Procédures légères

1 413 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales ou un fragment de tumeur de patient sous anesthésie générale, puis des mesures répétées et des injections de molécules deux fois par semaine sur quatre à six semaines, pour identifier les mécanismes de résistance à l'hormonothérapie du cancer de la prostate. Le porteur affirme que le développement tumoral n'est pas douloureux et n'attend pas de perte de poids. Il revendique un "besoin urgent" de nouvelles cibles et conclut qu'il est "indispensable" d'utiliser la xénogreffe de tumeur de patient.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) représente 1 400 000 nouveaux cas et 375 000 décès dans le monde par an (57 000 cas, 9 000 décès en France). Il est dépisté par mesure du PSA (Antigène Spécifique de la Prostate) et toucher rectal. Aux stades localisés, la chirurgie, la radiothérapie, la Curiethérapie, et des ultrasons sont curatifs. Au stade métastatique, l’hormonothérapie est le traitement de 1ère ligne, avec une problématique de taille, l’échappement hormonal, qui fait que le cancer reprend son développement. En conséquence il est actuellement proposé à ces patients une hormonothérapie de 2ème génération, notamment l’abirotérone ou l’enzalutamide, qui vont bloquer les hormones responsables du développement du cancer de la prostate, en combinaison avec des inhibiteurs de PARP (Poly(ADP-ribose) polymérase), qui représentent une classe de médicaments anticancéreux ciblant les cancers caractérisés par une surexpression des enzymes de type PARP (comme l’olaparib, le talazoparib, ou le niraparib), comme c’est le cas du cancer de la prostate. Pour améliorer la survie des patients de nouvelles avancées sont nécessaires, tant pour le diagnostic que pour le traitement de la maladie, et cela passe également par l’identification des mécanismes de résistance aux thérapies de référence actuelles. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer les mécanismes moléculaires de la résistance à l’hormonothérapie de 2ème génération en combinaison avec les inhibiteurs de PARPet de contourner cette résistance en inhibant les mécanismes moléculaires impliqués. Ces études permettront ainsi de développer des approches thérapeutiques pour le traitement du CaP, dans une logique de médecine personnalisée, c’est-à-dire adaptée aux caractéristiques de chaque patient.

Bénéfices attendus

Notre projet va permettre d’identifier et de contrer les mécanismes de résistances à l’hormonothérapie de seconde génération, notamment l’abiratérone, en association avec les inhibiteurs de PARP (Poly(ADP-ribose) polymérase), actuellement en thérapie de première ligne dans le cancer de prostate résistant à la castration. Les inhibiteurs de PARP, représentent une classe de médicaments anticancéreux ciblant les cancers caractérisés par une surexpression des enzymes de type PARP (comme l’olaparib, le talazoparib, ou le niraparib), comme c’est le cas du cancer de la prostate. Les retombées de notre projet ont ainsi des implications potentielles très importantes pour la clinique. Nos résultats permettront ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer de la prostate. Du fait que les patients deviennent résistants aux thérapies anti-tumorales classiques dans ce cancer, il y a un besoin urgent d’identifier les mécanismes à l’origine de cette résistance, mais bien sur également de découvrir, de développer et de valoriser de nouvelles alternatives thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients aux stades avancés de la maladie. Ainsi, nous pourrons apporter de nouveaux outils pour contenir la maladie, voire l’éradiquer

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales (modèles de xénogreffes de lignées cellulaires humaines) ou un implant tumoral en sous-cutané (modèles de xénogreffes de tumeurs de patients) au cours d’une chirurgie d’implantation sous anesthésie générale. L’intervention dure environ 15 secondes pour l’injection sous-cutané de lignées et environ 5 minutes pour l’implantation du fragment de tissu tumoral. Le volume tumoral sera suivi par mesure de la tumeur (longueur, largeur, profondeur) 2 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse électronique. Pour les traitements ils recevront des injections sous anesthésie générale répétées, sur 4 à 6 semaines, à raison de 2 injections par semaine durant environ 15 secondes, soit entre 8 et 12 injections avec les molécules thérapeutiques.

Impact sur les animaux

Comme il s’agit de xénogreffer des petits morceaux de tissus tumoraux, il est possible qu’il y ait une douleur au site d’incision, et une infection au point de suture. La chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois pour obtenir la taille tumorale initiale, pour l’initiation des thérapies. Une inflammation au site d’injection est aussi possible. En outre, concernant la procédure principale, comme il s’agit d’injections répétées, il peut y avoir un stress à la contention, et lors des injections, mais cela est minimisé par le fait que l’ensemble des gestes est réalisé sous anesthésie générale gazeuse à l’isoflurane, qui permet une induction et un réveil rapide. Cependant, il faut noter que nous avons une très forte expérience de ces protocoles, non seulement dans le développement de modèles CDX avec plusieurs lignées de divers types de cancers, mais également de modèles PDX avec des xénogreffes de près de 1000 tumeurs, et nous restons vigilants afin que les effets indésirables éventuels puissent être minimisés au maximum. Nous n’avons pas reporté de perte de poids, que ce soit dans nos observations ou celles d’autres investigateurs. Idem pour l’alimentation et l’hydratation (qui rejoint le poids), aucune différence n’est notée les animaux continuant à prendre du poids au cours de l’expérimentation de manière tout à fait normale. Aucun impact sur le comportement n’a été non plus répertorié dans ce type d’expérimentations.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expérimentations afin de collecter un maximum de tissus afin de procéder à des analyses complémentaires et soulager les douleurs éventuelles.

Remplacement

Le cancer de la prostate, comme beaucoup de cancer, se caractérise par une grande variabilité cytogénétique entre les individus et hétérogénéité au sein même de la tumeur. La réalisation d'études précliniques fiables nécessite l'utilisation de modèles reproduisant fidèlement ces caractéristiques des tumeurs humaines. Or, les modèles d'étude se basant sur les lignées cancéreuses clonales ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. De même, pour les systèmes de culture 3D en cours de développement qui ne permettent pas encore d’obtenir des résultats projetables à l’homme. Par conséquent, aucune méthode de remplacement pertinente n'existe à ce jour. Il est donc indispensable d’utiliser le modèle de xénogreffe de tumeur de patients, seul capable de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les différentes étapes du projet, mais en permettant les études statistiques, par les tests classiques et adaptés aux expérimentations. Le nombre d’animaux a été calculé statistiquement afin d’être réduit à son minimum tout en permettant d’atteindre les objectifs du projet. Dès que les objectifs seront atteints, ou en absence d’effet des traitements, aucun animal supplémentaire ne sera inclus permettant de réduire encore les effectifs.

Raffinement

Le raffinement sera assuré par un enrichissement des cages pour le confort des animaux (des bâtons à ronger pour limiter les querelles ; des carrés de coton pour une nidification ; des igloos, permettant le jeu et le repos). Les souris seront nourries et hébergées en groupe ; elles ne seront séparées qu'en cas de comportement agressif avec induction de plaies. Nous diminuerons la douleur et l'angoisse liées à la xénogreffe en opérant sous anesthésie gazeuse avec une anesthésie au site d’implantation, et en appliquant une analgésie (Meloxicam 5mg/kg/j en IP pendant 3 jours). Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. Il est à noter que le développement tumoral n'est pas douloureux pour les animaux. De plus, nous avons établi des points limite qui mettront fin à l’expérimentation en cas de souffrance et d’inconfort des animaux.

Choix des espèces

Les pathologies cancéreuses en général se caractérisent par une grande variabilité cytogénétique (variation de l’ADN des cellules tumorales) entre les individus et sont généralement hétérogènes au sein même de la tumeur. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales qui ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Par ailleurs, les modèles expérimentaux in vitro ne prennent pas en compte le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Ainsi, malgré le développement de cultures 3D dont la mise en place reste difficile, les modèles animaux s'avèrent donc indispensables pour la recherche translationnelle en oncologie. Le modèle expérimental décrit dans ce projet nécessite l'utilisation d'animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d'un tissu étranger. Les greffes seront réalisées sur des souris jeunes âgées de 5 à 6 semaines afin d’avoir un système immunitaire encore très peu mature, permettant d’assurer une prise de greffe optimale.

92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent le retrait chirurgical des ovaires sous anesthésie générale pour induire une ostéoporose, puis jusqu'à trois séances d'imagerie par an, pour étudier le lien entre une anomalie génétique de la mucoviscidose et la perte osseuse. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque de mortalité et prévoit d'abandonner la procédure si ce risque dépasse certains seuils. Il affirme qu'à sa connaissance il n'existe "pas d'alternative non animale efficace" et que les régulations en jeu ne sont pas modélisables sans un "animal complet".

Objectifs

L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Les patients souffrant de mucoviscidose présentent une forme particulière d’ostéoporose appelée maladie osseuse liée à la mucoviscidose. Cette maladie est due à un problème génétique dont l’effet précis sur l’os n’est pas aujourd’hui connu. Ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs a pour objectif donc de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de la problématique génétique sur la qualité osseuse, en étudiant les os de souris où l’ostéoporose sera induite par le retrait chirurgical des ovaires au cours du temps. Ces approches expérimentales permettent de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause chez la Femme, et de façon plus globale dans les deux sexes en lien avec le vieillissement de l’organisme. Ce travail permettra donc, à terme, de mieux comprendre l’impact de la problématique génétique sur les altérations osseuses dans des populations de plus en plus agées et donc de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre la pathologie osseuse liée à la mucoviscidose et plus généralement contre l’ostéoporose.

Bénéfices attendus

L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse, ou des substituts des hormones, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques et ne présentent qu’une efficacité limitée chez les patients souffrant de mucoviscidose. Les résultats de cette étude permettront une meilleure compréhension de l’impact de la problématique génétique dans l’établissement de l’ostéoporose post-ménopause ou liée à l’age et pourront orienter vers de nouvelles pistes thérapeutiques potentielles.

Procédures

Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30 min sous anesthésie générale pour la procédure de retrait des ovaires au sein du premier établissement utilisateur. Ils seront également soumis au maximum à trois séances d’imagerie de 30 min, sous anesthésie générale, par an, au sein du second établissement utilisateur

Impact sur les animaux

Toute approche chirurgicale implique un risque de mortalité lors de l’intervention et après. Néanmoins, si la mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie est supérieure à 10% pour le groupe d’animaux ne portant pas de problème génétique et supérieure à 50% pour le groupe portant l’anomalie génétique, la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée après les interventions chirurgicales est attendue dans les tous premiers jours avant une reprise de poids classique ensuite. A notre connaissance, aucun autre effet indésirable n’est attendu.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner à haute résolution et analyses histologiques et immunohistochimiques et biomécaniques.

Remplacement

A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace qui permet d’étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme, ou en lien avec le vieillissement de l’organisme. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.

Réduction

Sur la base de nos expériences précédentes, un nombre optimisé d’animaux (10 par groupe) sera employé pour ces procédures afin que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique en fin d’expérimentation. Une logique d’arrêt des procédures est de plus mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux par groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Des tests statistiques adaptés à nos effectifs seront utilisés.

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de d’acclimatation d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton...) permettant aux animaux d'améliorer leur cage. A chaque intervention les animaux seront endormis afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’intervention chirurgicale pour la procédure portant sur l’ostéoporose post-ménopause, une douleur après l’opération sera anticipée avec l’utilisation de médicaments antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les deux jours suivants la chirurgie et si des signes d’inconfort étaient détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours ensuite sur la première semaine puis deux fois par semaine ensuite. Les animaux engagés pour la procédure 2 seront visités deux fois par semaine. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés après anesthésie générale. Afin de réaliser les analyses par imagerie, sur un site distant abritant la plateforme dédiée, les animaux seront transportés par véhicule personnel climatisé afin de consevrer une température optimale pour les animaux de 20°C, (8 km, environ 10 minutes). Le transport sera effectué dans des cages de transport propres, spécifiquement préparées, et les animaux seront remis dans des cages habituelles avec eau et nourriture à volonté dès leur arrivée. Le retour s’effectuera de la même manière.

Choix des espèces

La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures ont donné des résultats exploitables. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur génère une lignée transgénique surexprimant une protéine pour provoquer un vieillissement prématuré, et décrit les atteintes attendues, perte de poids et de masse musculaire, baisse de la mobilité et des fonctions cognitives, douleurs chroniques, jusqu'à la mise à mort pour prélèvement d'organes. Les injections pharmacologiques sont administrées en une fois ou chaque jour sur dix jours. Il justifie le recours à l'animal par la rareté et la fragilité des patients atteints du syndrome de Cockayne et affirme qu'aucun système in vitro ne peut reproduire le vieillissement d'un tissu.

Objectifs

L’analyse de cellules dérivées de patients avec le syndrome de Cockayne (CS) a montré que la réparation défectueuse de l'ADN, due à l'altération de l’une ou l’autre des protéines n'était vraisemblablement pas la cause principale de la maladie, mais plutôt d’autres fonctions de ces mêmes protéines. Le vieillissement précoce et la neurodégénérescence dans le CS ont été réfractaires à l'expérimentation car les modèles murins ne récapitulent pas complètement la maladie, et car le matériel biologique provenant de patient est difficile à obtenir (les patients CS sont extrêmement fragiles). La faible représentativité des modèles animaux pour le CS représente un handicap majeur pour l'investigation et le développement éventuel de stratégies précliniques pour le CS. Au vu des données indiquées au-dessus, il est fort possible que la surexpression d’une protéine candidate soit une cause majeure de la maladie. Nous prévoyons donc de générer une nouvelle lignée de souris inductible cette protéine pour vérifier cette hypothèse.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à ce que cette lignée de souris exprime de manière ubiquitaire (dans tous les organes/tissus) des niveaux élevés de la protéine , de manière constante ou pendant des périodes données lorsqu'elle est supplémentée ad hoc avec un inducteur. Les souris surexprimant la protéine en permanence et/ou pendant des périodes données devraient présenter des signes de vieillissement prématuré et/ou de neurodégénérescence. Nous nous attendons à une durée de vie plus courte que les souris non supplémentées en inducteurs ou les souris contrôle (non transgéniques) ainsi qu’à une apparition plus précoce de la dégénérescence de plusieurs organes et du cerveau, ce qui se traduit par une mobilité, une flexibilité et une cognition affectées. Enfin, ce modèle de souris sera d'une grande importance pour les études mécanistes et précliniques du syndrome de Cockayne, y compris pour les thérapies, puisque nous avons identifié plusieurs molécules antioxydantes effectives in vitro.

Procédures

Les animaux recevront un traitement pharmacologique en injection unique (durée 15 sec/animal) ou en injections répétées de façon quotidienne (durée 15 sec/animal) sur une durée de 10 jours

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont ceux caractéristiques du processus de vieillissement ; incluant une perte de poids (musculaire), une réduction de la mobilité et des fonctions cognitives, et des douleurs chroniques (posturale, fibrotique), et ceux jusqu’à la mise à mort des animaux à la fin du protocole expérimental.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole expérimental ou en cas d’atteinte d’un point limite pour prélèvement d’organes pour analyse des défauts au niveaux moléculaire et/ou cellulaire et/ou histologique (les animaux ne pourront donc pas, ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés)

Remplacement

Aucun système in vitro ne peut récapituler la complexité des interactions et reproduire fidèlement les conditions naturelles au sein d’un tissu normal ou en vieillissement. Ceci est particulièrement justifié pour le vieillissement qui se définit par la dégénération d’un tissu ou organe avec le temps. Il est par conséquent difficile d’étudier l’ensemble des composantes du vieillissement à l’échelle cellulaire. En plus de ces limitations, le matériel biologique issu des patients (sang, biopsies) est très difficile à obtenir du fait de leur faible nombre (incidence : 1/200000) et de leur fragilité extrême. Le processus de vieillissement implique une multitude de réponses et d’interactions cellulaires avec leur environnement au sein d’une ultrastructure tridimensionnelle complexe (matrice extracellulaire tridimensionnelle, types cellulaires variés, facteurs de croissance, etc), qui ne peuvent être appréhendé dans leur globalité qu’in vivo.

Réduction

Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats statistiquement interprétables. Un nombre de 6 animaux, pour les groupes contrôles et les groupes expérimentaux, sont utilisés pour réaliser les expériences. Les résultats obtenus entre les groupes expérimentaux et les groupes contrôles sont analysés par des tests d’hypothèse paramétrique ou non paramétriques.

Raffinement

Un suivi régulier des animaux selon leur état général de santé et le développement des signes caractéristique du vieillissement (aspect pelage, motricité/activité, appétit) est prévu. Le poids des souris sera également enregistré. Les cages seront également garnies avec des éléments d’enrichissement pour réduire l’impact d’un environnent stressant pour les animaux. En cas d’identification d’une douleur ou souffrance quelconque de l’animal, liée ou non au vieillissement induit, des traitements sont prévus avec administration d’analgésique pour assurer un confort total des animaux. Si les signes cliniques de souffrance ne s’améliorent pas dans les jours suivants, ou en présence d’une perte de poids trop importantes, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les souris sont des petits mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’Homme. Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche. Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées). Cette richesse de ressources permet des croisements facilités afin d’étudier des composantes multifactorielles, particulièrement appropriées pour l’étude du vieillissement et surtout des maladies liées à l’âge, qui ne sont pas causées par l’altération d’un seul gène. Ceci entre dans le cadre du raffinement avec la possible valorisation d’animaux non utilisés pour d’autres projets. L’évaluation du phénotype de la nouvelle lignée nécessite l’utilisation des animaux à la naissance, au sevrage et à l’âge adulte. Dans l’autre procédure les animaux seront utilisés à partir de l’âge adulte (6 à 8 semaines) pour que le sevrage permette l’accès aux produits administrés dans l’eau de boisson ou la nourriture et ainsi réduire les injections. Notre objectif étant de générer un phénotype de vieillissement précoce par induction d’un transgène, les animaux seront utilisés jusqu’à l’apparition de signes phénotypiques d’un vieillissement sévère (souris gériatrique), et donc potentiellement pour les animaux contrôles jusqu’à 24-36 mois sous réserve d’un état général satisfaisant.

1 958 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent un modèle de maladie neurodégénérative ou un système immunitaire déficient, subissent une biopsie d'identification sur souriceau vigile, jusqu'à 35 injections dans l'abdomen, jusqu'à deux injections dans le cerveau sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, pour tester une immunothérapie ciblant les cellules immunitaires dans la maladie d'Alzheimer. Les retombées annoncées pour les patients sont renvoyées à de futurs essais cliniques, alors que le porteur a déjà lancé un essai pilote. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent qu'une fraction des interactions en jeu et conclut qu'un modèle animal est "totalement indispensable".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive de la mémoire et des fonctions cognitives. Elle est définie par deux types de lésions cérébrales : celles liées à la protéine A-Béta, et celles liées à la protéine Tau. Ces agrégats protéiques induisent une réaction immunitaire à plusieurs composantes. La première composante, consiste en une inflammation chronique cérébrale pouvant avoir des effets bénéfiques ou délétères. Des études récentes ont montré l’existence d’une seconde composante, par laquelle des cellules immunitaires infiltrent le cerveau et promeuvent la progression du déclin cognitif. Plusieurs analyses chez l’Homme et dans des modèles expérimentaux suggèrent que ces cellules ont un rôle délétère dans la MA. Des études ont montré que la modulation de ces cellules immunitaires délétères permet de réduire la perte de mémoire et de modifier l’inflammation cérébrale dans un modèle murin de pathologie A-Béta. Ces cellules immunitaires régulatrices pourraient également contrôler les réactions immunitaires pathogènes liées à la protéine Tau pathologique. Sur la base d’études pré-cliniques dans un modèle murin de pathologie Tau, l’objectif de ce projet est d’évaluer une approche thérapeutique innovante ciblant les cellules immunitaires dans la MA et d’autres pathologies liées à la protéine Tau.

Bénéfices attendus

La Maladie d’Alzheimer (MA) touche environ 1 million de personnes en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Cette maladie, sans traitement, nécessite une prise en charge importante liée à la perte d’autonomie des patients. Des études précliniques antérieures dans un modèle murin de MA ont apporté la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique d’un traitement à faible dose d’une molécule. Cette preuve nous a permis d’initier un premier essai clinique pilote pour évaluer l’efficacité thérapeutique de ce traitement modulant les réponses immunitaires délétères dans la MA précoce. Ce projet vise à présent à évaluer et établir la preuve de concept pré-clinique de l’efficacité accrue d’une nouvelle approche ciblant les réponses immunitaires pathogènes associées aux agrégats de protéine Tau. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.

Procédures

Les animaux modèles de la Maladie d’Alzheimer développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie (>1mm) effectuée de manière précoce sur animal vigile. Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des injections répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) à raison d’un maximum d’une injection quotidienne durant 10 jours à l’âge de 3 mois puis de rappel toutes les 3 semaines durant 5 jours jusqu’à l’âge de 9 mois (environ 20 secondes par injection). Les injections seront réalisées sur animal vigile avec au minimum 1 injection et au maximum 35 injections intra-péritonéales sur la durée du traitement. Ils auront également au maximum deux injections au niveau du crâne (intracérébroventriculaire) à l’âge de 3 mois pour la première et la seconde à un temps qui sera défini au cours du projet (environ 30 minutes par procédure chirurgicale). Ces injections seront réalisées sous analgésie et anesthésie. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile à la fin des 10 premiers jours puis au maximum toutes les 2 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement). Les animaux seront prélevés entre 1 et 9 fois sur la durée du traitement. Des tests comportementaux seront effectués à l’âge de 9-10 mois. Ces tests durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 6 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de maintien prévue en vue des prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entraîner des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensibles aux infections. La biopsie (

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact du traitement sur les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

L’ensemble de ce projet vise à mieux comprendre les interactions neuroimmunes au cours des maladies neurodégénératives. Il nécessite donc l’utilisation d’un système expérimental intégré, permettant de comprendre la physiologie du système nerveux central et ses interactions encore mal connues avec le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent être reproduites par des cultures cellulaires, qui ne permettent que l’étude du contact entre les cellules immunitaires et les cellules nerveuses. Or, ce type d’interaction ne constitue qu’une fraction minoritaire des échanges en jeu dans les maladies neurodégénératives. Des simulations informatiques ont également été effectuées et nous ont permis de valider que des réponses immunitaires spécifiques contre la protéine Tau étaient possibles. Cependant, l’effet de la modulation de ces réponses sur les maladies neurodégénératives ne peuvent être évaluées que dans un organisme vivant. Un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.

Réduction

Le projet impliquera un total de 1958 souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux des pathologies neurodégénératives et de lignée immunodéficiente nécessaire à la mise en œuvre de ce projet. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre des traitements, ils seront initiés à l’âge de 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie. Les animaux seront ensuite analysés à 9-10 mois (âge normal d’apparition des troubles cognitifs). Justification du sexe : Concernant les modèles transgéniques utilisés, nos résultats préliminaires indique qu’il existe une différence de phénotype comportemental et neuroimmunitaire entre mâles et femelles. Ainsi, l’ensemble des expériences sera réalisé sur les deux sexes de manière indépendante.

1 176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des extraits d'acariens par voie intranasale, jusqu'à seize doses pour une partie d'entre elles, du gavage forcé, un marquage des oreilles, et pour 252 d'entre elles une irradiation du corps entier avec transfert de cellules. Le porteur reconnaît qu'après irradiation certaines souris ne se reconstituent pas, deviennent pâles et sont maintenues en contention le temps de l'exposition. Il affirme que les interactions immunitaires étudiées ne peuvent être imitées in vitro et que les bénéfices médicaux "justifient, d'un point de vue éthique," ces expériences.

Objectifs

L'asthme est la cause la plus fréquente d'inflammation chronique des voies respiratoires et se définit par l'apparition d'épisodes aigus et récurrents de fermeture des voies respiratoires. Ces exacerbations sont généralement liées à l'exposition à des les allergènes en suspension dans l'air tels que le pollen, les squames d'animaux domestiques ou les excréments d'acariens. Au cours de la réponse allergique, nous produisons un anticorps appelé IgE qui induit la production d'histamine, ce qui déclenche la fermeture de voies respiratoires. Le rôle essentiel des IgE dans l'asthme allergique est encore souligné par le fait que l'administration d'omalizumab, un médicament ciblant les IgE, réduit considérablement la fréquence et la durée des exacerbations chez les patients asthmatiques. L'objectif de ce projet est de comprendre comment notre corps et les IgE se souviennent de ces allergènes afin de concevoir de nouvelles thérapies contre l'allergie.

Bénéfices attendus

L'asthme est une inflammation chronique des poumons qui touche un très grand nombre de personnes dans le monde, avec un coût et un fardeau élevés pour les patients et la société, comme le montrent les rapports de l'Organisation Mondiale de la Santé et de la Société Respiratoire Européenne. Il est urgent de mieux comprendre l'hétérogénéité de cette maladie afin d'améliorer le diagnostic et la prise en charge de l'asthme. Parmi les types définis de l'asthme, l'asthme allergique touche plus de la moitié des patients diagnostiqués avec cette maladie. Cependant, la sévérité de la maladie dans l'asthme allergique est très variable, soulignant le besoin d'une meilleure compréhension des mécanismes biologiques menant à son développement. Ce projet vise à étudier la fonction de différentes cellules mémoires spécifiques de l'allergène résidant dans différents organes tels que les organes lymphoïdes, la rate ou les poumons. En particulier, le rôle des cellules mémoire résidant dans les poumons pendant une exposition aux allergènes aeriens n'a pas été abordé jusqu'à présent. Nous voulons savoir si elles contribuent à la pathologie en produisant localement des IgE lors d'une nouvelle exposition à l'allergène. Cet étude pourrait permettre de mieux comprendre la fonction des cellules B à mémoire et de mettre au point de nouveaux traitements tels que la déplétion de certains sous-ensembles de cellules B mémoire.

Procédures

1) Traitement primaire avec extrait d'acariens par voie intranasale: 168 souris (11 doses-1 minute/dose). 2) Traitement primaire et secondaire avec extrait d'acariens par voie intranasale: 1008 souris (16 doses -1 minute/dose). 3) Gavage oral d'un produit chimique pour induire la suppression de gènes dans de l'huile de maïs : 504 souris (3 doses - 20 seconds/dose). 4) Marquage des oreilles: 504 souris (10 seconds). 5) Transfert de cellules par voie intraveineuse et irradiation: 252 souris (Transfert de cellules: 1 minute, Irradiation: 10 minutes total).

Impact sur les animaux

1) Pour l'immunisation avec l'extrait d'acariens, les seuls effets indésirables potentiels sont associés à l'effet à court terme de l'anesthésie à l'isoflurane, qui est transitoire. 2) En ce qui concerne la génération de chimères mixtes de moelle osseuse, il est possible que les souris ne soient pas bien reconstituées après l'irradiation et le transfert des cellules de moelle osseuse. Ceci est évident car ces souris ne peuvent pas régénérer les globules rouges et la base de la queue et les joues deviennent pâles. Les souris sont également maintenues dans des cages de contention pendant l'irradiation afin de garantir une irradiation uniforme de l'ensemble du corps. 3) Le gavage des animaux s'il est mal fait peut provoquer de la souffrance de l’animal. Cependant, nous avons une longue expérience avec cette procédure et nous n'avons jamais eu des problémes à la suite de cette procédure. 4) Complications de l'injection dans la veine caudale et le dispositif de contention pour l'injection qui peut stresser les souris. 5) La petite perforation de l'oreille pour le génotypage peut stresser l'animal, mais il s'agit d'une procédure universelle et très légère.

Devenir

Les animaux seront mis a mort a la fin de chaque experience. Nous prélèverons les organes (poumons, rate et ganglions lymphatiques) pour la cytométrie de flux, une technologie qui permet d'analyser rapidement des cellules lorsqu'elles passent devant plusieurs lasers, et la microscopie de cellules productrices d'anticorps.

Remplacement

La recherche sur les animaux est effectuée lorsqu'aucune autre approche ne permet d'obtenir les avantages scientifiques escomptés. Dans cette étude, nous analyserons le positionnement spatial de cellules B mémoires spécifiques dans la muqueuse pulmonaire apres l'exposition aux allergens respiratoires. Malheureusement, cet objectif ne peut être atteint autrement qu'en utilisant un modèle in vivo. En raison de la nature et de la complexité des interactions cellulaires au cours des réponses immunitaires, les expériences basées sur un organisme modèle sont inévitables pour développer nos connaissances sur les réponses des cellules B pulmonaires et ne peuvent pas être imitées par des modèles in vitro ou in silico. Nous utiliserons des souches de souris génétiquement modifiées, en raison des similitudes entre la physiologie de la souris et celle de l'homme et de la large gamme de réactifs immunologiques disponibles chez cette espèce. Les résultats escomptés permettront non seulement d'accroître les connaissances médicales, mais aussi de fournir des indications médicales pour le développement de vaccins contre les allergens. Par conséquent, les avantages potentiels de ce projet à des fins médicales humaines justifient, d'un point de vue éthique, la réalisation d'expériences sur des animaux.

Réduction

Dans la mesure du possible, nous réduirons le nombre d'animaux au minimum nécessaire. Nous utiliserons des tests statistiques lors de la planification des expériences afin de nous assurer que le nombre minimum d'animaux est utilisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous allons utiliser les mêmes souris pour les expériences d'imagerie et de cytométrie de flux pour réduire le nombre de souris nécessaires au projet.

Raffinement

L'utilisation d'animaux génétiquement modifiés et préalablement caractérisés est une bonne approche pour affiner les études sur les animaux, car elle évite l'utilisation de médicaments pour bloquer un processus biologique qui pourrait avoir des conséquences inattendues. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées à raison de 5 souris/cage maximum. La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier absorbant seront misà disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. Nous pourrons fournir également des aliments semi-solides aux animaux au cours de traitment si necessaire. Nous surveillons les souris après chaque intervention pour nous assurer qu'elles retrouvent leur comportement normal après chaque intervention. Après anesthésie transitoire et administration avec extrait d'acariens : 5 minutes. Après gavage oral et injection iv : 10 minutes. Après irradiation : tous les jours pendant 1 semaine. En outre, nous avons défini des points limites pour chaque procédure.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle d’étude des maladies inflammatoires de les poumons car l’obtention d’animaux génétiquement modifiés est bien contrôlée et les modèles expérimentaux bien calibrés. Or ces modèles sont les seuls permettant de tester la contribution génétique de modifications de certains gènes de susceptibilité au développement de ces pathologies. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 14 semaines seront utilisées.

2 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un génotypage par biopsie de la queue, des injections de virus et d'anticorps, une moyenne de huit échographies hépatiques sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier deux types de tumeurs du foie et leur résistance à l'immunothérapie. Le porteur indique qu'une encéphalopathie peut toucher jusqu'à un quart des animaux et qu'une partie est tuée faute du génotype recherché. Il décrit développer en parallèle des cultures en trois dimensions présentées comme un moyen de limiter le nombre de souris.

Objectifs

«Notre équipe s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais 70% des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques dans nos modèles murins. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie. Ce projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des mécanismes associés au développement et à la réponse aux traitements des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements ciblant le système immunitaire émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.

Procédures

1) identification des animaux par tatouage ou puces et biopsie de queue pour génotypage des souris sur animaux vigiles en 1minute (EU0050 et EU0140) 2) Injection intrapéritonéale unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles en 30s (EU0140), 3) Injection intraveineuse unique de virus sous anesthésie générale en 30s (EU0140), 4) traitement par anticorps tous les 3 jours par injection intrapéritonéale sur animaux vigiles en 30s pendant 2 mois maximum(EU0053), 5) échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne /souris- EU0053), 6) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s (EU0053)

Impact sur les animaux

une encéphalopathie peut être observée au maximum chez 25% des animaux selon les expériences trois semaines après modification génique . Au cours des expériences, la mise à mort des animaux ayant atteint les points limites peut conduire à des animaux isolés dans les cages pouvant engendrer du stress. Les injections rétrorbitaires et prélèvements sanguins au cours du traitement ciblant le système immunitaire ou au moment de la mise à mort sont des actes stressants. La numérotation et le génotypage des souris induit stress et douleur légère. Le transport des animaux entre centres pourra induire un stress aux animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet est mis à mort pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs. Une partie des animaux sont euthanasiés car sans génotype d'intérêt pour le projet.

Remplacement

Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. Notre projet vise à développer des cultures cellulaires en trois dimensions limitant le nombre de souris utilisées pour tester de nouvelles pistes thérapeutiques.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. Nous suivons le développement des tumeurs pour l'ensemble des animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Les tests statistiques utilisés sont des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise et limité grâce au suivi échographique des animaux. Nous souhaitons aussi réaliser des cultures in vitro de tumeurs en trois dimensions qui nous permettront à terme de tester de nouveaux médicaments.

Raffinement

Nous suivons le développement des tumeurs sous anesthésie générale dans un centre d’échographies expert, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral et évite la souffrance due à un développement tumoral important. Nous connaissons les phases où un phénotype dommageable peut apparaitre, et les expériences se déroulent avec une surveillance accrue à ce moment-là. Les injections stressantes, les prélèvements sanguins et les échographies sont réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues. Nous avons mis en place une grille de score avec des points limites, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Le transfert des animaux entre les établissements utilisateurs les plus distants est fait dans une boite de transfert contenant leurs nids et de l'hydrogel. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié à la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de tumeurs nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux-trois mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.