ 12 % de leur poids aux souris Balb/c au quatrième jour et peut en tuer 10 %, l'objet du projet étant de chercher des réservoirs du virus dans les plaquettes et les mégacaryocytes. Le porteur écrit qu'au total 1 224 souris seront "nécessaires", pour un projet qui en déclare 1 704, et affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit à ce jour les interactions hôte-virus aboutissant au Covid-19.
Objectifs
La pandémie Covid-19 est devenue une urgence sanitaire et médicale dans la plupart des pays dans le monde. Le SARS-CoV-2 cause des symptômes respiratoires qui peuvent être graves, ainsi que des symptômes à l’origine du COVID long par la persistance de réservoirs cellulaires du virus. Notre objectif est d’identifier et de caractériser ces réservoirs viraux dans le contexte de l’infection par le SARS-CoV-2 et les conséquences de ce phénomène sur la réplication virale et la pathologie Covid-19.
Bénéfices attendus
Les plaquettes et les mégacaryocytes sont des cachettes virales largement négligées. Nous étudierons leur participation dans des modèles murins de long COVID et COVID sévère. Nous proposons enfin de les cibler afin de restaurer le statut immunocompétent et la qualité de vie des individus présentant des déficits immunitaires persistants d'origine virale. A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire les interactions hôte-virus aboutissant au COVID-19. L'évaluation de la pathogénicité du SARS-CoV-2 pourra aider à développer de nouvelles stratégies de lutte qui nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’est pas possible à ce jour de remplacer par des tests in vitro ou in silico. Il est admis que le modèle murin et l’infection avec une souche du SARS-CoV-2 adaptée à la souris est pertinent pour le suivi de la réplication du virus et pour décrire la physiopathologie associée à l’infection par le SARS-CoV-2.
Procédures
(1) Infection de SARS-CoV-2 par voie nasale. L’instillation nasale du virus sera réalisée sous anesthésie générale obtenue par inhalation d’isoflurane. 1 infection par animal sera réalisée, celle ci dure environ 1 minute, après l'endormissement de l'animal par l'isoflurane. (2) Prélèvement sanguin par voie rétroorbitale. Une analgésie locale sera réalisée par le dépot d'une goutte de collyre à base de tétracaine. Une anesthésie générale sera obtenue par l'inhalation d’isoflurane. Les prélèvements intermédiaires (1 fois par semaine au maximum) durent moins d'une minute. Le prélèvement terminal en fin d'expérience durera plus longtemps afin d'obtenir un maximum de volume sanguin, les animaux seront euthanasiés à la suite de ce prélèvement. (3) Prélèvement de swabs buccaux. Ce prélèvement se fera à la suite du prélèvement sanguin intermédiaire pour éviter une autre anesthésie et contention des animaux. Un bref prélèvement à l'aide d'un swab (taille nourisson) sera effectué dans la bouche de chaque animal, ceux ci dureront moins d'une minute.
Impact sur les animaux
L’infection par le virus mouse-adapted SARS-CoV-2 conduit à une perte de poids d’environ 12% au 4ème jour de l’infection chez les souris Balb/c. A cette dose, 10% des souris Balb/c peuvent mourir, les C57Bl/6J ne meurent pas.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans cette procédure sera euthanasié à terme même ceux qui servent de contrôle. La durée maximale de conservation des animaux après le début des expériences est de deux mois.
Remplacement
Des modèles d'étude in vitro existent (organoides par exemple) cependant ils ne sont pas pertinents pour notre étude. En effet, nous nous intéressons à comprendre les effets physiopathologiques par l'infection au SARS-CoV-2 et seul l'étude sur l'organisme entier (animal) nous permettra de répondre à la problématique scientifique.
Réduction
Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe sera utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Dans cette étude, nous utiliserons un test de comparaison de moyennes t-test. Les expériences seront répétées 2 fois avec un nombre de 6 animaux par groupe expérimental. Au total, 1224 souris seront nécessaires. Cette utilisation maximise les données obtenues à partir de chaque animal, afin de limiter ou d'éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, la réalisation de procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Chaque animal sera observé et scoré (évaluation des signes cliniques) toutes les 24h à partir du jour de l’infection. Les souris sont placées dans des cages contenant entre 2 et 4 animaux pour maintenir leur caractère grégaire. Si des conflits sont observés, les animaux agressifs seront écartés du groupe. Pour tout prélèvement et injection, les animaux seront placés sous anesthésie générale. Une analgésie locale sera réalisée pour les prélèvements sanguins.
Choix des espèces
La souris, exprimant naturellement le récepteur ACE2 du SARS-CoV-2, représente un modèle pertinent pour l’étude des réponses immunes et inflammatoires liées à l’infection par ce virus. Chez la souris, il existe de nombreux outils (anticorps, kit ELISA) permettant une analyse des mécanismes immunologiques impliqués dans un effet physiologique. Les souris mâles et femelles seront infectées à l’âge de 8 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.
Etude des mécanismes impliqués dans l’altération de la masse et du métabolisme musculaire au cours du vieillissement
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Douze heures de jeûne nocturne avec une perte de poids attendue de 10 à 15 %, 48 heures seules en cage de mesure du métabolisme, six passages en résonance magnétique et une course jusqu'à la vitesse maximale sur tapis roulant, 120 souris subissent ces procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à la fin pour prélever de nombreux tissus. Elles reçoivent aussi une injection quotidienne pendant cinq jours, un poinçon à l'oreille et des prélèvements de sang à la queue, une partie d'entre elles étant nourries jusqu'à l'obésité. L'objet déclaré est de comprendre la fonte musculaire et la résistance à l'insuline qui accompagnent le vieillissement. Le porteur indique que le tapis roulant retenu remplace la stimulation électrique par un jet d'air sur l'arrière-train, et qu'il n'a jamais observé de blessure.
Objectifs
Le vieillissement se traduit par atrophie musculaire, c'est à dire une perte de la masse musculaire, conduisant à la perte d’autonomie des personnes et à l’augmentation de leur mortalité. L’étude des mécanismes impliqués dans la mise en place de ce phénomène est donc d’un intérêt clinique non négligeable. Cette perte musculaire affecte un type particulier de fibres, les fibres à contraction rapide. De plus, le vieillissement est également associé à une perturbation de la régulation du taux de sucre dans le sang avec une résistance à l’insuline. Notre projet à deux objectifs : 1) identifier les mécanismes cellulaires responsables de la perte de muscles induites par traitement aux glucocorticoïdes (médicaments anti-inflammatoires utilisés fréquemment) et au cours du vieillissement 2) identifier les mécanismes cellulaires responsables de la perturbation de la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang et résistance à l’insuline) qui apparait en en cas d’obésité ou au cours du vieillissement
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la perte de la fonction musculaire au cours du vieillissement pour permettre à plus long terme d’augmenter la qualité de vie (favoriser le bien vieillir). De plus, nous nous intéressons à la vulnérabilité des fibres musculaires à contraction rapide qui sont également touchées préférentiellement au cours de différentes pathologies (cancers, infections, sclérose latérale amyotrophique, insuffisance cardiaque et la broncho-pneumopathie chronique obstructive) ainsi qu’en cas de jeûne ou d’hypoxie (manque d’oxygène). Nos résultats pourraient donc être aussi intéressants pour de nombreuses autres pathologies.
Procédures
Tous les 120 animaux seront identifiés par poinçon à l'oreille (1 fois, 2 secondes) et seront traités avec 1 injection par jour (piqure 2 secondes) pendant 5 jours. Ils seront également soumis à des tests de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire (équivalent d'un IRM à l'hopital) (6 répartis sur l'ensemble du protocole, soit 6 x1min30 ). Ensuite, 48 animaux recevront aussi 1 injection par jour (piqure 2 secondes) pendant 7 jours. Le reste des animaux (soit 72) subiront aussi une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 30 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte espacés sur 2 heures (5 secondes par prélèvement) ainsi qu'un test de vitesse maximale aérobie sur tapis (1 fois, 30min). Ils seront également soumis à des tests comportementaux (3 fois 5 min et 3 fois 10 secondes).
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront des tests non-invasifs pour caractériser leur croissance, leur composition corporelle, leur activité physique et leur métabolisme. Ces tests pourront induire du stress. Les tests de capacités fonctionnelles sur les tapis pourraient engendrer du stress chez les animaux. Les effets indésirables pour le test d’activité sur tapis roulant peuvent être: l’épuisement de l’animal, une blessure à la patte. Les effets indésirables du traitement avec les glucocorticoïdes sont les modifications de poids et de comportement, ces derniers seront vérifiés tous les jours lors du traitement qui sera arrêté si un changement important de comportement est observé. Les animaux subiront un stress léger lié à la manipulation lors des tests de composition corporelle (2 minutes/semaine), de motricité (3 fois 5 min).Lors de la mesure du métabolisme respiratoire (48h) on peut attendre un stress modéré lié à l’individualisation nécessaire pour l’analyse. Pour le test de tolérance au glucose, on peut attendre une perte de poids de 10 à 15% liée au jeûne (12h sur la nuit, de 20h à 08h) et les animaux subiront une administration orale de glucose. Les prélèvements sanguins à la queue et le marquage à l'oreille induisent une douleur légère. Pour l'étude de l'influence d'un régime hypercalorique, qui reprend les mêmes tests mais sur des animaux ayant une nourriture plus riche, on attend les mêmes effets indésirables.
Devenir
Pour mener notre une étude et identifier les mécanismes d’interaction liant fonte musculaire, vieillissement, inflammation et obésité, nous devons prélever de nombreux tissus et réaliser des analyses moléculaires à l’issue de la procédure. Cela nécessite d’euthanasier les animaux en fin de projet.
Remplacement
Cette étude ne peut être conduite qu’avec des animaux car il n’y a pas de modèles cellulaires alternatifs pour l’étude des effets dépendant du type de fibres musculaires. De plus le vieillissement et la résistance à l’insuline sont des problèmes pathologiques impliquant de nombreux facteurs et de nombreux organes ce qui ne permet pas non plus le remplacement par des méthodes in vitro.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel de calculs statistiques pour définir le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous utiliserons un seul groupe contrôle pour l’ensemble des procédures. L’utilisation des deux sexes nous permettra d’inclure tous les animaux à l’étude et d’éviter les mises à mort inutiles lors de la production des lots expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront préalablement habitués à tous les tests de motricité et de course en étant simplement placés sur l’appareil, d’abord 1 minute sans mouvement, puis 1 minute à vitesse réduite. L’habituation sera répétée 2 fois, espacées de 24h, avant le test. Le tapis roulant utilisé sera un nouveau modèle sur lequel l’utilisation de stimulation électrique pour motiver la souris à courir est remplacée par un système qui envoie de l’air sur l’arrière train de l’animal. De plus, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque geste permettant d’éviter une trop grande fatigue, le stress ou la blessure. Par expérience nous n'avons jamais vu de blessure, cependant si c’était le cas, l’animal serait soigné et sorti du protocole. Chez les animaux obèses, la nourriture enrichie en graisse étant plus friable que la nourriture standard, nous ajouterons un bâtonnet de bois à ronger dans la cage afin de prévenir la croissance continue des incisives. Pour le change et la réalisation des tests, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués (enrichissement présent dans les cages). Ce tunnel permet aussi l’habituation à la mesure de composition corporelle où l’animal est maintenu dans un système équivalent le temps de la mesure (2 min environ). Nous utiliserons de la poudre hémostatique pour arrêter les éventuels saignements lors de la mesure de glycémie. Pour la surveillance des animaux et plus particulièrement des souris obèses, nous utiliserons la grille de score adaptée.
Choix des espèces
Les conditions de perte de muscles chez l’humain que nous souhaitons étudier plus précisément sont bien reproductibles dans le modèle souris. De plus, nous utiliserons un modèle génétiquement modifié qui n’existe que chez la souris. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. D'autre part, des souris âgées seront utilisées pour étudier la perte de muscle qui s’installe à partir de 18 mois.
Evolution de nos protocoles de transfert d’embryons et d’insémination de sperme par voie chirurgicale afin de raffiner la prise en charge de la douleur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Rats : 28
Pour valider un protocole antidouleur que le service pourra ensuite appliquer en routine à ses chirurgies de transfert d'embryons, 20 souris et 28 rats vont être utilisés, 20 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 28 un niveau léger. Les rates reçoivent quatre injections, une pour synchroniser leur cycle, une d'analgésique, une d'anesthésique et une dernière pendant leur sommeil. La moitié des femelles subit en plus une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes, l'autre moitié seulement l'anesthésie, puis toutes mettent bas et leurs petits sont comptés avant que mères et portées ne soient tuées, faute de pouvoir être réutilisées dans les activités de service de l'établissement. Le porteur écrit aussi que toute femelle chez qui une douleur ou un inconfort serait détecté sera mise à mort, dans un projet dont l'objet déclaré est la prise en charge de la douleur.
Objectifs
L'objectif du projet est de valider une nouvelle prise en charge de la douleur (administration de médicaments anti-douleur et anti-inflammatoire) lors de nos chirurgies de transfert d'embryons et d'insémination de sperme afin de raffiner nos procédures actuelles. L'utilisation de ces molécules et dans cette chronologie définie autour de la chirurgie doit être validée comme n'ayant aucun effet nocif sur la gestation et la mise bas afin de la passer en routine chez nous.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont d'améliorer la prise en charge de la douleur liée à la chirurgie de transfert d'embryons ou d'insémination de sperme sur nos rongeurs (rats et souris) et donc raffiner nos techniques. Le bien-être animal est une préoccupation majeure au sein de nos activités. Un animal qui ne souffre pas à des rendements plus fiables et plus reproductifs, ce qui impacterai également le R de Réduction. Donc sur ce projet on envisage d'impacter favorablement les R de raffiner et réduire.
Procédures
Les rates recevront une injection, sous simple contention rapide de 5 secondes, afin de synchroniser leur cycle pour devenir mères ou mères porteuses. 4 jours plus tard, les animaux recevrons une injection d'antidouleur sous simple contention rapide de 5 secondes, puis 40 minutes plus tard, ils seront anesthésiés par une autre injection, là encore sous simple contention rapide de 5 secondes. Une fois endormis, la moitié des animaux prévus vont passer en petite chirugie de transfert d'embryons sous anesthésie, alors que l'autre groupe, sera simplement anesthésié, sans aucune procédure invasive supplémentaire. La chirurgie dure environ 5 minutes. Juste après la chirugie, pendant que les animaux dorment encore, afin de limiter le stress, elles recevront un réhydratant et un anti-infammatoire en injectable. Ainsi, une rate recevra un total de 3 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie et 4 injections au total. Pour la souris, elle recevra 2 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie au total.
Impact sur les animaux
Le geste technique d'injection sous contention est un acte qui peu être un peu stressant pour l'animal, mais il ne dure que quelques secondes (environ 5 secondes) et est peu douloureux. Les animaux restent sous surveillance après leurs diverses injections, afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Les points de surveillance sont les suivants : rougeur, gonflement, traces de griffures si l’animal se gratte au niveau du site d'injection. Les animaux opérés (acte chirurgical) restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante. Les points de surveillance post-opératoire sont : l’apparence de l’animal, son comportement (prostré….), l’aspect du site de chirurgie (rongeur, gonflement, écoulement, automutilation….)
Devenir
Les femelles gestantes doivent mettre bas et nous devons comptabiliser le nombre de petits pour l'analyse de notre projet. Elles seront ensuite mises à mort, puisque nous ne pouvons pas réutiliser ces femelles dans le cadre de nos activités de service. Il en est de même pour les portées.
Remplacement
Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour l'analyse de l'effet des molécules antalgiques et anti-inflammatoires sur le bon déroulement de la gestation in vivo et la mise bas afin de raffiner nos protocoles chirurgicaux de transfert d'embryons et d'insémination de sperme.
Réduction
Notre activité est connue et il existe bon nombre de données témoins, ainsi, nous avons juste besoin de faire des groupes expérimentaux. Un bonne analyse bibliographique a été faite pour ajuster au mieux le protocole antalgique choisi avec le vétérinaire. Le projet se fera en 2 parties. La première partie (groupe 1) consiste uniquement à valider le fait que les molécules et doses choisies n'altèrent pas le bon déroulement des gestations et mises bas, sur les femelles gestantes mais qui n'ont pas subies de chirurgie. Seulement si cette étape est validée, nous passerons à la phase 2 (groupe 2, avec chirugie de transfert d'embryons). Nous avons choisi un effectif de 10 femelles pour chaque groupe et pour chaque espèce afin d'obtenir des résultats de comparaison fiables.
Raffinement
Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour pallier à toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. Les animaux sont hébergés en cages ventilées dans des conditions adéquates pour l'espèce. Des enrichissements (nids et quelques croquettes dans le fond de la cage pour les souris et nids + bois et balles à ronger + croquettes dans le fond de la cage pour les rats) sont mis à disposition dans la cage des futures mères lors de leur convalescence et gestation. Comme il s'agit ici d'un test, si une douleur ou un inconfort est détéctée, la femelle sera mise à mort pour lui éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Nous voulons des mère porteuses, il nous faut donc des femelles en âge de procréer donc entre 10 semaines et 6 mois (pour les 2 espèces).
Etude du rôle de l’acide rétinoïque dans la différenciation des cellules germinales chez le foetus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Gavées deux fois par voie orale sous contention de moins de trente secondes, des souris femelles gestantes sont ensuite tuées pour que leurs fœtus soient prélevés, puis tués à leur tour. 440 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur conclut que la mise à mort des femelles gestantes et de leurs fœtus fait qu'ils ne souffrent pas. Il ajoute qu'aucun ne peut être gardé en vie, réutilisé, adopté ni replacé, les testicules des fœtus mâles étant l'objet même de l'étude, consacrée au rôle de la vitamine A dans leur formation.
Objectifs
La vitamine A est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères mais son rôle reste à définir dans les différents tissus. Pour agir pendant le développement embryonnaire, la vitamine A est transformée par des enzymes en un métabolite actif qui se fixe ensuite sur des récepteurs nucléaires qui relayent son effet biologique. Les cellules dans lesquelles la vitamine A ne doit pas agir fabriquent d’autres enzymes qui dégradent ce même métabolite. Afin d’étudier et de comprendre le rôle de la vitamine A dans la différenciation des cellules constitutives du testicule chez la souris, nous proposons de comparer des fœtus normaux à des fœtus porteurs de mutations dans les gènes codant les enzymes qui transforment et qui dégradent la vitamine A, ainsi que dans les gènes codant les récepteurs nucléaires, aux étapes clés de la formation du testicule (entre les jours 14.5 et 18.5 post-fécondation).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre l’action de la vitamine A et de ses récepteurs nucléaires dans les différentes étapes de différenciation des cellules constitutives de testicule. En découvrant comment la vitamine A agit sur ces évènements chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour mieux diagnostiquer (et éventuellement traiter) des pathologies du testicule ou des cas d'infertilité chez l’Homme, qui sont en augmentation constante dans le monde. Comprendre le rôle de la vitamine A dans le testicule au cours du développement peut également fournir des pistes pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux, à condition de bien caractériser et comprendre au préalable tous les mécanismes mis en jeu dans un modèle expérimental comme la souris.
Procédures
Les souris femelles gestantes sont traitées par gavage oral pour permettre la mutation (recombinaison). Il s’agit de deux contentions simples qui durent moins de 30 secondes chacune. Les souris sont ensuite euthanasiées. Après prélèvement (quelques secondes), les fœtus sont euthanasiés.
Impact sur les animaux
La nuisance subie par les femelles gestantes est limitée à la contention et l’administration de substance par gavage. Le gavage oral est utilisé en routine au laboratoire et nous possédons l’expertise requise pour cette expérimentation. Les doses de solution de gavage sont déterminées pour n’induire aucun effet indésirable lié directement à l’ingestion. Immédiatement après le gavage, tout signe de fausse route (par exemple suffocation) sera suivi de la mise à mort immédiate de l'animal. A ce jour, nous n'avons jamais rencontré ce problème. Dans le cadre de ce projet, les femelles gestantes et les foetus sont euthanasiées, de sorte que les femelles gestantes et les foetus ne souffrent pas.
Devenir
Tous les animaux décrits dans ce projet (femelles gestantes et fœtus) sont euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus sont euthanasiés pour les analyses moléculaires ou sur coupes histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.
Remplacement
Le testicule est formé de diverses cellules qui ont toutes un rôle essentiel pour la différenciation des cellules germinales. A l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de reproduire in vitro les conditions nécessaires à la formation d’un testicule. En effet, les techniques de culture cellulaire ou d’organoïdes ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique du testicule, qui nécessite vascularisation, contexte tridimensionnel et interactions endocrines/paracrines. Par conséquent, l'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant toutes les étapes complexes de ce processus de développement, est indispensable. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
La stratégie des accouplements fait en sorte que parmi des fœtus obtenus, une moitié possède le génotype contrôle pour les allèles conditionnels et l’autre moitié possède le génotype mutant pour les allèles conditionnels. Relever les jours d’accouplement permet d’anticiper la date de mise à mort des femelles gestantes et de prévoir les dissections des fœtus. Utiliser à la fois les fœtus mâles et les fœtus femelles est impossible, puisque nous étudions le testicule. Les nombres de fœtus requis sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de qualité des résultats obtenus et à la robustesse de leur validité statistique.
Raffinement
Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes. La qualité de la contention permet d’assurer un gavage efficace et rapide, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel est formé à cet effet. Les solutions sont amenées à la température ambiante pour limiter l’inconfort de la femelle. Le bien-être des animaux est surveillé tous les jours et toute altération du comportement (souffrance, angoisse) est immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires (soins, analgésie, euthanasie, le cas échéant). Les animaux seront hébergés par quatre dans des cages comportant différents types d’enrichissement tels qu’un tunnel de transfert et suffisamment de fibres pour la construction de nids afin de leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques et physiologiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal du testicule est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous utilisons une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée. Tous les modèles génétiquement modifiés permettant d’étudier la fonction des gènes d'intérêt dans le testicule fœtal des souris sont déjà à notre disposition. Les femelles gestantes sont euthanasiées à différents moments du dernier tiers de la gestation, de sorte que la période de développement du testicule fœtal qui nous intéresse soit couverte.
Traitement de l’encéphalopathie par administration de produits sous forme de dialyse péritonéale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Vocalises spontanées, difficultés respiratoires, incapacité à se retourner, absence de réflexe pupillaire, ptôse palpébrale avec larmoiement : ces signes déclenchent la mise à mort anticipée des rats en phase de décompensation. 3 374 rats vont être utilisés au total, 1 368 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 1 356 un niveau modéré et 650 un niveau léger, tous tués pour l'analyse histologique du foie, des reins et du cerveau. Chacun reçoit jusqu'à 32 administrations de tétrachlorure de carbone, deux par semaine pendant seize semaines, ou subit une laparotomie avec ligature des voies biliaires, avant que des injections de lipopolysaccharide bactérien ou douze administrations d'éthanol ne déclenchent la défaillance hépatique. Le porteur écrit que la décompensation peut inéluctablement conduire l'animal à la mort, et n'appuie l'effectif de 3 374 rats sur aucun calcul.
Objectifs
L'encéphalopathie hépatique (EH) est un syndrome d'altération des fonctions cérébrales dû à une maladie hépatique aiguë ou chronique. Les manifestations peuvent aller de troubles psychiatriques, neurologiques subcliniques jusqu’au coma. Ce syndrome est associé à une morbidité, à un taux de mortalité élevé et nécessite des soins importants. La principale cause de cette pathologie est la cirrhose hépatique qui est caractérisée par la présence de tissus cicatriciels au niveau du foie en réponse à une agression répétée de l’organe.
Bénéfices attendus
La prévalence de l’encéphalopathie hépatique (EH) clinique concerne 30 à 45 % des patients cirrhotiques avec une incidence de 20 % par an. La prévalence de l’EH minime est plus difficilement estimable mais elle pourrait toucher plus de 2/3 des malades. La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). La survenue d’une EH constitue un facteur majeur de mauvais pronostic. En effet, le développement d’un premier épisode d’EH au cours de la cirrhose est un facteur de risque indépendant de mortalité avec un taux de survie cumulée à 1 an et 3 ans de respectivement 42 % et 23 %. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit à la mise en place de l’encéphalopathie hépatique et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).
Procédures
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 32 administrations de CCl4 (tétrachlorure de carbone, agent fortement hépatotoxique) à raison de 2 par semaines pendant 16 semaines (15 secondes) ou Chirurgie avec laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale et couverture analgésique (durée 15’) Pour les études pilotes : un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Pour les études avec produits : un prélèvement de sang intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Décompensation provoquée selon les procédures : Entre 18 et 20 administrations de CCl4 à raison de 2 par semaines pendant 9 ou 10 semaines (15 secondes) Ou Chirurgie avec laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale et couverture analgésique (durée 15’) un prélèvement de sang intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Déclenchement de la décompensation : Soi 4 administrations de LPS (Lipopolysaccharide: fragment de la paroi bactérienne entrainant une réaction inflammatoire à l'identique de celle rencontrée lors d'une infection) (15 secondes) à raison d’une administration journalière pendant 4 jours avec ou sans anesthésie selon la voie retenue soi 12 administrations d’éthanol à raison de 3 administrations par jour pendant 4 jours (15 secondes) un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Si procédure avec produit à étudier ajouter: 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes).
Impact sur les animaux
Les modèles d’étude ne présentent pas de douleur ou d’inconfort pendant la phase d’induction de la fibrose ou de la cirrhose. Sur cette phase, le seul inconfort serait l’intervention chirurgical associée à la ligature des voies biliaires, celui-ci est géré par l’utilisation préventif d’un analgésique et en curatif pendant les deux jours qui suivent la période post-opératoire. L’encéphalopathie est une pathologie très lourde pouvant conduire au décès du patient. La décompensation qu’elle soit « spontanée » en prolongeant l’induction soit dans l’épisode aigu associé à l’administration de l’agent précipitant à un stade plus précoce de la cirrhose compensée peut inéluctablement le conduire à la mort, c'est par définition la caractéristique du modèle étudié dans ce projet. Nous reproduisons ces évènements qui surviennent chez les patients cirrhotiques qui décompensent qui dans le cadre d’une ACLF (décompensation ou aggravation d’une décompensation rapide et brutale par un agent précipitant - infection, absorption massive d’alcool, intoxication médicamenteuse, …- chez des patients souffrants d’une maladie chronique du foie) peuvent avoir une survie estimée à 28 jours dans 70% des cas. Des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires (dyspnée), une incapacité à se retourner (sauf dans le cadre du binge drinking où les pertes d’équilibres peuvent aller jusqu’à l’incapacité à se retourner), une absence de réflexe pupillaire, une ptose palpébrale avec larmoiement et une pâleur prononcée pourront être observés chez les animaux en phase de décompensation. Ils constitueront un point d’arrêt et une mise à mort des animaux par anticipation.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Les modèles développés et décrits dans ce projet tentent de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation aigue ou chronique. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus jouant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc.)
Réduction
Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatiques. Le nombre initial de certaines procédures permettra l’élimination d’animaux sous ou sur-répondants, ce afin d’avoir une meilleure homogénéité après réponse à l’agent précipitant et donc in fine de réduire les groupes d’étude finaux. L’estimation du nombre d’animaux des groupes finaux a pour but de permettre une analyse robuste et fiable de l’effet des composés sur la pathologie. Les procédures de caractérisation des modèles permettront d’ajuster au mieux ce nombre d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet thérapeutique de composés.
Raffinement
L’encéphalopathie hépatique est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne de nombreux décès dans un délai de 1 à 3 ans. Le modèle expérimental s’avère donc lui aussi sévère sur la phase finale de la procédure (prolongation de l’agent inducteur ou administration de l’agent précipitant). Nous avons établi une liste de signes cliniques de manière à ne pas conserver des animaux ayant atteint ces points limites. La liste de ces points limites pourra être réajustée après les procédures de caractérisation des modèles et afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel ou igloo et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. L’insuffisance hépatique qui conduit à l’encéphalopathie étant une pathologie multi-organe, l’étude de la maladie requiert l’utilisation d’animaux et ne peut être remplacée par des expérience in vitro.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce Rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l'arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans: "Phenobarbitone induced enlargement of the liver : its relationship to carbon tetrachloride induced cirrhossis -Br. J.Exp.Pathol. 1981 Jun;62(3):283-8 », c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gfr environ que le ratio du poids du foie et le plus favorable, de même que l’expression du cytochrome P450 qui est plus stable.
Etude du rôle d’Arhgef18 dans la biologie endothéliale chez la souris_Amendement
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à des âges échelonnés de six jours à treize semaines. Les nouveau-nés reçoivent trois injections en trois jours, les adultes une injection intrapéritonéale par jour cinq jours par semaine pendant deux semaines, puis un prélèvement rétro-orbitaire et des mesures répétées de pression artérielle à la queue. Le porteur rattache ce travail sur une protéine des parois vasculaires à la prise en charge de l'anévrisme intracrânien, responsable selon lui de 36 000 hémorragies par an dans l'Union européenne, bénéfice qu'il situe à long terme. Aucun calcul n'appuie le chiffre de 420 souris, le porteur indiquant seulement que l'expérience de son équipe permettra d'en réduire le nombre.
Objectifs
La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.
Procédures
Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes. Procédure 5: 1 injection intrapéritonéale à 6 jours d'âge. L'injection dure moins d'une minute par animal
Impact sur les animaux
Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.
Devenir
Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Lot 7 : utilisés pour la procédure 5 pour analyse de la perméabilité vasculaire à 6 jours. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.
Remplacement
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Réduction
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.
Raffinement
Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).
Caractérisation d’un nouveau modèle de neuropathie de type Charcot-Marie-Tooth du à des mutations du gène KCTD11
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
108 souris, dont un tiers privées du gène kctd11 et un tiers porteuses d'une seule copie, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à 18 mois pour le prélèvement de leurs nerfs et de leur moelle épinière. À 6, 12 et 18 mois, chacune passe quatre tests, locomotion et équilibre, démarche, force musculaire mesurée en la tenant par la queue et en tirant, sensibilité de la plante des pattes à un filament appliqué jusqu'à cinq fois. À 12 et 18 mois s'ajoute la mesure des vitesses de conduction nerveuse, par aiguilles plantées à travers la peau des pattes sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique disposer de modèles cellulaires dérivés de cellules de patients et les utiliser, puis conclut que le remplacement reste impossible parce que ces modèles ne reconstituent pas le système nerveux périphérique complet.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer si le modèle murin dit « knock-out » (KO), dans lequel nous avons supprimé le gène kctd11, est un bon modèle pour la maladie humaine, causée par des mutations dans ce même gène KCTD11. Il s'agit de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, une maladie caractérisée par une dégénérescence progressive des nerfs du Système Nerveux Périphérique. Nous étudierons l'état des nerfs des souris KO en comparaison à des souris normales, grâce à des analyses de la structure des nerfs, à la mesure des vitesses de conduction nerveuse, ainsi qu’à l’évaluation des capacités locomotrices des souris, à différents âges (6-12-18 mois). Disposer de ce modèle va nous permettre de mieux comprendre comment la perte du gène KCT11 aboutit à une neuropathie et à définir des traitements pour la maladie.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si ce modèle de souris présente des caractéristiques de la maladie CMT et a le potentiel d’être un nouveau modèle de la pathologie afin de développer des traitements futurs pour les patients atteints de la maladie de Charcot-Marie-Tooth.
Procédures
Les animaux subiront quatre tests comportementaux, peu ou pas invasifs, à trois âges différents (6, 12 et 18 mois). Ces tests visent à tester les fonctions locomotrices des souris et à repérer des troubles de la sensibilité (ex: toucher, douleur). Les 4 tests sont listés ci-dessous: 1) un test pour mesurer la locomotion et l’équilibre des souris. Ce test se déroule sur 2 jours : 1er jour pour habituation, 2ème jour pour mesure. Le test dure environ 45 minutes (temps de repos inclus). 2) un test pour évaluer la démarche de l'animal. Durée : 15 minutes. 3) un test pour évaluer la force musculaire des souris. Le test dure environ 45 minutes (temps de repos inclus). Il est réalisé pour les pattes avant seulement puis répété pour les pattes arrière seulement. 4) un test pour analyser la sensibilité des souris à un stimulus mécanique au niveau des dessous des pattes. Durée : 10 minutes (temps de repos inclus). A 12 et 18 mois, on ajoute un cinquième test, qui sert à mesurer les vitesses de conduction des nerfs, par pose d’électrodes (aiguilles), sans chirurgie, au travers de la peau, au niveau des pattes inférieures. Nous réaliserons 3 mesures pour chaque patte, soit 6 mesures au total par animal. L’intervention dure environ 10-15 minutes par animal. A chaque âge, l’ensemble des tests, pour l’ensemble des souris, s’effectuera sur 3 semaines : La 1ère semaine : test 1 (2 jours) et test 3 (2 jours). La 2ème semaine : test 2 (4 jours) La 3ème semaine : test 4 (2 jours) et mesure des vitesses de conduction nerveuse (2 jours) (à 12 et 18 mois uniquement).
Impact sur les animaux
Les tests qui sont prévus dans ce projet ne sont pas ou peu invasifs. Les tests 1 et 2 entrainent peu d’inconfort aux souris. Le test 3 nécessite de tenir la souris par la queue et de tirer légèrement pour tester la force des pattes avant ou arrière. Ceci peut générer un peu d’inconfort que l’on limite en laissant la souris, bien au calme, avant et après l’expérimentation. Le test 4 entraîne un inconfort de courte durée, suite à l’exposition à un petit filament qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Cette procédure est répétée 5 fois maximum par animal avec des temps de repos pour limiter l’inconfort de l’animal. Le test le plus invasif est la mesure des vitesses de conduction nerveuse. On pose des électrodes au niveau des pattes inférieures. La pose des électrodes est non invasive (sans chirurgie) :les électrodes sont posées à travers la peau. Ce test n’est réalisé qu’à deux âges (12 et 18 mois). Pour éviter toute douleur ou inconfort, ce test est réalisé sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont maintenus au chaud grâce à un coussin chauffant et une couverture de survie. Enfin, afin d'identifier et de génotyper les animaux en procédure, ces derniers subiront la pose d’une puce RFID (puce électronique que l'on peut ensuite scanner à l'aide d'une scannette pour identifier facilement les animaux) et un petit poinçon à l'oreille à l'âge de 4 semaines. Ceci nécessite une contention des animaux de quelques secondes.
Devenir
A l'issue de l'expérimentation, les animaux seront âgés (18 mois) et nous avons besoin de récupérer leurs nerfs et la moelle épinière pour étudier quels sont les effets de la maladie sur la structure de ces tissus à long terme. Ainsi, les animaux seront mis à mort pour prélever ces tissus.
Remplacement
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une maladie génétique du Système Nerveux Périphérique, composé par l'ensemble des nerfs craniens et les nerfs "spinaux"qui servent à innerver tous les muscles du corps pour les faire bouger ou à transmettre au cerveau, à partir des extremités, une information de type douleur par exemple. Chez l’homme, le Système Nerveux Périphérique est inaccessible et impossible à étudier. L’utilisation de modèles cellulaires, à base de cellules souches adultes, dérivées de cellules (peau ou sang) prélevées chez un patient, peut dans certaines circonstances, constituer une bonne alternative, et nous les utilisons. En effet, nous savons, à partir de ces cellules souches, fabriquer les neurones du Système Nerveux Périphérique, mais pour l'instant nous ne parvenons pas à reconstituer, en tube, le Système Nerveux Périphérique complet. Ils sont un modèle extrêmement simplifié, qui ne permet pas notamment de reproduire la complexité du Système Nerveux Périphérique et de ses interactions avec les muscles. Il existe un autre modèle in vitro de la maladie, mais qui est obtenu à partir d’embryons de rongeurs (rat ou souris, génétiquement modifiés ou non) et qui donc nécessite l’utilisation des animaux. Pour finir, nous travaillons sur des anomalies du système neuromusculaire et devons donc pouvoir étudier la locomotion et la sensibilité à la douleur chez des animaux vivants. C’est pourquoi, malgré l’existence de modèles cellulaires alternatifs, que nous utilisons pour réduire et raffiner, le remplacement n’est pas possible et cette étude nécessite l’utilisation de modèles souris. Le passage au modèle animal est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme.
Réduction
Nous aurons trois groupes d'animaux (mutés (KO), hétérozygotes pour la mutation (HET) et sauvages (WT)). Le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation du projet est de 36 animaux par groupe. Ce nombre a été calculé, par un test statistique, au minimum nécessaire pour mettre en évidence un effet significatif sur les paramètres que nous allons évaluer.
Raffinement
Le phénotype des souris est très léger et leur survie est identique à celle des animaux contrôles.Il n'y a aucune chirurgie dans ce projet. Les tests sont décrits au paragraphe 5.6.1. Lors de chaque test, la salle est réservée et seule la personne expérimentatrice est présente dans la salle. Pour tous les tests, les animaux sont habitués au minimum 30 min dans la pièce expérimentale, avant le début de l’expérience. Après l’expérience, (et un temps de repos selon les tests), les souris sont replacées dans leur cage d’origine, avec leurs congénères, puis surveillées selon la grille de scoring. Afin de limiter le stress des animaux durant l’expérimentation, on procède toujours à une habituation, en particulier pour les tests 1 et 2. Lors de la manipulation, nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Les tests 1 et 2 entrainent peu d’inconfort aux souris. L’habituation permet aux souris de limiter le stress qu’elles pourraient ressentir.Le test 3 nécessite de tenir la souris par la queue et de tirer légèrement pour tester la force des pattes avant ou arrière. Ceci peut générer un peu d’inconfort que l’on limite en laissant la souris, bien au calme, 30 minutes avant et après l’expérimentation. Le test 4 entraîne un inconfort de courte durée, suite à l’exposition à un petit filament qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Cette procédure est répétée 5 fois maximum par animal avec des temps de repos pour limiter l’inconfort de l’animal. Le test le plus stressant est le test de mesure des vitesses de conduction nerveuse. Il sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Lorsque l’anesthésie sera suffisamment profonde, les animaux seront placés sur un coussin chauffante pour éviter l’hypothermie. Une petite couverture de survie pourra être placée sur l’animal pour bien maintenir sa température corporelle. Après les mesures, les souris sont maintenues sur le coussin chauffant, recouvertes d’une couverture de survie, jusqu’au réveil, puis placées dans une cage une dizaine de minutes sous surveillance. Lorsqu’elles sont bien réveillées, elles sont replacées dans leur cage d’origine, avec leurs congénères, puis surveillées selon la grille de scoring. Tout le long de la procédure, des points limites sont définis et les animaux seront mis à mort lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption définis.
Choix des espèces
Le laboratoire a identifié un nouveau gène muté dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT), une maladie génétique des nerfs périphériques (nerfs qui servent à faire bouger les muscles), qui entraine des troubles de la locomotion et de la sensation (toucher, douleur). C'est une maladie neurologique progressive aujourd'hui incurable. A l’heure actuelle, le rôle de ce gène dans le déclenchement de la maladie n'est pas bien compris, mais cette compréhension est nécessaire pour pouvoir mettre au point des traitements. Malgré le développement de modèles cellulaires alternatifs, nous avons besoin d'étudier un modèle animal, dans lequel le gène incriminé est invalidé, pour regarder quelles sont les anomalies des nerfs de ces souris, comprendre les mécanismes par lesquels l'invalidation du gène mène à ces anomalies, et tester des traitements qui permettent de supprimer les anomalies. le choix d'un animal dans lequel le gène est invalidé est justifié par le fait que chez les patients, les mutation qui causent la maladie aboutissent à une perte de fonction de la protéine représentée par le gène muté. Les expériences proposées dans ce projet sont réalisées à partir de mois et jusqu'à 18 mois, car la neuropathie, dont sont atteints les patients mutés pour le gène, est une maladie neurologique lentement progressive. Il faut donc pouvoir étudier des animaux agés. De plus à plus long terme, avant d'envisager un essai thérapeutique chez l'homme, il sera nécessaire de tester les traitements sur un modèle murin.
Thérapie Génique par surexpression de la phosphodiestérase de type 3 chez le rat pour traiter l’insuffisance cardiaque induite par l’hypertension artérielle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Certains rats reçoivent un implant sous-cutané sous anesthésie pour faire monter leur pression artérielle, d'autres des injections, et tous passent des échocardiographies successives sous anesthésie générale de vingt minutes. 160 rats vont être utilisés, 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 40 un niveau léger. Le projet vise à tester si une thérapie génique augmentant l'expression d'une enzyme dans le cœur protège de l'insuffisance cardiaque liée à l'hypertension. Le porteur écrit que le produit injecté devrait soulager les rats traités, tout en surveillant chez les animaux hypertendus l'apparition d'une ascite, d'un œdème pulmonaire, d'une dyspnée et d'une prostration. L'insuffisance cardiaque étant irréversible, indique-t-il, tous les rats sont tués en fin de procédure pour le prélèvement de leurs organes.
Objectifs
L’hypertension artérielle (HTA) est un problème de santé public majeur dont la prévalence est estimée à environ 30% soit 12.7 millions d’adultes en France. La pression artérielle continuellement élevée augmente le travail du cœur afin de maintenir un débit normal. À terme, cette évolution se traduit par une hypertrophie cardiaque et peut progressivement mener à l’insuffisance cardiaque (IC) chronique. Ceci correspond à l’incapacité du coeur à pomper suffisamment le sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Un dysfonctionnement du myocarde entraine des conséquences dramatiques qui affectent non seulement le coeur mais également les tissus périphériques et notamment les fonctions pulmonaires, rénales, hépatiques et musculaires. Notre hypothèse générale est que l’augmentation de l’activité des phosphodiestérases dans le coeur pourrait protéger contre la progression de la maladie. Nous avons déjà testé notre hypothèse dans des cultures primaires et validé notre hypothèse générale dans des modèles physiopathologiques mimant d’autres causes de de l'insuffisance cardiaque. L’utilisation d’animaux est indispensable pour l’évaluation de la fonction cardiovasculaire et ne peut être remplacée par des cultures cellulaires (les cellules cardiaques ne se divisent pas). De plus l’évaluation de la fonction cardiaque est à réaliser sur l’animal entier adulte afin de s’approcher le plus possible de la pathologie humaine.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de tester qu’une thérapie génique permettant l'augmentation de l'expression d'une enzyme, la phosphodiestérase de type 3 (PDE3A) dans le coeur, améliorerait l'activité cardiaque des patients atteints d’hypertension artérielle et éviterait que leur pathologie amène à l’insuffisance cardiaque. Notre stratégie thérapeutique pourrait ainsi constituer une alternative prometteuse ou un complément aux traitements actuels de l'insuffisance cardiaque induite par l’hypertension artérielle.
Procédures
Certains rats subissent des injections sous anesthésie. Cette intervention dure 10 minutes. Certains rats reçoivent un implant sous-cutané sous anesthésie, procédure qui dure 10 minutes. - La mesure de la pression artérielle est réalisée sur animal vigile et l’évaluation de la fonction cardiaque de tous les rats est réalisée sous anesthésie générale pendant 20 minutes par échocardiographies successives (n=160). Pendant des échographies sous anesthésie générale, les animaux subissent une injection.
Impact sur les animaux
Les injections ne provoquent qu'une nuisance légère et transitoire, c'est pour cela qu'elles sont réalisées sous anesthésie pour limiter le stress, après avoir appliqué un gel de lidocaïne au point d'injection pour limiter la douleur. L'injection du produit à visée thérapeutique devrait limiter la progression de l’insuffisance cardiaque et soulager les animaux ainsi traités. Les chirurgies réalisées entraineront des douleurs modérées et transitoires. L’hypertension et l’éventuelle insuffisance cardiaque qui vont ensuite s’installer dans le groupe soumis à traitement pour élever la pression artérielle va s’accompagner des signes cliniques de ces pathologies. Ainsi, l'apparition d’une ascite et un oedème pulmonaire, qui provoquent asthénie, une dyspnée, perte de poids et une prostration sera surveillée.
Devenir
L’insuffisance cardiaque est une pathologie irréversible, les animaux sont donc euthanasiés en fin de procédure. L’ensemble des animaux sera euthanasié pour prélèvements d’organes, ce qui est nécessaire pour permettre l’évaluation du potentiel thérapeutique de la thérapie génique que nous testons.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant de récapituler le phénotype d’une cellule cardiaque adulte. Les tests cellulaires ne peuvent donc être réalisés que sur des cellules fraichement isolées de coeurs. De plus, dans l’hypertension artérielle et l’insuffisance cardiaque, le corps met en place des régulations physiologiques impliquant le système neuro-hormonal. Ces régulations neuro-hormonales ne peuvent pas être reproduites in vitro ce qui rend indispensable l’expérimentation dans un modèle préclinique intégré.
Réduction
(i) une planification minutieuse basée sur un calcul de puissance et l’expertise de l’équipe ont permis l'estimation de la taille d'échantillon optimale. Ceci a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et de conserver une puissance statistique suffisante pour observer un effet de 40% obtenu sur la diminution de la fonction cardiaque (ii) les fonctions cardiovasculaires sont étudiées par des méthodes non invasives permettant de limiter le nombre d’animaux, (iii) afin de minimiser encore le nombre d’animaux utilisés, en fin d’expérimentation les tissus prélevés sont partagés entre les domaines explorés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages. Les rats sont mis en cage et observés tous les jours. Les cages sont changées 2 fois par semaine afin de minimiser une éventuelle infection. L’injection d’aav9 dans la veine caudale est réalisée à l’occasion de la première ou la deuxième échographie évitant un stress et une anesthésie à l’animal. L’hypertension artérielle sera induite en respectant au maximum les procédures de bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Toutes les mesures sont prises pour mettre en place la qualité de l’hébergement requis et la mise en place de procédures adaptées pour limiter la souffrance animale en accord avec la législation en vigueur et respecter l’application de la règle des « 3R ». Un suivi rigoureux des animaux engagés dans les procédures est mis en place. Des points limites ont été scrupuleusement déterminés et sont soigneusement évalués quotidiennement. Si ces points limites sont atteints, les animaux sont sacrifiés pour limiter leur souffrance et leurs organes sont prélevés.
Choix des espèces
Le rat est choisi car c’est un mammifère qui constitue un modèle courant et classique pour l'étude de la fonction cardiovasculaire y compris dans un contexte pathologique. Il est un modèle de choix car il offre la possibilité d’induire l’insuffisance cardiaque par des procédures chirurgicales. Des rats de 7 semaines (250g ) adultes ont été choisis comme modèles car les maladies cardiovasculaires chez l'humain et l'hypertension en particulier touche essentiellement des adultes.
Formations sur les gestes techniques chez le rat et la souris
- Formation professionnelle
Rats : 160
Ponctions de sang au sinus rétro-orbital, administrations par voies intraveineuse, intranasale, orale, vaginale et oculaire, puis mise à mort par dislocation cervicale : ce sont les gestes que des personnes en formation apprennent sur 160 souris et 160 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Un même animal peut subir jusqu'à trois gestes différents par jour, cinq jours de suite. Le porteur affirme que ces formations visent à limiter l'inconfort et l'anxiété des animaux non-humains pendant l'expérimentation, tout en reconnaissant qu'un geste réalisé par une personne peu expérimentée peut provoquer stress, inconfort et douleur locale. Ces séances sont des formations internes à une entreprise, initiales ou continues, adossées aux études de pharmacocinétique exigées par la réglementation du médicament.
Objectifs
Ce projet a pour but de décrire les formations du personnel avec des rats et souris, notamment les gestes techniques nécessaires pour faire des études pharmacocinétiques et les études mécanistiques de devenir du médicament dans l’organisme qui répondent aux exigences règlementaires. Les formations peuvent inclure : - la bonne contention - l’anesthésie d’un animal - les prélèvements de sang au sinus rétro-orbital, des organes ou des fluides chez le rat et la souris - l’administration par voie intraveineuse, intramusculaire, intranasale, per os, sous-cutanée, intra-vaginale, topique, intra-auriculaire et oculaire (topique) - la mise à mort d’un animal (dislocation cervicale). La formation est adaptée à la personne et à la fonction exercée. Pour une formation initiale dans l’entreprise, l’acquisition des notions théoriques et des gestes et techniques devant être réalisées seront évalués et, selon le degré de maitrise, seront validés ou nécessiteront une formation complémentaire. Pour la formation continue, les personnes concernées se forment uniquement aux nouveaux gestes nécessaires pour leur travail. Toute formation est faite en présence d’un formateur expérimenté qui maitrise la technique en question. La formation pour chaque geste est terminée quand le formateur juge que la technique est maitrisée.
Bénéfices attendus
Ces formations permettent aux expérimentateurs d’acquérir des gestes techniques parfaitement maîtrisés. Ceux-ci visent à limiter au maximum l’inconfort et l’anxiété de l’animal pendant l’expérimentation. De plus, la qualité des résultats expérimentaux obtenus pour le développement de médicaments à usage humain sera améliorée par la maîtrise de ces gestes et permettra de ne pas réaliser ces expérimentations sur un plus grand nombre d’animaux que nécessaire (réduction du nombre d’animaux utilisés).
Procédures
Le même animal sera utilisé pour plusieurs gestes si possible, par exemples, plusieurs types d'administration et prélèvement du sang. La durée des interventions sera comprise entre quelques secondes (par exemple pour les intraveineuse, Orales, Intrapéritoneale, Sous cutanée, occulaire et intra-auriculaire) et une minute (administration rectale, vaginale). La durée d’un prélevement rétro-orbital sera d’environ 10 secondes. Un maximum de 3 gestes (différents) par jour, par animal et sur un maximum de 5 jours ne sera pas dépassé. Administration par différentes voies, prélèvement du sang, mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie, prélèvement d’organes après mise à mort.
Impact sur les animaux
Les gestes ou actions expérimentales effectuées par une personne peu expérimentée peuvent générer du stress, un inconfort ou une douleur locale.
Devenir
Les mêmes animaux utilisés pour la formation de l’administration peuvent être également utilisés pour les formations de prélèvement. Dans la mesure de possible, les animaux sont utilisés pour collecter des organes ou du plasma nécessaire aux méthodes de dosages de bioanalyses) à la fin de l’ensemble des procédures.
Remplacement
La formation pour l’administration et le prélèvement ne peux pas être fait avec un autre modèle. La réglementation pour le développement de nouveau médicament exige les tests chez les rongeurs. Afin de pouvoir répondre à cette demande, une formation aux gestes techniques est obligatoire pour les études de pharmacocinétique.
Réduction
Avant l’utilisation des animaux, une formation théorique sera dispensée sur la bonne manipulation et la contention afin de réduire le stress et l’inconfort de l’animal. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les gestes sont montrés dans un premier temps pendant des études pharmacocinétiques liés à un autre projet autorisé (phase d’observation). La formation pratique sera ensuite faite sur les animaux. Aucun animal n’est spécifiquement commandé pour la formation.
Raffinement
La personne à former reçoit d’abord une formation théorique et une formation à la manipulation et contention de l’animal sans geste de prélèvement ou d’administration. Quand le formateur juge que la personne maitrise ces techniques, les autres formations peuvent commencer. L’animal sera anesthésié si la procédure le nécessite. De plus, lors de l’hébergement des animaux, l’enrichissement du milieu comprend l’utilisation de maisonnettes et boules de coton pour les souris, de tubes en carton et blocs de bois pour les rats. L’hébergement est réalisé en groupe stable.
Choix des espèces
Rat ou souris pour les essais règlementaires de pharmacocinétique nécessaires au développement de nouveaux médicaments à usage humain. Les animaux utilisés ont entre 6 et 12 semaines conformément à la règlementation.
Maintenance et reparation de la myéline centrale: role d’ADAM10
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 402 souris vont être utilisées dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère, toutes tuées au plus tard deux mois après la chirurgie pour prélever leurs tissus. Chacune subit un prélèvement à la queue entre le septième et le dixième jour de vie, un traitement pharmacologique, des tests de mémorisation et de locomotion de dix minutes, et pour une partie d'entre elles une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie destinée à provoquer une lésion de la myéline. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes. Le porteur chiffre le lot expérimental entre 1 152 et 2 304 souris, sans expliquer d'où viennent les 5 402 déclarées.
Objectifs
La myéline est une substance qui entoure le prolongement des neurones et qui est responsable de la conduction nerveuse et donc de la transmission des commandes initiées par le système nerveux. La myéline est produite par des cellules appelées oligodendrocytes, localisés dans le cerveau et la moelle épinière. La perte de myéline ou d’oligodendrocytes peut survenir dans le cas de pathologies appelées maladies démyélinisantes (telle que la sclérose en plaques) ou lors de traumatismes (par ex. accidents de la route), et peuvent mener à de lourds handicaps. La formation de la myéline (myélinisation) et sa réparation (remyélinisation) sont des processus complexes qui font intervenir de nombreux mécanismes dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est de comprendre l’implication d’une protéine particulière en recherchant (1) son rôle dans la maintenance des gaines autour des prolongements neuronaux et (2) son rôle dans la réparation de la myéline chez la souris en mimant une lésion par perte myélinique. Ce projet s’appuie sur des études précédentes montrant que l’activation de ce type de molécule est capable de protéger la myéline. Pour étudier l’implication de cette protéine uniquement dans les oligodendrocytes, nous caractériserons les individus d’un point de vue macroscopique (locomotion, cognition) mais aussi microscopique (état des tissus, organes, cellules). Le projet proposé nous permettra de mieux comprendre le rôle de notre protéine dans ces maladies démyélinisantes et son potentiel régénératif. Ce projet permettra d’ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutique pour les maladies démyélinisantes, pour lesquelles il n’existe actuellement pas de traitements efficaces chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes.
Procédures
- Un prélèvement à la queue sera réalisé à l’âge de P7-10 sur l’ensemble des souris afin de vérifier leur génotype (lien de leur parenté). - Les souris seront traitées par un composé pharmacologique afin de pouvoir étudier notre protéine d’intérêt dans le processus de réparation du système neveux. - Les souris réaliseront des expériences de comportement afin de vérifier leur capacités cognitives et motrices (mémorisation, locomotion). Ces expériences sont non-invasives et non douloureuses. Elles se feront sur animal vigile et dureront chacune maximum 10 min. - Une chirurgie sera réalisée sur des souris sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. L’ensemble des animaux sera mis à mort, 2 mois maximum après la chirurgie afin de récupérer les tissus d’intérêt pour les analyser.
Impact sur les animaux
- Stress de contention dû à la préhension de l’animal lors du traitement - Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie – Troubles moteurs suite à la chirurgie (de la nourriture humide sera placée dans la cage pour éviter les déplacements de l’animal).
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue des expérimentations de chaque procédure afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
Le modèle animal que nous utilisons permet de mimer certains aspects des pathologies que nous étudions (telle que la sclérose en plaques), et pour lesquelles il n’existe pas de traitement. Ce modèle est donc nécessaire pour mieux comprendre ces maladies. Les processus de myélinisation et de réparation de la myéline impliqués dans les maladies démyélinisantes que nous étudions induisent des processus biologiques et physiologiques complexes qui nécessitent l’intervention de multiples acteurs cellulaires. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet. Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer l’inflammation et la démyélinisation, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal.
Réduction
Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique suffisante nécessaire à l’interprétation des résultats. Ce nombre a été évalué́ à partir d’études précédentes (les expériences histologiques et biochimiques nécessitent au moins 6 animaux et les expériences comportementales en nécessitent au moins 10). Ces précautions permettent de limiter les variations inter-individuelles et d’aboutir à des conclusions rigoureuses. Les animaux issus des études comportementales seront ensuite utilisés pour les études des tissus prélevés, nous évitant ainsi d’avoir recours à de nouveaux lots de souris dédiés à cette analyse. De plus, plusieurs tissus d’intérêt seront prélevés sur chaque souris, permettant encore de réduire le nombre d’animal utilisé. Dans le cas où nos premiers résultats ne montreraient pas d’effet d’OLA10 dans la réparation de la myéline, la procédure serait abandonnée. Nous envisageons donc de commencer par des expériences pilotes avec un nombre réduit de souris. Si les résultats sont concluants, les données seront complétées et approfondies en utilisant la totalité des groupes expérimentaux prévus. Ainsi, le lot expérimental serait constitué d’un minimum de 1152 souris, et d’un maximum de 2304. Les animaux contrôles utilisés dans nos procédures sont indispensables pour établir des comparaisons fiables et tirer des conclusions précises. Ces animaux nous permettront de contrôler les variables externes, d’éliminer les biais et de mesurer les effets de nos traitements en les comparant aux groupes expérimentaux. Ils renforcent ainsi la validité de nos conclusions.
Raffinement
Un suivi particulier du bien-être des animaux soumis à la chirurgie sera mis en place et une prise en charge de la douleur sera utilisée si nécessaire. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique post-chirurgical et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà̀ du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité́, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisément d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec l’Homme, en particulier au niveau génétique et neurologique. Elles constituent des modèles de choix pour (1) étudier les mécanismes des pathologies neurologiques humaines et (2) explorer des traitements potentiels de manière pertinente pour ces maladies. Les souris sont des organismes modèle bien établis en recherche biomédicale, et offrent une capacité élevée de reproduction et de cohérence dans les résultats expérimentaux, permettant des interprétations fiables et de tirer des conclusions robustes. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de notre molécule d’intérêt et l’état de la myéline (affectée dans la pathologie étudiée) sont très bien adaptées chez la souris. Les animaux sont utilisés à l’âge d’au moins 7 semaines car il est connu que le processus de myélinisation est terminé à cet âge, ce qui nous permet d’étudier la maintenance de la myéline une fois les gaines achevées autour des prolongements de neurones. De plus, la perte de myéline survient principalement chez le jeune adulte, que ce soit lors de maladies démyélinisantes telle que la sclérose en plaques, ou lors de traumatismes mécaniques type accident de la voie publique. L’âge choisi pour notre modèle permettra donc de mimer au mieux les lésions médullaires survenant chez l’Homme et d’en étudier le processus de réparation. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de ce modèle animal, et ce à l’âge choisi.
Criblage des inhibiteurs intrinsèques aux lymphocytes T dans un microenvironnement tumoral et/ou allogénique
- Recherche appliquée
- Cancers
Deux à cinq injections sous anesthésie et une irradiation de dix minutes : 983 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour analyse post-mortem de leurs organes. Chacune porte une tumeur. Le projet cherche à identifier les molécules qui freinent les lymphocytes T dans un environnement tumoral, pour renforcer les thérapies cellulaires anticancéreuses. Les effets subis tiennent en trois fragments de phrase, effets liés aux tumeurs, aux injections et aux irradiations avec risque de maladie du greffon contre l'hôte, et aucun chiffre ne vient étayer l'effectif de 983 animaux.
Objectifs
Les lymphocytes T (ou cellules T) sont des acteurs clés de l'immunité contre le cancer. Le transfert de lymphocytes T dirigés contre les tumeurs représente une nouvelle thérapie majeure, permettant à la fois d’éradiquer directement la tumeur mais aussi de constituer une protection sur le long terme contre les rechutes. Cependant, leur prolifération (persistance et taux) peut être altérée dans un environnement immunosuppresseur, tel que le site tumoral lui-même ou par le système immunitaire de l’individu receveur. Nous proposons ici d’identifier de manière non biaisée et systématique les inhibiteurs spécifiques de ces cellules T dans ces environnements immunosuppresseurs dans le but de potentialiser de nouvelles générations de thérapies cellulaires. Nous cherchons à identifier des inhibiteurs de l’infiltration tumorale de cellules T mémoires pour améliorer l’efficacité des thérapies anti-tumorales. De plus, nous explorons la résistance des cellules T à la destruction par le système immunitaire du receveur dans le but de générer des thérapies cellulaires universelles à partir de donneurs sains de lymphocytes T.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles therapeutiques optimisant l'efficacité des thérapies cellulaires T. Ce projet va aussi permettre de répondre à des questions fondamentales pour mieux comprendre et comparer le comportement des cellules T CD4 et CD8 in vivo. Au final, les résultats attendus pourraient permettre d'améliorer la prise en charge de certains cancers humains.
Procédures
Deux à cinq injections (5 minutes) sur animaux anesthésiés. Irradiations (10 minutes): une par animal, pour certains animaux.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à la présence de tumeurs (une par animal). Effets liés à des injections. Effets liés aux irradiations (risque de maladie du greffon contre l'hôte).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour faire des analyses post-mortem sur les organes d'intérêt.
Remplacement
Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement immunosuppresseur auquel est soumis le système immunitaire in vivo. En effet, le système immunitaire est très compartimenté entre les organes lymphoïdes et les tissus avec une régulation des flux de cellules et des signaux (cytokines, chimiokines) très précise entre ces différents compartiments. De plus, l’utilisation d’un mode de sélection puissant in vivo nous permet d’identifier les inhibiteurs majeurs et non-redondants des cellules T, avec une relevance clinique immédiate.
Réduction
Nous pratiquerons le minimum d'expériences permettant à la fois d'être certain de la reproductibilité des phénomènes observés en assurant la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale du modèle employé. Nous allons effectuer des tests statistiques pour analyser la croissance tumorale et le suivi des souris.
Raffinement
Le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. Les souris sont anesthésiées pour les injections et l'imagerie. Les animaux seront suivis quotidiennement afin d’assurer leur bien-être et pour suivre les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des points-limites ont été établis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins et de la disponibilité de souches congéniques et transgéniques parfaitement définies. Nous utiliserons des souris adultes car elles possèdent un système immunitaire mature.
Etude de l’impact d’une exposition fœto-maternelle au chlordécone sur le système nerveux nigro-strié de la souris et lien avec les syndromes Parkinsoniens – EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Seize heures sans nourriture avant un test d'olfaction de dix minutes : 96 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance légère, toutes tuées par perfusion intracardiaque pour prélever leur système nerveux central. Quarante-huit subissent trois tests comportementaux nommés, motricité fine, olfaction, anxiété et motricité générale, le premier répété jusqu'à six fois. Les quarante-huit autres partent vers un second établissement pour une heure d'imagerie cérébrale sous anesthésie, dont six minutes de stimulation visuelle et trente-cinq minutes de stimulation pharmacologique. Le projet cherche à savoir si le chlordécone, insecticide interdit dans les années 90 mais toujours présent aux Antilles, favorise les syndromes parkinsoniens, le porteur écartant les organoïdes qu'il juge "prometteurs mais pas encore développés au laboratoire".
Objectifs
Le chlordécone est un insecticide organochloré utilisé aux Antilles pour lutter contre le charançon noir, un insecte ravageant les bananeraies. Compte tenu notamment de sa neurotoxicité à des doses élevées cet insecticide a été interdit dans les années 90. Malheureusement, cet insecticide est très persistant et a contaminé durablement l’environnement, les animaux et la population Antillaise. Pour l’heure les effets neurologiques éventuels d’une exposition à long terme sont mal connus. Toutefois, plusieurs éléments suggérant un effet délétère existent, notamment sur le neuro-développement chez les jeunes garçons nés de mères exposées. De plus, l’heptachlore, un autre insecticide organochloré à l’origine d’une contamination environnementale et humaine à Hawaï a un effet délétère chez la souris dans les régions du cerveau atteintes lors de la maladie de Parkinson et a été associé à des lésions cérébrales chez l’homme. L’objectif scientifique du projet est l’étude de l’effet sur la viabilité et la physiologie des neurones du système nerveux central chez des souris après une exposition au chlordécone par voie alimentaire chez la souris adulte d’une part et d’autre part après une exposition au chlordécone au cours de la période foeto-maternelle. Il s’agit d’un projet multisite qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La finalité de ces approches est d’évaluer un lien potentiel entre une exposition au chlordécone et le déclenchement ou l’accélération de la maladie de Parkinson et de documenter les évènements physiopathologiques associés à ce mode d’exposition.
Procédures
Dans l’établissement utilisateur 2 : l’Imagerie cérébrale est réalisée une fois sur 48 animaux : elle est réalisée sous anestésie générale. La procédure complète dure environ 1 heure et comprends 6 minutes de stimulation visuelle et 35 minutes de stimulation pharmacologique via une injection intra-péritonélae. Dans l’établissement utilisateur 1 : les 48 autres animaux sont soumis à trois tests comportementaux : le premier test mesurant la motricité fine dure 10 minutes et est répété 6 fois (3 habituations et 3 tests) ou 2 fois (1 habituation et 1 test) selon le groupe d’étude, le second test évaluant les capacités d’olfaction dure 10 minutes (après une privation de nourriture de 16 heures) et est répété 2 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude et le dernier test mesurant l’anxiété et la motricité générale dure 15 minutes et est répété 3 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude.
Impact sur les animaux
Une procédure expérimentale similaire a déjà été mise en oeuvre au laboratoire sur une durée de 4 mois mais à l’aide d’une exposition par injection intrapéritonéale et aucun signe de souffrance n’a été détecté, pas de perte de poids ni de décès chez les souris mâles exposées. Les modalités d’exposition sont présumées ne pas induir d’effets indésirables. L’ensemble des interventions sont susceptibles d’engendrer des nuisances de classes légères aux animaux : -Les tests comportementaux peuvent potentiellement induir un stress pour les animaux -Les perfusions intra-cardiaque représentent un risque de souffrance lors de l’injection des produits anésthésiants -Le transport des animaux vers le second etablissement utilisateur peut induir un stress -L’anesthésie, la contention et la stimulation chimique lors de la réalisation de l’imagerie cérébrale peuvent induir à la fois un stress de l’animal et de la souffrance
Devenir
L'objectif de ce projet est l'étude de l'effet neurotoxique du chlordécone, pour ce faire il est nécessaire d'euthanasier les animaux afin de disposer du système nerveux central.
Remplacement
A ce jour, le remplacement complet de ce modèle d’étude n’est pas envisageable. Il existe des modèles d’étude utilisant des lignées de cellules neuronales mais ces derniers ne permettent pas d’étudier l’effet d’une exposition sur les interconnexions neurales ou l’impact sur les cellules gliales. Des travaux plus récent proposent l’utilisation d’organoïdes, ces approches sont prometteuses mais pas encore dévelopées au laboratoire.
Réduction
Le nombre de souris est réduit jusqu’au nombre d’animaux minimal permettant d’attendre des résultats statistiquement significatifs dans les différentes approches proposées.
Raffinement
Conformément aux exigences de raffinement, les expérimentations ont été optimisées afin de réduire la douleur au minimum, les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans un environnement enrichi. En début de procédure, à la réception des animaux au laboratoire, un temps d’acclimatation d’environ 2 semaines est respecter. Un temps d’acclimatation est également respecté lors du transfert des animaux dans le second établissement utilisateur. Pour les animaux soumis aux tests comportementaux une étape d’habituation est également prévue. De plus, le personnel est attentif à la planification de ces tests afin de ne pas soliciter plus de 3 fois les animaux dans la même semaine. Cette alimentation supplémentée en Chlordécone n’a jamais été utilisée dans notre laboratoire en conséquence la quantité de nourriture ingérée par cage chaque semaine sera monitorée en plus du suivi du poids des animaux afin d’identifier le plus tôt possible un défaut d’appétence des croquettes
Choix des espèces
Les souris utilisées sont des souris conventionnelles C57Bl/6, cette lignée de souris est fréquemment utilisée dans les études du système dopaminergique. En effet, la physiologie de cette population neuronale est proche de celle de l’espèce humaine et la taille de sa population autorise des dénombrements précis. Par ailleurs cette lignée a déjà été utilisée dans notre laboratoire, nous pourrons ainsi comparer les résultats obtenus avec nos premiers résultats après deux et quatre mois d’exposition par injection intra-péritonéale. Le projet prévoit d’utiliser des souris adultes à l’âge de 2 mois au début du protocole d’exposition, ceci nous permettra de comparer les résultats de cette voie d'exposition avec notre projet précédent dans lequel les souris avaient subi une exposition similaire mais par voie intrapéritonéale. Le deuxième groupe d'animaux est constitué de souris exposées tout au long de la période de gestation et maintenues soit jusqu’à la fin de la période de sevrage soit jusqu'à l'âge de 2 mois. Cette partie du projet permettra d'obtenir des données quant à l'effet d'une exposition au chlordécone au cours de cette période du dévellopement.