Procédures légères
Role de la signalisation cannabinoide dans la régulation astrocytaire de la plasticité du cortex visuel
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un œil suturé, le crâne incisé et ouvert pour une injection intracérébrale : 1 432 souris subissent ces interventions, 1 320 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 112 d'un niveau léger, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur indique que la fermeture d'un œil a au long cours une incidence modérée sur le bien-être de l'animal non-humain, et qu'après la chirurgie crânienne des souris peuvent perdre du poids, présenter un comportement anormal ou devenir incapables de boire et de se nourrir. Certaines sont utilisées à 21, 28 ou 50 jours, donc dès le stade juvénile. Le projet porte sur le rôle d'un récepteur aux cannabinoïdes dans la plasticité du cortex visuel, avec des pistes annoncées pour comprendre les troubles du neurodéveloppement.
Objectifs
La plasticité cérébrale est la capacité à modeler et remodeler la structure et la fonction des réseaux de neurones en fonction des expériences. A la naissance, les connexions qui participent aux fonctions sensorielles, motrices et cognitives sont immatures. Elles se raffinent au cours de fenêtres de plasticité accrue, appelées périodes critiques. Leurs altérations sont associées à des troubles du neurodéveloppement. Des travaux récents ont mis en évidence le rôle de cellules du cerveaux appelées "astrocytes" dans la régulation de la période critique du cortex visuel. Notre projet a pour but d'élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans ce processus, en nous intéressant plus particulièrement au rôle du récepteur aux cannabinoides à la surface de ces cellules.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, ces travaux doivent enrichir nos connaissance concernant le rôle des astrocytes dans la régulation de la plasticité cérébrale. D’un point de vue plus médical, ces travaux doivent offrir de nouvelles pistes de compréhension des troubles du neurodéveloppement dans lesquels des altérations de période critique ont été décrits, comme l'autisme.
Procédures
Injection dans la cavite abdominale (environ 5 minutes, une fois par jours 4 à 5 jours de suite par souris). Suture d'un seul oeil (environ 15 minutes, une seule fois par souris). Injection intracerebrale (environ 30 minutes, une seule fois par souris). Imagerie cérébrale chez l’animal vivant (environ 2h, une seule fois par souris).
Impact sur les animaux
L’injection dans la cavité abdominale peut induire une douleur et un stress légers à la piqure et une irritation abdominale en lien avec le produit injecté. La suture d’un oeil sous anesthésie générale peut s’accompagner d’une douleur légère autour de l’oeil au réveil et une plaie superficielle dûe au grattage est possible dans les jours suivants. Au long cours, la fermeture d’un oeil a une incidence modérée sur le bien-être de l’animal. L’injection intracérébrale sous anesthésie générale nécessite d’inciser la peau du crane et de réaliser une ouverture dans ce-dernier. Au reveil, des douleurs post-operatoires modérées peuvent etre presentes sur une courte durée. Dans les jours suivant la chirurgie, les animaux peuvent dans certains cas présenter des pertes de poids, un comportement anormal, une incapacité de boire ou se nourrir. L’imagerie cérébrale chez l’animal vivant se fait par illumination à travers le crâne, sous anesthésie. Elle nécessite d'inciser la peau du crâne sans faire d'ouverture dans ce dernier.
Devenir
Les animaux seront donc euthanasiée en fin de procédure afin de pouvoir prélever leur cerveau pour des études en histologie.
Remplacement
Pour l’étude fonctionnelle de la plasticité du cortex visuel, il n’est pas possible de remplacer les enregistrements du cerveau intact par des simulations ou par des cultures de cellules du cerveau.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la taille des lots en calculant en amont, par des formules statistiques dédiées, le nombre d'animaux nécessaire pour détecter l'effet attendu. De plus, chaque animal étudié en imagerie optique intrinsèque sera perfusé en fin de procédure afin de coupler l’analyse histologique à l’analyse fonctionnelle. Enfin, dans plusieurs expériences, un animal sera son propre contrôle en utilisant les données des deux hémisphères. Ces éléments doivent permettre de réduire le nombre d’animaux de manière significative.
Raffinement
Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Après l’injection intra-corticale, les animaux seront surveillés quotidiennement et suivis à l’aide d’une grille de score prenant en compte l’apparence et le comportement de l’animal. Pour les expériences d'imagerie et d’injection intra corticale, pour pallier la douleur induite par l'incision de la peau au-dessus du crâne, un analgésique sera injectée avant. De plus, la technique d'imagerie utilisée pour l’enregistrement de l’activité cérébrale est minimalement invasive et ne nécessite pas de chirurgie lourde. Les animaux seront logés à plusieurs dans des cages contenant du coton pour faire leur nid et boisson et nourriture à volonté. Enfin, pour chaque procédure, nous avons défini des points limites motivant une action précoce pour limiter la souffrance de l'animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car son développement est proche de celui de l’homme. Le décours temporel de sa période critique dans le cortex visuel a déjà été exploré, ce qui permettra une meilleure comparaison avec les résultats décrits dans la littérature. De plus, notre équipe utilise couramment cette espèce et possède l’expertise technique sur ce modèle. Par ailleurs, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de parents. Enfin, la souris permet de nombreuses manipulations génétiques non disponibles dans d'autres modèles mammifères. Pour toutes les procédures sauf une, les animaux seront utilisés à différentes étapes du développement : 21 jours (ouverture de la période critique du cortex visuel), 28 jours (pic de plasticité de la période critique), 50 jours (fermeture de la période critique), 100 jours (plasticité adulte). Ceci permettra d’identifier une éventuelle altération du décours temporel de la période critique dans nos différentes expériences. Pour une procédure à part, l’expression du récepteur à la surface des astrocytres étant maximale à l’âge adulte, nous utiliserons des souris après 90 jours.
Evaluation de la biodistribution de nanoparticules dans un modèle murin sain
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Pour cribler des nanoparticules censées mieux acheminer des médicaments vers les muscles, 195 souris saines sont utilisées, toutes tuées à l'issue, 105 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 90 d'un niveau modéré. Elles sont rasées sur le ventre, reçoivent jusqu'à deux injections intramusculaires ou intraveineuses sous anesthésie, ou des injections intranasales sur animal vigile, et pour certaines une injection de toxine provoquant une lésion musculaire. Le porteur situe le bénéfice pour les personnes atteintes de dystrophie musculaire à deux étapes de distance, après des tests sur des animaux dystrophiques puis chez l'humain. Il indique que ces nanoparticules ont déjà fonctionné sur des cultures de cellules musculaires, tout en jugeant l'animal "indispensable" pour étudier des "organismes entiers".
Objectifs
Les dystrophies musculaires (telles que la myopathie de Duchenne) sont des troubles entrainant un handicap physique qui touche 20 personnes sur 100 000 dans le monde. Malgré une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques des dystrophies, presque aucun traitement n'est disponible. Ce projet vise à améliorer le transport des molécules médicaments en utilisant des nanoparticules vers les zones musculaires cibles pour augmenter leur efficacité.
Bénéfices attendus
Le présent projet permettra de démontrer l'efficacité des nanoparticules pour véhiculer des molécules médicaments dans les muscles d'animaux sains et en régénération musculaire. Ces études devraient permettre de cribler les nanoparticules qui ont une meilleure affinité pour le muscle. Ensuite elles pourront être testé chez des animaux avec dystrophie pour pouvoir ensuite être testé chez l'humain.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux seront rasés sur la face ventrale pour des raisons d'imagerie des animaux. Ensuite, certains animaux seront soumis à des injections intramusculaires ou intraveineuses (maximum 2 par animal) qui seront réalisées sous anesthésie gazeuse (temps d'anesthésie inférieur à 10 minutes). D'autres animaux seront soumis à des injections intranasales sur animaux vigiles (inférieur à 2 min) afin de permettre l'inhalation des nanoparticules.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, du stress peut être induit aux animaux lors des anesthésies et des contentions pour la réalisation des injections. De plus, une légère douleur passagère peut être induite à la suite de l’injection du traitement. L’injection de la toxine induisant la lésion musculaire peut induire une légère douleur musculaire. L'injection intranasale se faisant sur animal vigile peut occasioner du stress chez l'animal. Le rasage de la face ventrale de l'animal peut occasioner du stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée des différents organes prélevés qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Des études préliminaires ont démontré l'efficacité de nos nanoparticules pour délivrer des molécules thérapeutiques dans des cultures de cellules musculaires. Pour aller plus loin, l'utilisation d'animaux est indispensable pour ce projet car il vise à démontrer et optimiser l’efficacité thérapeutique de nanoparticules pour traiter préférentiellement les muscles tout en limitant leur impact sur les autres organes. Il est donc nécessaire de pouvoir étudier l'effet de ce traitement sur des organismes entiers.
Réduction
L'utilisation des animaux est réduite au nombre minimal et nécessaire pour l'obtention de données expérimentales statistiquement exploitables. Ce projet étant conçu par étapes successives, l'obtention de résultats positifs sera nécessaire pour passer à l'étude suivante. L'efficacité des nanoparticules ne sera pas uniquement étudiée au niveau du muscle mais également pour tous les organes vitaux, ainsi si ces nanoparticules démontraient une possible efficacité dans un organe spécifique autre, cela pourrait conduire à l'établissement de potentielles nouvelles applications.
Raffinement
Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage et de bien-être afin d'enrichir l'environnement des souris (incluant boules de coton, dôme et roue). Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Durant toute la durée des protocoles les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bien-être général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. Les souris devant être rasées sur la face ventrale, du coton sera placé dans les cages. Lors de l'injection d'une lésion musculaire dans la patte arrière de certains animaux, ceux-ci auront à disposition de l'eau gélifiée ainsi que des croquettes humidifiées dans leur cage pour éviter de devoir se dresser.
Choix des espèces
La structure et le fonctionnement du tissu musculaire de la souris sont très proches de ceux de l'homme. La souris représente donc un modèle expérimental privilégié pour les investigations des maladies musculaires survenant chez l’homme. Les souris utilisées seront adultes, âgées de 8 à 12 semaines, car à ce stade les souris ont un système nerveux et musculaire entièrement développé, ce qui permet des études plus précises et plus pertinentes de la progression des maladies et des traitements potentiels.
Consolidation du protocole de marquage par fluorochrome chez l’anguille européenne (Anguilla anguilla) pour la détection externe des marques sur individus vivants en vue d’applications opérationnelles
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Relâchées dans le milieu naturel à l'issue de l'expérience, 900 civelles sont capturées en estuaire, marquées par immersion dans un colorant fluorescent puis maintenues 180 jours en aquarium et en bassin, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. 300 d'entre elles sont anesthésiées, mesurées et passées au lecteur portatif à 60 et 180 jours. Le porteur indique que la mise à mort restera "anecdotique", limitée aux cas d'atteinte des points limites, et compte sur une mortalité en captivité pouvant atteindre 40 à 50 %. L'objectif déclaré est de valider une détection externe des marques, ce qui éviterait à l'avenir de tuer les civelles pour lire leurs otolithes.
Objectifs
Face au déclin des population d’anguilles européennes, des mesures sont mises en œuvre pour reconstituer les stocks et sauvegarder l’espèce, dans le cadre du plan national de gestion de l’anguille. Des opérations de repeuplement sont réalisées chaque année : des jeunes anguilles (civelles) sont capturées en estuaire et relâchées dans les zones amont des cours d’eau côtiers. Afin d’évaluer le succès de cette pratique de repeuplement, il est nécessaire de pouvoir différencier les individus introduits ; pour cette raison, les civelles capturées sont marquées par immersion dans un colorant avant d’être relâchées. Ce colorant génère une marque fluorescente fixée durablement dans les structures osseuses des jeunes anguilles, et en particulier dans des concrétions de l’oreille interne (otolithes). L’observation de ces structures nécessite toutefois la mise à mort des individus. La possibilité d’une détection externe des marques a été récemment démontrée sur des civelles et des tests réalisés en 2022 puis 2023 ont confirmé la présence de marques dans la mâchoire et les nageoires des civelles, détectable après 180 jours à l’aide d’un dispositif portatif. L’objectif de la présente étude est de rendre opérationnel le protocole de marquage en réduisant les quantités de colorant utilisé et en validant la procédure de détection sur des individus vivants après 6 mois.
Bénéfices attendus
La lecture externe des marques sur individus vivants permettrait en premier lieu la préservation des civelles analysées (pas de mise à mort), une simplification du protocole de détection, la réduction du temps de lecture des marques et l’augmentation de la taille de l’échantillon analysé dans un soucis de représentativité statistique.
Procédures
Les animaux seront soumis au marquage par immersion dans une solution de marqueur fluorescent, selon 4 traitements et un contrôle. La durée des interventions sera de 13.5 minutes (balnéations "flash"). Puis 60 individus seront prélevés, anesthésiés, mesurés, pesés et leur fluorescence observée à l’aide du lecteur portatif. La durée totale de l’intervention hors d’eau sera de 1 minute.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables potentiels sur les animaux concernent le transport après capture, le marquage, le maintien en captivité et l’anesthésie avant lecture de fluorescence. Toutefois, ces effets peuvent être considérés comme légers au vu de l’expérience des opérateurs dans le transport et le marquage des civelles, qui sont communément réalisés dans le cadre du programme de repeuplement.
Devenir
900 civelles seront capturées, transportées, marquées puis stabulées pendant 180 jours en aquarium puis en bassins (mésocosmes). A 60 et 180 jours, 150 individus seront anesthésiés, mesurés, analysés (mesure de fluorescence), puis remis en liberté. Tous les autres individus seront remis en liberté en fin d’expérience. La mise à mort restera anecdotique, uniquement en cas d’atteinte des points limites.
Remplacement
La civelle est l’objet d’étude et ne peut pas être remplacée pour cette expérience de recherche de fluorescence externe. Les résultats obtenus sur une autre espèce de poisson ne pourraient être transposés à la civelle, du fait de sa singularité morphologique (poisson serpentiforme), anatomique (épiderme translucide) et comportementale (activité nocturne).
Réduction
L’effectif de 900 individus (3 lots de 50 individus pour chacun des 5 traitements + 1 lot contrôle de 150 individus) tient compte de la mortalité attendue en milieu contrôlé au stade civelle (maximum 40-50%, en fonction de la qualité des civelles récupérées chez le mareyeur, variables selon la période de pêche). A 2 occasions au cours du suivi (60 et 180 jours), un effectif de 30 individus par traitement sera analysé. Ainsi, au total 300 individus seront anesthésiés et analysés, afin de prendre en compte la variabilité inter-individuelle du niveau de fluorescence, potentiellement importante si l’on se réfère aux résultats des études réalisées en 2022. Tous les individus (analysés ou non) seront relâchés dans le milieu naturel sur les sites de repeuplement (au maximum 900 individus).
Raffinement
Lors du transport, les civelles seront réparties dans deux sacs de transport gonflés à l’O2 et contenant un volume d’eau adapté. La densité de civelles sera très faible comparé aux densités de stockage observées chez les mareyeurs et lors des opérations standards de marquages effectuées depuis 2011 pour les repeuplements. La durée de transport est limitée au minimum et estimée à environ 1 heure, ce qui permet de garantir le maintien d’un niveau d’oxygénation très élevé dans les sacs (très faible consommation par les civelles). Pour le marquage, l’oxygénation des solutions sera maintenue à 100% à l’aide de diffuseurs d’oxygène, point essentiel en raison des fortes densités d’individus. Les aquariums seront enrichis à l’aide caches constituées de tubes PVC puis des flottangs seront utilisés dans les mésocosmes, dispositifs permettant aux civelles de s’abriter. Des daphnies seront ensemencées pour leur alimentation. La concentration en déchets du métabolisme azoté sera contrôlée chaque semaine, la concentration en oxygène et la température seront également contrôlées quotidiennement. Des changements d’eau seront réalisés si nécessaire, notamment en période de fort réchauffement estival. Lors des contrôles de fluorescence (à 60 et 180 jours), les civelles seront anesthésiées individuellement puis au moment de la lecture de fluorescence, leur tête sera protégée des rayonnements laser à l’aide d’un cache opaque. La durée totale de la manipulation hors d’eau n’excèdera pas 1 minute.
Choix des espèces
L’anguille est une espèce menacée au niveau européen, qui fait l’objet d’un plan de conservation à l’échelle nationale. L’évaluation des pratiques de repeuplement par une méthode de détection externe non létale représente un fort enjeu pour la gestion future. Les animaux seront utilisés au stade civelle car c'est le stade utilisé en France pour réaliser les opérations de repeuplement d'anguille.
Étude de la dysfonction coronaire microvasculaire et de sa prévention par échographie chez le petit animal (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses immunohistochimiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation qui les rend diabétiques et obèses, elles reçoivent un gavage quotidien six jours sur sept pendant douze semaines, quatre échographies cardiaques sous anesthésie avec épilation de la zone examinée, et deux prélèvements de sang à la queue sur animal vigile. Le porteur justifie la mise à mort par la "nécessité" d'objectiver la dysfonction des microvaisseaux coronaires par des analyses post-mortem. Le projet teste un médicament contre l'insuffisance cardiaque déjà commercialisé, l'Entresto, dont il indique que les effets coronaires restent inconnus.
Objectifs
Les maladies des artères coronaires sont responsables d’une augmentation de la mortalité cardiovasculaire. L’objectif de cette étude est d’étudier la possibilité de la prévention de ces maladies en utilisant un traitement contre l’insuffisance cardiaque (Entresto) dont les effets coronaires sont inconnus à ce jour, dans un modèle de souris obèse diabétique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra l’évaluation de la capacité de l’Entresto à prévenir la dysfonction coronarienne microvasculaire.
Procédures
Les animaux prendront part à plusieurs imageries échographiques cardiaques réalisées à 8, 12, 16 et 20 semaines d’âge. Elles se feront sous anesthésie volatile et dureront 30 min maximum pour chaque souris. Durant les acquisitions les souris seront épilées au niveau de la zone d’intérêt avec une crème épilatoire pour peaux sensibles, elles seront sur un lit thermostaté pour compenser la chute de température corporelle liée à l’anesthésie et recevront un gel ophtalmique pour prévenir toute sécheresse oculaire. Les échographies auront lieu dans un autre établissement utilisateur que l’hébergement, Le transport des animaux vigiles prendra environ 10 min et se fera par voie pédestre dans des conditions de raffinement maîtrisées en utilisant des cages isolées des stimuli extérieurs. A partir de l’âge de 8 semaines et immédiatement après la 1ère échographie, une solution d’Entresto dilué dans du liquide physiologique sera administrée quotidiennement par gavage aux animaux du groupe traité jusqu’au terme du protocole, c’est-à-dire pendant 12 semaines, soit jusqu’à 20 semaines d’âge. Le volume administré quotidiennement per os sera de l’ordre de 500 µL. Les animaux des groupes diabétiques et contrôles non traités se verront administrer un volume similaire de liquide physiologique. Une trêve dominicale sera observée pour tous les animaux (traitement 6 jours / 7 pendant 12 semaines), compatible avec la pharmacocinétique de l’entresto décrite chez le rongeur. Un prélèvement sanguin caudal sera effectué sur les animaux vigiles à 8 et 20 semaines pour dosage plasmatique d'un marqueur d’efficacité du traitement.
Impact sur les animaux
L’imagerie échographique cardiaque implique l’administration intrapéritonéale d’un agent vasodilatateur qui sera réalisée sous anesthésie volatile afin de limiter le stress aux animaux. Le transport et le changement d’animalerie peuvent aussi induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport, pédestre, sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que les deux prélèvements caudaux peuvent également causer un stress léger. En revanche, aucun effet indésirable n’est attendu comme conséquence de l’administration de l’Entresto, qui est largement utilisé en clinique.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue de la procédure expérimentale est justifiée par la nécessité d’objectiver la dysfonction coronaire microvasculaire par des études immunohistochimiqes post-mortem.
Remplacement
Les atteintes des microvaisseaux coronaires sont la conséquence de désordres métaboliques et physiologiques qui sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro et qui nécessitent l’utilisation d’un modèle animal. De plus, l’évaluation de l’effet de l’Entresto sur la microcirculation coronaire doit être effectuée in vivo pour que l’on puisse envisager une extrapolation des résultats à la situation clinique.
Réduction
L’utilisation de 24 animaux au total se répartissant en 8 animaux / groupe est un minimum pour l’analyse fiable des résultats. Nous fondons ce dimensionnement sur une étude préalable ayant mis en évidence une dysfonction coronaire microvasculaire par réduction significative de la réserve coronaire in vivo chez des rats obèses avec des effectifs similaires. Nous comptons également sur l’absence de mortalité observée précédemment au décours de ce protocole expérimental pour limiter au maximum la taille initiale des groupes expérimentaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites stricts et spécifiques au modèle animal et aux actes réalisés sont mis en place, via une grille de scoring, afin d’évaluer une potentielle souffrance. Une surveillance accrue de la consommation d’eau de boisson en raison de la polydipsie des animaux diabétiques sera réalisée et la fréquence de change des cages sera augmentée si nécessaire. Les sessions d’imagerie échographique cardiaque se dérouleront sous anesthésie volatile, avec une anesthésie d’environ 30min. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et les fréquences respiratoire et cardiaque seront monitorées en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie échographique cardiaque n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse.
Choix des espèces
La lignée de souris choisie possède une mutation génétique qui la rend diabétique. Le modèle est très largement utilisé pour l’étude de maladies métaboliques car il reflète bien la maladie humaine , tout en étant moins sévère que d’autres modèles. Ce modèle constitue donc un outil largement utilisé pour l’étude de la maladie coronaire microvasculaire et de sa prévention. Les animaux seront accueillis à 7 semaines d’âge, à un stade de développement précoce de la maladie diabétique entraînée par la mutation dont ils sont porteurs. Le choix de ce stade précoce est guidé par la volonté d’étudier le potentiel de l’Entresto à prévenir la maladie coronaire microvasculaire.
Rôle spécifique des composants d’une voie de réponse à l’infection dans l’immunodépression suite à une infection chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour comprendre l'immunodépression qui suit une infection sévère, 7 648 souris sont utilisées, toutes tuées pour prélever des organes vitaux, 6 880 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 768 d'un niveau sévère. Une partie subit une péritonite provoquée par perforation du tube digestif sous anesthésie, une autre reçoit l'injection d'un composant bactérien sur animal vigile, puis des injections d'inhibiteurs chaque jour pendant six jours jusqu'à la mise à mort. Le porteur indique que la péritonite peut provoquer douleurs, perte de poids et réduction de la mobilité, et prévoit une mise à mort anticipée en cas d'inconfort trop important. Il juge l'étude sur "animal entier" indispensable et rappelle que des médicaments inhibant cette voie sont déjà utilisés en clinique dans d'autres indications, ce qui rend selon lui la perspective thérapeutique "très concrète".
Objectifs
Chez les patients de réanimation présentant une infection sévère, des altérations de la réponse immunitaire se développent, responsables de la majorité des décès. Les mécanismes à l’origine de ces dysfonctionnements des cellules du système immunitaire restent mal connus. L’activation d’une voie particulière de l’inflammation pourrait participer à ce phénomène. Les souris présentant une infection sévère ont une activation de cette voie, en association avec des altérations du système immunitaire. Au cours de ce projet, nous allons étudier plus précisément le rôle respectif des différents composants de cette voie en utilisant d’une part des souris génétiquement modifiées capables ou non d’activer cette voie de l’inflammation et d’autre part des inhibiteurs de cette voie. Nous utiliserons un modèle murin d’infection sévère par péritonite ou par injection d’un composant bactérien. Nous étudierons les altérations immunitaires présentées par ces souris dans différents organes (rate, moelle osseuse, sang, péritoine, poumon).
Bénéfices attendus
Les infection sévères sont des pathologies fréquentes qui peuvent causer de nombreuses maladies et décès. Le pronostic des patients développant ces infections sévères est principalement grevé par le développement d’altérations de la réponse immunitaire à l’origine à moyen terme d’infections secondaires contractées à l’hôpital et à long terme du développement de maladies cardiovasculaires et de cancers. Une meilleure compréhension des mécanismes de ces altérations est jugée nécessaire par l’Organisation Mondiale de la Santé pour progresser dans la prise en charge de cette pathologie. En focalisant les efforts sur une voie majeure de réponse à l’infection et en particulier sur ses différents composants, cela permettra de générer des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles d’améliorer le devenir de ces patients. L’existence de médicaments capables d’inhiber cette voie utilisés en pratique clinique et bien tolérés dans d’autres indications rend cette perspective très concrète. Ces stratégies thérapeutiques innovantes auraient un effet préventif des conséquences à moyen et long terme de ces infections sévères.
Procédures
L’étude des modifications génétiques des souris sera réalisée grâce à une biopsie de l’oreille. Le projet s’appuie sur 2 modèles d’infections chez la souris. Le premier modèle est une infection au niveau abdominal (péritonite) créée par perforation du tube digestif (durée de la procédure : 5 minutes) sous anesthésie générale. Cette intervention est réalisée une seule fois en début de procédure, à J0. Le deuxième modèle consiste en l’injection d’un composant bactérien (injection sur 10 secondes) sur animal vigile. Cette injection est réalisée une seule fois en début de procédure à J0. L’injection des différents inhibiteurs d’une voie de réponse à l’infection sera réalisée au maximum une seule fois par jour pendant 6 jours, jusqu’à mise à mort de l’animal (De J1 à J6 injection sur 10 secondes) sur animal vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés exclusivement sous anesthésie générale le jour de la mise à mort (10 secondes) et les différents autres prélèvements en post-mortem.
Impact sur les animaux
La péritonite peut être à l’origine de douleurs, d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité. Il existe également une douleur au point d’injection lors de l’injection d’anesthésique. L’injection du composant bactérien est à l’origine d’une perte de poids, d’une douleur au point d’injection lors de l’injection et d’une réduction de l’activité et de la mobilité. L’injection d’inhibiteurs de cette voie de l’inflammation génère une douleur au point d’injection lors de l’injection. L’étude des modifications génétiques des souris sera réalisée grâce à une biopsie de l’oreille. Cette biopsie est à l’origine d’une douleur légère de courte durée.
Devenir
Une mise à mort sera réalisée à l’issue des procédures du fait du prélèvement nécessaire d’organes vitaux (poumon par exemple) ne permettant pas d’envisager une autre issue.
Remplacement
Un modèle utilisant uniquement des cellules isolées ou l’utilisation d’outils informatiques ne pourraient refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire contre les infections sévères et les relations entre les cellules de l’immunité. L’étude sur un animal entier est donc indispensable et nous utiliserons 2 modèles d’infection bien validés dans d’autres études et qui reproduisent la réponse anti-infectieuse décrite chez l’homme.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, de multiples analyses utilisant des techniques différentes seront réalisées sur les différents prélèvements afin de minimiser le nombre de souris utilisé.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être, une prise en charge de la douleur (anesthésie générale lors de l'intervention, administration d’antalgiques) et une prise en charge de la déshydratation seront réalisées. A l'issue de la chirurgie, les souris seront replacées dans leurs cages avec un aménagement spécifique pour garantir leur confort. La cage sera placée dans une armoire chauffante. Une surveillance quotidienne avec pesée des souris et grille d’évaluation spécifique sera effectuée jusqu'à mise à mort. En cas de douleur ou d’inconfort trop important, une mise à mort anticipée des souris sera réalisée.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement et des modèles génétiquement modifiés sont d’ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (8-12 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.
Etude du développement de la spécialisation hémisphérique du langage chez le babouin (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Maintenus en vie et replacés dans leurs groupes sociaux, 76 babouins sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 38 d'entre eux et léger pour 38 autres, avec une réutilisation possible dans d'autres projets. Trente-huit sujets suivis depuis la naissance subissent chacun six IRM, chaque séance impliquant une capture, deux heures de transport en camion, une anesthésie de deux à trois heures et 48 heures d'isolement, les nouveau-nés étant séparés de leur mère pendant l'examen. Huit femelles reçoivent en plus un dispositif d'imagerie optique fixé sur le crâne et dans le dos, posé et retiré sous anesthésie. Le porteur affirme qu'aucune de ces interventions n'est douloureuse ou invasive, tout en listant comme nuisances le stress des captures, le transport, l'anesthésie, l'isolement et le port du dispositif, et présente le babouin comme un "modèle incontournable" pour étudier l'origine du langage.
Objectifs
Ce projet explore la piste des origines gestuelles de la parole. Et si la communication gestuelle était centrale dans l'origine et l’organisation cérébrale du langage dominé par l’hémisphère gauche ? Cette hypothèse gagne du terrain à la lumière des liens étroits mis en évidence non seulement entre les gestes et le langage dans l'espèce humaine mais aussi entre les gestes de nos cousins les primates et certaines propriétés du langage. Au regard de leur proximité phylogénétique, seule une perspective comparative entre primates humains et non humains peut nous aider à déterminer les continuités entre la latéralisation des gestes des primates et celle du langage humain. A la croisée de l’éthologie, de la psychologie comparée et des neurosciences non invasives, ces recherches continuront d’être menées sur les babouins hébergés en captivité en groupes sociaux et porteront (1) sur le développement longitudinal de gestes communicatifs (et signaux vocaux) au sein du groupe social de babouins olives Papio anubis, leurs asymétries et leur spécialisation hémisphérique anatomique (via IRM anatomique et de diffusion) auprès de 38 babouins depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte; (2) sur leurs liens avec la specialisation hémisphérique associée à leurs relations sociales, incluant ainsi l’étude de celle de leurs congérères, impliquant près de 38 indidus supplémentaires ; (3) sur les asymétries cérébrales fonctionnelles des gestes et des vocalisations mesurées par imagerie optique auprès de 8 sujets entrainées Papio anubis. Tous les sujets, dont la taille optimale d'échantillon a été évaluée, sont observés dans leur groupe social respectif et ne sont mobilisés que temporairement au cours du projet sur 5 ans lors de la pose du serre-tête de l'appareil d'imagerie optique ou lors d'acquisitions d’images IRM, et ce, sous anesthésie monitorée dans les standards de sécurité et de bien-être animal avant d'être remis dans leur groupe social après le réveil.
Bénéfices attendus
L’étude de l’ontogénèse de la communication gestuelle du babouin et de sa spécialisation hémisphérique cérébrale associées à des zones homologues du langage revêt une importance cruciale pour comprendre les précurseurs phylogénétiques de l’organisation de notre système de communication, des précurseurs qui auraient été hérités à partir de notre ancêtre commun. Les recherches longitudinales sur des babouins en développement, de la naissance jusqu’à l’âge adulte, constituent une opportunité unique d'explorer les déterminants neurobiologiques potentiels du développement de la communication gestuelle. Une telle approche longitudinale étant peu réalisable sur primates humains, elle renforce l’intérêt de ses recherches, avec le babouin comme modèle incontournable, pour comprendre l’ontogénèse de la spécialisation hémisphérique associée au langage dans l’espèce humaine. De surcroît, les conclusions tirées de ces recherches peuvent avoir des implications uniques pour la compréhension du développement précoce du langage chez l'humain et enrichir notre connaissance en neurosciences cognitives, particulièrement en ce qui concerne la communication gestuelle, ses bases cérébrales et son évolution.
Procédures
Les 38 animaux adultes seront soumis à une anesthésie de 2 à 3h pour une acquisition IRM associée à une capture, un tranport en camion (2h environ aller/retour) et un isolement de 48h. Les 38 sujets suivis longitudinalement seront soumis à 6 IRM chacun. Chaque IRM impliquera également une capture, un tranport en camion et un isolement de 48h et une anesthésie de 2 à 3h pour chaque session. Un sous groupe de 8 femelles sera également utilisé pour des acquisitions d'imagerie optique (3 à 6 par animal) qui nécessitent l'installation d'un dispositif amovible sur le crâne et dans le dos. Pour chaque session, l'animal aura deux anesthésies (1 de 1h pour placer le dispositif, 1 de 20 minutes pour le retirer), 2 captures et un isolement inférieur à 24h. Aucune de ces interventions n'est douloureuse ou invasive.
Impact sur les animaux
Stress lors des captures. Transport. Anesthésie. Isolement 48h. Port du dispositif.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les sujets seront maintenus en vie car les acquisitions ne sont ni invasives ni douloureuses, il seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.
Remplacement
Dans une problématique qui porte sur les origines, au regard de la proximité phylogénétique des primates humains et non humains, seule l'étude du modèle primate peut nous aider à détecter les précurseurs éventuels de certaines propriétés du langage et de leurs bases cérébrales chez notre ancêtre commun. Il nous est donc impossible de remplacer l’animal par un autre sujet ou une autre méthode alternative.
Réduction
Au regard de la variabilité interindividuelle anatomique des cerveaux, étudier les corrélats neuroanatomiques des comportements gestuels des babouins nécessite généralement de larges cohortes de sujets pour la collection d'images IRM. Cette étude étant pionnière sur l’approche longitudinale du développement des asymétries cérébrales de primates non-humains et leurs corrélats comportementaux, il n’existe pas d’"effect size" connu à ce jour sur ce modèle, ne permettant pas d’estimer avec exactitude le nombre de sujets idéal pour la constitution de cette base de données. Néanmoins, en fonction de résultats publiés sur les asymétries cérébrales de babouins de tout âge (n=96), un effort de réduction à 38 sujets a été estimé pertinent au regard de l’aspect répété (x6) des mesures au cours du développement. - Dans l'étude d'imagerie optique fonctionnelle, le nombre de sujets critique a été estimé en fonction des résultats publiés de travaux en imagerie cérébrale fonctionnelle menées sur primates de l’ancien monde (macaques).
Raffinement
Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. La capture est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Les animaux sont maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache sur la cage de transport et le compartiment du véhicule agrée est chauffé. L’IRM est une méthode non-invasive, ne causant aucune souffrance ou risque pour l’animal et ni de douleur importante apparente et est réalisée sous anesthésie générale. Pour le T0, les sujets étant des nouveaux-nés ils sont capturés avec leurs mères et sont transportées avec celles-ci. Le nouveau-né est alors temporairement séparé de samère pour l’IRM (3h max). Le temps d’anesthésie est compris entre 2 et 3h. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés et des mesures de réchauffement sont mises en place (matelas air chaud pulsé et couverture de survie). De retour à la station, les sujets sont réintroduits dans leur groupe social et surveillés quotidiennement. Les nouveaux-nés seront suivis avec une grille de scoring spécifique pendant 3 jours. Pour la partie portant sur l'imagerie optique, les animaux seront préalablement entraînés à des tâches manuelles et ne pourront commencer qu'une fois l'entraînement terminé et répétable. Des séances de désensibilisation sans anesthésie (approche, renforcement à se laisser toucher la tête) sont mises en place en amont afin de diminuer le stress. Le dispositif sera placé sous anesthésie. Les premières sessions seront consacrées à la phase d'habituation du dispositif (de 1 à 3 sessions par sujet) et se feront donc avec un dispositif factice jusqu’au succès du processus d’habituation avant de réaliser les sessions expérimentales (3 sessions répétées) avec l'appareil d'imagerie. Les sessions seront limitées à 60 minutes (30 minutes d’anesthésie et 10-30 minutes de tâches). Les individus sont hébergés pendant toute la durée du projet en groupes sociaux. Ils seront seulement séparés de leurs groupes au moment des IRM (48h) ou pour les sessions d'imagerie optique (moins de 24h).
Choix des espèces
Dans une problématique qui porte sur les origines, au regard de la proximité phylogénétique des primates humains et non humains, seule l'étude du modèle primate non-humain comme le babouin peut nous aider à détecter les précurseurs éventuels de certaines propriétés du langage et de leurs bases cérébrales chez notre ancêtre commun. Le babouin est un modèle incontournable pour étudier l’ontogénèse de la communication et de la spécialisation hémisphérique cérébrale du langage, au regard de leur taille de cerveau (deux fois plus gros que celui du macaque par exemple), leur latéralité manuelle et gestuelle déjà documentée et associée à des latéralisations cérébrales équivalentes à celles décrites dans l’espèce humaine, et un repertoire de signaux gestuels intentionnelles uniques parmi les singes de l’ancien monde. C’est la seule espèce chez qui nous pouvons poursuivre nos recherches longitudinales initiées au cours d’un précédent projet à partir d’une cohorte de bébés en développement. Pour 38 individus, notre échantillonnage inclut 6 stades de développement de la naissance jusqu’à l’âge adulte, en passant par le stade de fin de myélinisation et de sevrage maternel : - T0 : de 6 à 15 jours : le plus tôt possible après la naissance - T1 : de 8 à 10 mois : sevrage naturel de la mère - T2 : 24 mois : stade juvénile avec une vie sociale intégrée au groupe. - T3 : de 48 à 60 mois : maturité sexuelle - T4 : à 7 ans : Adulte (plafond volume cérébrale) - T5 : à 9-10 ans : Adulte avancé Les 8 mères des nouveaux nés seront utilisées à l’âge adulte. Enfin, 30 congénères adultes (âgés entre 7 et 25 ans) seront également scannés à l’IRM. Les 8 femelles impliquées dans le projet d'imagerie optique seront d’un âge supérieur à T1 (i.e., après le sevrage) et font partie du lot du suivi longitudinal.
Evaluation de traitements contre les comorbidités associées au syndrome de Dravet dans un modèle murin EU 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Soumises à une biopsie d'oreille puis à des injections ou des gavages quotidiens pouvant aller jusqu'à 42 administrations, 275 souris sont toutes tuées à l'issue, 200 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 75 d'un niveau léger. Ces souris portent une mutation qui déclenche des crises d'épilepsie spontanées, et le porteur indique que 40 à 50 % d'entre elles n'atteindront pas l'âge de 60 jours. Il annonce jusqu'à cinq tests comportementaux par animal sans préciser lesquels, alors que l'objet déclaré du projet porte justement sur l'hyperactivité, la sociabilité et la cognition. Il affirme que l'usage d'animaux transgéniques est "indispensable" pour reproduire un syndrome d'origine génétique, et compte sur ce modèle pour proposer des traitements des comorbidités du syndrome de Dravet.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l’impact de traitements (pharmacologiques et ou probiotiques) sur les comorbidités liées à l’épilepsie, telles qu’une hyperactivité, une altération de la sociabilité ou des déficits cognitifs. Le syndrome de Dravet est une épilepsie rare de l’enfant qui a pour cause (dans plus de 80% des cas) une mutation hétérozygote (ne touchant qu’un allèle sur les 2) du gène SCN1A, codant pour un canal sodique. Ce syndrome épileptique est très bien caractérisé au niveau des crises épileptiques, mais l’est moins pour les comorbidités psychiatriques qui se développent à plus long terme. Des modèles murins du syndrome de Dravet ont été établis par transgène en délétant ou en mutant le gène Scn1a, ce qui mène au développement de crises épileptiques, provoquant dans certains cas une mort prématurée (phénotype aussi présent chez l’homme), ainsi que certaines comorbidités. Nous proposons d’utiliser un des modèles murins qui récapitule un grand nombre des caractéristiques du syndrome de Dravet : des crises précoces spontanées, une mort prématurée (nommée SUDEP = sudden unexpected death in epilepsy), et des altérations comportementales, comme une hyperactivité, une diminution de la sociabilité ou encore des déficits cognitifs. Ce modèle robuste est toujours utilisé pour le développement de traitements pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Le syndrome de Dravet est un syndrome épileptique de l’enfant dont les traitements actuels ne permettent pas de soigner tous les patients. De plus, même si certaines crises sont atténuées par les traitements actuels, les comorbidités psychiatriques associées à ce syndrome ne sont pas traitées et entrainent une diminution de la qualité de vie des patients. Ce projet vise à tester de nouveaux traitements chroniques pour atténuer les comorbidités psychiatriques, ce qui permettra de proposer de nouveaux traitements chez l’homme.
Procédures
Tous les nouveaux-nés (environ 200) seront identifiés et génotypés à l’aide d’un prélèvement (biopsie) à l’oreille qui sera effectuée une seule fois (maximum 5 minutes/animal). Pour l’évaluation du comportement, les animaux (150) seront testés au maximum 5 fois à l’aide de test allant de 8 min à 30 min/jour, le tout sur 5 semaines maximum. Pour les traitements, les animaux (120) seront administrés quotidiennement (une fois par jour, maximum 2 min/animal) par voie intrapéritonéale (injection) ou voie orale (gavage) pendant la durée des tests comportementaux soit au maximum : 42 fois au total.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues (connues de la littérature) sont : 1) Une survenue de crises épileptiques spontanées, qui peuvent entrainer une mort prématurée (environ 40% à 50% des animaux au maximum n’atteignent pas l’âge de 60 jours). 2) Un stress et une douleur associée à la biopsie d’oreille pour l’identification et le génotypage simultané 3) un stress dû au transport entre le site de maintien de la lignée et le site de test. 4) un stress dû aux tests comportementaux (isolement dans un environnement nouveau) 5) un stress et une douleur dus à l’administration chronique des traitements (par gavage ou injection intrapéritonéale) Les traitements seront effectués par une personne expérimentée pour limiter le stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car le comportement (locomoteur, social, cognitif) ne peut être étudié au niveau cellulaire (in vitro) ou par modélisation (in silico). De plus, afin de mimer un syndrome d’origine génétique, l’utilisation d’animaux transgéniques est indispensable
Réduction
Afin de limiter l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype dommageable, les animaux HE seront générés à partir de fécondation in vitro d'ovules de femelles C57BL/6 à l’aide de sperme issus de male modèle de Dravet. Nous ferons aussi une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord le phénotype comportemental du modèle murin dans nos conditions expérimentales (environnement) avant de tester de possibles traitements. Le calcul du nombre des animaux est fait selon une approche statistique, il nous faut donc au minimum 12 animaux par groupe pour pouvoir évaluer le phénotype des animaux.
Raffinement
Pour la procédure d’élevage, les animaux sont hébergés en isolateur enrichies avec des morceaux de coton et de la frisure de carton servant de matériel de nidification. La température est de 22°C +/-2°. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 6h/18h. Une manipulation réduisant le stress des animaux sera réalisée (manipulation dans le creux de la main). Le transport entre le site d’élevage (procédure 1) et le site utilisateur (procédures 2 et 3) se fera dans des cages où les animaux seront groupés en conservant les groupes sociaux, avec de la frisure de carton en enrichissement, de l’eau gélifiée et de l’aliment, et dans des conditions environnementales contrôlées. Pour les procédures comportementales, les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies avec de la frisure de carton. La température est de 22°C +/-2°. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Des points limites strictes sont définis pour chacune des procédures. Les administrations (injection intrapéritonéale ou gavage oral à l’aide de sondes souples) seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
Afin de modéliser au mieux le syndrome de Dravet, qui est à plus de 80% dû à une mutation génétique, l’espèce souris dont la modification génétique du gène Scn1a déjà publié est la plus pertinente. Ce modèle récapitule le phénotype Dravet : crises fébriles, crises spontanées, SUDEP et comorbidités psychiatriques. Pour la procédure 1, les animaux seront élevés de la naissance à leur expédition à partir de 8 semaines d’âge. Pour les autres procédures (2-3), des animaux adultes (à partir de 8 semaines d’âge) seront réceptionnées et utilisés. A cet âge, la survie n’est plus diminuée (stabilisation de la mortalité) et les comorbidités psychiatriques au syndrome de Dravet sont bien retrouvées chez l’adulte.
Maintien de lignées de Xenopus laevis et production de têtards pour étude de la myélinisation et de la remyélinisation
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Une cinquantaine de xénopes seront tués parce qu'ils ne pondent plus, et 75 juvéniles seront élevés pour les remplacer. Au total 155 xénopes sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, dans un élevage qui fait naître des têtards pour des études pharmacologiques. Les reproducteurs reçoivent des injections hormonales à chaque accouplement, jusqu'à 120 injections pour un mâle sur la durée du projet, ainsi qu'un prélèvement de peau sur une nageoire arrière pour le génotypage. Le porteur justifie la mise à mort des animaux devenus peu fertiles par l'impossibilité de les replacer, "cette espèce étant considérée comme nuisible". Il indique que le choix du xénope tient à la transparence des têtards et au grand nombre d'individus qu'une femelle produit, ce qui facilite les études réclamant beaucoup d'animaux non-humains.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de produire des têtards pour les études pharmacologiques réalisées au laboratoire, nécessitant un nombre élevé de têtards, ainsi que pour des études sur certains mécanismes présents dans des maladies neurodégénératives telle que la sclérose en plaques. Les têtards générés pour chacune des pontes sont utilisés en continu pour les différents projets qui ont lieu en parallèle. Les têtards non utilisés dans les projets sont utilisés pour renouveler les reproducteurs, c’est pour cela qu’ils doivent être génotypés et identifiés lorsque leur taille le permettra.
Bénéfices attendus
Les têtards générés par les adultes Xénopes reproducteurs permettront de produire les lots expérimentaux nécessaires à nos différents projets de recherche. Ils nous permettent notamment d’effectuer des tests pharmacologiques pour étudier l’effet de molécules dans des mécanismes présents dans certaines maladies neurodégénératives, telle que la sclérose en plaques , afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. Ces études pharmacologiques nécessitent un grand nombre de têtards, ce qui explique le nombre de reproducteurs pour ce projet. D’autre part, concernant l’étude de l’effet des perturbateurs endocriniens, avec des effets plutôt délétères sur certains mécanismes dans le cerveau, les têtards utilisés permettraient de mieux comprendre l’augmentation de l’incidence de maladies neurodégénératives dans le monde. Enfin, nous utiliserons des têtards pour identifier de nouvelles voies de signalisation à l’origine de la mise en place de la myéline (enroulement de certaines cellules autour des neurones dans le cerveau), ce qui pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour des maladies neurodégénératives.
Procédures
A l’âge d’environ un an les Xénopes auront un prélèvement de peau au niveau d’une nageoire de la patte arrière, dans une zone peu vascularisée, sur animal vigile. L’acte de la contention jusqu’au prélèvement dure moins d’une minute par animal et est réalisé une seule fois. Enfin, les adultes reproducteurs ont des injections d’hormones pour chaque reproduction (2 injections par accouplement pour les mâles, 1 pour les femelles), qui sont réalisées dans le bas du dos. Les injections sont réalisées sur animaux vigiles pris en contention, à l’aide de seringues fines et stériles, rapidement (moins de 10 secondes) et peu douloureuses (peu de volume injecté et aiguilles de petit diamètre, avec un geste maitrisé). Au maximum les mâles feront 60 accouplements sur la durée du projet et les femelles 15 accouplements, soit 120 et 15 injections maximum respectivement. Pour chaque accouplement, les reproducteurs sont isolés pendant 60 heures maximum (en général du vendredi soir au dimanche soir).
Impact sur les animaux
Pour les adultes utilisés pour les accouplements, un léger stress serait attendu durant la phase de capture, où les animaux sont attrapés grâce à une épuisette et scannés pour identification grâce à une puce sous cutanée. De plus, les animaux sont isolés 60h maximum avant la mise en contact entre les mâles et les femelles, ce qui peut aussi engendrer un léger stress. Lors des injections d’hormones, une contention des animaux est nécessaire, ce qui peut engendrer un stress. Une légère et brève douleur pourra être ressentie par l’animal lors de l’injection en sous cutanée. Un prélèvement de moins de 2mm2 est réalisé au niveau palmaire pour le génotypage, ce qui peut entraîner une légère et brève douleur, à laquelle s’ajoute le stress de la préhension et de la contention.
Devenir
Dans les 80 animaux reproducteurs actuels, on estime au cours du projet que 50 d’entre eux vont présenter une absence répétée de fertilisation ou une diminution de la ponte, qui nécessitera leur euthanasie, puisqu’ils ne peuvent pas être réutilisés ni replacés, cette espèce étant considérée comme nuisible. Nous produirons donc 75 juvéniles qui permettront de remplacer et compléter l’effectif des animaux au fur et à mesure, et qui seront en utilisation continue, ainsi que les 30 animaux reproducteurs qui n’auront pas présenté de baisse de la fertilité. Il devrait donc y avoir au final dans l’animalerie environ 105 animaux, qui seront en utilisation continue pour notre élevage.
Remplacement
Des études in vitro seront réalisées en amont de nos projets, cependant elles ne permettent pas de suivre les mécanismes pathologiques au sein de la complexité du système nerveux. Notre projet prévoit de générer des têtards de Xénope pour trois projets de recherches, ces trois projets nécessitant l’utilisation de Xénope car : - Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro - La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central sans euthanasie, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal - Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux
Réduction
Dans ce projet, afin de respecter la règle des 3R nous favorisons les accouplements naturels plutôt que les fécondations in vitro ce qui évite d’avoir à prélever les testicules et donc d’euthanasier les Xénopes mâles pour la réalisation de fécondation in vitro (FIV). De plus, la pré-stimulation augmente le rendement d’œufs fertilisés, donc plus de têtards générés, pour un nombre de couples limité. Cela évite de manipuler et d’isoler plus d’animaux adultes. Compte tenu de la nature du projet, les tests statistiques ne peuvent pas être appliqués, car il s’agit d’un projet élevage. Cependant, le nombre de têtard à générer pour nos projets de recherche a été déterminé par des tests de puissance statistique pour n’utiliser que le nombre de têtards nécessaires, ce qui permet de réduire au strict minimum le nombre d’accouplements à réaliser, et donc le nombre d’animaux reproducteurs utilisés. Nous mettons en moyenne 65 couples d’adultes en croisement par an pour assurer la production d’œufs et de têtards. Cette espèce accuse une perte importante au cours du développement ce qui explique la fréquence des pontes, pour obtenir les têtards nécessaires à nos études. Nous utilisons à ce jour 48 femelles et 32 mâles, soit 80 animaux qui recevront des injections et pourront être isolés. Les femelles ne peuvent être stimulées que tous les 4 mois, ce qui explique que leur nombre soit plus important que les mâles, qui eux peuvent être réutilisés tous les mois. De plus, nous travaillons avec des animaux génétiquement modifiés, il est donc nécessaire de maintenir les différents génotypes présents à l’animalerie. Nous prévoyons de conserver 75 têtards pour renouveler et compléter l’effectif des adultes reproducteurs. Sur la durée du projet, ces animaux seront identifiés, prélevés pour génotypage et potentiellement injectés et isolés au cours du projet. Ces 75 animaux permettront de remplacer 50 Xénopes, qui arrivent bientôt à l’âge de 8 ans, et qui ne pourront plus être utilisés pour la reproduction. Au total le projet impliquera donc 155 animaux.
Raffinement
Les Xénopes adultes sont hébergés dans des bacs adaptés au nombre d’individu et à la taille, maximum 10 individus par bac. Des enrichissements sont disposés pour permettre aux animaux de se cacher (tuyaux, similis rochers, plantes artificielles), et des enrichissements alimentaires sont proposés une fois par semaine aux animaux (vers de vase rouges congelés). Les paramètres physico-chimiques de l’eau des adultes sont maintenus grâce à un système d’eau circulante automatisé (maintenue à 18 degrés Celsius). Les animaux sont observés quotidiennement si l’un d’entre eux parait amaigri, gonflé, rougeurs…, il est isolé et un avis vétérinaire est demandé. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Un contrôle sanitaire de la zone est effectué de manière annuelle. Les bacs utilisés pour l’isolement et la reproduction sont opacifiés pour que les Xénopes ne soient pas perturbés par l’environnement extérieur. Ces bacs sont remplis avec de l’eau provenant de leur aquarium d’origine, changée tous les deux jours. Un temps de repos de minimum 4 mois sera respecté pour les femelles avant de les remettre en accouplement, et minimum 1 mois pour les mâles. Le génotypage est réalisé sur des juvéniles à partir d’un an, l’animal est attrapé délicatement avec une épuisette et est immobilisé pour avoir accès à une patte arrière. La zone choisie pour le prélèvement nécessaire pour connaitre le patrimoine génétique de l’animal est peu ou pas innervée, et se régénère de façon spontanée au bout d’une semaine. Après le prélèvement, un antiseptique est appliqué afin de prévenir tout saignement ou infection avant remise en bac avec les congénères, et une surveillance accrue est mise en place pendant une semaine, pour repérer tout signe anormal chez l’individu (rougeurs, apathie, gonflements… ).
Choix des espèces
Le choix du Xénope se justifie par plusieurs raisons : 1) les têtards de Xénope sont transparents, ce qui facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction en cas d’étude longitudinale), 2) les amphibiens (Xénope) sont les premiers vertébrés sur l’arbre évolutif à utiliser un profil de protéines des cellules cérébrales différent dans le système nerveux central et périphérique, ce qui est un avantage pour les projets scientifiques que nous menons. Les animaux utilisés à la reproduction sont des adultes, en capacité de se reproduire, donc de plus de 3 ans. Le génotypage est réalisé sur des animaux à la limite du stade juvénile et adulte, soit à partir d’un an, quand ils ont atteint une taille suffisante pour faciliter la manipulation.
Hébergement, reproduction et génotypage de souris génétiquement modifiées pour des études immunohistochimiques et électrophysiologiques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 111 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage et de génotypage de lignées génétiquement modifiées, 1 543 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 568 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Le seul geste pratiqué sur l'animal vivant est le prélèvement d'un millimètre de queue pour le génotypage, dont le porteur reconnaît qu'il génère stress, douleur ponctuelle et saignement. Les souris dont le génotype ne convient pas à la gestion de l'élevage sont mises à mort, les reproducteurs sélectionnés étant maintenus en vie pour produire les portées suivantes. Le porteur indique qu'une des lignées manifeste des symptômes nuisant à sa santé et prévoit un génotypage avant la troisième semaine pour repérer les mutants avant l'apparition de la maladie.
Objectifs
L'équipe étudie le système nerveux moteur situé dans la moelle épinière impliqué dans la locomotion. Ce réseau de neurones, pour qu'il fonctionne correctement, doit être régulé finement. L'un des projets de l'équipe est d'étudier les mécanismes moléculaires au niveau de ces neurones qui seraient responsables de l'activation de ce réseau innervant les muscles locomoteurs. Des protéines particulières présentes en grande quantité à la surface des neurones, sont principalement ciblées. Ainsi, l'élevage de ces lignées de souris chez qui certaines protéines sont altérées ou spécifiques d'un neurone identifié, est primordial pour caractériser et spécifier leur activité générée dans les neurones du système nerveux.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des animaux de ces lignées faite de façon précoce nous permet d'optimiser la gestion de l'élevage mais aussi de contrôler et maîtriser la non apparition du phénotype dommageable chez les souris susceptibles de le développer. L'utilisation de souris génétiquement modifiées est nécessaire pour mieux comprendre la contribution de protéines d'intérêt dans l'activité du réseau locomoteur spécifiquement dans des neurones identifiés. De plus, une inactivation de la protéine ciblée chez ces animaux particuliers, nous permet d'explorer des mécanismes qui lui sont spécifiques et ainsi mettre en lumière des concepts pouvant être communs à certaines pathologies comme la lésion de la moelle épinière, l'épilepsie ou d'autres maladies neurodégénératives. La recherche qui découle de ces lignées de souris profitera à l'ensemble de la communauté scientifique en lien avec ce domaine de recherche.
Procédures
La plupart des interventions sur ces animaux se fera post-mortem. La seule intervention que ces animaux subissent de leur vivant, est le prélèment de tissu à l'extrémité de la queue (segment de 1mm) pour le génotypage grâce à une paire de ciseaux adaptée, notamment chez le jeune qui n'a pas de poils. Il n'est prévu qu'une seule intervention par animal d'une durée de 1 minute. Une fois que le génotypage sera mis au point sur le follicule pileux, un génotypage plus tardif pourra être effectué si celui ci est compatible avec la technique expérimentale utilisée.
Impact sur les animaux
Biopsie de l'extrémité de la queue qui peut engendrer un stress, une douleur ponctuelle et un saignement. Les femelles reproductrices seront soumises à un stress accru lors de la dernière semaine de gestation du fait de leur isolement comme pour les mâles reproducteurs séparés de la femelle.
Devenir
Mise à mort des animaux de génotype non utile pour la gestion de l'élevage en gardant en vie les animaux reproducteurs sélectionnés en fonction de leur génotype. Utilisation des animaux sélectionnés pour les expérimentations pour l'objectif scientifique.
Remplacement
Nos évaluations et caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des neurones connectés les uns aux autres formant ainsi un réseau complexe. Pour cela, nous utilisons des tissus prélevés sur souris d'élevage. En effet, il n'est pas possible de reproduire sur un modèle bioinformatique ou en culture cellulaire la complexité de ces connexions ou la particularité d'un neurone spécialisé, même si de nombreuses études préliminaires in vitro ont permis de diminuer le nombre d'animaux nécessaires et/ou à retarder leur utilisation.
Réduction
Les techniques de prédilection employées dans cette étude sont de l'ordre de 4. Elles nous permettent d'utiliser un même animal pour plusieurs mesures et différentes conditions d'exposition. Le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre une significativité dans nos résultats est ainsi limité à son strict minimum. En effet, grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques, à chaque question scientifique posée, nous estimons un nombre d'individu minimal suffisant pour atteindre une significativité. Ainsi par exemple, pour tester l'efficacité d'une molécule médicamenteuse sur l'activité du neurone, nous choisissons deux techniques spécifiques qui nécessitent chacune, 8 animaux par condition. En revanche, pour toutes les questions relatives à l'efficacité d'une molécule médicamenteuse sur la quantité de protéine présente à la surface de neurones ou sur sa manière dont elle est exprimée à l'intérieur d'un tissu en fonction des traitements employés, cela nécessite l'emploi de 2 autres techniques qui demandent entre 4 et 12 animaux par condition. Sur l'ensemble de la saisine, il y aura 2111 souris qui seront génotypées. Plus de la moitié sera utilisée pour leur génotype d'intérêt en lien avec les questionnements scientifiques du projet de recherche, tandis que l'autre partie sera utile pour le maintien de la lignée. Dans un moyen long terme, nous estimons que la mise au point du génotypage sur follicule pileux nous permettra le maintien de la lignée sans geste invasif et sans phénotype dommageable, puisque l'on privilégiera les accouplements sans risque. Seul le prélèvement d'un peu de tissu de l'extrémité de la queue sera toujours effectué sur les souriceaux provenant d'un accouplement à risque dédié à une série expérimentale spécifique.
Raffinement
Après sevrage, les animaux seront hébergés entre 3 et 5 par cage en fonction de leur âge, de leur sexe et de leur poids. Les cages seront enrichies régulièrement de rondin de bois, de tunnel, de matériel de nidification. Concernant les accouplements à risque, une observation renforcée sera mise en place par l'expérimentateur et les zootechniciens pour cette lignée qui manifeste des symptômes nuisant à la bonne santé de l'animal uniquement chez les souris dont la mutation touche les gènes impliqués. Un génotypage systématique des animaux sera fait avant la 3eme semaine post-natale afin d'identifier les mutants le plus tôt possible avant l'apparition de symptômes de la pathologie. Un point d'arrêt sera de toute façon établi en cas d'apparition précoce des symptômes. La biopsie sera effectuée par un personnel qualifié qui maitrise le geste avec agilité et rapidité permettant ainsi de limiter le stress, l'inconfort et la douleur chez l'animal.
Choix des espèces
Les lignées de souris seront utilisées essentiellement jusqu'à la 2eme semaine post-natale en expérimentation pour l'enregistrement de l'activité des neurones ou la quantification de protéines d'intérêt à la surface des neurones et leur localisation dans le tissu nerveux. Ce stade précoce est essentiel pour la compréhension de la contribution des protéines ciblées dans la mise en place de l'activité neuronale. Une inactivation provoquée d'une de ces protéines chez des animaux génétiquement modifiés nous permet d'explorer des mécanismes qui lui sont spécifiques et ainsi mettre en lumière des concepts pouvant être communs à certaines pathologies comme la lésion de la moelle épinière, l'épilepsie, ou d'autres maladies neurodégénératives.
Etude des conséquences de l’exposition de souris gestantes aux nanoplastiques présents dans l’eau de boisson sur l’axe placenta-intestin-cerveau
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Pour étudier les effets des nanoplastiques avalés pendant la gestation, 1 064 souris sont exploitées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus. Les femelles boivent une eau chargée de nanoparticules de polystyrène une semaine avant l'accouplement puis pendant toute la gestation, et leurs petits sont soumis à des tests d'activité locomotrice, de mémorisation et d'anxiété à un et deux mois. Le porteur indique qu'un défaut de placentation peut entraîner une résorption fœtale, que les petits peuvent naître plus légers, et qu'un prélèvement de sang à la queue sans anesthésie provoque une douleur brève. Il décrit les modèles in vitro et les organoïdes comme "imparfaits" et présente le recours à la souris comme le seul moyen d'observer les conséquences sur la descendance.
Objectifs
L’exposition placentaire humaine aux nanoparticules de plastique est dorénavant documentée ainsi que leur passage transplacentaire. En effet, quatre études ont montré leur présence dans les placentas humains ainsi que dans le méconium des nouveau-nés, suggérant un passage materno-foetal. Des modèles in vitro et ex vivo ont permis d'étudier les conséquences de cette exposition sur les cellules placentaires humaines. Cependant, l’exposition n’est réalisable que sur des courtes durées et sur des cellules placentaires du 3ème trimestre. Or, les stades initiaux de la placentation sont cruciaux pour le bon déroulé de la grossesse, en particulier l’ancrage du placenta dans la muqueuse utérine. Ceci ne peut être étudié in vitro/ex vivo du fait de l'indisponibilité de placentas précoces avant 7 semaines d’aménorrhée. Aussi, les modèles d’organoides restent imparfaits tant dans leur structure cellulaire que dans l’exposition non-physiologique aux particules qui en résulte. Les conséquences sur le développement fœtal ne sont pas évaluables in vitro et ex vivo. Ainsi, les modèles actuels ne permettent pas d'étudier les conséquences sur le développement des nouveau-nés exposés in utero. A travers ce projet, nous nous intéresserons donc aux conséquences sur l’issue de grossesse de l’exposition aux nanoparticules de polystyrène au cours de la gestation et sur le devenir des nouveau-nés jusqu’au stade adulte. L’effet de deux lots de nanoparticules de polystyrène de diamètres différents présentant des caractéristiques d’internalisation différentes, sera étudié. De plus, les mécanismes d’action de ces nanoparticules variant selon leur concentration, l’effet de deux concentrations envionnementales et décrites dans la littérature sera analysé. Les souris (femelles) seront donc exposées une semaine avant l’accouplement puis tout au long de la gestation à ces particules via leur eau de boisson. L’objectif sera d’étudier le développement placentaire et l’issue de gestation de ces souris (poids foetal et maternel, anomalies placentaires, risque de retard de croissance intra-utérin). La descendance (exposée aux particules in utero) sera suivie jusqu’à l’âge adulte avec des analyses portant sur leur tractus digestif et leur dévelopement cérébral. L’ensemble de ce projet permettant ainsi d'étudier les conséquences d'une exposition in utero aux nanoparticules de plastiques sur l'issue de la gestation et le developpement global de la descendance.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera donc des connaissances sur l’absorption et la distribution sanguine des nanoparticules via le dosage de celles-ci. Des informations précieuses seront récoltées concernant les conséquences sur le développement et les fonctions placentaires mais aussi sur le développement des souris exposées in utero, tant sur la maturation intestinale et l’installation de leur microbiote que sur leur développement cérébral et comportemental. Ce projet s’inscrit dans un projet plus global et complètera les résultats obtenus sur les modèles in vitro et ex vivo. Ces résultats apporteront des connaissances essentielles concernant l’impact de l’exposition au cours de la grossesse aux polluants environnementaux avec une évaluation globale de l’axe placenta-intestin-cerveau. A long terme, ce projet participera à la détection des populations particulièrement à risque de grossesses pathologiques lié à une exposition environnementale ou professionnelle importante et au développement de mesures préventives.
Procédures
Les souris gestantes seront exposées 1 semaine avant l'accouplement puis tout au long de la gestation aux nanoparticules de plastique présentes dans leur eau de boisson. Un prélèvement bihebdomadaire, chez les souris gestantes, des fèces après émission spontanée sera réalisé pour un suivi du microbiote. Il est non-invasif, indolore et très court. Un prélèvement hebdomadaire des fèces après émission spontanée sera réalisé pour un suivi du microbiote jusqu’à J28 pour les souriceaux exposés in utero puis 1 fois à 1 et 2 mois. 15 jours après la mise-bas, en même temps que le prélèvement de fèces chez les souriceaux, un prélèvement de sang à la queue de la souris (sans anesthésie) sera pratiqué, provoquant une douleur légère de courte durée. Des tests comportementaux chez les souriceaux à 1 et 2 mois seront réalisés : tests d'activité locomotrice, de mémorisation et d'anxiété. Ils seront réalisés avec un intervalle de 2-3 jours. Les tests de locomotion, de mémorisation et d'anxiété durent respectivement 15 min, 30 min et 4min. Les prélèvements sanguins en fin d'expérimentation sont réalisés sous anesthésie prodonde pour éviter toute souffrance à la souris.
Impact sur les animaux
Les concentrations en nanoparticules choisies n’induisent pas de cytotoxicité aigue d’après les données de la littérature et les résultats in vitro sur cellules placentaires humaines. Aussi, l’exposition sera réalisée uniquement sur les souris femelles, au moment de la gestation à savoir, 1 semaine en amont de l’accouplement et durant l'ensemble de la gestation. Les effets indésirables prévus d’après les données de la littérature sont relativement faibles mais : il est possible qu’un défaut de placentation survienne entrainant alors un risque de résorption fœtale chez les souris gestantes. Un plus petit poids de naissance peut être observé chez les souriceaux exposés in utero aux particules. Aussi, les tests comportementaux pourront entrainer une possible anxiété et le prélèvement sanguin à J15 un risque d’hypovolémie. Les prélèvements de selles seront non-invasifs (isolement bref de 5min d’une souris et récupération de crotte) n’entrainant pas d’effets indésirables. Les mâles reproducteurs seront isolés brièvement entre les périodes d'accouplement; un risque d’ennui et de stress existe qui sera réduit par des cages transparentes leurs permettant de voir leur congénères et par un enrichissement de celle-ci.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de sang et de tissus.
Remplacement
Des études in vitro et ex vivo ont été menées afin de tester la cytotoxicité des nanoparticules sur les cellules placentaires humaines. Les concentrations choisies n’induisent pas de cytotoxicité aigue in vitro. Aussi, ces travaux ont permis d’appréhender certains mécanismes d’action cellulaires qui seront recherchés dans ce modèle in vivo; seul modèle permettant d'étudier les conséquences d'une exposition aux nanoparticules de plastique, in utero, sur la descendance.
Réduction
Grâce aux données de la littérature, un calcul statistique de puissance a été réalisé afin d’évaluer le nombre d’animaux à inclure pour obtenir des résultats significatifs tout en réduisant au maximum ce nombre. Les analyses statistiques seront réalisées avec des tests non-paramétriques pour les petits nombres d’animaux par groupe (
Raffinement
Les souris gestantes seront exposées par l’eau de boisson à des concentrations environnementales en nanopolystyrene pour une durée d’un mois maximum. Pour maintenir l’interaction sociale, les souris seront placées au nombre de 3 à 4 par cage avec un enrichissement sous forme de coton, carton, bâtonnets de bois. Le soin et le suivi des animaux seront évalués par des personnes compétentes et expérimentées (zootechniciens) et de manière bihebdomadaire par l’expérimentateur. Des points limites bien définis à l’aide d’une grille de score seront mis en place avec mise à mort selon les scores atteints. L’anesthésie profonde au moment de la mise à mort sera vérifiée par pincement des doigts avant de procéder aux prélèvements.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car elle possède un placenta hémochorial dont les échanges foetaux-placentaires sont extrapolables à l’espèce humaine. La gestation est de courte durée et la taille de la portée importante ce qui facilite l’étude concernant le devenir de la descendance exposée in utero aux nanoparticules. Les souris femelles gestantes et les males reproducteurs seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Les souriceaux mâles et femelles seront utilisés à partir de la naissance. Les nanoparticules seront incluses dans l’eau de boisson des souris gestantes une semaine avant l’accouplement et tout au long de la gestation. Les souriceaux exposés in utero aux particules (males et femelles) sont inclus dans le protocole dès la naissance et jusqu’au stade adulte (2 mois). Des prélèvements de selles (passif, pas de gestes invasifs) sont pratiqués une fois par semaine jusqu’à J28 puis 1 fois par mois à 1 et 2 mois (J7, J15, J21, J28, J42, J56). Des tests comportementaux sont pratiqués à 1 et 2 mois.
Evaluation de la biodistribution et de l’efficacité de nanoparticules lipidiques comme vecteur de thérapie génique dans un modèle murin de la Dystrophie Musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
718 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la dystrophie musculaire de Duchenne, elles subissent jusqu'à huit anesthésies générales par animal pour des injections et des séances d'imagerie, ainsi qu'un rasage et la pose d'une boucle à l'oreille. Le porteur teste des nanoparticules censées transporter une thérapie génique vers les muscles à la place des virus. Il présente l'ensemble comme une "preuve de concept" préclinique, sans bénéfice direct pour les patients à ce stade.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique mortelle entrainant un handicap physique qui touche 5 personnes sur 100 000 dans le monde. Malgré une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques de cette pathologie, presque aucun traitement n'est disponible. Les thérapies géniques utilisant des virus inactivés peuvent induire des effets toxiques et ne sont pas applicables à tous les patients. Ce projet vise à améliorer le transport des thérapies géniques en utilisant des nanoparticules à la place des virus vers les zones musculaires cibles pour augmenter leur efficacité et réduire les effets toxiques. Pour cela, nous utiliserons 2 modèles de souris de la myopathie de Duchenne : un modèle léger et un modèle modéré.
Bénéfices attendus
Le présent projet permettra de fournir une preuve de concept pré-clinique de l’efficacité thérapeutique de nos nanosystèmes pour délivrer la thérapie génique dans un modèle de souris de la myopathie de Duchenne, en vue de fournir des traitements innovants potentiellement transférables chez les patients.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux seront rasés sur la face ventrale pour des raisons d'imagerie sous anesthésie générale et juste après cela, les animaux seront soumis à une injection intramusculaire ou intraveineuse (temps d'anesthésie total inférieur à 5 minutes). Les animaux seront imagés chaque jour durant les 7 jours suivant l'administration des nanosystèmes sous anesthésie générale (temps d'anesthésie inférieur à 2 minutes). Au total, 8 anesthésies générales par animale seront donc réalisées pour les étapes d'injections et imageries. Les animaux seront identifiés par pose d'une boucle d'identification à l'oreille.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, du stress peut être induit aux animaux lors des anesthésies et des contentions pour la réalisation des injections. De plus, une légère douleur passagère peut être induite à la suite de l’injection du traitement. Le rasage de la face ventrale de l'animal ainsi que la pose de la boucle d'identification à l'oreille peut occasioner du stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée des différents organes prélevés qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Des études préliminaires ont démontré l’efficacité de nos nanoparticules pour délivrer des molécules thérapeutiques dans des cultures de cellules musculaires et chez la souris saine. Pour aller plus loin, l’utilisation d’animaux dans un modèle pathologique de la maladie est nécessaire pour démontrer l’efficacité thérapeutique de nos nanoparticules. Il est donc nécessaire de pouvoir étudier l’effet de ce traitement sur des organismes entiers.
Réduction
L’utilisation des animaux est réduite grâce des outils statistiques au nombre minimal et nécessaire pour l’obtention de données expérimentales statistiquement exploitables. Le projet étant conçu par étapes successives, si aucun effet bénéfique n’est observé sur le modèle léger de la maladie, il ne sera pas poursuivi sur le modèle modéré et également l'obtention de résultats positifs sera nécessaire pour passer d'une étude à la suivante.
Raffinement
Durant toute la durée des protocoles les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bien-être général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. Les souris devant être rasées sur la face ventrale, du coton sera placé dans les cages. Pour les animaux présentant une expression modérée de la maladie, ceux-ci seront maintenus jusqu'à l'âge de 5 mois avant qu'ils développent une expression aggravée de la maladie entravant leur qualité de vie. Les études histologiques et moléculaires permettront d'évaluer l'efficacité du traitement.
Choix des espèces
La structure et le fonctionnement du tissu musculaire de la souris sont très proches de ceux de l'homme. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour les investigations de la physiopathologie des maladies musculaires survenant chez l’homme. Les modèles de souris pertinents utilisés présentent des signes histologiques légers ou modérés de la pathologie des patients DMD dès l’âge de 2 mois. Pour les animaux présentant une expression modérée de la maladie, ceux-ci seront maintenus jusqu'à l'âge de 5 mois avant qu'ils ne développent une expression aggravée de la maladie entravant leur qualité de vie.
Utilisation de modèles murins pour étudier du rôle de l’acide rétinoïque dans le développement cardiaque.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
7986 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent un traitement modifiant la voie de l'acide rétinoïque, leurs embryons et foetus pouvant présenter des malformations cardiaques, tandis que les souriceaux subissent une biopsie de l'oreille et certains adultes des échocardiographies sous anesthésie. Le porteur indique que ces défauts peuvent conduire à une insuffisance cardiaque, des troubles du rythme et des morts subites. Il présente cette recherche fondamentale comme un "prérequis essentiel" au développement futur de thérapies, sans application immédiate annoncée.
Objectifs
Les malformations cardiaques congénitales sont les anomalies congénitales les plus fréquentes puisqu'elles représentent environ 1% de toutes les naissances. Ces malformations peuvent être d'origine génétique mais peuvent aussi être dues à un problème de développement pendant la grossesse. Plusieurs études ont montré que la voie de l’acide rétinoïque (AR), dérivé de la vitamine A, est impliqué dans le développement du cœur et en particulier celui des populations cellulaires à l’origine de la formation du cœur. Des dérégulations de la voie de l'AR (excès ou carence) durant le développement embryonnaire se traduisent par de graves malformations congénitales structurelles du cœur telles que les anomalies des gros vaisseaux (ainsi que de la séparation des oreillettes et des ventricules. Il a également été montré que l’AR est nécessaire à la formation des valves cardiaques qui assurent une circulation unidirectionnelle du sang à chaque cycle cardiaque. Les défauts de fonctionnement des valves (valvulopathies) peuvent également avoir une origine génétique et développementale. Dans ce projet, nous souhaitons utiliser des modèles murins génétiquement modifiés pour mieux comprendre comment la voie de l’AR contrôle le développement du cœur et celui des valves cardiaques.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet qu’il augmente nos connaissances sur le rôle essentiel de l’AR dans le développement du cœur pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui conduisent à des malformations cardiaques congénitales. La compréhension de ces mécanismes est un prérequis essentiel pour le développement de thérapies dans le futur.
Procédures
Les femelles gestantes seront soumises à une administration unique soit par voie orale soit par voie intrapéritonéale (contention et administration durant environ 1 minute). Les embryons et foetus peuvent présenter des malformations congénitales. A l'âge de 3 semaines, les souriceaux subiront une biopsie à l'oreille permettant de réaliser simultanement l'identification et le prélèvement d'ADN pour identifier les animaux mutants (génotypage). Les souris adultes peuvent être amenées à présenter des signes d'insuffisance cardiaque, des troubles du rythme et des morts subites. Certaines d'entre elles auront deux échocardiographies sous anesthésie générale gazeuse (30 minutes chacune). Ils peuvent être amenés à présenter des signes d'insuffisance cardiaque, des troubles du rythme et des morts subites. En cas d'apparition de signes cliniques, les animaux pourraient recevoir des injections d'antiinflammatoire (une injection sous cutanée, une fois par jour, maximum 3 jours) ou de diurétiques (une injection intra péritonéale, deux fois par jour, maximum 3 jours).
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, des femelles gestantes recevront des traitements par voie orale et voie intra péritonéale. Aux doses administrées, les traitements n’auront pas d’impact sur les femelles. Les embryons et les fœtus étudiés pourront avoir des malformations congénitales avec des degrés de sévérités variables. Sur les lignées étudiées après la naissance, les défauts développementaux, (principalement cardiaques) pourront conduire à l'apparition d'insuffisance cardiaque avec des difficultés respiratoires (oedème pulmonaire)
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Notre projet consiste en l’étude de la morphogénèse du cœur durant le développement embryonnaire qui ne peut pas être reproduit en culture cellulaire. De plus, le cœur humain comme celui de la souris est un organe complexe composé de quatre cavités. Nous allons étudier la séparation des quatre cavités cardiaques, ce qui rend l’utilisation d’autre modèle comme le poisson (contenant un seul ventricule) incompatible avec nos recherches.
Réduction
Par une approche statistique nous réduirons au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet et défini qu'il nous faut au moins 17 souris/embryons par groupe. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 20 souris/embryons par groupe. Pour l'analyse de la fonction cardiaque, nous avons choisi une méthode d'analyse longitudinale (échographie cardiaque) permettant d'analyser un même animal à différents temps, premettant ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage, afin de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la manipulation à faible stress des rongeurs. Certains des modèles que nous allons utiliser n’ont pas été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations poussées des animaux et identifier, de la manière la plus précoce, l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la Structure Chargée du Bien Etre Animal.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des cardiopathies, de leurs conséquences sur la circulation sanguine et de leurs causes génétiques. Les femelles utilisées pour les accouplements seront utilisées durant les fenetres de fertilité des rongeurs: entre 2 et 8 mois. Au cours de l'étude, nous nous intéresserons à différents stades développementaux: le début du développement cardiaque (jours 8, 8.5, 9.5 et 10.5 post fécondation), au moment de la séparation des chambres cardiaques et du début de formation des valves cardiaques (jours 13.5 et 15.5 post fécondation) et juste avant la naissance (jours 18.5 post fécondation / mise bas naturelle prévue entre autour de 20 jours post fécondation dans nos modèles) Pour les individus de la procédure 3, nous analyserons leur phénotype à 1,5 et 3 mois correspondant aux stades de début et de fin de maturation des valves cardiaques.