Procédures légères

Soumises à une restriction alimentaire maintenant leur poids à 90 % pendant l'expérience, 288 souris vont être utilisées puis toutes tuées pour prélèvement de tissus cérébraux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont isolées, exposées de façon répétée au sucre et prélevées trois fois par voie sanguine, pour étudier la motivation alimentaire et la consommation excessive de saccharose. Le porteur indique que l'isolement et la restriction sont sources de stress et que les prises de sang peuvent causer douleur, infection voire nécrose. Il affirme qu'aucun modèle autre que "l'animal entier" ne permettrait cette étude, dont les retombées restent renvoyées à un futur projet.

Objectifs

Dans les pays développés, la consommation alimentaire est motivée par le plaisir plus que par le besoin de se nourrir. De ce fait, des dérives sont observées dans les comportements alimentaires, notamment une consommation excessive de nourriture appétissante peut devenir préoccupante puisque plusieurs pathologies y sont liées, comme l’obésité. Cependant, les adaptations comportementales et cérébrales associées à ces troubles de l’alimentation ne sont pas encore bien caractérisées. Ce programme de recherche vise à étudier la relation entre les prises excessives de nourriture appétissante et la motivation. En particulier, un protocole classique de mesure de la motivation chez la souris est utilisé pour de la nourriture normale ou de la nourriture appétissante comme le sucre. Les profils d’acquisition de la tâche seront comparés entre mâles et femelles. Ensuite, les effets d’une consommation excessive de sucre sur cette motivation seront évalués. Enfin, les changements d’expression de gènes et de protéines dans le cerveau seront étudiés pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents

Bénéfices attendus

En identifiant les mécanismes physiologiques, notre recherche permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes centraux impliqués dans les troubles alimentaires. Nous observerons notamment si des différences motivationnelles intersexuelles existent. Ce projet servira egalement de base à un futur projet visant à evaluer les alterations moleculaires associées aux troubles alimentaires

Procédures

Exposition au sucre pour l’apprentissage de la tâche au maximum 45j, avec une session de 45 min par jour maximum selon les conditions testées. Une privation de nourriture avec le maintien du poids à 90% du poids de départ sera effectuée pendant la durée de l’expérience (45 j max). Consommation excessive de saccharose : les animaux ont le choix entre de l’eau et du sucre tous les jours, pendant 4h ou 24h selon le groupe expérimental, pendant 2 ou 8 semaines, selon les résultats. Prise de sang à 3 reprises lors du protocole (semaines 1, 4 et 8).

Impact sur les animaux

L’isolement des animaux permettant la mesure individuelle de consommations de liquide et de nourriture peut être une source de stress ou d’anxiété pour les animaux. Une perte de poids est attendue avec la restriction alimentaire mise en place la veille du paradigme operant. La restriction alimentaire est poursuivie pendant toute l’expérience avec un maintien du poids à 90% du poids de depart. La prise de sang à 3 reprises lors du protocole de binge saccharose peut induire une douleur et un risque d'infection voir de nécrose.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort pour prélèvements de tissus et analyses moléculaires .

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur la caractérisation comportementale et moléculaire d’une consommation excessive d’aliment ou de la motivation pour ces aliments, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques avec les mêmes cohortes utilisées pour l analyse comportementale et l’analyse moléculaire. Les expériences seront menées sur les deux sexes.

Raffinement

La surveillance des animaux est journalière (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (nourriture/sucre/eau), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours accès à de l’eau, Pour le paradigme opérant, les souris sont mises en restriction alimentaire afin de maintenir les animaux à 90% du poids initial pendant la durée de l’expérience. Le poids des animaux est monitoré tous les jours et la quantité de nourriture ajustée en fonction . Le prélèvement sanguin est effectué sous analgésie locale. Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés sera mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. De plus, les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires

1 570 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de léger à modéré, 1 456 étant mises à mort pour prélèvement de tissus et 114 gardées vivantes pour d'autres projets. Modèles d'Alzheimer, elles subissent des chirurgies d'une à deux heures et demie avec injections et pose d'électrodes, des enregistrements cérébraux en cage isolée et des tests de mémoire spatiale et sociale. Le projet cherche à relier l'effet d'un environnement enrichi sur la mémoire au remodelage de certains neurones de l'hippocampe. Le porteur affirme qu'étudier des comportements complexes rend "indispensable" le modèle animal.

Objectifs

Dans le cerveau, certains neurones jouent un rôle clé dans le contrôle de l’activité des autres neurones et dans la formation et le maintien des souvenirs. Après un apprentissage, ces neurones subissent des modifications qui leur permettent d'assurer la stabilité des souvenirs nouvellement acquis. Or, ces neurones fonctionnent de façon anormale dans le cerveau de souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA) ainsi que celui de patients atteints par cette pathologie. Chez l'humain, les études épidémiologiques indiquent qu'une vie riche en expériences diverses, que ce soit sur le plan intellectuel, sportif ou social par exemple, permet de former une réserve cognitive qui permettrait de diminuer les risques ou de ralentir la progression des maladies neurodégénératives. Cette ressource repose sur le fait que le cerveau peut compenser différentes lésions ou affections cérébrales en utilisant des réseaux neuronaux préexistants, ou en activant de nouvelles connexions neuronales. En accord avec cette idée, les souris modèles de la maladie d'Alzheimer placées dans un environnement enrichi (EE) qui comporte des expériences sensorielles et sociales stimulantes (cages plus grandes, avec plus de congénères, et des objets changés régulièrement) ont des capacités d’apprentissage et de mémoire améliorés au moins pendant plusieurs mois. Ce projet vise à démontrer que les améliorations comportementales observées chez les souris Alzheimer sont directement liées aux modifications subies par les neurones impliqués dans la formation et le maintien des souvenirs suite à ces stimulations. Il cherchera également à évaluer si les changements subis par ces neurones suite au séjour dans l’EE s’accompagne d’un rétablissement de l’activité électrique dans la région cérébrale clef dans la formation des souvenirs, l’hippocampe.

Bénéfices attendus

Ce projet se place dans le contexte général de la compréhension des substrats neuronaux à l’amélioration comportementale et cognitive observée suite à des stimulations sensorielles et sociales dans la maladie d’Alzheimer (concept de réserve cognitive). Précisément, l’objectif de ce projet est de montrer le lien causal entre le remodelage d'une population de neurones et l’amélioration de la mémoire après le séjour dans un environnement enrichi (EE) chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Dans un premier objectif, nos expériences nous permettront de déterminer si c’est l’activation de ces neurones qui sous-tend l’amélioration de la mémoire des souris, ou s’il s’agit de la modification de ces neurones, ou si les deux sont nécessaires. Le deuxième objectif permettra d’étudier si les changements subis par ces neurones suite à un séjour dans un EE s’accompagnent d’un rétablissement de l’activité électrique cérébrale. Le troisième et dernier objectif permettra d’évaluer si la stimulation de ces neurones, en dehors de toutes stimulations environnementales, et suffisante pour obtenir des bénéfices comportementaux et d’activité cérébrale chez les souris modèles de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale d’une durée variant de 1h à 2h30 en fonction des gestes réalisés : ils pourront recevoir des injections (entre 1h et 1h30 par animal), des poses d'électrodes (environ 1h par animal), ou la combinaison des deux gestes précédemment cités (entre 2h et 2h30 par animal). Une partie des individus sera soumise à trois enregistrements de l’activité cérébrale, espacés dans le temps, et qui dureront de 72h à 24h. Durant ces phases d’enregistrements, les animaux seront placés dans des cages individuelles. Enfin les souris sont soumises à des tests comportementaux afin d’évaluer leur mémoire spatiale (3x10 min par animal) et leur mémoire sociale (90min par animal).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale peut induire une douleur modérée au stade post opératoire (environ 12h). De plus, durant les enregistrements de l’activité cérébrale, les souris seront placées individuellement dans des cages isolées les unes des autres ce qui peut induire un stress durant les premières heures (3 sessions d’une durée totale de 120h). Par ailleurs, toutes les manipulations liées aux tests comportementaux peuvent engendrer un stress léger. Enfin, dans le cadre de leur suivi à l’aide d’une grille de scoring par le personnel de l’animalerie, les animaux sont pesés deux fois par semaine, ce qui peut engendrer un léger stress dû à leur manipulation.

Devenir

1456 souris seront mises à mort pour réaliser des prélèvements de tissus et effectuer des observations anatomiques et histologiques nécessaires à la validation scientifique de ce projet. 114 souris seront maintenues en vie et pourront être réutilisées dans d’autres projets.

Remplacement

L’objectif du projet étant l’étude de comportements complexes et les activités cérébrales associées à la maladie d'Alzheimer, il est indispensable de travailler sur un modèle animal. Il s’agit de valider une stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum pour nous permettre de comparer statistiquement les groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d'animaux, la mémoire sociale et la mémoire spatiale seront étudiés sur les mêmes individus.

Raffinement

Les souris sont hébergées par groupe de 2 à 5 individus dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Après réception, un temps d'habituation d'une semaine est respecté avant le début des expériences. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par du personnel formé au soin et des points limites ont été définis à partir d’une grille de scoring. En cas de blessure ou de souffrance, les animaux recevront un traitement analgésique adapté. Tous les signes de souffrance détectés lors de l’observation quotidienne tels qu’un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos voûté, une expression faciale modifiée, une altération du pelage, une perte de poids > 20% conduiront à la mise à mort de l’animal en accord avec le vétérinaire référent. Concernant les chirurgies, elles seront réalisées sous anesthesie générale dans des conditions aseptiques et accompagnées d'une analgésie.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle souris car il existe des souris modifiées génétiquement présentant des symptômes similaires à la maladie d’Alzheimer humaine. Elles seront utilisées à l’âge de 5-6 mois car à cet âge, les souris présentent un stade modéré́ de la maladie. En ce qui concerne les souris démonstratrices pour les tests de mémoire sociale, elles seront toutes des femelles non-transgéniques, âgées entre 3 et 9 mois. Cette tranche d'âge correspond à des souris adultes. En effet, il est préférable d'utiliser des souris démonstratrices ni juvéniles (moins de 8-10 semaines), ni âgées (plus de 9-10 mois), ce qui pourrait entrainer des comportements sociaux différents.

76 babouins (Papio anubis) vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de léger à modéré, puis remis dans leurs groupes sociaux et susceptibles d'être réutilisés dans d'autres projets. Suivis de la naissance à l'âge adulte, ils subissent des captures répétées, un transport, un isolement de 48 heures et six séances d'IRM sous anesthésie de deux à trois heures, les nouveau-nés étant temporairement séparés de leur mère, et huit femelles portent un dispositif fixé au crâne pour l'imagerie optique. Le projet étudie l'origine gestuelle du langage et la latéralisation cérébrale, une question que le porteur relie à l'évolution humaine. Il affirme que seule l'étude d'un primate permet ces comparaisons et qualifie le babouin de modèle "incontournable".

Objectifs

Ce projet explore la piste des origines gestuelles de la parole. Et si la communication gestuelle était centrale dans l'origine et l’organisation cérébrale du langage dominé par l’hémisphère gauche ? Cette hypothèse gagne du terrain à la lumière des liens étroits mis en évidence non seulement entre les gestes et le langage dans l'espèce humaine mais aussi entre les gestes de nos cousins les primates et certaines propriétés du langage. Au regard de leur proximité phylogénétique, seule une perspective comparative entre primates humains et non humains peut nous aider à déterminer les continuités entre la latéralisation des gestes des primates et celle du langage humain. A la croisée de l’éthologie, de la psychologie comparée et des neurosciences non invasives, ces recherches continuront d’être menées sur les babouins hébergés en captivité en groupes sociaux et porteront (1) sur le développement longitudinal de gestes communicatifs (et signaux vocaux) au sein du groupe social de babouins olives Papio anubis, leurs asymétries et leur spécialisation hémisphérique anatomique (via IRM anatomique et de diffusion) auprès de 38 babouins depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte; (2) sur leurs liens avec la specialisation hémisphérique associée à leurs relations sociales, incluant ainsi l’étude de celle de leurs congérères, impliquant près de 38 indidus supplémentaires ; (3) sur les asymétries cérébrales fonctionnelles des gestes et des vocalisations mesurées par imagerie optique auprès de 8 sujets entrainées Papio anubis. Tous les sujets, dont la taille optimale d'échantillon a été évaluée, sont observés dans leur groupe social respectif et ne sont mobilisés que temporairement au cours du projet sur 5 ans lors de la pose du serre-tête de l'appareil d'imagerie optique ou lors d'acquisitions d’images IRM, et ce, sous anesthésie monitorée dans les standards de sécurité et de bien-être animal avant d'être remis dans leur groupe social après le réveil.

Bénéfices attendus

L’étude de l’ontogénèse de la communication gestuelle du babouin et de sa spécialisation hémisphérique cérébrale associées à des zones homologues du langage revêt une importance cruciale pour comprendre les précurseurs phylogénétiques de l’organisation de notre système de communication, des précurseurs qui auraient été hérités à partir de notre ancêtre commun. Les recherches longitudinales sur des babouins en développement, de la naissance jusqu’à l’âge adulte, constituent une opportunité unique d'explorer les déterminants neurobiologiques potentiels du développement de la communication gestuelle. Une telle approche longitudinale étant peu réalisable sur primates humains, elle renforce l’intérêt de ses recherches, avec le babouin comme modèle incontournable, pour comprendre l’ontogénèse de la spécialisation hémisphérique associée au langage dans l’espèce humaine. De surcroît, les conclusions tirées de ces recherches peuvent avoir des implications uniques pour la compréhension du développement précoce du langage chez l'humain et enrichir notre connaissance en neurosciences cognitives, particulièrement en ce qui concerne la communication gestuelle, ses bases cérébrales et son évolution.

Procédures

Les 38 animaux adultes seront soumis à une anesthésie de 2 à 3h pour une acquisition IRM associée à une capture, un tranport en camion (2h environ aller/retour) et un isolement de 48h. Les 38 sujets suivis longitudinalement seront soumis à 6 IRM chacun. Chaque IRM impliquera également une capture, un tranport en camion et un isolement de 48h et une anesthésie de 2 à 3h pour chaque session. Un sous groupe de 8 femelles sera également utilisé pour des acquisitions d'imagerie optique (3 à 6 par animal) qui nécessitent l'installation d'un dispositif amovible sur le crâne et dans le dos. Pour chaque session, l'animal aura deux anesthésies (1 de 1h pour placer le dispositif, 1 de 20 minutes pour le retirer), 2 captures et un isolement inférieur à 24h. Aucune de ces interventions n'est douloureuse ou invasive.

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Transport. Anesthésie. Isolement 48h. Port du dispositif.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les sujets seront maintenus en vie car les acquisitions ne sont ni invasives ni douloureuses, il seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.

Remplacement

Dans une problématique qui porte sur les origines, au regard de la proximité phylogénétique des primates humains et non humains, seule l'étude du modèle primate peut nous aider à détecter les précurseurs éventuels de certaines propriétés du langage et de leurs bases cérébrales chez notre ancêtre commun. Il nous est donc impossible de remplacer l’animal par un autre sujet ou une autre méthode alternative.

Réduction

Au regard de la variabilité interindividuelle anatomique des cerveaux, étudier les corrélats neuroanatomiques des comportements gestuels des babouins nécessite généralement de larges cohortes de sujets pour la collection d'images IRM. Cette étude étant pionnière sur l’approche longitudinale du développement des asymétries cérébrales de primates non-humains et leurs corrélats comportementaux, il n’existe pas d’"effect size" connu à ce jour sur ce modèle, ne permettant pas d’estimer avec exactitude le nombre de sujets idéal pour la constitution de cette base de données. Néanmoins, en fonction de résultats publiés sur les asymétries cérébrales de babouins de tout âge (n=96), un effort de réduction à 38 sujets a été estimé pertinent au regard de l’aspect répété (x6) des mesures au cours du développement. - Dans l'étude d'imagerie optique fonctionnelle, le nombre de sujets critique a été estimé en fonction des résultats publiés de travaux en imagerie cérébrale fonctionnelle menées sur primates de l’ancien monde (macaques).

Raffinement

Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. La capture est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Les animaux sont maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache sur la cage de transport et le compartiment du véhicule agrée est chauffé. L’IRM est une méthode non-invasive, ne causant aucune souffrance ou risque pour l’animal et ni de douleur importante apparente et est réalisée sous anesthésie générale. Pour le T0, les sujets étant des nouveaux-nés ils sont capturés avec leurs mères et sont transportées avec celles-ci. Le nouveau-né est alors temporairement séparé de samère pour l’IRM (3h max). Le temps d’anesthésie est compris entre 2 et 3h. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés et des mesures de réchauffement sont mises en place (matelas air chaud pulsé et couverture de survie). De retour à la station, les sujets sont réintroduits dans leur groupe social et surveillés quotidiennement. Les nouveaux-nés seront suivis avec une grille de scoring spécifique pendant 3 jours. Pour la partie portant sur l'imagerie optique, les animaux seront préalablement entraînés à des tâches manuelles et ne pourront commencer qu'une fois l'entraînement terminé et répétable. Des séances de désensibilisation sans anesthésie (approche, renforcement à se laisser toucher la tête) sont mises en place en amont afin de diminuer le stress. Le dispositif sera placé sous anesthésie. Les premières sessions seront consacrées à la phase d'habituation du dispositif (de 1 à 3 sessions par sujet) et se feront donc avec un dispositif factice jusqu’au succès du processus d’habituation avant de réaliser les sessions expérimentales (3 sessions répétées) avec l'appareil d'imagerie. Les sessions seront limitées à 60 minutes (30 minutes d’anesthésie et 10-30 minutes de tâches). Les individus sont hébergés pendant toute la durée du projet en groupes sociaux. Ils seront seulement séparés de leurs groupes au moment des IRM (48h) ou pour les sessions d'imagerie optique (moins de 24h).

Choix des espèces

Dans une problématique qui porte sur les origines, au regard de la proximité phylogénétique des primates humains et non humains, seule l'étude du modèle primate non-humain comme le babouin peut nous aider à détecter les précurseurs éventuels de certaines propriétés du langage et de leurs bases cérébrales chez notre ancêtre commun. Le babouin est un modèle incontournable pour étudier l’ontogénèse de la communication et de la spécialisation hémisphérique cérébrale du langage, au regard de leur taille de cerveau (deux fois plus gros que celui du macaque par exemple), leur latéralité manuelle et gestuelle déjà documentée et associée à des latéralisations cérébrales équivalentes à celles décrites dans l’espèce humaine, et un repertoire de signaux gestuels intentionnelles uniques parmi les singes de l’ancien monde. C’est la seule espèce chez qui nous pouvons poursuivre nos recherches longitudinales initiées au cours d’un précédent projet à partir d’une cohorte de bébés en développement. Pour 38 individus, notre échantillonnage inclut 6 stades de développement de la naissance jusqu’à l’âge adulte, en passant par le stade de fin de myélinisation et de sevrage maternel : - T0 : de 6 à 15 jours : le plus tôt possible après la naissance - T1 : de 8 à 10 mois : sevrage naturel de la mère - T2 : 24 mois : stade juvénile avec une vie sociale intégrée au groupe. - T3 : de 48 à 60 mois : maturité sexuelle - T4 : à 7 ans : Adulte (plafond volume cérébrale) - T5 : à 9-10 ans : Adulte avancé Les 8 mères des nouveaux nés seront utilisées à l’âge adulte. Enfin, 30 congénères adultes (âgés entre 7 et 25 ans) seront également scannés à l’IRM. Les 8 femelles impliquées dans le projet d'imagerie optique seront d’un âge supérieur à T1 (i.e., après le sevrage) et font partie du lot du suivi longitudinal.

2 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de queue, des injections d'anti-oestrogènes et de virus, un traitement par anticorps tous les trois jours pendant deux mois et des échographies répétées, pour étudier le développement de tumeurs du foie, une partie étant mise à mort faute de génotype d'intérêt. Le porteur indique qu'une encéphalopathie peut toucher jusqu'à 25 % des animaux et que le transport entre établissements est source de stress. Il affirme développer en parallèle des cultures en trois dimensions pour limiter le nombre d'animaux.

Objectifs

«Notre équipe s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais 70% des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques dans nos modèles murins. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie. Ce projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des mécanismes associés au développement et à la réponse aux traitements des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements ciblant le système immunitaire émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.

Procédures

1) identification des animaux par tatouage ou puces et biopsie de queue pour génotypage des souris sur animaux vigiles en 1minute (EU1 et EU2) 2) Injection intrapéritonéale unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles en 30s (EU2), 3) Injection intraveineuse unique de virus sous anesthésie générale en 30s (EU2), 4) traitement par anticorps tous les 3 jours par injection intrapéritonéale sur animaux vigiles en 30s pendant 2 mois maximum (EU3), 5) échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne /souris-EU3), 6) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s (EU3)

Impact sur les animaux

une encéphalopathie peut être observée au maximum chez 25% des animaux selon les expériences trois semaines après modification génique . Au cours des expériences, la mise à mort des animaux ayant atteint les points limites peut conduire à des animaux isolés dans les cages pouvant engendrer du stress. Les injections rétrorbitaires et prélèvements sanguins au cours du traitement ciblant le système immunitaire ou au moment de la mise à mort sont des actes stressants. La numérotation et le génotypage des souris induit stress et douleur légère. Le transport des animaux entre centres pourra induire un stress aux animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet est mis à mort pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs. Une partie des animaux sont euthanasiés car sans génotype d'intérêt pour le projet.

Remplacement

Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. Notre projet vise à développer des cultures cellulaires en trois dimensions limitant le nombre de souris utilisées pour tester de nouvelles pistes thérapeutiques.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. Nous suivons le développement des tumeurs pour l'ensemble des animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Les tests statistiques utilisés sont des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise et limité grâce au suivi échographique des animaux. Nous souhaitons aussi réaliser des cultures in vitro de tumeurs en trois dimensions qui nous permettront à terme de tester de nouveaux médicaments.

Raffinement

Nous suivons le développement des tumeurs sous anesthésie générale dans un centre d’échographies expert, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral et évite la souffrance due à un développement tumoral important. Nous connaissons les phases où un phénotype dommageable peut apparaitre, et les expériences se déroulent avec une surveillance accrue à ce moment-là. Les injections stressantes, les prélèvements sanguins et les échographies sont réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues. Nous avons mis en place une grille de score avec des points limites, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Le transfert des animaux entre les établissements utilisateurs les plus distants est fait dans une boite de transfert contenant leurs nids et de l'hydrogel. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié à la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de tumeurs nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux-trois mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.