Procédures légères

228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans un élevage impliquant un niveau de souffrance léger pour 120 d'entre elles et modéré pour 108, pour produire des lignées développant un cancer du foie. Elles sont identifiées par une bague à l'oreille et génotypées par la coupe d'un à deux millimètres de queue, puis placées dans une cage vide pour recueillir leurs fèces. Le porteur indique surveiller l'apparition d'un gonflement abdominal lié à la tumeur et prévoit de tuer les souris pour prélever leur foie. Il affirme que les souris transgéniques sont souvent le seul modèle disponible et écarte le rat traité par un cancérogène, jugé plus douloureux.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le cancer du foie le plus fréquent. Il est au cinquième rang mondial en terme d’incidence et au deuxième en terme de décès par cancer et son incidence est en augmentation constante. Il se développe à la suite d’infection chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) ou C (VHC), ou de maladies hépatiques chroniques non virales, dues à la consommation d’alcool, à l’obésité et au diabète. Pendant 15 ans, les médecins ne disposaient que d’un seul médicament peu efficace pour traiter les CHC non opérables. Récemment, l’introduction de l’immunothérapie a permis d’augmenter la survie globale de certains patients, mais le bénéfice de ce traitement ne concerne qu’un tiers d’entre eux. Il a été récemment montré que la composition bactérienne de l’intestin (microbiote) influençait le développement de certains types de cancer, comme le cancer du poumon, et la réponse des patients à l’immunothérapie. L’objectif de ce projet est d’élever plusieurs lignées de souris transgéniques développant un CHC pour étudier les mécanismes d’initiation et de progression du cancer du foie, ainsi que les altérations du microbiote fécal accompagnant cette progression. Pour cela, nous prélèverons le foie et les crottes de ces lignées à différents âges, de façon à disposer d’échantillons spécifiques des stades de développement de la tumeur. Notre étude devrait permettre de mieux comprendre comment les altérations du microbiote influencent le développement du CHC.

Bénéfices attendus

L’élevage de nos souris transgéniques permet de disposer d’un modèle de cancer du foie proche de celui développé par l’Homme. D’autre part, le CHC est trois fois plus fréquent chez l’homme que chez la femme. Or, nos résultats préliminaires montrent des différences au niveau du développement du CHC et de la composition du microbiote entre les souris mâles et femelles. En plus d’une meilleure compréhension de l’influence du microbiote sur le développement du cancer, notre étude pourrait donc apporter des informations sur les causes des différences observées entre mâles et femelles.

Procédures

Pour pouvoir étudier le microbiote fécal, chaque souris sera mise une fois dans sa vie dans une cage vide jusqu’à obtention d’une crotte (10 minutes au maximum).

Impact sur les animaux

A l’âge de 3 semaines, les animaux seront identifiés par la pose d'une bague à l’oreille. L’extrémité de la queue sera coupée pour déterminer le génotype (1 à 2 mm).

Devenir

Les animaux seront obligatoirement mis à mort pour prélever leur foie.

Remplacement

Un nombre croissant de publications montrent un lien entre la composition du microbiote intestinal et le développement d’un cancer ou la réponse au traitement. Pour mieux comprendre ce lien, nous avons besoin d’un organisme vivant. C’est pourquoi, nous utilisons des souris transgéniques qui développent un CHC.

Réduction

Les souris nécessaires au maintien de l’élevage seront également utilisées pour les prélèvements de foie et de selles aux différents âges, de façon à limiter au maximum le nombre de souris nécessaire. Concernant ces prélèvements, nos résultats préliminaires, analysés par un bioinformaticien, ont montré que 6 femelles et 6 mâles pour chaque âge sont suffisants pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives.

Raffinement

Les cages contiennent du coton pour permettre la formation d’un nid. Les femelles gestantes sont isolées avant la mise bas et jusqu’au sevrage des petits. A partir de deux semaines avant l’apparition supposée de la tumeur, l’observation minutieuse de l’état général des animaux sera effectuée 2 à 3 fois par semaine, pour détecter tout signe de souffrance lié au développement de la tumeur, en particulier un gonflement abdominal.

Choix des espèces

Les souris transgéniques sont souvent le seul modèle dont on dispose pour se rapprocher au mieux du développement du cancer chez le patient. Dans le cas du CHC, il est possible d’utiliser des rats traités avec un cancérogène chimique, mais le traitement chimique est plus douloureux. De plus, il risque d’avoir des effets sur le microbiote qui masquent ceux dus au développement de la tumeur. Comme nous souhaitons suivre le développement de la tumeur, nous utiliserons des souris de quatre à 60 semaines.

1697 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1333 d'entre elles et modéré pour 364. Selon les lots, elles subissent une greffe de thymus, une ablation du thymus par ouverture du thorax, des injections dans le thymus guidées par ultrasons, des injections répétées ou une irradiation. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer inactivité, perte de poids et douleur pendant trois jours, et que toutes les souris sont tuées pour analyser leurs organes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le développement de ces cellules immunitaires et que seul un 'organisme complet' permet d'étudier leur migration.

Objectifs

Les cellules MAIT (Mucosal Associated Invariant T cells) sont des lymphocytes T reconnaissant des dérivés métaboliques. Ces cellules représentent 1 à 10% des lymphocytes T circulants chez l'homme, et entre 10 et 40% dans les tissus muqueux tels que le poumon, la peau ou encore le foie. Différentes données du laboratoire et de la littérature suggèrent qu’elles sont importantes pour l’immunité et la réparation tissulaire. Les cellules MAIT se développent dans le thymus, un organe situé dans la partie supérieure du thorax. Là elles se différencient en deux sous-ensembles nommées MAIT1 et MAIT17 qui ont différentes fonction. Actuellement, les molécules qui déterminent ce point de différenciation sont inconnues. L’objectif de ce projet est donc d’étudier comment les cellules MAIT se développent dans le thymus ainsi que les facteurs permettant leur colonisation dans les tissus muqueux périphériques.

Bénéfices attendus

Ce projet tente de répondre à une question fondamentale en immunologie : comprendre les différents signaux qui sont nécessaires pour le développement et la colonisation des tissus par les cellules MAIT. Ce projet pourrait permettre à court terme d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes qui influencent la génération et distribution des cellules MAIT dans les tissus et de découvrir les bénéfices qui peuvent arriver en conséquence. A plus long terme, ces découvertes peuvent permettre une meilleure maîtrise des cellules MAIT qui ont d’importantes fonctions pour la défense de l’organisme contre les bactéries entre autres et la régénération des tissus.

Procédures

Chaque animal ne subira qu’une procédure décrite ci-après. Un premier lot d’animaux subira un greffe de thymus, chirurgie qui dure au maximum 20min, sur animal anesthésié avec une injection intra-péritonéale (i.p). L’analgésie sera réalisée par injection sous-cutanée 20min avant la chirurgie puis maintenue par injection sous-cutanée (s.c.) en fin d’intervention et puis 2 fois/jour pendant 48h. Chaque injection durera moins de 10sec. Un second lot de souris subira une ablation du thymus (thymectomie), chirurgie qui dure 20min max avec l’ouverture du thorax et ablation. La même analgésie sera réalisée que précédemment. Deux autres lots de souris, sous anesthésie gazeuse, seront injectées (avec un marqueur ou des cellules) dans le thymus en utilisant une machine à ultrasons (durée maximum 15 min). Dans une 5ème lot de souris, des administrations régulières de substances par voie s.c. ou i.p. seront faites sur animal vigile 1 ou 2 fois par jour (selon l’expérience) jusqu’à 2 semaines (durée de chaque injection inf 10sec). Dans un 6ème lot de souris, des cellules thymiques seront injectées par voie intraveineuse (i.v.) sur animal vigile ou sous anesthése gazeuse (durée maximal de 10 min avec anesthésie). Dans un 7ème lot, les souris seront irradiées (durée : 30 min incluant le placement dans les chambres d’irradiation et l’irradiation ) puis recevront par voie i.v. des cellules de moelle osseuse donneuses. Dans un dernier lot, les souris subiront des gavages de produit non toxique jusqu’à un maximum de 8 fois pendant 2 semaines.

Impact sur les animaux

Après les chirurgies de greffe de thymus et thymectomie, les animaux peuvent se présenter plus inactifs et perdre du poids ainsi que sentir une douleur pendant les 3 jours qui suivent les chirurgies. Aucun effet de longue durée est lié à ces chirurgies et les animaux récupèrent vite et normalement démontrent un comportement normal après 3 jours. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements ou cellules seront une légère douleur liée à l’injection. Aucun effet indésirable indirect n’est prévu pour la durée des traitements. Irradiation pour la génération des chimères. Les animaux peuvent perdre du poids pendant les 3 jours suivants la procédure et seront donc surveillés pendant ce temps.

Devenir

Le point final de toutes les expériences nécessite la mort de tous les animaux pour l'analyse des organes. Par conséquent, aucun animal d'expérience ne sera vivant à la fin du projet.

Remplacement

La nature de ce projet ne permet pas le remplacement des souris car des modèles in vitro qui miment le développement des cellules MAIT dans le thymus n’existent pas. De plus, la seule manière d’étudier la migration et la colonisation dans les tissus muqueux est l’utilisation d’un organisme complet comme la souris pour permettre l’ensemble des interactions entre les cellules. Par contre, nous mettons au point actuellement un modèle in silico pour prévoir l’importance de gènes cibles sur le développement des cellules MAITs. Cette approche permettra la priorisation et la sélection de gènes à étudier chez la souris.

Réduction

Au sein du laboratoire, nous avons développé un système de culture de cellules MAIT in vitro ce qui nous permet de les expandre et d’obtenir une quantité de cellules plus importante à partir d’un animal. L’analyse de données in silico générées au laboratoire va permettre de prioriser des gènes cibles diminuant le nombre d’expériences nécessaires au projet. En plus, nous avons développé un modèle de transfert de cellules qui permettra de tester rapidement la fonction de plusieurs gènes cibles et réduire le nombre de nouvelles lignées crées sur la base des résultats obtenus. Dans les procédures nécessitant la mise en culture de cellules, l’expérimentateur sera formé à la technique de récupération de cellules de moelle osseuse sur les os principaux qui en contiennent (tibia, fémur et iliaque). Ceci permettra de réduire le nombre d’animaux donneur de cellules. Nous utiliserons de façon générale 12 souris par groupe expérimental (à repartir équitablement par 3 répétitions, soit 4 souris par group á chaque manip). Il s’agit d’un nombre suffisant qui nous permettra de surmonter les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à notre modèle. Ce nombre se base sur des expériences similaires réalisées au laboratoire avec ce modèle. En plus, ce nombre nous permettant également d’avoir une puissance statistique suffisante pour identifier un effet biologique et ainsi valider les résultats d’une expérience.

Raffinement

Afin de limiter aux maximums les nuisances sur l’animal : Pour les injections intraveineuses, utilisation d’anesthésie Avant les chirurgies, l’expérimentateur viendra manipuler sans douleur les animaux pour qu’ils puissent s’habituer à la préhension. Cela permet de limiter le stress lié à l’expérimentation. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec prise en charge pré, per et post-opératoire et se termineront par l’injection d’une solution de réhydratation chauffée. De la nourriture gélifiée sera disposée dans le fond de cage pour faciliter l’accès De la crème vaseline oculaire sera utilisée pour éviter l’assèchement de l’œil durant et après l’anesthésie. Surveillance de l’animal dès le lendemain de la chirurgie puis au minimum 2 fois par semaine pour surveiller l’état général des souris. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est ici un modèle de choix du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. Plus particulièrement, les cellules MAIT ainsi que leur molécule de restriction n’apparaissent que chez les mammifères, chez qui elles sont très fortement conservées. De plus, nous avons une bonne connaissance du génome de la souris, ce qui nous permet de créer des souris génétiquement modifiées pour des gènes d’intérêts pour notre projet de recherche. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 - 12 semaines ou, pour certaines procédures, plus jeunes (dès 2 semaines). Pour les injections des cellules ou substances, les animaux plus jeunes seront utilisés parce qu’il a été démontré que la colonisation des tissus muqueux est surtout établi à cet âge. Par contre, pour les chirurgies les animaux seront utilisés à l'âge de 6 – 12 semaines afin qu’ils aient fini leur croissance, qu’ils récupèrent mieux des procédures et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.

3920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2660 d'entre elles et modéré pour 1260. Elles subissent des injections intrapéritonéales, des mises à jeun de 16 heures, des gavages, des prélèvements de sang par microcoupure de la queue et une biopsie de la queue pour génotypage, sous un régime riche en graisses les faisant grimper jusqu'à 45 grammes. Le porteur indique que les souris sans génotype d'intérêt seront tuées sans procédure et les autres à la fin pour prélever leurs tissus. Il affirme que les organoïdes et cultures cellulaires ne reproduisent pas le dialogue entre organes d'un 'organisme entier' et conclut à l'absence d'alternative non animale.

Objectifs

Il est établi que les cellules immunitaires jouent un rôle clé dans la mise en place et de la progression du diabète. Nous avons identifié plusieurs gènes cibles impliqués dans la pathogenèse du diabète de type 2, mais leurs rôles sont moins bien connus. Notre objectif est de déchiffrer les rôles de ces gènes cible dans l’inflammation et le développement des maladies et complications liées à l’obésité alimentaire.

Bénéfices attendus

L'obésité et le diabète de type-2 sont de mieux en mieux compris par la communauté scientifique, toutefois plusieurs inconnues demeurent quand au rôle de l'inflammation chronique dans ces maladies. Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes gouvernant l’inflammation du tissu adipeux et du foie dans l’obésité et pourrait définir une nouvelle approche thérapeutique.

Procédures

- Injection intrapéritonéale, 10s, 2X par animal. - Mise à jeun, 16h, 2X par animal. Mise à jeun, 6h, 2X par animal. - Gavage, 10s, 2X par animal. - Prélèvement de sang par microcoupure de la queue, 10s, 6X par animal. Biopsie de queue, 10s 1X par animal

Impact sur les animaux

- Régime riche en graisse (HFD) : les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines (jusqu’à 45 grammes) et devenir un peu moins actifs. - Injection intrapéritonéale (IP) : douleur légère due à la piqure. - Microcoupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. - Mise à jeun : Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. - Gavage : stress dû à la contention et à la sonde de gavage. - Biopsie de l'extrême poite de la queue à l'age de 10 jours pour génotypage: douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet. Les animaux sans génotype d'interet seront sortie de l'étude (mis à mort sans procédure).

Remplacement

Les alternatives non animales comprennent principalement les organoïdes et les cultures de lignées cellulaires, ainsi que les simulations in silico. Ces modèles ont été déployés pour établir les interactions moléculaires et valider nos outils d'intervention, notamment par l'édition génétique via CRISPR-Cas9. Cependant, ces alternatives ne permettent pas d'étudier le cross-talk interorgane ni de reproduire les interactions complexes présentes dans un organisme entier. Ainsi, malgré leur utilité initiale, elles s'avèrent insuffisantes pour les objectifs avancés de notre projet qui requiert une analyse systémique du métabolisme et des processus physiopathologiques. Nous avons évalué en profondeur la faisabilité de ces méthodes alternatives et avons conclu qu'il n'existe pas d'alternative non animale capable de remplir intégralement les objectifs de notre étude, surtout en ce qui concerne la compréhension des interactions à l'échelle de l'organisme. Avant de déterminer la nécessité d'utiliser des modèles animaux, nous avons envisagé des approches de remplacement partiel, notamment les études in vitro et ex vivo pour certaines phases expérimentales, ainsi que les approches in silico pour la modélisation prédictive. Ces étapes ont été cruciales pour la validation moléculaire. Néanmoins, pour caractériser les rôles des acteurs moléculaires dans un contexte physiologique et pathologique complexe, les modèles in vivo sont devenus incontournables. Cela nous permet d'explorer l'impact des modifications moléculaires sur plusieurs systèmes d'organes simultanément, un aspect qui ne peut être capturé par les alternatives précédentes.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et transcriptomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. De plus nous avons déterminé un nombre de 30-40 souris par groupe en fonction de données de la littérature et grâce à l'utilisation d'un outil statistique pour le calcul des effectives avec un test de puissance. Concernant les résultats, une analyse statistique (test de Wilcoxon) sera réalisée en tenant compte de la variabilité intra-groupe (T test (2 conditions), Test anova (plus de 2 conditions)), ainsi qu'un test ANOVA sur mesures répétées pour les mesures de glycémie/insulinémie et les poids des souris.

Raffinement

Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Pour limiter les nuisances/effets indésirables par exemple Injection intrapéritonéale, nous utiliserons d’une aiguille fine 26 ou 27 Ga, pour gavage un sonde souple. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les personnel seront formé à ces techniques.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de l’obésité alimentaire et l’insulinorésistance. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été valide dans des publications précédentes. Les souris utilisées auront entre 8 et 10 semaines au début de la procédure, ce qui correspond à la maturité sexuelle des souris soit la stabilisation hormonale. De plus à cet âge la maturation du système gastro-intestinal en lien avec le système immunitaire, largement étudié dans ce projet, a déjà eu lieu. À la fin de la procédure, les souris seront l'âgé de entre 20 à 24 semaines, qu’il s’agit de souris adultes.

810 souris et 298 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des cellules de gliome sont implantées dans le cerveau par chirurgie, puis les animaux reçoivent des injections thérapeutiques répétées et des ultrasons pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique, avec des sessions d'imagerie sous anesthésie, le porteur reconnaissant une toxicité possible sur les organes sains. Les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas le flux sanguin ni l'infiltration immunitaire et revendique un fort potentiel de transfert clinique.

Objectifs

De nouvelles innovations thérapeutiques à base d’anticorps et de peptides spécifiques pourraient améliorer significativement les conséquences des cancers du cerveau les plus graves : les gliomes. Ces thérapies ciblent spécifiquement des molécules exprimées principalement par les gliomes et diminuent considérablement les effets secondaires tout en augmentant l’efficacité thérapeutique. Malheureusement l’efficacité de ces traitements est freinée une barrière naturelle, appelée « barrière hémato-encéphalique » (BHE), qui limite la diffusion dans le cerveau des médicaments qui pourraient être efficaces contre ces tumeurs. Les gliomes, qui sont des tumeurs cérébrales très agressives, restent essentiellement incurables même si la BHE est partiellement compromise par la présence de cette tumeur. L’objectif du projet est d’évaluer une stratégie thérapeutique qui vise à surmonter la limitation de la diffusion des médicaments dans la tumeur, en combinant des ultrasons focalisés à des médicaments innovants, associés ou non avec des isotopes thérapeutiques. Les isotopes directement injectés dans la circulation sanguine, agissent comme une radiothérapie interne. Ils ont aussi été montrés stimuler le système immunitaire en plus de leur effet thérapeutique sur les cellules tumorales. Les ultrasons focalisés ont prouvé leur capacité à faciliter la diffusion de divers médicaments dans le cerveau grâce à une ouverture transitoire et sécurisée de cette barrière sans causer de lésions cérébrales. Nous exploiterons cette perturbation de la BHE pour adresser les médicaments directement dans la tumeur, tout en y associant une radiothérapie interne. Cette stratégie sera évaluée sur des modèles de rongeurs (souris et rats) présentant soit un statut immunitaire normal soit une immunorésistance, pour évaluer toutes les conditions pouvant se présenter en clinique humaine. . Ce projet sera réparti entre deux établissements pour réaliser d’un côté la thérapie et de l’autre le suivi par imagerie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider de nouvelles stratégies thérapeutiques en utilisant des traitements innovants et des ultrasons focalisés. Ces approches thérapeutiques présentent un fort potentiel de transfert chez les patients. Dans le cadre de ce projet, une évaluation des thérapies par imagerie TEP est également envisagée. Cette méthodologie, associée à l'utilisation de radioligands, pourrait bénéficier aux patients de deux manières : en améliorant la sélection des patients pouvant bénéficier des traitements innovants et en optimisant la dose médicamenteuse afin de réduire les effets toxiques potentiels.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o La mise en place du modèle tumoral (45 minutes d’intervention chirurgicale, une seule injection par animaux) : des cellules tumorales seront injectées sous anesthésie générale dans une sous-structure du cerveau : le striatum pour la formation de tumeurs o L’injection de molécules permettant l’imagerie chez l’animal sous anesthésie générale pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre total d’injections par souris/rats : maximum 3). o L’injection des agents thérapeutiques qui aura lieu tous les deux à trois jours pendant deux semaines environ (temps d’injection de la thérapie 5 minutes, nombre total d’injections par souris/rats : maximum 6). o Une anesthésie lors des différentes sessions imageries (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 6 sessions d’imagerie. o Un prélèvement sanguin sur animaux sous anesthésie (maximum 5 minutes, 5 maximum au total ). Le diagnostic et la thérapie seront réalisés dans un premier établissement utilisateur alors que le suivi par imagerie sera réalisé dans un autre établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • L’injection des radioligands en intra veineux peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (70 minutes maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. • Le geste chirurgical lors de la mise en place du modèle tumoral induira une douleur au niveau de la boite crânienne. L’acte chirurgical durera 30 min. Les traitements peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de dose thérapeutique décrite et validée dans la littérature.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour des analyses ex vivo de biomarqueurs d’intérêt tumoraux et au niveau du système immunitaire.

Remplacement

Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont évaluées sur des cultures cellulaires et des tumoroides pour déterminer leur pertinence, ainsi que pour identifier une éventuelle surexpression de biomarqueurs au niveau des tumeurs. Un travail impliquant plusieurs équipes spécialistes des gliomes et de la BHE porte notamment sur l’élaboration de modèles tumoroides couplant gliomes et microenvironnement tumoral pour évaluer in vitro les différentes stratégies thérapeutiques. Les tests in vitro préliminaires sont mis en place afin de définir la stratégie qui sera appliquée in vivo, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés pour l'évaluation sur un modèle murin. Cependant, nos modèles in vitro sont limités quant à l’interaction entre les cellules tumorales et le microenvironnement tel que les différentes populations du système immunitaire.Afin de valider les thérapies et la stratégie associée par imagerie, il est nécessaire d'implanter les tumeurs dans l'organe cible, en l'occurrence le cerveau. L’ouverture de la BHE par l’utilisation d’ultrasons thérapeutiques ne peut être que testée dans un environnement complexe récapitulant le flux sanguin, les jonctions de la barrière cérébrales, l’infiltration immunitaire et les flux lymphatiques cérébraux uniquement observable in vivo. Cette approche permet de mieux simuler le contexte physiologique et de fournir des données plus pertinentes pour le transfert clinique de ces stratégies.

Réduction

L’imagerie TEP permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux étant donné que l’impact des traitements sera suivi de manière longitudinale sans avoir recours à des euthanasies à différents temps d’imagerie. Cette évaluation nécessitera d’avoir recours à un traitement des images et l’utilisation de modèles mathématiques pour extraire un maximum de données directement transférables en clinique. En tenant en compte les différentes données préliminaires et les données bibliographiques, le nombre d’animaux par groupe a été déterminé entre 10 et 12 afin d’être statistiquement significatif. Les données quantitatives issues de l’imagerie seront exprimées en moyenne avec un écart-type associés.

Raffinement

Toutes les interventions invasives à savoir les injections de radioligands, les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse complétée par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liés aux interventions. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Les animaux seront entrainés à la manipulation pour éviter tout stress. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. Si une souffrance est observée, un antalgique pourra être administré en accord avec le/la vétérinaire référent-e. sera administrée. Les rongeurs seront transportés dans des cages adaptées aux transports comportant de la litière et de la nourriture gélifiée. Le transport sera réalisé dans un véhicule dédié aux transports des animaux avec une climatisation. Le parcours entre les deux sites est de 20 minutes maximum.

Choix des espèces

Ce projet a comme objectif d’évaluer de nouveaux axes thérapeutiques qui peuvent être directement transférables à l’humain. En fonction de la lignée cellulaire tumorale utilisée, la souris ou le rat sont des animaux de choix pour la mise en place de modèle tumoraux. Ayant une taille adaptée pour la manipulation et l’imagerie corps entiers. Les modèles permettant une implantation de la tumeur dans son environnement d’origine sont largement utilisés pour examiner le microenvironnement tumoral essentiel pour valider les stratégies thérapeutiques et les biomarqueurs prédictifs. Les souris et les rats utilisés dans ce projet auront atteint un stade jeune adulte (5 semaines) à adulte (8 semaines). Cette tranche d’âge permet d’être représentative des cancers cérébraux chez les patients majoritairement à l’âge adulte.

920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection intracérébrale de virus par stéréotaxie, avec ouverture de la peau du crâne, avant une perfusion intracardiaque, le porteur reconnaissant des effets modérés liés à la chirurgie et une perte de poids transitoire. Le cerveau est prélevé pour les analyses histologiques. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne peut recréer les interactions entre astrocytes, neurones et vaisseaux.

Objectifs

Les astrocytes sont les cellules gliales majoritaires du cerveau. Ils possèdent une interface vasculaire qui consiste en des prolongements ou "pieds" qui vont au contact des vaisseaux sanguins cérébraux. A cette interface, appelée l’unité gliovasculaire, les astrocytes régulent les fonctions vasculaires cérébrales. Cependant les modalités de ces régulations astrocytaires sont très mal connues alors même qu'elles sont altérées dans un grand nombre de pathologies cérébrales. L'intérêt d'étudier les interactions entre les astrocytes et le système vasculaire est donc in fine de pouvoir comprendre les mécanismes de ces pathologies et de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans une étude récente, nous avons montré que MLC1, une protéine des astrocytes très enrichie dans les pieds astrocytaires périvasculaires controle le développement postnatal de plusieurs fonctions vasculaires cérébrales. Le but de notre projet est de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu en comparant des souris transgéniques MLC1KO a des souris WT issues des mêmes portées (littermates). Nous avons identifié 50 marqueurs à tester au cours du développement de l’unité gliovasculaire à 15 jours postnatal (stade immature) 2 mois (stade intermédiaire) 4 mois (stade mature) et 1 an (stade âgé). Ces investigations seront réalisées sur des coupes histologiques de cerveau . Pour pouvoir étudier les marquages spécifiquement dans les astrocytes, nous avons prévu de les marquer par une protéine fluorescente telle que la GFP (Green fluorescent protein) qui sera induite par une approche virale administrée par stéréotaxie. Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle de MLC1.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle de la protéine MLC1 dans le développement de l’unité gliovasculaire du cerveau. Ce projet apportera des éléments de connaissances essentielles sur les modalités des régulations astrocytaires et apportera un éclairage essentiel sur denombreuses pathologies cérébrales dans lesquelles ces régulations sont altérées pour in fine proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les interventions sous anesthésie générale (injection stéréotaxique puis perfusion intracardiaque) durent 30 minutes et ne sont réalisées qu’une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

Nous n’attendons pas de nuisance liée au génotype des animaux MLC1KO qui est une modification génétique non dommageable. Les animaux subiront une injection intracérébrale de virus de type AAV (adenovirus associé) qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie pendant laquelle une ouverture de la peau du crane est pratiquée. L'opération peut aussi être à l'origine d'une perte de poids transitoire.

Devenir

L'euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour les analyses histologiques. Ces analyses nécessitent que les vaisseaux sanguins ne contiennent plus de sang car sa présence interfère avec l'expérience d'immunofluorescence

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Cependant, le nombre d'animaux utilisés (800 animaux au total) sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entreles différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la surutilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et de l'environnement. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 5 animaux indépendant par condition. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité possible entre les animaux en général que nous avons observée lors d’une étude précédente sur le modèle MLC1KO.

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement (présence dans la cage de coton pour faire un nid et objets en carton) et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal en accord et en dialogue avec notre SBEA et notre vétérinaire référente. Nous n’attendons pas d’effet particulier lié au génotype des animaux MLC1KO qui est une modification génétique non dommageable (phénotype étudié dans une étude précédente). Dans nos expériences où une anesthésie profonde est réalisée, la qualité de l'anesthésie sera systématiquement contrôlée par l'absence de reflexe réponse au pincement de la patte. Les souris subiront une injection intracérébrale de virus de type AAV (adenovirus associé) qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie (ouverture de la peau du crane). Les animaux opérés feront donc l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure de chirurgie et les jours suivants. Une procédure avec des points limites gradés a été mise en place pour la surveillance des animaux post opération. Elle est basée sur l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé), la mobilité des animaux (prostration), l'absence de lésion ou saignement, la présence d'un nid dans la cage. Ces points limites intermédiaires permettent la mise en place de soins des animaux seront respectés évitant l'euthanasie des animaux. La cicatrisation de la peau sera surveillée par l'expérimentateur. La chirurgie peut aussi être à l'origine d'une perte de poids transitoire qui sera surveillée en pesant les animaux avant et après (pendant les 5 jours post chirurgie).

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous avons identifié 50 marqueurs à étudier (variation d'expression de gènes identifiés lors d'une étude transcriptomique issue de la littérature) à tester au cours du développement de l’unité gliovasculaire au jour postnatal 15, à 2 mois, à 4 mois et à 1 an. Ces stades ont été choisis sur la base de nos études préalables qui montrent que les pieds astrocytaires et les vaisseaux ont formés mais immatures à P15 et continuent leur maturation moléculaire entre P15 et 4 mois. Le stade d’un an correspond à un stade âgé pour comprendre les effets de l’absence de MLC1 dans le contexte du vieillissement.

48 macaques à longue queue vont être utilisés, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. La moitié est exposée au SARS-CoV-2 puis subit des séances d'imagerie sous anesthésie, des prélèvements sanguins et de nombreux écouvillonnages nasaux et trachéaux, avant d'être tuée pour prélever les organes, les 24 autres étant gardés vivants et réorientés vers d'autres projets. Le porteur qualifie ces prélèvements d'organes d'"indispensables" pour valider l'imagerie. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'offre le répertoire immunitaire d'un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet a pour objectif principal de déterminer la dynamique de distribution dans l’organisme des cellules immunitaires effectrices, c’est-à-dire qui participent à la réponse immunitaire suite à une infection par le virus du SARS-CoV-2 chez le primate non-humain. Cela permettra une meilleure compréhension des mécanismes d’infection et des réponses immunitaires associées dans les voies aériennes mais également les organes non-respiratoires tout au long de l’infection, des phases les plus précoces au suivi de la pathologie chronique. Ce projet permettra également à terme d’évaluer l’efficacité de traitements et vaccins, en suivant l’adéquation de la réponse immunitaire cellulaire induite avec la résolution de la pathologie mais aussi de mieux comprendre les phénomènes induisant les symptômes de COVID long.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal de ce projet est une meilleure compréhension à l’échelle du corps entier de la réponse immunitaire à court et moyen terme suite à une infection par le virus du SARS-CoV-2. Il est aujourd’hui connu que la sur-stimulation du système immunitaire chez certains patients infectés par le SARS-CoV-2 induit un emballement du système immunitaire qui entraine par la suite des défaillances respiratoire et cardiaque. Cependant chez la majorité des patients infectés, cette réponse immunitaire reste plus modérée et souvent faiblement symptomatique. Ces réponses sont relativement bien caractérisées au niveau sanguin mais demeurent encore peu explorées à l’échelle du corps entier. Ce projet permettra ainsi de renforcer nos connaissances au niveau de ces réponses et d’établir des corrélats de protection par exemple pour les futures stratégies de prévention.

Procédures

Les animaux du premier groupe seront soumis sur une période totale de 2 semaines à 4 séances d’imagerie médicale (durée de 30 minutes à 2h) sous anesthésie générale avec un prélèvement sanguin effectué lors de ces séances. Les animaux du second groupe seront soumis aux mêmes séances d’imagerie médicale avec prélèvements sanguins (4 prélèvements répartis sur 2 semaines) mais seront auparavant exposés sous anesthésie générale (durée de l’intervention d’environ 30 minutes) de manière unique au virus SARS-CoV-2 et testés sous anesthésie par écouvillonnage nasal (11 écouvillons sur les 3 premières semaines après infection) et trachéal (11 écouvillons sur 3 semaines) pour évaluer la présence du virus dans les voies aériennes (chaque session de test par écouvillonnage est d’une durée de 15 minutes) .

Impact sur les animaux

La pathologie engendrée par l’exposition au SARS-CoV-2 provoque chez les animaux des symptômes légers à modérés (légère perte de poids et d’appétit). Les anesthésies nécessaires aux prélèvements pour le suivi de la pathologie (écouvillons nasaux, trachéaux, prises de sang) ainsi que pour les examens d’imagerie peuvent provoquer une légère perte de poids et un stress transitoire chez les animaux.

Devenir

Seuls les animaux infectés avec le SARS-CoV-2 seront euthanasiés au cours de cette procédure. L’euthanasie est nécessaire à la fin de la séquence d’imagerie afin de prélever les organes clés identifiés par imagerie, sur lesquels seront réalisées des analyses dosimétriques et multiparamétriques. Ces analyses sont indispensables pour valider les données observées en imagerie et pour permettre une caractérisation plus fine des réponses immunitaires dans ces organes clés. Les animaux non exposés au SARS-CoV-2 seront gardés en vie et après avis vétérinaire, inclus dans d’autres projets compatibles avec les procédures subies dans celui-ci.

Remplacement

Les outils d’étude in vitro des réponses immunes associées à l’infection par le SARS-CoV-2 sont en plein essor : études sur épithéliums reconstitués, ou sur organoïdes par exemple. Cependant, jusqu’à présent, aucune alternative non-animale n’offre le répertoire des réponses immunes développées in vivo dans un organisme entier, ni la symptomatologie associée à l’infection par le SARS-CoV-2. Le modèle animal choisi est le macaque car il présente d’une part une réponse immunitaire semblable à celle de l’humain, et d’autre part des caractéristiques physiopathologiques très similaires à celles observées dans la majorité des cas d’infection chez l’humain. De plus, des outils nécessaires au développement de ce modèle primate non-humain sont disponibles et maitrisés. Les molécules traceuses ciblant les réponses immunitaires qui seront utilisées in vivo chez l’animal seront bien entendu auparavant testées et caractérisées in vitro auparavant.

Réduction

Un total de 48 animaux maximum seront utilisés dans ce projet. Pour chacune des deux procédures, un total de 24 animaux au maximum seront utilisés. Pour la première procédure, l’objectif est d’étudier la distribution et l’atteinte de ses cibles in vivo d’un traceur qui permettra de visualiser les cellules immunitaires d’intérêt. Quatre molécules test de traceur seront utilisées et pour chaque molécule test, deux doses seront administrées. Trois animaux par dose et par traceur sont prévus au maximum afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la fiabilité des résultats pour établir la preuve de concept. Pour cette première procédure, le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse si moins de 4 molécules tests sont nécessaires à la caractérisation recherchée. De plus si deux molécules sont compatibles, c’est-à-dire si elles ne risquent pas d’entrainer une réponse immunitaire dirigée contre l’autre molécule, alors un même groupe de 3 animaux pourra tester 2 voire 3 traceurs au lieu d’un seul, avec une période de 1 mois minimum entre chaque test de molécule, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés au total. Pour la deuxième procédure, qui a pour objectif de déterminer la cinétique de distribution de populations de cellules immunitaires d’intérêt chez des animaux infectés par le SARS-CoV-2, trois groupes d’animaux sont prévus, un par stade de pathologie : phase aigüe, phase intermédiaire et long terme. Le premier groupe évaluera 2 traceurs et comportera 12 animaux. Les deux groupes suivants évalueront chacun 1 traceur et comporteront 6 animaux .Les résultats obtenus permettront d’évaluer statistiquement les différences de distribution de ces cellules d’intérêt en fonction du stade de la pathologie.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera effectué sur des animaux anesthésiés. Nous serons cependant très vigilants, les animaux seront surveillés quotidiennement et plusieurs grilles de score permettant d’évaluer l’état clinique d’avancement de la pathologie SARS-CoV-2, le comportement et la douleur de l’animal seront mises en place. De plus, nous possédons un système d’alerte automatique via notre base de données en cas de perte de poids supérieure à 10% en 15 jours ainsi que pour des numérations sanguines anormales ; une alerte de limite de volume sanguin total selon le poids de l’animal est également en place. Il n’est pas attendu de douleur particulière liée aux interventions. L’utilisation d’antalgiques n’est donc pas prévue de façon systématique mais elle pourra être mise en place si des signes cliniques inattendus de douleur ou un comportement anormal de l’animal (position antalgique, poil hérissé, gémissement) apparaissent. Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors des séances d’imagerie. Un anesthésique local sera utilisé lors de l’intubation et les animaux seront étroitement surveillés jusqu’à leur réveil. Les animaux seront hébergés en groupe sauf pendant les 2-3 semaines suivant l’infection SARS-CoV-2 afin d’éviter les contaminations croisées entre individus et durant lesquelles un enrichissement adapté sera proposé

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus est retenu pour ce projet pour plusieurs raisons : - La réponse immunitaire similaire à celle de l’homme, et évaluation de la réponse immune possible dans les tissus. - Les réponses aux vaccins et aux traitements dans cette espèce sont semblables à celles observées chez l’homme - Ils ont déjà fait l’objet de publications scientifiques en tant que modèles d’infection par le SARS-CoV-2 L’objectif de ce projet est de mieux comprendre la réponse immunitaire à court et moyen terme après une infection par le virus du SARS-CoV-2 chez l’humain adulte. Le système immunitaire évoluant en fonction du stade de développement et de l’âge des animaux, les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux adultes âgés de 2 ans minimum, avec un système immunitaire mature. Les animaux utilisés seront au stade de développement adulte (2 ans minimum) car ils ont un système immunitaire mature. Le système immunitaire évolue en fonction du stade de développement et de l’âge des animaux.