Procédures légères

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une partie porte une cardiomyopathie génétique et reçoit des injections hebdomadaires dans l'abdomen ainsi que des échocardiographies mensuelles sous anesthésie sur trois mois, avant la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique que l'anesthésie gazeuse peut provoquer un stress thermique et, rarement, un arrêt cardio-respiratoire. Il affirme que le recours à la souris est "indispensable" et que le développement de ces stratégies "ne peut se faire que sur un modèle animal".

Objectifs

Ce projet a pour but l’évaluation des modifications de la tubuline sur la fonction cardiaque puis d'evaluer l’effet bénéfique de petites molecules touchant ces modifications chez des souris atteintes d’une maladie génétique touchant le muscle cardiaque. Nous venons de démontrer que cette approche était un moyen de corriger le la pathologie cardiaque ches des souris.

Bénéfices attendus

Ce projet peut aboutir à la première description du role des modification de la tubuline dans le developement de pathologies cardiaques. Les repercussions peuvent etre majeures en santé humaine, en tant que medecine personnalisee pour cette pathologie, pour laquelle aucun traitement n'est actuellement disponible. En effet, tout impact positif sur la fonction cardiaque avec ces traitements, sera etudié pour une utilisation en clinique.

Procédures

1) Injection dans un etat vigile de l'animal. Dans son intégralité (contention+injection), le geste s'effectue rapidement en quelques secondes; 2) Echocardiographie tous les mois, pendant 3 mois, sous anestesie. La durée d’une échocardiographie est de 5 à 10 minutes par souris. Les souris seront des animaux controles non genetiquement modifiés et des souris presentant une cardiomyopathie génétique (modele murin d'étude). les injections intra-peritoneales (abdomen) se font toutes les semaines, sur la duree du traitement. Les souris seont euthanasiees en fin de protocole par methode reglementaire en vue des prelevements tissulaire pour analyse.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont surtout dus à un éventuel développement précoce du phénotype dommageable de la lignée qui développe une pathologie cardiaque induisant une insuffisance cardiaque (10 mois pour les mâles et 12 mois pour les femelles). L'injection intrapéritonéale peut entraîner chez l'animal un stress de courte durée (contention et piqûre). La fonction cardiaque sera évaluée par échocardiographie, sous anesthésie gazeuse. Cette technique d'imagerie cardiaque n'est pas invasive mais l’anesthésie peut induire un stress thermique et dans de rares cas des complications (arrêt cardio-respiratoire).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. Les organes des animaux seront prélévés pour une étude moléculaire de la correction génique et du recouvrement des mécanismes cellulaires.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour optimiser le traitement pour la cardiomyopathie. Pour cela il est nécessaire d’étudier le rôle de notre approche corrective, et les effets du traitement dans un modèle animal tel que la souris pour avoir accès à la fonction cardiaque. Pour réaliser cette étude, l’utilisation du modèle murin est donc indispensable. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.

Réduction

Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité permettant une analyse statistique. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et que l’on n’ait pas à la refaire. Nous allons effectuer le projet sur 10 groupes de 10 souris (non genetiquement modifiée et souris modeles de la pathologie), en etudient l'effet sur les deux sexes ( 10 souris pour groupes pour un total de 100 souris)

Raffinement

Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). Les zootechniciens assurent un contrôle quotidien des animaux afin de relever le moindre signe de souffrance, un changement régulier des cages, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum hors cages d’accouplement) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage et de la bouillie pourra être introduite dans les cages si nécessaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (suivi de poids hebdomadaire, évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de nécroses ou escarres). L'état de santé des animaux aisi que la survenue de points limitres sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent. Les effets indésirables attendus par les traitements sur les animaux peuvent survenir suite à l'anesthesie (risques d'hypothermie our d'arret cardio-respiratoire). Notre connaissance approfondie de l'histoire naturelle du developpement du phenotype chez le modele souris (plus de 20 ans avec cette lignee de souris), permet de determiner precisement la progression de l'atteinte cardiaque et en particulier l'age. Dans notre experience, nous n'avons jamais observé de tels effets mais nous allons les surveiller avec la plus grande attention. Lorsque les points limites sont atteints pour des animaux, nous procederons a une euthanisie par methode reglementaire.

Choix des espèces

La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie . Les premiers symptômes sont détectés dès 3 mois chez les souris homozygotes et évoluent rapidement jusqu’au décès des animaux provoqué principalement par l’aggravation du phénotype cardiaque (vers 10 mois d'âge).Nous allons etudier le benefice des traitements sur des souris entre 3-6 mois, lorsque la pathologie cardiaque apparait.

50 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux castrés reçoivent des injections de testostérone toutes les deux semaines pendant trois mois pour hypertrophier la prostate, puis subissent sous anesthésie une thermoablation du foie et de la prostate par laser ou micro-ondes guidée par IRM. Le porteur indique que la testostérone peut modifier le comportement et signale que la procédure de thermoablation, terminale, ne devrait pas causer d'effets indésirables. Il valide une technique destinée à traiter des tumeurs humaines et affirme qu'aucune méthode in silico ne peut remplacer l'animal.

Objectifs

Ce projet a pour but de valider la pertinence d’une technique de thermoablation (consistant à détruire des tissus par la chaleur) par fibre laser et micro-ondes sous guidage IRM, pour traiter des tumeurs de la prostate et du foie chez l’homme. Elle présente peu de complications et un temps de récupération rapide pour les patients en comparaison de la chirurgie conventionnelle. Cependant, cette procédure interventionnelle demeure assez peu normalisée, ce qui conduit à une variabilité de l’efficacité des traitements cliniques. L’utilisation de l’IRM pour estimer la quantité de chaleur déposée permet de visualiser l’avancement de la procédure en 3D et temps réel. Cela ouvre donc la possibilité d’optimiser le traitement (de manière à recouvrir toute la tumeur en réduisant au maximum l’impact sur les tissus sains environnants). Pour cela, une étape importante consiste à valider la thermométrie IRM. Il s’agit de vérifier que les dimensions des lésions thermiques mesurées sur les données de thermométrie correspondent aux dimensions des lésions mesurées sur les tissus après prélèvement. Par nature, le porc juvénile castré possède une très petite prostate comparée à celle de l’homme mâture, ce qui complique la procédure interventionnelle. Un traitement hormonal préalable à la thérapie par laser ou micro-ondes est donc nécessaire pour induire une augmentation du volume de la prostate, afin d’obtenir un modèle animal dont les caractéristiques anatomiques sont plus proches des situations cliniques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal attendu de ce projet est la validation des données de thermométrie pour prédire les dimensions des lésions thermiques par nécrose de coagulation lors d’ablations laser et micro-ondes réalisées sur le foie et la prostate. D’autre part, les données expérimentales obtenues dans ce projet permettront d’affiner les protocoles de thermoablation (durée et température cible) des dispositifs médicaux évalués. Ces données serviront également à raffiner les logiciels de simulation afin de réduire le nombre d’animaux à inclure dans des études ultérieures.

Procédures

Les animaux inclus dans cette étude subiront une injection intramusculaire toutes les deux semaines pendant 3 mois maximum (animaux vigiles). Une procédure d’injection minimisant le stress de l’animal sera appliquée (bolus de moins de dix secondes). Pour la procédure mini invasive de thermoablation sous IRM, les animaux seront placés sous anesthésie générale et analgésie adaptée (l’anesthésie par injection de médicaments en quelques secondes). Des aiguilles laser ou micro-onde seront insérées dans le foie et/ou la prostate, via une légère incision pratiquée sur la peau de l’animal, pour réaliser des ablations (lésions) thermiques. Pour les besoins de l’expérimentation, la procédure durera un maximum de 4h. Pour réaliser des images anatomiques, le respirateur pourra être mis en pause pour une durée de 30s.

Impact sur les animaux

Bien que l’injection de testostérone soit déjà validée en clinique humaine, l'influence de ce type d’injection chez le porc juvénile castré reste peu documentée. Les nuisances potentielles suivantes seront évaluées lors de la phase de croissance : modification du comportement (ex : agressivité envers les congénères et vis-à-vis des soigneurs/manipulateurs) et variation notable de la prise de poids par rapport aux courbes documentées pour cette espèce. La procédure expérimentale de thermo-ablation est terminale et réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Ce type de procédure est déjà en place et maitrisée par l’équipe de l’établissement utilisateur. Il n’est donc pas attendu d’effets indésirables sur cette partie de l’expérimentation.

Devenir

Après induction d’une hypertrophie de la prostate, tous les animaux vont rentrer dans un protocole de thermoablation à l’issue duquel tous les animaux seront euthanasiés afin d’explanter les tissus cibles.

Remplacement

Il est nécessaire d’évaluer in vivo l’efficacité et l’innocuité des techniques de thermoablation en vue d’une application chez l’homme. Des évaluations sur organes ex vivo ont déjà été réalisées et sont systématiquement effectuées pour chaque dispositif d’ablation avant d’envisager une évaluation in vivo. Néanmoins, ces expériences ne permettent pas d’analyser précisément l’influence de la diffusivité thermique, de la perfusion tissulaire, des mouvements (respiratoires, péristaltisme digestif), de la proximité des gros vaisseaux (artères et veines), des interfaces entre différents organes et de leur composition (infiltrats graisseux notamment) qui influent très fortement sur la distribution résultante de la température tissulaire autour du dispositif de thermoablation.

Réduction

L’évaluation préalable sur des gels et organes ex vivo permet de valider la compatibilité IRM de chaque dispositif médical de thermoablation à disposition sans recourir à une expérimentation in vivo. Une fois cette phase réalisée, les expérimentations in vivo sont réalisées avec comme objectif de valider le côté prédictif des données de thermométrie IRM et de définir les dimensions typiques atteignables pour différents protocoles (durée, température maximale) de thermoablation. La possibilité de réaliser plusieurs ablations sur un même animal (une sur la prostate et jusqu’à 3 sur le foie) permet de réduire le nombre d’animaux à inclure. Si l’utilisation de testostérone pour augmenter la taille de la prostate porcine ne permet pas d’obtenir une hypertrophie suffisante de la prostate pour réaliser des thermoablations dans cet organe, les animaux concernés seront utilisés pour réaliser des ablations thermiques sur le foie. En effet, il n’a pas été démontré dans la littérature qu’une supplémentation à court terme en testostérone provoquait des dommages hépatiques (physiologie et morphologie). Les prostates des animaux ne répondant pas suffisamment au traitement hormonal (hypertrophie insuffisante) ou n’ayant pas subi d’ablation dans cet organe pourront être prélevées pour réaliser des tests ex-vivo. Actuellement, nous n’avons pas d’estimation de la variabilité des mesures que nous observerons. Le nombre d’animaux par campagne de validation annuelle a été établi sur la base de validations précédentes réalisées sur le foie, en considérant que la variabilité des mesures sera plus faible sur la prostate. Les premières expériences nous permettront d’avoir une estimation plus précise de la variabilité de nos mesures ; il nous sera alors possible d’ajuster le nombre d’animaux requis pour les différentes campagnes, suivant une approche statistique.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement sont adaptés au projet. Les animaux seront maintenus dans un premier temps chez l’hébergeur annexe de l’EU en condition de ferme puis au sein de l’EU. Les animaux seront en hébergement collectif avec des objets d'enrichissement (Kong, balles, jouets en caoutchouc durs mastiquables...) à disposition. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale et analgésie adaptées. Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux durant les deux phases d'acclimatation d’une semaine : celle précédant les injections chez l’hébergeur et celle précédant l’expérimentation terminale réalisée sur le site de l’établissement utilisateur. Des critères d’alerte précis sont surveillés chez l’éleveur. Si l’animal présente un signe clinique ou développe un comportement agressif, la posologie sera ajustée (réduction de moitié de la dose injectée) assortie d’une surveillance accrue du comportement de l’animal. Si dans les deux semaines qui suivent, l’animal ne retrouve pas un comportement normal, le traitement sera arrêté. Le comportement des premiers animaux permettra d’ajuster si nécessaire la posologie à appliquer pour les animaux suivants. Les gestes interventionnels sont réalisés sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. Un monitoring continu des signaux physiologiques sera réalisé pendant toute la procédure et permettra d’évaluer sir les points limites prédéfinis sont atteints (plage de température corporelle physiologiques et rythme cardiaque limite).

Choix des espèces

Du fait de ses caractéristiques anatomiques (taille, structure et morphométrie des organes, stabilité génétique) et son métabolisme proche de ceux de l’homme, le porc est le modèle de référence pour l’évaluation des dispositifs médicaux d’ablation. D’autre part, les organismes de régulation des dispositifs médicaux (FDA, CE) exigent la production de résultats sur ce modèle animal pour évaluer la conformité réglementaire. Enfin, il n’existe pas à ce jour de méthode de substitution in silico permettant de s’affranchir d’une phase expérimentale sur animal vivant. L’hébergeur va directement accueillir dans son enceinte agrée des animaux âgés de 2 mois (ces animaux ayant été castrés à l’âge de 10 jours). Il sera alors nécessaire de commencer les injections sur ces animaux (entre 15-20kg), l’objectif étant de réaliser les ablations sur des cochons entre 45 et 90 kg après 3 mois de traitement. En dessous de quatre mois , les porcs risquent d’être trop petits, avec une trop petite prostate pour obtenir des résultats concluants. Au-dessus de 5 mois, les porcs risqueraient d’être trop volumineux pour réaliser les expériences sous IRM dans de bonnes conditions.

563 souris vont être utilisées, tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les 60 mères étant réutilisées pour l'élevage. Les souriceaux reçoivent deux injections intrapéritonéales d'harmaline par jour pendant cinq jours, ce qui provoque des tremblements aigus et une phase d'hyperactivité gênant la prise alimentaire. Le porteur indique un retard de poids inférieur à 4 % et signale que la manipulation peut conduire les mères à rejeter leurs petits. Il étudie le rôle de l'activité neuronale dans le développement d'un réseau du cervelet et affirme qu'une telle étude n'est pas possible en culture cellulaire.

Objectifs

Dans le cerveau, la cellule de Purkinje du cervelet reçoit différents types de connexions, dont celles des fibres grimpantes, axones des neurones de l’olive inférieure. L’activité neuronale régule la formation et le maintien des synapses entre fibres grimpantes et cellules de Purkinje, ce qui fait du réseau olivo-cérébelleux un système d’étude idéal pour analyser les mécanismes moléculaires dépendants de l’activité menant à l’établissement de réseaux neuronaux fonctionnels. De plus, le réseau olivo-cérébelleux présente une organisation en modules, traitant différentes informations sensorielles et motrices, et permettant un contrôle précis de différentes fonctions et en particulier la motricité. Nous proposons d’étudier le rôle de l’activité neuronale dans l’établissement de l’organisation modulaire de ce réseau ainsi que dans la régulation des facteurs moléculaires contrôlant sa mise en place.

Bénéfices attendus

Les maladies mentales et neurologiques constituent un réel problème de santé publique puisqu’elles sont la première cause d’invalidité dans le monde. Parmi ces maladies, la schizophrénie et l'autisme touchent chacune environ 1% de la population. Les symptômes associés à ces maladies sont très variés et apparaissent dans l'enfance pour l'autisme, et à la fin de l’adolescence ou chez le jeune adulte pour la schizophrénie. Les patients présentent par exemple des déficits cognitifs (concentration, attention, mémoire de travail…) qui apparaissent dans l’enfance et auraient pour origine des défauts neurodéveloppementaux. Les traitements, qui restent pour l’heure purement symptomatiques, sont la plupart du temps peu efficaces. Il est donc crucial de comprendre l’origine de ces maladies, pour pouvoir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Les synapses, connexions permettant aux neurones de communiquer entre eux, sont indispensables au bon fonctionnement du cerveau. Aujourd’hui, il est très bien établi que des déficits de connectivité neuronale sont présents dans le cortex chez des patients atteints d'autisme ou de schizophrénie. En revanche, en dépit de la présence évidente de déficits cérébelleux chez certains patients, l’implication du cervelet dans ces pathologies reste très peu étudiée. La présente étude nous permettra d’identifier des déficits synaptiques dans le réseau olivo-cérébelleux, suite à la modulation de l’activité neuronale au cours du développement du cervelet et nous aidera à mettre en évidence les protéines synaptiques potentiellement modulées par l’activité neuronale qui pourraient provoquer l’apparition de certaines maladies du cerveau lorsqu’elles sont dérégulées.

Procédures

Nous injecterons les souris en intra-péritonéal, 2 fois par jours pendant 5 jours. Chaque injection prend moins d'une minute. Le poids des souriceaux sera déterminé avant chaque injection afin d'adapter la dose à injecter. Les animaux sont maintenus immobiles en réalisant un pli de peau au niveau du dos, légère contention permettant l’insertion de l’aiguille très fine dans l'abdomen. Lors des injections, les souriceaux sont séparés seulement quelques minutes de leur mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Lorsque l'âge voulu est atteint, les souris seront toutes anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant puis euthanasiées.

Impact sur les animaux

Chez la souris, la dose de produit injectée conduit à des tremblements aigus et temporaires des muscles axiaux et a un effet de type anxiolytique. Après chaque injection, les souris présentent une période de quelques heures d’hyperactivité qui semble conduire à une difficulté à se nourrir pendant cette période, avec un retard de prise de poids que nous avons établi à moins de 4% par rapport aux contrôles dans notre précédent projet autorisé par le CEEA. Lorsque les souris sont en âge de se nourire, de la poudre de croquette humidifiée est ajouté dans la cage pour favoriser le nourrisage. La manipulation des souriceaux peu parfois amener les femelles à rejeter leurs petits. Pour éviter cela, les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère. Aucun autre effet indésirable n’a été observé sur ces animaux dans notre précédent projet.

Devenir

Pour les études d’électrophysiologie, de biochimie ou d'histologie, les 563 animaux injectés seront euthanasiés en fin de procédures. Les 60 mères seront réutiliées à des fins d'élevage dans notre animalerie. Après les injections, les animaux resteront auprès de leur mère dans une cage enrichie (cotons et dôme en carton pour leur nid) jusqu’à l’âge du prélèvement.

Remplacement

La souris est devenue un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. Elle permet l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elle permet également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. Certaines études fonctionnelles ne peuvent pas être réalisées chez les patients. De plus, il est important d’étudier les réseaux cérébelleux dans le contexte du cerveau puisque le cervelet est connecté à d’autres régions du cerveau dont le cortex qui est déjà connu pour son implication, par exemple, dans l'autisme ou la schizophrénie. Une telle étude ne serait donc pas possible en culture cellulaire et nécessite d’avoir recourt à des animaux vivants.

Réduction

Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats statistiquement et scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.

Raffinement

Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Notamment, des compléments environnementaux (dômes en carton, cotons, baguettes en bois) sont ajoutés afin de permettre à la femelle de créer un meilleur nid, de diminuer tout stress éventuel et d'user ses dents. De même, les injections intrapéritonéales chez le souriceau seront réalisées avec des aiguilles très fines afin de minimiser la douleur. Lors de ces injections, les souriceaux sont séparés de la mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère afin d’éviter le rejet des souriceaux par la mère. Les animaux sont surveillés quotidiennement jusqu’à leur euthanasie. Lorsque les souris sont en âge de se nourrir seules, de la poudre de croquette humidifiée est ajouté dans la cage pour favoriser le nourrissage après l'injection qui provoque des tremblements temporaires. Nous utilisons une grille de suivi des animaux, les points limites sont mis en place pour éviter toute douleurs ou mal être des animaux.

Choix des espèces

Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elles permettent également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. De plus, le court cycle de reproduction chez la souris et sa petite taille permettent de maintenir ces animaux relativement facilement, tout en gardant une espèce assez proche de l’homme en terme de développement. La topographie du réseau olivo-cérébelleux s’établit en plusieurs étapes, dont une étape de raffinement qui est dépendante de l' activité et qui se produit entre P5 et P21. Le stade auquel l’activité joue un rôle majeur n’est pas connu et sera défini en réalisant plusieurs séries d’expériences avec plusieurs groupes de souris entre P5 et P21. Nous utiliserons également des souris plus agées (P45) comme contrôles, car à ce stade la carte topographique est établie et l'activité neuronale continue de contrôler la connectivité.

12 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée et environ 200 réutilisées. Chaque animal subit le prélèvement d'un millimètre de queue sous anesthésie locale pour son génotypage, avant le sevrage. Le porteur indique que les souris au génotype recherché rejoignent d'autres procédures, tandis que celles sans intérêt sont réutilisées ou tuées. Il reconnaît qu'aucune méthode de génotypage moins invasive, comme la PCR sur poils, ne donne à ce jour de résultats exploitables dans son établissement.

Objectifs

Le projet consiste à produire des souris génétiquement modifiées qui nécessitent un prélèvement d'un petit bout de la queue (1mm maximum) afin de connaitre leur génétique et savoir si elles seront utilisables pour les projet de recherche ou non.

Bénéfices attendus

Raffiner la production de souris génétiquement modifiées en prenant en charge la douleur ressentie lors de l'acte de biopsie pour génotypage.

Procédures

Identification et prélèvement d'un petit bout de la queue pour caractérisation des souris (moins d'une minute).

Impact sur les animaux

Lors de l'acte de prélèvement d'un bout de queue les animaux peuvent ressentir de la douleur. C'est pourquoi nous réalisons cet acte sous anesthésie locale.

Devenir

Les animaux présantant un génotype d'intérêt seront utilisés dans des procédures expérimentales de notre établissement en utilisation continue. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux seront soit réutilisés pour d’autres projets expérimentaux quand c’est possible, soit euthanasiés.

Remplacement

Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris car ces animaux correspondent au coeur-même des projets des utilisateurs. Pour le moment, aucune autre méthode de biopsie pour génotypage moins invasive fonctionne. En effet, les protocoles de génotypage par PCR sur des poils ne nous ont toujours pas permis d'obtenir des résultats exploitables pour déterminer le génotype de nos animaux. Mais nous sommes toujours dans le recherche d'un nouveau protocole et nous ne manquerons pas de changer pour une méthode de biopsie moins invasive dès que possible.

Réduction

La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc). La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire pour la production de lots expérimentaux.

Raffinement

Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (batonnets de coton, maison en carton, mise à disposition de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière si besoin , etc... adaptation du nombre d'animaux / cage). Immédiatement avant l'acte de prélèvement du bout de la queue (1mm maximum), la pulvérisation d'un anesthésique sera effectuée sur la queue de l'animal afin de réduire au maximum toute douleur pouvant être ressentie. Une infection au niveau du site de biopsie serait le point seul point limite pouvant être atteint. Il s'agit ici d'une anticipation d'une potentielle infection car le cas ne nous est jamais arrivé, bien que nous réalisons ce geste sur un grand nombre d'animaux. Si cela devait nous arriver, nous désinfecterions la plaie avec de la povidone iodée (Vétédine) dans un premier temps et si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors nous euthanasierons l'animal afin de stopper ses souffrances.

Choix des espèces

La souris est un animal permettant un grande variété de techniques génétiques permettant d'établir des relations entre gènes, fonctions, comportements et pathologies. L'acte de biopsie d'un bout de queue est réalisé sur les nouveau nés, ceci afin de pouvoir les génotyper avant le sevrage dans une optique de réduction.

36 porcs mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis remis dans le circuit d'élevage. Chaque animal subit une immobilisation au lasso de quelques secondes pour une prise de sang unique, afin de mesurer l'effet d'une poudre de gattilier sur la testostérone et les comportements sexuels. Le porteur indique que l'immobilisation et le prélèvement provoquent une douleur faible et brève. Il vise à réduire les chevauchements entre porcs non castrés en engraissement et affirme que l'étude du comportement ne peut être remplacée par une approche in vitro.

Objectifs

Depuis le 1er janvier 2022, la castration à vif des porcelets est interdite, leur castration doit être réalisée sous anesthésie et analgésie. Certains éleveurs font le choix d’élever des porcs mâles non castrés, mais ils peuvent être confrontés à des problèmes comportementaux. En effet, la production d’hormones sexuelles augmente avec le développement pubertaire au cours de la phase d’engraissement. Ces hormones stimulent le comportement sexuel et peuvent induire des chevauchements qui conduisent parfois à des chutes, des boiteries, et des paralysies partielles de l’arrière-train dans les rares cas extrêmes. L’augmentation de l’espace et l’enrichissement du milieu comme c’est le cas en système biologique ne permettent pas de réduire totalement ces comportements de chevauchement. Notre objectif est de tester les effets des fruits du gattilier réduits en poudre distribués sur la ration alimentaire. Le gattilier ou « Chastetree » (nom scientifique : Vitex agnus-castus) est une plante méditerranéenne connue dès le Moyen-âge pour réduire la libido des moines (effet anaphrodisiaque). Les fruits du gattilier sont autorisés en tant que matières premières pour l’alimentation animale. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet sur le comportement des porcs et les concentrations plasmatiques de testostérone d’une dose croissante de gattilier au cours de la croissance des porcs (afin de conserver le ratio quantité de gattilier/poids vif).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de vérifier si la distribution de doses croissantes de l’aliment testé (poudre de fruits de gattilier) à des porcs mâles non castrés en engraissement permet de diminuer les comportements sexuels délétères par des analyses physiologiques du comportement et des concentrations de testostérone et d’objectiver les effets de cette plante autorisée pour l’alimentation animale en vue d'une application en élevage.

Procédures

Ce projet comporte une prise de sang en condition vigile pour 36 porcs en fin d’engraissement lors d’une immobilisation au lasso. La phase d’immobilisation pour la prise de sang est très courte et dure 7 secondes en moyenne et dans tous les cas moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

L'immobilisation au lasso et la prise de sang provoquent une douleur de faible intensité, transitoire et de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie et remis dans le circuit classique d'élevage porcin.

Remplacement

Le projet concernant le comportement sexuel du porc en croissance, son utilisation ne peut être remplacée par une approche in vitro ou de modélisation.

Réduction

Le nombre de porcs a été limité à 2 lots de 18 porcs qui auront une prise de sang car cet effectif permettra de réaliser un test statistique pour comparer le niveau de testostérone entre le lot témoin et le lot traité.

Raffinement

Les prises de sang seront réalisées par du personnel expérimenté. Tous les animaux seront élevés en conditions biologiques (accès à des surfaces paillées de 1.3 mètres carrés par animal et courettes de 1 mètre carré par animal avec un enrichissement par de la paille à disposition). Les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites ont été définis permettant une action dans les plus brefs délais.

Choix des espèces

Ce projet a pour objectif d’étudier le comportement des porcs à l’engraissement, nous utiliserons donc l’espèce porcine. Nous utiliserons les animaux en fin d’engraissement à 170 jours d’âge afin de voir l’effet de l’aliment sur les taux de testostérone qui augmentent au cours de la puberté.

150 pigeons des villes vont être capturés puis relâchés, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque oiseau est maintenu deux à trois semaines en volière, pesé, épouillé, soumis à une prise de sang et à une injection sous-cutanée d'un mitogène, dans le cadre de travaux pratiques de master. Le porteur indique que ces gestes n'occasionnent qu'un stress transitoire et que les individus, marqués, sont ensuite suivis pour d'autres programmes de recherche. Il affirme que les objectifs pédagogiques, dont l'apprentissage de la manipulation d'un animal vivant, ne peuvent être atteints avec des vidéos ou des cadavres.

Objectifs

Dans le cadre de la formation en Master, nous avons mis en place une session de travaux pratiques (en automne) sur la découverte des ectoparasites, des parasites intestinaux et des parasites sanguins du pigeon urbain en relation avec le phénotype (poids, sexe, couleur, immunocompétence) et l'environnement (degré d'urbanisation) de celui-ci. L'objectif de ces travaux pratiques est quadruple. Le premier est d'observer la diversité des parasites du pigeon dans différents tissus (plumes, intestin et sang) et leurs cycles de vie. Le deuxième est fondamental et vise à faire comprendre aux étudiants le rôle des facteurs phénotypiques et environnementaux sur les paramètres épidémiologiques (prévalence et intensité). Le troisième vise à leur apprendre à manipuler et à mesurer des vertébrés vivants ainsi que de réaliser une prise de sang sur ce vertébré. Le quatrième est de les sensibiliser à l'éthique en expérimentation animale en leur enseignant les rudiments en éthique animale (les 3R, la douleur, les points limites, la législation etc...). Dans ce contexte, les étudiants seront invités à manipuler un pigeon, le peser, lui mesurer les tarses, l'aile, lui peigner les plumes pour collecter les ectoparasites du plumage, lui prélever une goutte de sang afin d'identifier les parasites sanguins et lui injecter un mitogène en sous-cutané pour mesurer une valeur de l'immunocompétence.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ces travaux pratiques sont, comme décrit précédemment, multiples. Le premier est d'observer la diversité des parasites du pigeons dans différents tissus (plumes, intestin et sang) et leurs cycles de vie. Le deuxième est fondamental et vise à faire comprendre aux étudiants le rôle des facteurs phénotypiques et environnementaux sur les paramètres épidémiologiques (prévalence et intensité). Le troisième vise à leur apprendre à manipuler et à mesurer des vertébrés vivants ainsi que de réaliser une prise de sang sur ce vertébré. Le quatrième est de les sensibiliser à l'éthique en expérimentation animale en leur enseignant les rudiments en éthique animale (les 3R, la douleur, les points limites, la législation etc...).

Procédures

Les pigeons seront capturés en condition naturelle avec une épuisette raquette, placés en volière 2 semaines avant la procédure et seront soumis à 3 interventions sur animaux vigiles: la première constitue des mesures morphométriques et un épouillage par une contention spécifique (20 minutes), la deuxième est une prise de sang unique par individu (5 minutes) et la troisième est une injection unique en sous-cutané d'un mitogène (5 minutes). Ces interventions seront effectuées les unes après les autres et dureront moins de 30 minutes par individu. A l'issue de cette procédure (2 jours de TP) et donc après moins de 3 semaines en volières, les pigeons seront relâchés à l'endroit où ils ont été capturés.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent principalement le stress de la capture de la manipulation, du brossage, de la prise de sang et de l'injection et d'un environnement non adapté lors du transport. Ces nuisances ne durent que le temps de la manipulation ou du transport et n'engendrent aucun effet indésirable. En effet, dans nos précédentes études, les pigeons se remettent rapidement de telles interventions et reprennent des comportements normaux (alimentation, lissage des plumes, reproduction et interactions sociales).

Devenir

A la fin de la procédure, les pigeons seront replacés dans les volières avant d'être relâchés dans leur milieu de capture. En effet, l'ensemble des procédures étant légères, elles n'impactent pas la survie et la reproduction des individus en conditions naturelles. De plus les individus sont marqués, cela nous permet de suivre ces individus dans le temps afin d'estimer leurs survies pour nos programmes de recherche sans avoir à en recapturer. Nous mutualisons donc ces animaux à des fins de recherche.

Remplacement

Afin d'atteindre les objectifs pédagogiques qui se focalisent sur une population de vertébré en conditions naturelles, le recours à des animaux est nécessaire et il n'y a pas moyen de le remplacer. En effet, il est impossible d'estimer la variabilité entre individus en prévalence et abondance de parasites et en immunocompétence à l'aide de vidéos, de mannequins ou de cadavres. De plus, l'objectif pédagogique vise également l'apprentissage de la manipulation d'un animal vivant. Ces objectifs ne sont atteignables qu'en utilisant des animaux vivants. Dans ce contexte, le pigeon biset Columba livia apparaît comme étant un modèle animal idéal pour étudier les mécanismes écologiques et évolutifs en milieu urbain. En effet, c’est un oiseau issu d’élevage domestique relâché par l’homme par le passé qui s’est installé dans les zones urbaines et qui est, a priori, soumis à de fortes pressions évolutives. De par ses grandes facilités d’adaptation, il constitue le modèle vertébré « sauvage » le plus répandu en zone urbaine. Son étude permet d’une part de dégager des principes généraux et fondamentaux en écologie urbaine et en évolution en milieu urbain et d'autre part d'étudier les différents parasites qu'il héberge. La variabilité individuelle des pigeons peut être caractérisée facilement par des étudiants (coloration, comportement, immunocompétence, mesure morphométrique) grâce à des protocoles mis au point dans notre laboratoire et l'identification de nombreux parasites est accessible. Toutes ces caractéristiques en font un modèle idéal pour enseigner de manière pratique toutes les approches évolutive, écologique et éco-épidémiologique. De plus, cette espèce est très répandue et ne constitue pas une espèce menacée d’extinction.

Réduction

Nous échantillonnerons 30 pigeons par an (30 par TP sur 5 ans donc 150 au total) que nous maintiendrons en captivité dans les volières. Les promotions d'étudiants sont autour de 20 pour les TPs. Cet effectif nous permettra d'avoir au moins un pigeon par étudiant. En mutualisant les données, il sera également possible de tester des relations entre les variables individuelles et les variables épidémiologiques avec une bonne puissance statistique. En nous basant sur les TPs précédents, les tests de puissance révèlent par exemple qu'un effectif de 30 permet de détecter une corrélation significative entre la couleur mélanique et l'immunocompétence. Ceci correspond donc à un effectif minimum permettant à la fois d'avoir une puissance statistique pour détecter les relations et de faire manipuler l'ensemble des étudiants.

Raffinement

Pendant ces 3 semaines, les pigeons seront hébergés en volière extérieure en grillage galvanisé, divisée en 16 compartiments et couverte en partie par un toit en tôle. Les compartiments sont plus longs que larges, ce qui permet aux individus d’effectuer de brefs vols. Chaque compartiment est enrichi de 6 nichoirs, de 4 perchoirs en bambou, une mangeoire, un abreuvoir d’eau et une baignoire. Tous ces enrichissements permettent de réduire le stress de la captivité. Aucune médication n'est prévue dans le cadre de cette procédure (pas d'acte invasif) mais une surveillance attentive permet de suivre les animaux de manière ciblée. De plus, cette procédure repose sur une équipe technique et pédagogique ayant une expérience sur le pigeon de plus de 15 ans. Lors du déroulement du projet, nous avons également identifié des points limites. En effet, dans le cas où nous détectons un comportement anormal, des signes d'infection, une perte de masse de plus de 30 pourcent, ou une blessure conséquente à la procédure (ces informations sont donc les points limites), les individus seront alors exclus des procédures et isolés en quarantaine. Le vétérinaire sera alors contacté pour soigner ou euthanasier l'individu.

Choix des espèces

Le pigeon biset Columba livia apparaît comme étant un modèle animal idéal pour étudier les mécanismes écologiques et évolutifs en milieu urbain. En effet, c’est un oiseau issu d’élevage domestique relâché par l’homme par le passé qui s’est installé dans les zones urbaines et qui est, a priori, soumis à de fortes pressions évolutives. De par ses grandes facilités d’adaptation, il constitue le modèle vertébré « sauvage » le plus répandu en zone urbaine. La variabilité individuelle des pigeons peut être caractérisée facilement par des étudiants (coloration, comportement, immunocompétence, mesure morphométrique) grâce à des protocoles mis au point dans notre laboratoire et l'identification de nombreux parasite est accessible. Toutes ces caractéristiques en font un modèle idéal pour enseigner de manière pratique toutes les approches évolutive, écologique et éco-épidémiologique. De plus, cette espèce est très répandue et ne constitue pas une espèce menacée d’extinction. Les pigeons échantillonnés seront tous adultes (jeunes adultes entre 4 et 8 mois ou adultes de plus de 8 mois). Les adultes sont, d'une part, moins sensibles au stress de la procédure que les juvéniles et, d'autre part, présentent une variabilité en parasites plus importantes que les juvéniles. Ils sont donc plus adaptés à l'objectif scientifique du TP qui vise à expliquer la variabilité de la prévalence et l'abondance des parasites par différentes variables individuelles.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un gavage oral de tamoxifène une fois par jour pendant cinq jours avant d'être tuées pour prélever le cerveau, afin de cartographier des neurones de l'hypothalamus impliqués dans l'obésité. Le porteur décrit l'immobilisation du gavage comme une source de stress qu'il atténue en enrobant la canule de sucrose. Il situe les retombées contre l'obésité à long terme et affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal pour mesurer le comportement alimentaire.

Objectifs

L'obésité est un problème mondial, touchant plus de 13% de la population et entraînant des comorbidités graves telles que le diabète, l'hypertension et les maladies cardiaques. Cette condition résulte principalement de troubles de la balance énergétique. Cependant, les thérapies actuelles ont des limites en termes d'efficacité à long terme. Pour développer de nouvelles stratégies, il est essentiel de comprendre les mécanismes biologiques régulant la balance énergétique. Dans ce contexte, il existe dans notre cerveau des neurones capables de détecter différents nutriments issus de l’alimentation, afin d’adapter nos choix alimentaires. Certains de ces neurones ont longtemps été considérés comme responsables de la satiété, mais des études récentes ont dévoilé leur grande hétérogénéité. L'objectif est d'identifier ces sous-populations de neurones susceptibles de dysfonctionner dans l'obésité. Pour cela, une caractérisation anatomique, électrophysiologique et fonctionnelle sera entreprise.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes obèses à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malheureusement, les traitements disponibles à l’heure actuelle ne sont que peu efficaces pour lutter contre cette pathologie, et seules des techniques extrêmement invasives comme la chirurgie bariatrique permettent une perte de poids durable (sans garantie de succès systématique). Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au développement de l’obésité, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques qui favorisent le développement de l’obésité et des comorbidités associées. En outre, il s’inscrit pleinement dans un contexte de recherche international visant à décrypter les rôles spécifiques des différentes sous-populations de "neurones de la satiété". À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité.

Procédures

Gavage oral (1440 souris) : un gavage oral sera réalisé 1 fois par jour durant 5 jours, sans anesthésie. La durée de l’administration orale de tamoxifène ne dure que 15 secondes par animal, en prenant en compte la contention de l’animal et l’administration de l’agent pharmacologique à proprement parler. La durée de l'administration de la dose d’euthanasiant quant à elle ne dure que 10 secondes à prenant en compte la contention et l’administration en elle-même.

Impact sur les animaux

Nous avons identifé un seul effet indésirable pour cette étude, un inconfort d'une courte durée pourra être ressenti par les animaux lors l'administration orale par gavage. Bien que le gavage oral soit une méthode indolore, il implique l'immobilisation totale de l'animal, ce qui pourrait induire du stress chez les souris. Pour pallier à ce stress, une semaine avant l'administration, les souris seront habituées à la procedure. De plus, la canule de gavage sera recouverte de sucrose afin de rendre cette expérience plus agréable pour les souris.

Devenir

À l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés, pour des études réalisées post-mortem

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier la relation entre l’activité de certains neurones et la consommation de régime hypercalorique. Dans ce contexte, les neurones que nous étudions interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques qui influencent l’activité neuronale via des signaux hormonaux. Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et les variables mesurées ici telles que le comportement alimentaire nécessite évidemment un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux en utilisant des tests statistiques robustes. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 6 semaines et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales. 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été́ définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. En effet, le cerveau contient des neurones qui sont sensibles au régime alimentaire, ce qui permet au cerveau d'être le chef d'orchestre de la balance énergétique. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Les animaux seront issus de l’animalerie d’élevage. Ceux-ci seront déplacés à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie d’expérimentation. Nous attendrons deux semaines avant de commencer toute expérimentation (traitement au tamoxifène) sur les animaux pour deux raisons. La première, est d’attendre que l’animal s’acclimate à son nouvel environnement. La deuxième, est qu’à 8 semaines nous considérons que les souris atteignent le stade adulte. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser les atlas cérébraux de référence nécessaires à de l’imagerie ou de l’électrophysiologie. Nous attendrons ensuite deux semaines afin de permettre au tamoxifène d’exercer son effet afin de permettre la visualisation de neurones impliqués dans la balance énergétique. Les animaux à 10 semaines subiront un changement de régime ; (1) soit un régime normal/standard, (2) soit un régime hypercalorique. Puis pour étudier les effets d’un régime hypercalorique à court-terme et à long-terme, nous avons choisi d’étudier 3 temps différents par de l’imagerie ou par de l’électrophysiologie : 3 semaines, 3 et 6 mois après changement de diète. Les animaux seront donc âgés de 13, 22, 34 semaines respectivement.