Procédures légères

480 souris porteuses d'un modèle de maladie du cerveau vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont hébergées en cage individuelle jusqu'à trois mois, certaines avec une roue d'activité, et soumises à des tests comportementaux et mnésiques, dont une immersion dans l'eau à 22°C pouvant provoquer un stress thermique et une hypothermie transitoire. Le porteur cherche à identifier les marqueurs génétiques et épigénétiques des effets de l'environnement enrichi et de l'exercice sur un modèle de type Alzheimer, les bénéfices pour la santé humaine étant annoncés comme des pistes à long terme. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et qu'il faut recourir à "l'animal entier".

Objectifs

L’environnement, tel que l’augmentation des activités sociales, de la nouveauté et de l’activité physique, influence positivement l’expression des gènes nécessaires à la plasticité neuronale dans le cerveau. Cela est possible grâce à des mécanismes appelés épigénétiques, c’est à dire qu’ils permettent l’adaptation des programmes génétiques. L’objectif de ce projet vise à établir ces régulations génétiques/épigénétiques à l’échelle de tout le génome, c’est à dire de doser tous les gènes qui seront changés par les conditions d’hébergement, et leur régulation au sein même du génome, ainsi que ceux qui seront relargués dans le sang. Pour ce faire, nous utilisons un modèle animal (souris) de maladie du cerveau. Une fois les transcrits identifiés dans le sang, ils pourraient servir de biomarqueurs pour faire valoir de l’efficacité d’un hébergement enrichi (environnement ou exercice physique). De plus, ces études seront menées de façon cellule-spécifique (cellules neuronales et non neuronales) car toutes les cellules ne répondent pas de la même façon à l’environnement. Ce projet questionne les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux effets bénéfiques de ces changements d’environnement, leur efficacité au niveau cognitif (évaluations comportementales) et les modifications structurelles et fonctionnelles qu’ils induisent sur le cerveau (imagerie). Le projet sera mené sur des souris mâles et des souris femelles.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ces études est l'obtention de données claires démontrant si des (et quelles) modifications épigénétiques et programmes génétiques sous-tendent les effets bénéfiques de l’environnement enrichi et de l’exercice physique dans un modèle de maladie du cerveau aussi répandu que la maladie d’Alzheimer. De plus, cette étude apportera des réponses concrètes sur les mécanismes d’action impactés par l’environnement et l’exercice sur le plan comportemental, cellulaire et moléculaire : formation de la mémoire à long terme dans l’hippocampe et le cortex frontal, transcription des gènes dans l’hippocampe, formation d’épine dendritiques dans l’hippocampe, impact sur les différentes structures cérébrales. En apportant des bases mécanistiques, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet bénéfique de l’environnement et leur implication en santé humaine. Ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes et des preuves de concept pour la mise en place de stratégies de prévention. En fournissant des informations sur les mécanismes moléculaires/cellulaires, dépendants du sexe et de l'âge, qui sous-tendent les interventions non pharmacologiques telles que l'environnement enrichi et l’exercice physqiue dans les principales régions cérébrales affectées par la maladie d’Alzheimer, nos données offriront de nouvelles opportunités pour la personnalisation de la médecine et leur mise en place aux stades les plus précoces. Ce projet devrait in fine permettre un traçage biologique (dans le sang) visant à utiliser des stratégies thérapeutiques nouvelles, ou combinatoires soutenant des stratégies non pharmacologiques (épi-médicaments ou thérapies basées sur l'ARN). Ces études permettront aussi de mieux comprendre la maladie d’Alzheimer, son développement et sa progression dans les modèles animaux, qui pourront être ensuite rapportés/étudiés chez l’Homme. Enfin, ce projet comprend les analyses conjointes sur les souris mâles et femelles. Les taux de prévalence de la maladie d'Alzheimer varient en fonction de l'âge mais aussi du sexe, les femmes représentant deux tiers des patients atteints. En apportant une analyse complète (cognitif, moléculaire, imagerie cérébrale) des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes pouvant être spécifiquement liés au sexe.

Procédures

240 animaux vigiles seront hébergés en cage isolée avec dispositif de nidification pendant 3 mois (de 6 à 9 mois), 120 bénéficieront d’une roue d’activité sur laquelle ils pourront tourner, cette roue sera bloquée pour les 120 autres animaux. Comportement réalisé sur 160 animaux vigiles sur une période de 33 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester différents aspects comportementaux et mnésiques (en moyenne 15 minutes par jour) sur 13 jours environ avec des phases de repos de 3 jours entre les tests. Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 9 mois.

Impact sur les animaux

L’isolement des congénères nécessaire pendant les tests comportementaux (33 jours) et pendant l’hébergement en cage d’exercice, ainsi que et leurs contrôles (3 mois) peut générer un stress. Dans un des tests comportementaux, les animaux sont placés dans l’eau à 22°C pendant un temps inférieur à une minute (4 fois/jour pendant 6 jours), ce qui peut produire un stress thermique ainsi qu’une hypothermie transitoire. Les études de comportement pourront induire du stress aux animaux.

Devenir

Tous les animaux (480) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 20 souris/groupe (10 mâles et 10 femelles) pour le comportement et l’imagerie cérébrale, et 6 souris/groupe (soit 3 mâles et 3 femelles) ainsi que 4 souris/groupe (soit 2 mâles et 2 femelles) pour les approches moléculaires. L’efficacité de chaque type d’hébergement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.

Raffinement

Pour appliquer le principe de raffinement, un enrichissement environnemental est apporté dans les cages standards ainsi que dans les cages à roue : dispositif de nidification (certifié contact alimentaire) chaque semaine. Les changes seront opérés par les animaliers à l’aide de tunnels (polycarbonate transparent), permettant de réduire le stress des animaux, notamment efficace chez les souris (raffinement d’hébergement). Dans le cas d’hébergement en cage isolé (cages à roue et comportement), plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance : les souris sont observées lors de la visite journalière, et une surveillance plus détaillée des souris se fait tous les 15 jours (observation visuelle de l’aspect général, posture). Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des tests comportementaux. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie. Les souris sont maintenues sous anesthésie lors des procédures d'imagerie pour réduire au maximum le stress de l'animal. Enfin, par mesure de raffinement lors de l'examen terminal, la combinaison anesthésie/analgésie générale sera renforcée par un analgésique locale.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront testés à l'âge de 9 mois, nos études antérieures ayant montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ce modèle. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.

45 souris obèses et diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des probiotiques dans l'eau de boisson pendant quatre semaines, subissent deux jeûnes de six heures et une incision au bout de la queue pour mesurer la glycémie, puis une anesthésie et un prélèvement sanguin avant la mise à mort. Le porteur teste une nouvelle voie d'administration d'un analogue d'un facteur de croissance contre la fonte musculaire, les retombées pour les patients restant renvoyées au conditionnel. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible et que cette lignée génétiquement modifiée est la seule à combiner trouble du métabolisme et fonte musculaire.

Objectifs

Le facteur que nous étudions sera appelé facteur X dans cette demande de projet. Le facteur X est un facteur de croissance décrit pour son rôle dans le métabolisme et reconnu pour son abilité à lutter contre la sarcopénie. La sarcopénie est une perte progressive de la masse et de la force musculaires liée au vieillissement et/ou à la maladie. C’est un facteur de risque pour la santé des sujets puisque le degré de la sarcopénie est lié à la mortalité. Il n’existe actuellement aucun traitement efficace. Dans ce contexte, le facteur X apparaît comme une solution prometteuse. Cependant, deux inconvénients sont liés à son utilisation : (i) sur le long terme, il favorise le développement de tumeurs du foie et (ii) il requiert d’être administré par injections. Ces deux inconvénients altèrent son potentiel comme outil thérapeutique. Récemment, un analogue du facteur X a été développé. Celui-ce ne favorise plus le développement de tumeurs, conserve les propriétés de régulation du métabolisme et est capable d’augmenter la taille des cellules musculaires dans des modèles en culture. Cependant, à ce jour, aucune équipe n’a encore vérifié sa capacité à lutter contre la sarcopénie ni trouvé d’alternative à l’administration par injections. Les objectifs de ce projet sont : -de valider une nouvelle méthode d’administration de l’analogue du facteur X. Pour cela, des bactéries probiotiques (bactéries non pathogènes) contenant la séquence ADN de l’analogue du facteur X ont été préparées. Elles seront données par voie orale (dans l’eau du biberon) aux souris afin que les cellules de leur intestin produisent elles-mêmes l’analogue. -de démontrer que cet analogue du facteur X produit dans l’intestin des animaux est produit en quantités suffisantes pour réguler le métabolisme et augmenter la taille des muscles et ce dans un modèle de souris obèses, diabétiques et sarcopéniques (souris ob/ob).

Bénéfices attendus

Plusieurs bénéfices pourront être tirés de ce projet. Premièrement, aucune équipe à ce jour n’a vérifié que l’analogue possédait toujours la capacité d’augmenter la taille des muscles. Les résultats permettront donc de faire progresser la connaissance. De plus, s’il est mis en évidence que l’analogue est capable d’augmenter la taille des muscles cela permettra de faire émerger une nouvelle molécule candidate pour la prise en charge de la sarcopénie, avancée non négligeable puisqu’il n’existe à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique. Enfin, les résultats pourront également permettre de valider une nouvelle approche d’administration de l’analogue du facteur X via les bactéries probiotiques, méthode moins invasive et bien plus physiologique que les injections.

Procédures

Les 45 souris recevront des probiotiques dans leur biberon (durée= 4 semaines). A deux reprises (avec deux semaines d’intervalle), les 45 animaux seront mis à jeun (sans nourriture) pendant 6 heures (durée nécessaire pour obtenir des mesures fiables). Suite à ce jeûne, une petite incision sera réalisée à l’extrêmité de la queue et une goutte de sang prélevée pour mesurer le glucose. Ce geste sera réalisé sur animaux vigiles et sans besoin de contention (durée= moins de 30 sec). Avant la mise à mort, les 45 animaux seront à nouveau mis à jeun pendant 6 heures. Suite à ce jeûne, ils seront anesthésiés par une injection dans l’abdomen (durée=30 sec contention comprise/animal) pour effectuer un prélèvement sanguin (20 secondes). Toutes les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement (2 secondes).

Impact sur les animaux

Cette procédure entraînera des nuisances modérées sur les animaux. En effet, le modèle de souris obèses, diabétiques et sarcopéniques est un modèle génétiquement modifié associé à un phénotype qualifié de dommageable. La mutation génétique donne lieu à une obésité massive à l’origine de la sarcopénie. Cette obésité massive peut réduire la mobilité des animaux, créant ainsi stress et inconfort. A l’âge où les animaux seront utilisés (entre 5 et 10 semaines de vie), aucune altération de la mobilité n’est attendue. Le jeûne nécessaire avant les mesures de glycémies et avant la mise à mort peut entraîner un stress et un inconfort des animaux. La petite incision au bout de la queue pour récupérer du sang et mesurer le glucose peut générer du stress et une douleur chez l’animal. L’injection d’anesthésiques nécessaire pour le prélèvement de sang final peut générer une douleur et un stress chez l’animal. Aucun effet néfaste lié à l’ingestion des probiotiques est attendu.

Devenir

Les 45 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier la capacité des probiotiques à transmettre les séquences ADN aux cellules de l’intestin des souris, puis la capacité de ces cellules à produire l’analogue, et enfin la capacité de celui-ci à agir sur les muscles et le métabolisme. Il s’agit d’une problématique complexe impliquant une cascade d’évènements et la communication entre plusieurs organes. Aucune alternative non animale n’est disponible pour répondre à une telle problématique. Ainsi ce projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Il est important de mentionner que l’analogue a été testé en amont sur des cellules de muscle en culture afin de valider ses propriétés. Le modèle de souris génétiquement modifié ne peut pas être remplacé par un autre modèle de souris car il est le seul à combiner une altération du métabolisme et une fonte musculaire.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Il est basé sur des études précédentes chez des souris injectées avec le facteur X. Pour observer une différence significative dans la taille des muscles, compte tenu de la variabilité et de la fragilité des muscles, il faut compter 15 souris/groupe. Cette procédure utilisera 45 animaux. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger ou pourront être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.

Raffinement

L’état général des animaux et leur comportement seront étroitement observés 3X/semaine. Les animaux seront pesés 2X/semaine. La prise alimentaire sera contrôlée 2X/semaine également. Les probiotiques seront administrés dans l’eau de boisson et non par gavage pour éviter manipulation quotidienne, stress et douleur liés au gavage. De la nourriture sera disposée dans les mangeoires mais aussi directement au fond de la cage pour palier aux difficultés de mobilité des animaux obèses. Les souris seront anesthésiées par injection pour permettre un prélèvement de sang avant la mise à mort. Surveillance des animaux, pesées, incisions du bout de la queue et injections seront réalisées par une personne expérimentée, si possible toujours la même, pour limiter le stress. Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier les effets des facteurs de croissance sur les muscles. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’Homme et permet d’étudier la production de l’analogue par les cellules de l’intestin ainsi que ses effets sur la taille des muscles et le métabolisme. Des souris âgées de 6 semaines seront utilisées. A ce stade, les souris obèses présentent les altérations du métabolisme et la sarcopénie qui sont les deux paramètres à améliorer grâce à l’action de l’analogue.

65 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent un vecteur viral et des immunosuppresseurs, puis subissent une greffe de cellules pancréatiques dans le foie par voie portale, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires, pour tester une thérapie génique censée rendre le foie tolérant à la greffe. Le porteur indique un risque de saignement à l'injection dans la veine porte et une baisse d'immunité exposant aux infections. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne mime l'organisme receveur, tout en reconnaissant que le passage à l'humain supposerait d'abord un partenariat industriel et des validations chez le primate.

Objectifs

L'objectif du projet est de jeter les bases expérimentales d'une nouvelle approche de la greffe d'îlots de Langerhans en clinique humaine. Celle-ci s'effectue actuellement avec des îlots de donneur ou, dans les essais thérapeutiques en cours, avec des cellules pancréatiques issuées de cellules souches humaines. Dans les 2 cas, une immunosuppression importante est necessaire pour tolérer les cellules greffées. Comme les îlots greffés son transplantés dans le foie du receveur par voie portale, notre approche originale est de rendre le foie receveur tolérant aux cellules issues du donneurou cellules souches le cas échéant. Nous avons conçu une stratégie qui consiste à introduire dans les hépatocytes le gène d'une cytokine anti-inflammatoire (IL 10). Pour effectuer ce transfert, nous utiliserons un vecteur viral adéno-associé (AAV) employé actuelleent dans la grande majorité des thérapies géniques (+ de 200 essais de phase 1 ont utilisé/utilisent ces vecteurs pour véhiculer des gènes thérapeutiques). Le vecteur portant le gène de l'IL10 sera injecté au receveur avant la greffe d'îlots. Les cellules hépatiques capteront le vecteur et exprimeront le gène thérapeutiue dans les 2 semaines qui suivront. L'IL10 produite permettra de réduire, voire d'inhiber la réaction immunologique de rejet du greffon qui sera implanté un mois après l'administration du vecteur.

Bénéfices attendus

Après l’achèvement du projet chez le rat, nous aurons en cas de succès obtenu la preuve de concept d’un procédé permettant de rendre le foie d’un patient diabétique tolérant aux îlots (ou aux cellules souches qu’on lui greffera). Dans la mesure où la thérapie génique par vecteurs AAV étend actuellement ses applications à de nombreuses maladies humaines, la biodistribution et la tolérance de ces vecteurs ont été largement étudiées chez l’homme et ne représenteront aucune barrière inattendue dans notre projet clinique. On peut donc en cas de succès chez le rat anticiper une forte probabilité de transfert aux patients diabétiques de type 1, chez qui les greffes restent actuellement très restreintes du fait des limites et des complications de l’immunosuppression. Pour réaliser ce transfert, il faudra très probablement aborder un partenariat avec une société biotechnologique disposant des moyens financiers suffisants pour conduire des validations spécifiques chez le primate et aller vers l’homme.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirugicale, à savoir la greffe de cellules pancréatiques. De plus, les animaux recevront des administrations de médicaments immunosuppresseurs et d'adénovirus 4 semaine avant la greffe. Enfin, les animaux seront prélevés de sang de façon hebdomadaire (

Impact sur les animaux

La transplantation des ilots de Langerhans se faisant dans le systeme sanguin portal, cela peut engendrer des saignements +/- abondants localement. Ceux-ci seront controler par l'application d'eponge hemostatique au niveau du point d'instillation de la veine porte. Cependant, il est eventuellement possible qu'un leger signement persiste après suture et réveil de l'animal (peu probable). Egalement, du fait des traitements immunosuppresseurs, les animaux traités verront leur immunité diminuée. Ils pourraient être eventuellement plus sensible aux infections. Une vigilance accrue sera prévue.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole.

Remplacement

Le projet a pour objectif général l'amélioration de la transplantation de cellules pancréatiques humaines. Il n'existe à ce jour aucune methode alternative efficace nous permettant de mimer l'organisme receveur. L'emploi d'animaux est essentielle dans un tel projet. Néanmoins, des manipulations in vitro préalables nous permettront de déterminer les meilleures concentrations cellules/virus.

Réduction

en fixant un niveau de confiance de 95%, une puissance statistique supérieure à 80%, il faut au minimum 4 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence statistique significative Le choix est donc orienté sur 5 animaux- receveurs par groupe pour pallier toute défaillance technique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement favorable à leur bien-être. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et habitué à ce genre de geste. Pour la transplantation faite sous anesthésie, un traitement anti-douleur local sera pratiquée, et pour des douleurs plus globales, un traitement systémique est prévu. Afin de suivre le moindre inconfort, nous avons élaborer un arbre décisionnel afin d'adopter les bons gestes et soins suivant les cas (Comportement, Plaie, perte de poids). Si toutefois, ces soins étaient insuffisants pour améliorer la santé de l'animal concerné, nous procéderons à l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Le choix s'oriente chez le rat pour plusieurs : - Taille compatible avec un chirurgie (transplantation intra-hépatique aisée et moins dommageable que chez la souris) - Capacité d'hébergement adapté

2280 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur supprime une ou plusieurs protéines des lymphocytes T, par manipulation génétique ou par injection sur trois jours, avant de les mettre à mort pour prélever thymus, rate et ganglions, afin d'étudier la régulation des cellules T impliquées dans les maladies auto-immunes. Le porteur indique que l'absence de ces protéines peut provoquer un lymphome T et prévoit une mise à mort si le poids chute de 5 %. Il affirme qu'il est "impossible" de remplacer l'animal car les cellules T naïves doivent rester dans un environnement in vivo, les retombées thérapeutiques restant au stade des bases moléculaires.

Objectifs

Notre équipe travaille sur des protéines jouant un rôle crucial dans le développement et la fonction des cellules du système immunitaire. Ces protéines intéragissent avec d'autres protéines pour moduler la fonction des cellules T. Cependant, jusqu’ici, aucune étude n’a déterminé l’impact de l’absence cumulée de ces différentes protéines dans le devenir des cellules T. L’objectif de ce projet est de déterminer la coopération fonctionnelle entre différentes protéines dans les mécanismes qui contrôlent la génération et la maintenance des cellules T inflammatoires. Nous génèrerons différentes combinaisons de souris ne possédant plus ou partiellement ces protéines, soit de manière chronique dans les cellules T, soit de manière inductible après injection d'un composé spécifique. Après mise à mort, les organes lymphoïdes (thymus, rate, ganglions lymphatiques) seront récupérés et des expériences in vitro seront réalisées.

Bénéfices attendus

L’utilisation de ces modèles murins nous permettra de comprendre comment un réseau de protéines peut contrôler la génération, la maintenance, l’activation des cellules T, qui sont des acteurs principaux dans différentes pathologies autoimmunes telles que la sclérose en plaque ou l’arthrite rhumatoïde. Comprendre les mécanismes sous-jacents permettra de poser les bases moléculaires pour le développement de nouveaux traitements pour ces pathologies.

Procédures

Les injections du produit permettant la suppression de nos protéines se font sur animaux vigiles. Après une contention de la souris, le produit sera injecté à raison d'une injection par jour, pendant 3 jours consécutifs. La procédure prend 20 secondes maximum à partir du moment où l'animal est pris en main.

Impact sur les animaux

L'absence des protéines que nous étudions peut conduire à un développement d'un lymphome T. Nous effectuerons une étude pilote pour déterminer si ces souris sont susceptibles de développer un lymphome et à quel âge. Nous surveillerons les souris étroitement afin de veiller à ce qu’elles ne montrent aucun signe de souffrance comme par exemple le poil hérissé, le dos vouté, une prostration. L'injection du produit permettant l'élimination de nos protéines ne prendra que quelques secondes et le site d’injection sera surveillé chaque jour et désinfecté si besoin.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement d'organes

Remplacement

Nous travaillons sur le devenir des cellules T naïves, qui ont la particularité de ne jamais avoir rencontré de pathogène. Jusqu’à ce jour, les lignées cellulaires disponibles ne récapitulent pas les caractéristiques des cellules T naïves. Dans l’état actuel de notre projet, les cellules T näives ne peuvent être remplacées par un autre modèle animal, une lignée cellulaire ou des expériences in vitro que nous avons déjà réalisées. Ces cellules doivent être maintenues dans un environnement in vivo pour maintenir leur caracéristiques spéciales. C'est pourquoi notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo et qu'il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux dans ce projet. Cependant, au cours de notre expérimentation, nous nous réservons la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le but de ce projet sera de récupérer les organes lymphoïdes afin d’étudier le devenir des différentes populations des cellules T ex vivo et d’étudier la biologie des cellules T naïves in vitro. Nos prélèverons le maximum d’organes (ganglion, rate, thymus) pour chaque animal afin de collecter le plus d’informations au cours d’une procédure. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs. Un test statistique sera effectué pour comparer les groupes.

Raffinement

Une étude pilote permettra de déterminer si les souris ne possédant plus ou partiellement les deux protéines étudiées sont susceptibles de développer un lymphome et à quel âge. Pour la suite de l'étude, les animaux seront utilsés avant apparition d’un phénotype dommageable. Les souris seront élevées dans une zone d'élevage spécifique, protégeant les souris de pathogènes spécifiques et établissant un statut sanitaire de souris en bonne santé. Les souris seront étroitement surveillées afin de veiller à ce qu’elles ne montrent aucun signe de souffrance comme par exemple le poil hérissé, le dos vouté, une prostration. Les animaux seront élevés en groupe dans des cages ventilées avec le matériel nécessaire pour qu'elles créent leur nid et leur permettre des conditions d'hébergement optimales. Si une diminution du poids corporel de 5% sur une semaine est observée, l’animal sera sorti du lot et mis à mort. Lors de l’injection du produit permettant la suppression des protéines d'intérêt, le risque d’infection dans la zone d’injection sera pris en considération.

Choix des espèces

Les souris présentent l’avantage de pouvoir être modifiées génétiquement, ce qui permet de contrôler l’expression d’un ou plusieurs gènes soit dans un type de cellule spécifique, soit dans toutes les cellules. Le système immunitaire de la souris se rapproche de l’Homme et représente un modèle de référence pour l’étude des cellules T et de certaines pathologies comme les maladies auto-immunes associées à une dérégulation des cellules T, ce qui est l’objet de notre recherche. Nous étudions le devenir d'une population de cellules T très spécifiques qui a la particularité de ne pas avoir rencontré de pathogène. Cette population est plus abondante chez les souris jeunes. De ce fait, nous utiliserons les souris qui auront une suppression des protéines spécifiquement dans les lymphocytes T entre 4 et 8 semaines et celles qui auront une suppression des protéines aigüe entre 4 et 15 semaines.

1080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau sous anesthésie, puis est mis à mort deux semaines plus tard pour analyse histologique, afin de suivre par CRISPR/Cas9 l'expression de marqueurs fluorescents dans les astrocytes. Le porteur indique des douleurs postopératoires modérées, atténuées par des antalgiques, et une douleur légère liée à la biopsie d'oreille. Il affirme qu'un système in vitro ne peut pas reproduire les interactions entre astrocytes, neurones et vaisseaux, et qualifie ce travail d'"indispensable" pour de futures cibles thérapeutiques.

Objectifs

Les astrocytes sont les cellules gliales majoritaires du cerveau. Ils possèdent une interface vasculaire qui consiste en des prolongements ou "pieds" qui vont au contact des vaisseaux sanguins cérébraux. A cette interface, appelée l’unité gliovasculaire, les astrocytes régulent les fonctions vasculaires cérébrales. Cependant les modalités de ces régulations astrocytaires sont très mal connues alors même qu'elles sont altérées dans un grand nombre de pathologies cérébrales. Dans une étude récente, nous avons identifié de nouveaux répertoires moléculaires des interfaces astrocytaires. Le but de notre projet est de caractériser l’expression de ces nouveaux marqueurs au cours du développement des astrocytes par la technique CRISPR Cas9 permettant d’intégrer un marqueur fluorescent dans les gènes candidats pour suivre leur expression dans les astrocytes du cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau le répertoire moléculaire des astrocytes du cerveau qui est encore mal connu. Il est indispensable de faire progresser ce domaine de recherche car les astrocytes sont de plus en plus considérées comme des cibles thérapeutiques pour les pathologies neurologiques. Cependant sans une connaissance accrue de leur fonctionnement moléculaire ces pistes ne pourront pas être développer.

Procédures

Concernant le génotypage sur biopsie, cette procédure est validée dans une autre DAP. Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale qui durent 30 minutes. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Ils seront mis à mort 2 semaines après la première intervention.

Impact sur les animaux

Douleurs post opératoire de gravité modérée minorées par des antalgiques et douleur légère de courte durée liée à la biopsie d’oreille.

Devenir

L euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour le prélèvement et l'analyse histologique des tissus.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Cependant, le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entre les différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la sur-utilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et de l'environnement. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 4 animaux indépendant par condition. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité possible entre les animaux en général.

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les opérations seront faites sous anesthésie générale. Les souris subissant une opération feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure de chirurgie et les jours suivants. L'intervention pouvant générer de l'inconfort et de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, les points limites intermédiaires permettant la mise en place de soins des animaux sera mise en place évitant l'euthanasie des animaux. Des analgésiques sont prévus et co-administrés pour limiter la souffrance pendant et après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous avons identifié 60 marqueurs à étudier lors d'une étude transcriptomique menée au laboratoire, à tester au cours du développement de l’unité gliovasculaire au jour postnatal 15, à 2 mois, à 4 mois et à 1 an. Ces différents stades permettre de suivre l’évolution de l’expression des marqueurs au cours de la maturation des astrocytes ce qui est essentiel pour comprendre leur fonction.