Procédures légères

Tuées quand leur génotype ne présente pas d'intérêt, gardées vivantes dans le cas contraire : sur les 3 113 souris de ce projet d'élevage, 2 823 sont conservées pour être utilisées dans d'autres projets. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et consistent, pour une partie des animaux, en un prélèvement de trente secondes à l'oreille pour lire leur génotype. Le projet sert à purifier le fond génétique d'une lignée modifiée pour ne plus produire un acide aminé, lignée dont les souris perdent du poids et voient leur fonction cardiaque se dégrader sous régime pauvre en protéines. Le porteur affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour cette physiologie intégrée et que la souris est la seule espèce permettant de choisir le lieu et le moment exacts de la mutation.

Objectifs

Depuis plusieurs années, l’intérêt s’est porté sur les propriétés régulatrices des acides aminés. En effet, différents travaux ont montré qu’un acide aminé particulier avait des effets sur plusieurs fonctions de l’organisme, comme sur la fonction musculaire, la fonction cardiaque, le système immunitaire, le métabolisme glucidique,... Cependant, dans toutes les études réalisées jusqu’alors sur cet acide aminé, celui-ci était apporté par voie exogène. Les effets de cet acide aminé endogène, c’est-à-dire produit par l’organisme, et plus particulièrement dans un organe précis, n’ont quant-à-eux jamais été étudiés. Pour palier cela, nous avons développé une lignée de souris qui n’exprimait pas le gène de l’enzyme responsable de la production de cet acide aminé, et qui ne produisait donc pas cet acide aminé au niveau de l’organe voulu. A l’aide de ce modèle, nous avons mis en évidence que l’absence de cet acide aminé au niveau plasmatique (via l’absence de production), lors d’un régime standard, n’avait pas d’effet sur les animaux. En revanche, sous régime faible en protéines, l’absence de cet acide aminé au niveau plasmatique entrainait une importante perte de poids chez les animaux (masse maigre et masse grasse) ainsi qu’une forte altération de leur fonction cardiaque. Cependant, le rôle majeur de cet acide aminé en cas de régime hypoprotéique, et non sous régime standard, sur le métabolisme protéino-énergétique et sur le système cardiovasculaire n’est pas encore totalement compris. Lorsqu’on possède une lignée de souris transgéniques, il est nécessaire, pour éviter une dérive génétique, de purifier le fond génétique de ces souris en les croisant avec des souris sauvages ayant un fond génétique « pur ». Le but de ce projet-ci est donc de purifier puis de conserver notre lignée de souris génétiquement modifiées. Pour cela, nous devons effectuer un génotypage invasif afin de définir les animaux qui comportent la modification génétique et ceux qui ne la possèdent pas.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de purifier le fond génétique de notre lignée de souris transgénique, puis de conserver nos 2 lignées de souris de façon à poursuivre les investigations pour une meilleure compréhension du rôle de notre acide aminé d’intérêt dans les différentes fonctions de l’organisme.

Procédures

Une partie des animaux sera prélevée au niveau de l’oreille pour génotypage (durée : 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont les suivantes : stress lié au prélèvement d’un morceau de l’oreille pour le génotypage.

Devenir

Certains animaux sans génotype d’intérêt sont mis à mort et les autres sont conservés pour une utilisation continue dans les projets (2823 souris).

Remplacement

Le modèle animal que nous souhaitons conserver est utilisé dans des projets qui étudient les conséquences d’une diminution de la concentration d’un acide aminé au niveau plasmatique (via la suppression de l’enzyme permettant sa production) sur différentes fonctions de l’organisme, et notamment le métabolisme protéino-énergétique. Le recours à des modèles alternatifs comme des cellules en culture n’est, dans l’état actuel des connaissances, pas possible parce que nous nous situons dans le domaine de la physiologie intégrée. L’objectif des projets qui utilisent ce modèle de souris transgéniques est de mieux comprendre comment cet acide aminé module différentes fonctions de l’organisme au niveau corps entier. Dans ce but, un modèle in vivo est indispensable. Le choix de la souris se justifie car c’est la seule espèce qui permet de créer des animaux transgéniques pour lesquels nous pouvons choisir le lieu exact de la mutation génétique, ainsi que le moment précis où nous voulons que celle-ci apparaisse.

Réduction

Comme un des gènes que nous ajoutons au génome des souris transgéniques doit absolument rester à l’état hétérozygote, nous devons obligatoirement conserver les 2 lignées distinctes. Cependant, tous les calculs ont été effectués de façon à ajuster au maximum les accouplements et les animaux à conserver pour la purification du fond génétique de la lignée dans laquelle notre gène d’intérêt est marqué et la conservation de ces 2 lignées.

Raffinement

Les animaux seront en collectivité, en cages ouvertes, permettant aux individus de sentir la présence de leurs congénères, avec un milieu enrichi par l'ajout d'objets dans les cages (tunnels, abris en carton...). De plus, nous utiliserons des points limites gradés précis et adaptés permettant de suivre objectivement l’état général des animaux, et d’agir rapidement en cas de problème. Enfin, les expérimentateurs/soigneurs ont été formés aux différentes techniques utilisées dans ce protocole, et ont développé les compétences permettant de respecter le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le recours à l’utilisation de lignées cellulaires n’est, dans l’état actuel des connaissances, pas réalisable parce que nous évoluons dans le domaine de la physiologie intégrée et nous nous inscrivons dans une approche fonctionnelle du métabolisme. L’objectif des projets utilisant ces lignées de souris est de mieux comprendre le rôle d’un acide aminé endogène dans la régulation de l’équilibre protéino-énergétique au niveau corps entier. Dans ce but, un modèle in vivo est indispensable. Le choix de la souris se justifie car c’est la seule espèce qui permet de créer des animaux transgéniques pour lesquels nous pouvons choisir le lieu exact de la mutation génétique, ainsi que le moment précis où nous voulons que celle-ci apparaisse. Les animaux seront mis en accouplement à l’âge de leur maturité sexuelle, soit 8 semaines.

Réduire les troubles digestifs du sevrage et l'usage d'antibiotiques dans les élevages de lapins : c'est à cette fin qu'une phéromone de synthèse est testée sur 6 lapines et 48 lapereaux, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque lapereau est immobilisé et piqué à la veine d'une patte arrière à l'état éveillé, jusqu'à six fois à raison d'une par semaine, et trente-deux d'entre eux vivent seuls en cage grillagée pendant trente-cinq jours, vingt-trois heures par jour en semaine et vingt-quatre le week-end. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel peut provoquer des comportements anormaux et une baisse d'activité, et que la collecte hebdomadaire de leurs fèces molles les prive d'un aliment qu'ils consomment normalement. Les 48 lapereaux sont tués au trente-cinquième ou au soixante-dixième jour pour prélever leur intestin, les 6 mères étant gardées vivantes, jeunes et en bonne santé, pour de futures procédures.

Objectifs

Le bien-être des lapins domestiques est une préoccupation croissante en Europe. Qu'ils soient des animaux de compagnie ou d'élevage, ils sont souvent soumis à des situations stressantes comme la manipulation, les changements d'environnement, les rencontres avec d'autres lapins, les déplacements ou les visites chez le vétérinaire. Il est crucial d'améliorer l'élevage des lapins pour les rendre plus résistants et mieux adaptés à leur environnement. Aujourd'hui, l'élevage vise à assurer leur bien-être, à optimiser leur alimentation, à renforcer leur système immunitaire et à réduire l'usage des antibiotiques. Le microbiote (l’ensemble des virus, bactéries, champignons) intestinal des lapins joue un rôle vital dans ces objectifs. Il influence la digestion, le métabolisme, la santé intestinale, l'immunité et même le fonctionnement cérébral. Les premières semaines de vie sont essentielles pour le développement du microbiote car c'est à ce moment-là que l'intestin des lapins est colonisé par des micro-organismes. Ce projet de recherche examine si l'utilisation de phéromones apaisantes maternelles durant les premières semaines de vie des lapereaux, notamment lors de moments tels que la séparation de la mère, le sevrage et le mélange d'animaux, peut réduire le stress et influencer la composition du microbiote intestinal. Des études antérieures suggèrent que les phéromones pourraient influencer le microbiote. Cette recherche vise à approfondir ces connaissances en examinant l'effet des phéromones sur différentes espèces d'élevage, y compris les lapins, qui sont particulièrement sujets à des problèmes intestinaux. Réduire l'usage d'antibiotiques dans l'élevage des lapins nécessite de nouvelles approches pour maintenir leur santé, en particulier pour prévenir les troubles digestifs après le sevrage, liés à des déséquilibres dans le microbiote intestinal et/ou à une immaturité de l'intestin et/ou du système immunitaire. Cette étude vise à déterminer si l'exposition des lapereaux aux phéromones pendant leurs premières semaines de vie peut favoriser le développement d'un microbiote intestinal sain, ainsi que la maturation et le bon fonctionnement de leur système digestif et immunitaire. Pour ce faire, différents aspects seront étudiés, comme la composition du microbiote intestinal, la fonction immunitaire, la structure de l'intestin, la capacité de l'intestin à agir comme barrière protectrice, les capacités digestives, ainsi que le comportement des animaux.

Bénéfices attendus

Le bien-être des lapins de compagnie et d'élevage est de plus en plus important en Europe. Par exemple, dans les élevages de lapins, les maladies intestinales restent une grande menace. Le stress peut affaiblir le système immunitaire, entraînant des réponses immunitaires moins efficaces. Cela peut causer des problèmes digestifs après le sevrage, une période de grands changements pour les lapins. Leur système immunitaire n'est pas encore complètement développé à ce stade. Le microbiote intestinal joue un rôle crucial dans le développement du système immunitaire et digestif. Une idée intéressante pour améliorer la santé des lapins, et prévenir les maladies intestinales, est de favoriser un bon microbiote. Utiliser une phéromone apaisante maternelle de lapin pourrait aider à réduire le stress et à améliorer leur bien-être. Ce projet vise à montrer comment cette phéromone peut aider à développer un microbiote intestinal sain et diversifié, renforçant ainsi les défenses immunitaires et digestives et réduisant les effets du stress. À long terme, cela pourrait réduire l'utilisation d'antibiotiques chez les animaux domestiques, contribuant ainsi à lutter contre l'antibiorésistance et à améliorer les pratiques d'élevage, conformément au concept "Une seule santé".

Procédures

Tous les lapereaux (48 au maximum) subiront au moins une fois une immobilisation et un prélèvement sanguin réalisé sur animaux éveillés. Cette intervention (immobilisation et prise de sang) devrait être d'une durée inférieure à 10 minutes/lapin. Pour deux tiers des lapereaux (32 au maximum), cette intervention (immobilisation et prise de sang) sera répétée encore 5 fois, à raison d'une fois/semaine, jusqu'à la fin de la procédure au 70ème jour. Deux tiers des lapereaux (32 lapereaux au maximum) seront hébergés individuellement, toutefois sans isolement visuel, olfactif et auditif d'avec les autres lapins, et dans des cages métalliques grillagées spacieuces fournies avec du matériel d'enrichissement, pendant 35 jours, à raison de 23h maximum par jour les jours de semaine, et 24h par jour le week-end. En effet, les lapereaux issus d’une même portée (pour assurer la compatibilité avec les autres lapins) seront sortis de leurs cages et regroupés dans un « parc d’activités » (enclos sur 2 niveaux, avec paille, matériel à ronger, jouets, tunnel, rampe, cabane) pour leur permettre exercice physique et socialisation avec les autres lapins et les habituer à la manipulation, à raison d’1h/jour minimum, tous les jours de semaine.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les nuisances attendues pour les animaux sont représentées par : (i) les conditions d’hébergement puisque dans la phase 2 de l’étude, les animaux seront hébergés individuellement (sans isolement visuel, auditif et olfactif) au-delà de 24h. Cela peut conduire à l’apparition de comportements anormaux chez les animaux, une baisse de leur activité physique et à une altération de leur bien-être ; (ii) par la privation d’une partie de leurs fèces molles lors des prélèvements hebdomadaires de ceux-ci, empêchant leur consommation si celle-ci se met en place avant la fin de l’étude, pouvant possiblement altérer les apports nutritionnels au lapin ; (iii) par la manipulation et la contention des lapereaux lors des pesées et prises de sang dans la phase 2, possiblement sources de stress psychologique; (iv) par l’introduction d’une aiguille dans la veine de la patte arrière sur animal éveillé lors des prises de sang dans la phase 2, qui peut être source de douleur et possiblement créer un hématome sur le site du prélèvement; (v) par la piqûre pour l'anesthésie préalable à l’injection d’euthanasiant lors de la mise à mort des animaux (au 35e et 70e jour) qui peut être source de douleur.

Devenir

Les 6 lapines gestantes puis mères n'auront subi qu'une procédure légère (exposition au traitement pendant 45 jours, et seulement pour la moitié d'entre elles de surcroit, le groupe placebo n'étant pas exposé à la phéromone apaisante), elles seront encore jeunes, attendues en bonne santé, et donc pourront être réutilisées dans de futures procédures. Tous les laperaux (48 individus au maximum) seront mis à mort au cours de la procédure (soit au 35ème jour pour 1/3 d'entre eux, soit au 70ème jour pour 2/3 d'entre eux) car l'étude implique des prélèvements léthaux, qui seront réalisés post-mortem: tissus intestinaux (section et muqueuse de l'iléon) et contenu intestinaux (digesta du caecum et de l'iléon). Ces prélèvements seront utilisés dans des analyses biologiques visant notamment à déterminer la composition du microbiote (proportion et identité des différentes bactéries), la présence de certaines espèces bactériennes favorables, la structure/architecture de la muqueuse intestinale, à mesurer l'expression de certains gènes modulant le système immunitaire et la fonction barrière intestinale.

Remplacement

Il s’agit d’une étude de recherche fondamentale investiguant les effets de la phéromone apaisante de lapin sur le comportement, les paramètres d'élevage, la physiologie des systèmes digestifs et immunitaires, et le microbiote (communauté des micro-organismes) du lapin, le tout formant des systèmes biologiques interdépendants et s’influençant mutuellement. En tant qu'étude de physiologie, elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitement phéromonal est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organisme entier pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle. Cela nécessite donc l’implication d’êtres vivants, dans ce cas des lapins.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans l'étude est déterminé par des calculs statistiques pour détecter un effet significatif du traitement, basés sur des études précédentes. En fonction des données et des tests, 3 à 12 unités par traitement sont nécessaires pour observer une différence significative entre les groupes (placebo vs. phéromone). Dans la phase 1, les lapereaux sont logés ensemble, donc l'unité est la cage/portée en raison de la collecte des fèces qui ne peut être individualisée. Chaque groupe comprendra au moins 3 lapines gestantes pour garantir une variété génétique et une représentativité des résultats et permettre l’analyse statistique. Cela signifie que 18 à 24 lapereaux naîtront ensuite dans chaque groupe (selon le taux de naissance et de mortalité des lapereaux). A la fin de la phase 1 et avant la phase 2, un tiers des lapereaux sera mis à mort, laissant 12 à 16 lapereaux pour être logés individuellement et collecter leurs fèces de manière individuelle. Tous les paramètres mesurés seront alors rapportés à chaque lapereau qui est ici l’unité. Les analyses statistiques compareront les traitements sur les paramètres biologiques. Des modèles statistiques seront utilisés, avec des analyses multivariées dans la phase 2. Des précautions seront prises pour éviter les biais (randomisation, aveuglement des traitements, etc.).

Raffinement

Les cages, métalliques à barreaux, sont fournies d’une litière, une plateforme/abri, du matériel à ronger (buchettes en bois, boules en osiers, balles de foin, balle en plastique). Dans la phase 1, une boite à nid à rebords hauts avec litière est fournie aux lapines gestantes. Dans chaque salle sont réglés les paramètres nécessaires à l’espèce en termes de température, luminosité, ventilation et humidité. Pour compenser l’hébergement individuel dans la phase 2, les cages seront les unes à côté des autres pour permettre le contact visuel, olfactif et auditif entre les lapins. De plus, lors de cette phase, les lapereaux issus d’une même portée seront sortis de leurs cages et regroupés dans un « parc d’activités » (enclos sur 2 niveaux, avec paille, matériel à ronger, jouets, tunnel, rampe, cabane) pour leur permettre exercice physique et socialisation et les habituer à la manipulation, à raison d’1h/jour minimum, tous les jours de semaine. Afin de limiter la réaction de peur des lapins, l’opérateur frappe 3 fois à la porte pour avertir de son entrée. Aussi, des séances de socialisation (caresser les lapins dans leur cage) seront prévues pour limiter la peur des lapins durant la sortie de la cage et des manipulations. Les prélèvements sanguins respectent les recommandations en termes de volumes et fréquences, et sont effectués par un vétérinaire et/ou un opérateur expérimenté, toujours en binôme avec un autre operateur formé à la contention. Les prises de sang se déroulent dans une salle différente à l’élevage, loin des autres lapins, dans une ambiance calme. Pour éviter la réaction de douleur du lapin à la perforation de la peau, un gel anesthésique local est appliqué avant la ponction sanguine. Une serviette pourra être utilisée pour mieux contenir le lapin et diminuer sa peur. La pesée des lapins provoque peu de stress car les animaux sont introduits dans une boite qui est posée sur la balance, évitant ainsi la contention des animaux. La pesée servira aussi à suivre la croissance des animaux et détecter d’éventuels problèmes de santé. De même, lors du recueil des féces molles au crépuscule des lapins, l’opérateur notera si des comportements anormaux (par exemple, rongement des barreaux) se manifestent à ce moment particulier d’activité plus élevée des lapins.

Choix des espèces

La phéromone apaisante testée est une version artificielle de la phéromone que les mères lapines produisent pour calmer leurs petits après la naissance. Nous avons choisi d'étudier les lapins car ce sont des mammifères herbivores à un seul estomac, souvent utilisés en laboratoire et pour lesquels nous disposons de nombreuses méthodes d'analyse validées. Les résultats de cette recherche pourraient également être appliqués et bénéficier aux lapins de compagnie et d'élevage en améliorant leur santé intestinale et leur bien-être. Nous utilisons des lapines gestantes adultes car elles sont sexuellement matures, et des lapereaux juvéniles, depuis la naissance jusqu'à 10 semaines, avant qu'ils ne soient sexuellement matures. Cette période d'âge jeune est cruciale pour le développement de leur microbiote intestinal, influencé par la génétique, l'alimentation, l'hygiène, l'environnement et le stress. Le sevrage, qui marque le début de l'alimentation solide, peut être stressant pour les lapereaux, perturbant leur flore intestinale et leur santé digestive et immunitaire. Nous couvrons donc tous les moments importants pour comprendre comment le microbiote intestinal se forme et influence le développement des systèmes digestif et immunitaire.

Les souris de ce projet sont immunodéprimées, ce qui les expose à un gonflement, du pus ou un hématome là où la matrice qu'elles reçoivent est implantée. 624 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit sous la peau du dos deux implants contenant des cellules prélevées sur des valves aortiques humaines, retirés quatorze jours plus tard sous anesthésie, pour repérer quelles cellules de la valve forment des vaisseaux sanguins. Toutes sont tuées au retrait, le porteur indiquant que la recherche des implants exige deux grandes cicatrices dorsales et que leur extraction abîme la chair de l'animal, ce qu'il qualifie lui-même de nuisance très importante.

Objectifs

La sclérose valvulaire aortique est le rétrécissement de l'ouverture de la valve aortique due à une atteinte structurelle de la valve cardiaque. C’est un enjeu majeur de santé publique qui touche 2 à 6 % des personnes âgées de plus de 65 ans. Sa prévalence est susceptible de doubler au cours des 50 prochaines années en raison du vieillissement croissant de la population. La sclérose valvulaire aortique est maintenant principalement considérée comme un processus incluant une formation de vaisseaux sanguins pathologiques à l’intérieur de la valve aortique. Ainsi notre projet consiste à comprendre quelles cellules de la valve permettent de former des vaisseaux sanguins, notamment en fonction de leur localisation dans la valve aortique. Le but du projet est d’étudier la capacité des cellules, issues de différentes parties de la valve aortique humaine, à former des vaisseaux sanguins dans un modèle murin. Nous comparerons l’aptitude à former des vaisseaux sanguins les cellules isolées de différentes parties de la valve aortique à des cellules endothéliales de sang de cordon ou de sang adulte connues pour former des vaisseaux sanguins. L’objectif est de mettre en évidence le type cellulaire capable de former de manière la plus importante des vaisseaux sanguins et de rechercher des voies de blocage afin d’envisager des nouveaux traitements de la sclérose valvulaire aortique.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les caractéristiques de fonctionnement des cellules de la valve devrait conduire à une meilleure compréhension des dégénérescences valvulaires et éventuellement proposer des stratégies de modulation des fonctions de ces cellules dans un objectif thérapeutique afin à terme de traiter et/ou de prévenir la sclérose valvulaire aortique.

Procédures

Les souris seront anésthésiées 5 minutes maximum pour les deux injections en sous-cutanée des deux implants 1 fois, chaque injection dure au maximum 20 secondes. Les souris seront anésthésiées 5 minutes maximum pour le retrait des implants au bout de 14 jours.

Impact sur les animaux

Les souris peuvent avoir un inconfort lié à la préhension des animaux et une potentielle douleur au point d’injection de la matrice extracellulaire. Les souris immunodéprimées peuvent avoir au niveau de la zone d’injection de la matrice extracellulaire un gonflement, du pus ou un hématome.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort après la récupération des implants. Malgré le repérage des implants par palpation la recherche des implants nécessite deux grandes cicatrices au niveau dorsal. De plus le retrait des implants abime la chair de l’animal. Ces deux points constituent une nuisance très importante pour l’animal tant au niveau de la cicatrice que de la chair.

Remplacement

Malgré l’existence de nombreux modèles in vitro évaluant les différents processus impliqués dans la capacité des cellules à former des vaisseaux, l’utilisation de modèles in vivo reste indispensable en raison des nombreuses interactions entre les cellules et leurs environnements qui permettent la génération de vaisseaux fonctionnels

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux : -Nous effectuerons en amont des études in vitro afin d’étudier la capacité des cellules à former des tubes. Deux implants seront injectés par animal pour limiter le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux devra être de 5 par condition (soit 10 implants) afin d’avoir des résultats significatifs. Ce nombre a été calculé selon l'expérience acquise dans notre équipe en tenant compte de la variabilité observée lors d'expériences similaires et les données de la littérature. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et d’un environnement enrichi (coton). De plus, l’injection sous-cutanée et le retrait des implants seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux seront surveillés de façon hebdomadaire avec mise en place de points limites qui permettront une prise en charge précoce en cas de douleur ou de souffrance. Si les animaux présentent une douleur ou une souffrance, un traitement analgésique sera administré et la fréquence de surveillance sera augmentée (au minimum 2 fois par semaine).

Choix des espèces

Le système vasculaire murin est proche du système vasculaire humain (vertébré) et la souris est un des modèles les plus utilisés dans la littérature pour l’étude de l’angiogenèse chez un animal adulte (modèle d’angiogenèse tumorale, modèle d’ischémie du membre inférieur). Souris adultes de 6-8 semaines pour que les animaux aient une taille suffisante pour permettre l'injection de deux implants sur le dos.

60 souris âgées de six semaines vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées au quinzième jour pour prélever leurs ganglions. Chacune reçoit deux injections d'antigènes de micro-organismes pathogènes dans le muscle du jarret, avec pesée et surveillance quotidiennes. Le porteur affirme que ce protocole n'entraîne jamais de détérioration de l'état général, puis liste comme effets possibles la boiterie, des grosseurs, des yeux mi-clos, une prostration et un pelage ébouriffé, la mise à mort étant envisagée en cas de nécrose au point d'injection. Les anticorps seront ensuite produits in vitro, et il conclut que la souris reste "irremplaçable" pour cette étape, invoquant notamment des "protocoles bien établis" et un "historique de succès clinique".

Objectifs

Depuis l'attribution du prix Nobel de Médecine en 1983 pour la découverte de la génération et de production d'anticorps monoclonaux, le développement et l'utilisation de ces derniers sont devenus des outils essentiels dans tous les domaines de la biologie, couvrant des questions scientifiques fondamentales jusqu'au développement de traitements des infections. La présente demande d'autorisation de projet vise à obtenir des anticorps de souris spécifiquement dirigés contre des antigènes d'intérêt impliqués dans les mécanismes infectieux de différents pathogènes affectant tant l'homme que les animaux. Ces anticorps de souris spécifiques auront plusieurs objectifs : (1) améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires du cycle de vie des micro-organismes pathogènes, (2) servir de référence en tant qu'outils d'études pour tous les laboratoires ou sociétés internationales travaillant dans le domaine de l'infectiologie, et (3) être utilisés dans le développement de stratégies thérapeutiques visant à lutter contre les agents infectieux émergents. Le processus de génération d'anticorps nécessite une étape d'immunisation des animaux pour susciter une réponse immunitaire permettant d'obtenir ces anticorps. Dans le cadre de l'immunisation, les souris sont injectées dans le muscle du jarret des pattes arrières avec les antigènes d'intérêt. Au bout de 15 jours, les souris sont euthanasiées afin de collecter les ganglions, qui seront utilisés pour développer des anticorps dirigés contre les antigènes d'intérêt. Ces anticorps joueront un rôle essentiel dans les diagnostics et les thérapies à venir contre les agents infectieux.

Bénéfices attendus

Le projet de génération et de production in vitro d’anticorps monoclonaux permettra des avancées à court, moyen et long terme, contribuant tant aux connaissances scientifiques qu'aux bénéfices thérapeutiques pour les êtres humains et les animaux contre des pathogènes infectieux. Les bénéfices à court terme résulteront d'une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires des micro-organismes pathogènes par l'étude et la compréhension de leur cycle de vie. En effet, les anticorps monoclonaux produits in vitro à partir des cellules immunitaires des souris deviendront des outils essentiels pour d'autres laboratoires nationaux et internationaux, facilitant la recherche en infectiologie. À moyen terme, l'identification de nouvelles cibles permettra le développement de thérapies pour lutter contre les maladies infectieuses émergentes. Ces connaissances acquises pourraient conduire à des stratégies thérapeutiques anti-infectieuses innovantes dans le domaine de la recherche médicale. Les impacts à long terme se feront sentir sur la santé publique grâce au développement de moyens préventifs et curatifs plus efficaces contre les agents infectieux à l'échelle nationale et mondiale. De plus, cela aura un impact positif sur l'environnement en permettant une meilleure compréhension et gestion des maladies infectieuses émergentes, réduisant potentiellement leur l'impact sur les écosystèmes. En résumé, le projet offre des bénéfices immédiats en termes d'avancées scientifiques et d'outils de recherche. À moyen et long terme, il pourrait conduire à des solutions innovantes pour traiter les maladies infectieuses, contribuant durablement à la recherche médicale et ayant des effets positifs sur la santé animale et humaine.

Procédures

Le processus de création des anticorps monoclonaux s'étend sur quinze jours et implique une immunisation chez la souris réalisée par deux injections, chacune d'une durée de 5 secondes, de protéines d'organismes pathogènes visant à stimuler leur système immunitaire. Durant ce protocole, les souris sont surveillées et pesées quotidiennement.

Impact sur les animaux

Ce protocole n'entraîne jamais de détérioration de l'état général des animaux et n'a jamais nécessité la mise en œuvre d'une médication générale dans le but de réduire la douleur, la souffrance ou l'angoisse. Cependant, les effets potentiels indésirables pourraient inclure des symptômes tels que la boiterie, la rougeur, la formation de grosseurs, des yeux mi-clos, une prostration, ou encore un aspect ébouriffé du pelage.

Devenir

Tous les animaux qui suivront le protocole d'immunisation seront euthanasiés afin de prélever leurs cellules immunitaires, permettant ainsi de générer des anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes des pathogènes étudiés.

Remplacement

Il est important de souligner que l'utilisation de souris pour la production d'anticorps monoclonaux peut être justifiée dans de nombreux cas, mais il est tout aussi essentiel de reconnaître qu'il existe des situations où d'autres alternatives peuvent être envisagées. Cependant, pour certains scénarios, les souris restent irremplaçables pour les raisons suivantes : (1) Une similitude avec la réponse immunitaire humaine : Les souris partagent une similitude dans leur réponse immunitaire avec les humains, ce qui en fait un modèle précieux pour la production d'anticorps monoclonaux destinés à des applications médicales. (2) Des protocoles bien établis : les techniques de génération d'anticorps monoclonaux chez la souris sont éprouvées et bien établies, avec des protocoles standardisés qui ont prouvé leur efficacité au fil des décennies. (3) Une polyvalence : les souris offrent une polyvalence d'applications, couvrant un large éventail de besoins de recherche et de développement thérapeutique, ce qui peut ne pas être aussi bien accompli avec d'autres modèles. (4) Historique de succès clinique : de nombreux anticorps monoclonaux développés chez la souris ont démontré leur succès clinique, soulignant leur efficacité dans la pratique médicale. (5) Une standardisation des résultats : en raison de la standardisation des protocoles et de la disponibilité de souches de souris bien caractérisées, les résultats obtenus avec les souris sont souvent plus prévisibles et reproductibles. Bien que des alternatives telles que les cellules humaines, les cellules animales autres que les souris, ou même des techniques in vitro soient envisageables dans certaines circonstances, la complexité du système immunitaire et les exigences spécifiques des applications médicales rendent souvent les souris indispensables dans la production d'anticorps monoclonaux.

Réduction

Le protocole proposé dans cette demande d'expérimentation permet de réduire de moitié le nombre de souris utilisées par rapport au protocole de référence. De plus, il réduit le nombre d'injections nécessaires à seulement 2, comparé à 6 dans le protocole précédent, et raccourcit la période d'expérimentation à quinze jours au lieu de deux mois. Ce protocole d'immunisation requiert l'utilisation de deux souris pour obtenir des anticorps dirigés contre l'antigène d'intérêt.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation, en groupes de 2 à 5 individus, avec un environnement maintenu à des niveaux adéquats de température, d'éclairage, de bruit, et doté d'une litière ainsi que de matériaux de construction de nids adaptés à l'espèce. L'injection des antigènes dans les jarrets permet de maintenir une excellente mobilité des animaux. En cas de signes de douleur tels que la boiterie, la rougeur, la formation de grosseurs, des yeux mi-clos, la prostration, ou un pelage ébouriffé, un analgésique est administré. Si nécessaire, la réhydratation de l'animal est envisagée par l'injection de sérum physiologique par voie sous-cutanée, et l'accès à la nourriture est facilité en plaçant celle-ci au sol dans la cage. En présence de signes de prostration, d'hypoactivité, ou de piloérection accompagnant une plaie, une infection, ou une nécrose au point d'injection, l'euthanasie est envisagée.

Choix des espèces

Afin d'identifier, de comprendre et de caractériser les mécanismes d'infection des microorganismes pathogènes étudiés, il est nécessaire de disposer d'anticorps monoclonaux spécifiques dirigés contre les facteurs impliqués dans ces mécanismes. Pour obtenir ces anticorps monoclonaux, il est essentiel de passer par une étape d'immunisation d'animaux suffisamment éloignés de l'homme pour générer une réponse immunitaire robuste. La souris est l'espèce de choix depuis la publication du protocole de génération d'hybridomes pour la production d'anticorps monoclonaux en 1975, récompensé par le prix Nobel en 1983. Les souris utilisées dans ce protocole ont un âge de 6 semaines, avec un poids supérieur à 20 g. Ces jeunes souris possèdent un système immunitaire permettant ainsi une meilleure réponse immunitaire.

Un millimètre de queue coupé ou un poinçon dans l'oreille, vers vingt jours d'âge et sous anesthésie générale : 36 000 souris subissent ce prélèvement pour que leur génotype soit lu. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit qu'il n'y aura ni saignement, ni nuisance, ni effet indésirable, tout en indiquant que le prélèvement de poils, moins invasif, n'est pas encore au point pour toutes les lignées et que la biopsie a été retenue pour sa fiabilité. Les souris dépourvues du génotype recherché et les surnuméraires sont tuées par inhalation progressive de CO2, les autres restant en vie pour l'élevage, environ un quart partant vers des projets soumis à autorisation.

Objectifs

Les études faites au sein de notre animalerie nécessitent l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Afin de pouvoir définir le génotype des souris, un génotypage est nécessaire. Après avoir testé différents types de prélèvements sur les animaux, il s’avère que le prélèvement le moins invasif (prélèvement de poils) n’est pas encore au point pour toutes les lignées. Nous devons donc effectuer ce génotypage par biopsie. Ce mode de prélèvement a démontré une meilleure fiabilité que d’autres prélèvements. Afin de s’assurer du bien-être des animaux, ces prélèvements sont effectués sous anesthésie générale au vetflurane et les animaux sont tout de suite remis dans leurs cages d’hébergement pour réveil avec leurs parents.

Bénéfices attendus

Le génotypage permet de connaitre le génotype des animaux et donc de sélectionner les bons animaux pour le projet ou le maintien de lignée

Procédures

Les animaux subiront un prélèvement de 1 mm de bout de queue ou d’un poinçon de l’oreille vers 20 jours d’âge sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Les animaux étant prélevé à un jeune âge et sous anesthésie, la coagulation se fera rapidement, il n’y aura pas de saignement. Les animaux se réveilleront avec leurs parents, il n’y aura pas de nuisances ni d’effets indésirables.

Devenir

Les animaux surnuméraires ou ne possédant par le génotype nécessaire seront mis à mort par inhalation progressive de CO2. Les animaux possédant le bon génotype seront gardés en vie pour le maintien de la lignée ou pour la réalisation de projet ne nécessitant pas de demande d’autorisation de projet. Environ 25 % partiront dans le cadre d'une utilisation continue dans des projets nécessitant une demande d'autorisation de projet

Remplacement

Le génotypage des animaux est indispensable au bon déroulé des études et à la bonne gestion de lignées OGM. Le modèle vivant ne peut donc pas être remplacé.

Réduction

Le génotypage des animaux permet de ne garder que le minimum d’animaux. En effet si la lignée suit la loi de Mendel, nous pouvons supposer du nombre d’animaux possédant le bon génotype issu d’un accouplement. Cela permet donc de ne garder qu’un nombre minimum de parents géniteurs et donc un nombre minimum de petits à génotyper

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permet l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bienêtre des animaux. Les différentes manipulations des animaux et prélèvements seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Afin de diminuer le stress des animaux, le puçage et la coupure du bout de la queue se font en même temps sous la même anesthésie générale par inhalation de vetflurane. Ainsi les animaux ne sont anesthésiés qu’une fois.

Choix des espèces

Au sein de notre animalerie, nous n’effectuons de prélèvements que sur les souris car seules les souris génétiquement modifiées sont mises en accouplement et nécessite un génotypage. Les animaux seront prélevés à l’âges de 20 jours, cet âge permet de pouvoir génotyper les animaux avant la date de sevrage et donc de pouvoir répartir les animaux dans les cages d’hébergement par génotype au moment du sevrage.

Injectées d'hormone dans les sacs lymphatiques la veille de la ponte, les femelles xénopes sont laissées au repos cinq mois avant d'être stimulées de nouveau. Les mâles, eux, sont tués pour prélever leurs testicules et féconder les œufs hors du corps. Sur 170 xénopes utilisés dans des procédures déclarées de souffrance légère, 70 sont réutilisés et 100 tués, pour étudier des enzymes impliquées dans la migration cellulaire, le porteur décrivant une espèce qui fournit "beaucoup de matériel d'étude" avec peu d'animaux mis à mort. Il ne mentionne comme effet indésirable que des nausées et des vomissements en cas de dose hormonale trop forte, et affirme que la stimulation de la ponte ne met pas en danger le bien-être des femelles.

Objectifs

La migration cellulaire est essentielle à de nombreux phénomènes physiologiques tels que le fonctionnement normal du système immunitaire, la cicatrisation des plaies ou encore le développement embryonnaire. De plus, la migration cellulaire est impliquée dans des processus pathologique comme la dissémination des cellules cancéreuses (métastases). Le projet vise à mieux comprendre comment les cellules adaptent des capacités migratoires et comment cette migration est ensuite régulée via des interactions entre cellules ou via des informations présentes dans l’environnement des cellules. Le projet porte particulièrement sur le rôle d’enzymes de la famille des métalloprotéases matricielles (MMPs). Ces enzymes sont exprimées et sécrétées par de nombreux types cellulaires au cours du développement et chez l’adulte. Elles sont principalement connues pour permettre aux cellules de modifier la matrice extracellulaire et faciliter ainsi la migration et l’invasion. Toutefois, ces enzymes sont aussi détectées à l’intérieur des cellules. Elles ont de nombreux substrats non-matriciels. Enfin, elles présentent des fonctions indépendantes de leurs capacités enzymatiques. Ces fonctions annexes restent peu ou pas caractérisées. Le projet a pour objectif de mieux définir ces fonctions non-canoniques des MMPs et de valider leurs importances physiologiques de façon expérimentale in vivo dans un modèle amphibien, le Xénope.

Bénéfices attendus

A court termes, le projet permet d’obtenir des informations cruciales sur le mode de fonctionnement des MMPs in vivo et leurs rôles sur l’initiation et le contrôle de la migration cellulaire. Ce projet a déjà donné lieu à plusieurs productions scientifiques dans lesquelles nous avons démontré des rôles précoces des MMPs en amont de l’acquisition du phénotype migratoire notamment via la régulation de la polarité cellulaire et/ou le contrôle de l’expression de gènes régulant la transition épithélium-mésenchyme. A long terme, les informations recueillies sur le rôle des MMPs chez l’embryon permettra d’affiner les analyses d’échantillon pathologique (biopsie de tumeur) et contribuera à la mise au point de protocole permettant de moduler leurs activités dans le cadre des pathologies (cancers, fibroses).

Procédures

Stimulation des femelles : La ponte des femelles d'amphibien doit être stimulée par injection d'hormone. Une injection au niveau des sacs lymphatiques est pratiquée la veille du jour de ponte. Cette procédure est suivie d'une période de repose de 5 mois (20 semaines) à l'issu de laquelle les femelles peuvent être à nouveau stimulées. Stimulation des mâles : Les mâles d'amphibien sont injectés au niveau des sacs lymphatiques. Les mâles ainsi injectés sont fertiles pendant quatre semaines. Les testicules sont prélevés chirurgicalement.

Impact sur les animaux

La stimulation de la ponte par injection hormonale peut entraîner des nausées et vomissements si la dose est trop forte et si les animaux injectés sont nourris le jour de l'injection.

Devenir

Le prélèvement des testicules requiert l’euthanasie préalable. La stimulation de la ponte ne met pas en danger le bien-être des femelles, elles sont donc gardées en vie le plus longtemps possible.

Remplacement

Le contrôle de la migration cellulaire est impliqué dans de nombreux phénomènes physiologiques (immunité, cicatrisation) et des pathologies comme le cancer et les inflammations chroniques. Nos objectifs scientifiques (analyse de la migration des cellules) et nos stratégies expérimentales nécessitent de travailler sur des cellules animales dans des systèmes qui permettent des manipulations in vivo et in vitro. Le choix est fait d'utiliser un animal modèle (Amphibien/Xénope) qui fournit beaucoup de matériel d'étude (oeufs fécondés) avec un nombre limité d'animaux mis à mort comparativement aux modèles mammifères

Réduction

Les embryons de Xénopes sont obtenus par fécondation in vitro à partir de testicules prélevés sur des mâles mis à mort. Les testicules sont conservés en milieu de culture, au froid, pendant deux semaines ce qui permet de féconder les pontes de 4 à 8 femelles. Afin de réduire le nombre d’animaux mis à mort, nos études sont complétées par l'utilisation de lignées cellulaires de souris et d'embryons précoces de poulet qui ne nécessitent aucuns animaux mis à mort. A activité scientifique constante, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés de 40% par rapport aux projets de recherche précédents.

Raffinement

Afin de réduire la manipulation des animaux nous avons modifié le protocole de stimulation des femelles par rapport aux projets de recherche précédents. Elle s’effectue désormais en une seule injection la veille de la ponte au lieu de deux injections à 5 jours d’intervalle. Par ailleurs, avant injection les femelles sont pesées afin d’ajuster au mieux la dose d’hormone nécessaire. Cette pesée permet également un suivant sanitaire. Enfin, pour éviter les risques de nausées et de vomissements les animaux sont mis à jeûn le jour de l'injection.

Choix des espèces

Le choix du Xénope est justifié de par la possibilité d'obtenir un grand nombre d'ovocytes (1000 oeufs pondus par femelle) sans mettre à mort les femelles, par opposition à la souris notamment. Par ailleurs, nous avons choisi comme population cellulaire modèle les cellules de la crête neurale. Ces cellules utilisent un programme de développement qui est ensuite réutilisé de façon opportuniste lors des cancers. Ceci en fait un modèle extrêmement pertinent du point de vue physiologique. Cependant, cette population de cellules n'existe que chez les vertébrés ce qui exclut un remplacement du Xénope par un organisme "inférieur" comme la drosophile. Les femelles et mâles sont achetés et utilisées à maturité sexuelle. Ensuite à partir des oeufs fécondés obtenus, nous travaillons uniquement sur des embryons entre les stades 2 cellules et 3 jours de développement (avant acquisition de l'autonomie).