Procédures légères

685 souris porteuses d'un modèle de trisomie 21 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections répétées par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée, jusqu'à cinq pour une partie d'entre elles, et sont hébergées en cage individuelle, source de stress que le porteur reconnaît. L'objectif est d'étudier la modulation d'un récepteur aux cannabinoïdes sur les réseaux de neurones, les pistes thérapeutiques annoncées restant qualifiées d'"inexplorées à ce jour". Sur le remplacement, le porteur indique avoir mené des analyses in silico et in vitro en amont, mais affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour l'étude de systèmes intégrés.

Objectifs

La trisomie 21 ou syndrome de Down est une maladie grave caractérisée par la triplication de tout ou partie du chromosome 21. La trisomie 21 est la première cause de retard mental d’origine génétique affectant 60 millions de personnes dans le monde. Découvrir une thérapie pouvant atténuer les déficits intellectuels, notamment cognitifs, est donc un enjeu de santé publique. Le but de notre projet de recherche est d’ordre préclinique en utilisant un modèle animal. Des modèles du syndrome de Down ont été développés chez la souris et la lignée Ts65Dn est, à ce jour, la plus étudiée car ces souris ont une triplication de chromosomes (équivalent au chromosome 21), sont viables avec un développement non dommageable, et présentent des caractéristiques proches des symptômes observés chez les individus atteints de trisomie 21. Notamment, les souris Ts65Dn sont caractérisées par des déficits cognitifs (différents types de mémoire et apparition précoce de la maladie d’Alzheimer) et psychomoteurs. Des données scientifiques suggèrent un dysfonctionnement des réseaux de neurones chez les souris Ts65Dn et proposent des cibles potentielles pour le traitement des symptômes. L’objectif général de notre projet de recherche consiste donc à étudier les modifications des réseaux neuronaux chez les souris Ts65Dn présentant un syndrome de Down. Cette étude contribuera ainsi à mieux comprendre les mécanismes de régulation sur les réseaux de neurones dans le cadre la trisomie 21 afin d’identidier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

La trisomie 21 est une maladie génétique causée par la triplication de tout ou partie du chromosome 21. Elle se manifeste par différents symptômes dont les plus fréquents sont le retard mental et les déficiences cognitives. Des données issues de la littérature mettent en évidences de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de ces symptômes, bien qu’inexplorée à ce jour. En effet, une classes de composés pharmaceutiques sont capables d’inverser certains déficits d’apprentissage chez les souris trisomiques. Ce projet consistera ici à produire une meilleure connaissance des mécanismes fondamentaux sous-tendant la régulation des réseaux monoaminergiques par les récepteurs CB1 dans le cadre du syndrome de Down.

Procédures

L’ensemble des gestes techniques décrits ci-après sera réalisé par une personne compétente formée à l’expérimentation animale et aux gestes techniques, qui sera sous la responsabilité du porteur de projet et sera en contact régulier avec le personnel zootechnique de l’animalerie d’expérimentation et les responsables du bien-être animal. Dans ce projet, 400 animaux recevront une seule injection au cours de la procédure et 160 autres animaux recevront un total de 5 injections : une injection quoditienne pendant 4 jours puis une dernière injection 24h après ou 4 semaines après pour induire une anesthésie générale. Ces injections seront réalisées sur animal vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. La durée du geste technique pour effectuer une injection est d'environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

L’administration des substances par voie intra-péritonéale et sous cutanée, ainsi que la contention nécessaire à la réalisation des administrations entrainent des douleurs et du stress. Des nuisances pourraient survenir à la mise en cage individuelle des animaux en raison du stress lié à l'hébergement individuel

Devenir

Au cours de ce projet tous les animaux seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau afin de réaliser des analyses ex vivo immunohistochimique ultérieures.

Remplacement

Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches substitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Des analyses in silico nous ont permis d’identifier le site de fixation allostérique de la pregnenolone sur le récepteur CB1. De plus, des études in vitro ont permis de montrer l’effet régulateur de la PREG sur le récepteur CB1. Ce projet s’applique maintenant à l’étude de systèmes intégrés qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal. En effet, il n’existe actuellement pas de modèle in vitro et donc de méthode alternative à l’utilisation des animaux. De plus, l’organisation du système nerveux central de la souris est assez proche de celle de l’homme, ce qui permettra une extrapolation à l’homme des résultats obtenus dans le projet de recherche.

Réduction

Dans le cadre de la stratégie de réduction, notre expérience au sein du laboratoire nous a permis de déterminer qu’un nombre de 10 souris par groupe expérimental est nécéssaire pour les prélèvements et analyses ex vivo, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets traitement. Enfin, les études réalisées au cours du projet précédent et une connaissance accrue de la bilbiographie sur la pregnénolone et le récepteur CB1 nous permet de proposer des groupes expérimentaux pertinants avec des conditions témoins appropriées.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne, et ce dès leur réception. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites. De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuisances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur réception, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, sizzle, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Les animaux seront alors placés dans des cages individuelles transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. La mise en cage individuelle est ici nécéssaire afin de minimiser l’impact potentiel de la hierarchie sociale sur le phénotype des et afin de reproduire les conditions d’hébergement dans le projet précédent. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation. Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie. Le cas échéant, un enrichissement supplémentaire pourra être apporté dans les cages d’hébergement afin d’optimiser le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le modèle de trisomie 21 chez la souris Ts65Dn est très bien caractérisé dans la littérature et représente le modèle de choix pour les études d’efficacité préclinique. En effet, c’est un des modèles génétiques les plus largement utilisés du syndrome de Down car les souris Ts65Dn sont trisomiques pour environ 2/3 des gènes orthologues au chromosome 21 humain. Ces souris triploïdes présentent les avantages d’être viables, d’avoir un développement non dommageable et d’exprimer plusieurs phénotypes qui reproduisent les symptômes des individus trisomiques, comme des déficits d'apprentissage et de mémoire; et elles développent précocement les signes pathologiques de la maladie d'Alzheimer. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes-adultes (entre 2 et 5 mois de vie) présentant des déficits cognitifs d'apprentissage et de mémoire et avant le développement de signes pathologiques précoces comme la maladie d'Alzheimer.

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modifiées génétiquement pour modéliser la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent des injections sous anesthésie, passent six tests de comportement mesurant l'anxiété, l'anhédonie, la sociabilité, l'apprentissage et la mémoire, et subissent pour certaines un prélèvement de liquide céphalo-rachidien et de sang avant mise à mort. Le porteur vise à évaluer le bénéfice thérapeutique de deux protéines des cellules gliales, mais les retombées pour les 900 000 personnes concernées restent renvoyées à un horizon lointain. Sur le remplacement, il affirme que les interactions entre neurones et cellules gliales ne sont pas reproduites in vitro et conclut à la nécessité de comparer ces régions sur l'"organe entier".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative encore incurable, et dont l'apparition semble liée à des phénomènes d’inflammation dans le cerveau auquel participent les cellules gliales (astrocytes et microglies), qui sont des partenaires essentiels aux neurones. Ce projet vise à évaluer le bénéfice thérapeutique de deux protéines exprimées par les cellules gliales à des stades différents du développement de la MA, l’une étant exprimée lors de la phase précoce de la MA, l’autre ayant un rôle dans l’inflammation observée lors de la MA. La première protéine ciblée est exprimée à la surface des cellules microgliales, les cellules immunitaires du cerveau, c’est un récepteur microglial. La deuxième protéine ciblée est exprimée par les astrocytes. Ce projet cherche à évaluer l’impact d’une part de la perte d’expression du récepteur microglial et d’autre part de la surexpression de la protéine astrocytaire sur le comportement, et les atteintes affectant les tissus et organes, dans un modèle souris de la MA. L’objectif est de prévenir et ralentir le développement de certains symptômes comportementaux, déficits de la mémoire et altérations des cellules et du cerveau observés chez les personnes atteintes de la MA.

Bénéfices attendus

La MA touche plus de 900 000 personnes en France et représente un problème sociétal majeur. Jusqu'à présent, la plupart des stratégies thérapeutiques ont ciblé directement les neurones et ont malheureusement échoué en clinique. Les cellules gliales assurent des fonctions clés dans le cerveau qui peuvent être perturbées dans la MA. Cibler ces cellules pour les rendre plus bénéfiques aux neurones apparaît comme une stratégie alternative potentielle. Cette étude préclinique dans un modèle souris de la MA à de multiples niveaux (biochimique, cellulaire, tissulaire, comportemental), permettra d’établir le bénéfice thérapeutique à cibler les cellules gliales pour la MA.

Procédures

Certaines souris recevront une injection sous anesthésie gazeuse de cinq minutes et seront analysées quatre mois plus tard par des tests de comportement. Certaines souris passeront six tests de comportement à deux âges espacés de 3 mois. Ces tests visent à évaluer l’anxiété, l’anhédonie (incapacité à ressentir le plaisir), la sociabilité, l’apprentissage et la mémoire des souris, ils durent entre cinq minutes et une heure chacun et seront réalisés sur six semaines en laissant deux-trois jours de repos entre chaque test. Enfin, toutes les souris seront euthanasiées par une méthode validée pour la réalisation d’une analyse post-mortem histologique ou biochimique. Certaines souris auront un prélèvement de liquide céphalo rachidien et de sang sous anesthésie et analgésie avant leur euthanasie (prélèvement de trente minutes maximum)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux utilisés sont une douleur limitée (en intensité et dans le temps) liée à l’injection intraperitonéale avant l’euthanasie ou l’injection intraveineuse sous anesthésie, ainsi que le stress lié à la contention et des tests comportementaux. Le stress sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement. Le stress sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement. La douleur lors des prélèvements de liquide céphalo-rachidien et de sang et avant perfusion sera pris en charge par la mise en place de procédures d’analgésie et d’anesthésie adaptées. Les changements comportementaux liés à la modélisation de la MA (réduction fine de la mémoire, légère anxiété mesurées sur des dispositifs dédiés et sensibles) représentent des nuisances extrêmement légères, qui n’entravent pas la capacité des souris à se nourrir, déplacer, et réaliser leurs comportement habituels…

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones (les cellules vulnérables dans la MA) et les cellules gliales partenaires. Ces interactions cellulaires ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. De plus la vulnérabilité de certaines régions cérébrales (ici préfrontal cortex et hippocampe) nécessite de comparer sur l’organe entier ces différentes régions qui ont parfois des connections anatomiques et fonctionnelles cruciales pour expliquer cette vulnérabilité sélective, et ne sont pas reproduite in vitro dans toute leur complexité. Les souris utilisées dans ce projet, permettent d’étudier les interactions neurones-astrocytes-cellules microgliales dans le contexte génétique de la MA. Elles reproduisent le phénomène d’agrégation de peptides amyloïdes et différents symptômes histologiques, biochimiques et cognitifs caractéristiques de la MA.

Réduction

Le projet prévoit au maximum 224 souris nées dans une animalerie agrée ou dans notre élevage. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par exemple certaines souris auront une analyse sanguine et du liquide céphalorachidien ainsi qu’une évaluation histologique complète de plusieurs régions du cerveau avec quantification de plusieurs paramètres par souris. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Des points limites sont établis pour chaque procédure, pour lesquels les souris seront euthanasiées. La gestion de la douleur et de l’inconfort liés aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à l’expérimentateur avant chacune des sessions de tests comportementaux permet de réduire le stress des souris à la manipulation. Un soutien thermique sera mis en place lors des anesthésies.

Choix des espèces

Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones et cellules gliales ; les organismes modèles simples possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau mammifère. Les souris modèles de la MA, utilisées pour ce projet, permettent d’étudier les interactions neurones-cellules gliales dans le contexte génétique de la MA. Elles présentent aussi des altérations cognitives et comportementales caractéristiques de MA. La MA est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Les altérations histologiques et biochimiques, ainsi que les altérations du comportement apparaissant dans ce modèle de la MA vers 6-9 mois. Les souris seront analysées entre 6 et 10.5 mois en fonction de l’évolution des symptômes analysés.

1866 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Ils subissent pendant des mois des tests comportementaux quotidiens, une restriction alimentaire, des tests d'anxiété et de locomotion, une chirurgie intracérébrale et des séances de contention forcée, pour étudier le rôle de récepteurs nicotiniques dans des troubles neuropsychiatriques. Le porteur qualifie les dommages de minimes en indiquant que les modèles employés n'induisent pas d'altération majeure de la santé. Il affirme que ces fonctions cognitives et émotionnelles ne peuvent s'étudier que sur des animaux au système nerveux entier et fonctionnel.

Objectifs

Un rôle important de certains récepteurs cellulaires a été mis en évidence par de nombreuses études dans un ensemble de pathologies neurologiques, neurodéveloppementales et psychiatriques, notamment dans les troubles cognitifs associés. L’objectif global du projet est de préciser ce rôle et d’identifier ses mécanismes sous-jacents qui ne sont pas encore élucidés, dans l’espoir d’ouvrir de nouvelles voies de recherche thérapeutique. Plus précisément les objectifs sont i) de mieux caractériser le rôle de deux sous-unités majeures d’un récepteur dans les processus cognitifs altérés au cours de différentes pathologies neuropsychiatriques, ii) de tester l’impact de molécules pharmacologiques agissant sur ces récepteurs sur certains de ces processus, et iii) d’identifier les circuits cérébraux impliqués dans leurs mécanismes d’action, en utilisant des modèles précliniques présentant une forte valeur translationnelle.

Bénéfices attendus

Les pathologies neurodégénératives, neurodéveloppementales et psychiatriques représentent l’un des enjeux majeurs de santé publique, et leur prévalence s’accroit. Il n’existe à ce jour pratiquement aucun traitement efficace pour soigner ces pathologies, notamment les troubles cognitifs qui leur sont associés. A court terme, ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des rôles de certains récepteurs aux neurotransmetteurs, exprimés dans différentes régions du cerveau, dans les fonctions cognitives impactées au cours de ces pathologies. De plus, ce projet devrait permettre d’identifier une étiologie commune potentielle à différents troubles neuropsychiatriques, grâce à des approches précliniques impossibles à mettre en œuvre en recherche clinique. Grâce à l’implémentation de tests précliniques à forte valeur translationnelle, ce projet pourra ouvrir à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur des composés ciblant certains sous-types de récepteurs nicotiniques, tels que des modulateurs allostériques de ces récepteurs qui sont actuellement en voie de développement. Ce projet générera également des bases solides pour de futures études cliniques avec nos collaborateurs proches qui ont accès à des cohortes de patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests comportementaux quotidiens d’1h maximum par jour, pendant des mois, élaborés pour générer le moins de stress possible aux animaux. Ils seront également soumis, seulement une fois et pour 30 minutes maximum, à des tests d’anxiété et de locomotion, susceptibles d’entraîner un stress passager. Les animaux ne seront pas soumis à plus d’un test de comportement par jour. Les animaux seront soumis à une très légère restriction de nourriture pendant toute la durée de l’expérience mais ils auront accès à une récompense sucrée presque chaque jour, et l’eau sera laissée à volonté. En outre, certains animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale au cours de laquelle une infusion ou implantation intracérébrale sera réalisée. La chirurgie dure environ 30 minutes puis l’animal aura une semaine minimum pour récupérer. Certains animaux recevront des injections intrapéritonéales, ou infusions intracérébrales (qui dureront 3 minutes tout compris et auxquelles ils auront été progressivement habitués), de composés pharmacologiques, répétées maximum 9 fois par animal, avec au moins 3 jours d’écart entre chaque injection ou infusion. Enfin, certains animaux seront exposés à un stress de contention pendant 30 minutes pour un maximum de trois fois par animal avec une semaine d’écart entre chaque exposition.

Impact sur les animaux

Les dommages escomptés pour les animaux sont minimes car nous mettrons tout en œuvre pour supprimer douleur et souffrance qui pourraient être induites par les différentes procédures, d’autant plus que les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux différents tests cognitifs. Les différents modèles et protocoles qui seront employés pour induire l’expression ectopique de gènes d’intérêt ou des symptômes de type neuropsychiatriques ont déjà été testés et validés, et n’ont pas été associés à des altérations majeures de la santé physique ou émotionnelle des animaux. Ils ont été choisis sur cette base. On peut s’attendre cependant à voir l’apparition d’états d’inconfort, de douleur ou de stress passagers chez certains animaux soumis à une privation alimentaire légère, à un stress induit volontairement sur un temps court, ou à une chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car les cerveaux seront prélevés pour des expériences ex vivo

Remplacement

Pour identifier les mécanismes cérébraux mis en jeu et les effets de composés thérapeutiques sur les processus cognitifs associés à des pathologies neuropsychiatriques, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un système nerveux entier et fonctionnel, et d’étudier les comportements et les états émotionnels associés au fonctionnement exécutif au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique intègre entre les différentes régions du cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisant pour en faire des modèles d’étude pertinents

Réduction

La méthodologie statistique a été discutée en amont de la soumission de ce projet avec un biostatisticien. Dans nos études, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire de tester au moins 15 animaux, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Un groupe contrôle adapté d’animaux sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souches d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle les mêmes souches de rats sont couramment utilisées. Notre expérience en chirurgie intracérébrale, études comportementales et marquages cellulaires nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions pour comparer les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car leurs cerveaux seront systématiquement prélevés à l’issue des expériences pour effectuer des vérifications et mesures de marqueurs neurophysiologiques. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.

Raffinement

Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Pendant toutes les expériences de comportement les animaux seront manipulés très régulièrement (presque tous les jours), ce qui les rend très peu réactifs émotionnellement à la manipulation, et ce qui permet de détecter le moindre changement d’attitude ou l’apparition de signes externes inquiétants. Pour les autres expériences, ils seront laissés tranquille dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. Nous enrichirons le milieu avec des blocs de bois, et des tunnels en carton si un animal doit être isolé, et nous nous rapprocherons du comité responsable du bien-être animal pour redéfinir les conditions optimales d’enrichissement si besoin. Concernant les chirurgies, des antidouleurs seront appliqués au moins 30 min avant la chirurgie. L’état général et les signes de douleur des animaux seront évalués régulièrement, selon la grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort du comité responsable du bien-être animal. Au moins une fois par jour les animaux sont examinés pour des signes de détresse (changements de posture, yeux plissés, manque de toilettage) et l’incision est examinée pour signes d’infection. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’analgésique seront données. Si au bout de 24h le traitement s’avère inefficace et les points limites atteints les animaux seront mis à mort. Pour l’ensemble du projet une pesée quotidienne et l’utilisation des traitements décrits ci-dessus seront appliqués en cas de dégradation de l’état de l’animal avant atteinte des points limites. Des points limites sont identifiés et leur atteinte conduira à la mise à mort de l’animal. Ces points correspondent à : une prostration, dos courbé et expression faciale très altérée, ou dénutrition majeure, ou perte de poids supérieure à 20%, et, pour les chirurgies, signes de douleur malgré l’analgésie, poils hérissés, animal prostré, hypothermie.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre ce projet). Le rat est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite étudier des fonctions cognitives complexes et particulièrement pour des tests cognitifs basés sur la technologie dite ‘touchscreen’ et l'auto-administration de drogue sur une longue période qui présentent une forte valeur translationnelle. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte pour la grande majorité (à partir de 8 semaines), afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des interventions, et l’homogénéité de leur comportement. Un groupe d’animaux sera utilisé ponctuellement dès une semaine après la naissance pour recevoir des injections d’un composé pharmacologique dans le but de modeler le développement du cerveau (une injection aux jours 7, 9 et 11), puis laissés sans manipulation jusqu’à l’âge adulte. Un groupe d’animaux sera exposé in utero à un composé pharmacologique dans le but de modeler le développement du cerveau à travers une injection réalisée chez la mère vers le milieu de la gestation.

200 chevaux et poneys vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, aucun tué à l'issue selon le porteur, 140 proposés à l'adoption, 50 réutilisés et 10 renvoyés à l'élevage. Ils reçoivent des vaccins vétérinaires en développement, des prélèvements de sang et des biopsies de peau, une partie subissant une épreuve virulente par inhalation d'une solution virale. Le porteur indique que la maladie s'exprime surtout dans le groupe témoin non vacciné. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer un vaccin vétérinaire et qu'il doit être testé sur l'espèce cible avant commercialisation.

Objectifs

Afin de commercialiser un nouveau vaccin vétérinaire, un dépôt de dossier d’AMM est nécessaire. Ce projet vise à fournir les données techniques et scientifiques du dossier d’AMM permettant de démontrer l’efficacité et l’innocuité du nouveau produit.

Bénéfices attendus

Les bénéfices escomptés sont les gains sur la santé des chevaux et poneys qui recevront le candidat vaccin testé une fois celui-ci mis sur le marché. Par exemple : prévention de la rhinopneumonie, de la grippe Equine,…

Procédures

Les animaux reçoivent les vaccins testés par injection (intramusculaire, sous cutanée,…). Les injections ont une durée de l’ordre de 3 secondes, La vaccination respecte le calendrier vaccinal prévu pour le vaccin testé (En général 2 à 3 injections espacées dans le temps. Pour les étude d’innocuité, les doses peuvent être plus répétées afin d’amplifier la survenue d’effets secondaires qui ne seraient pas mis en évidence par une simple vaccination. Par exemple lors d’une étude sur mères gestantes, une jument peut-être vaccinée à chaque tiers de gestation. Par la suite, les animaux sont observés : état général, examen clinique, prise de température rectale,… L’observation d’un animal peut durer environ 10 minutes. Il peuvent aussi être prélevés (sang, écouvillons naseaux,…) afin de mesurer la réponse immunitaire ou la diminution de la présence virale grâce à la vaccination. Les prélèvements de sang durent environ 10 secondes. Les observations et prélèvements sont réalisées 2 fois le jour de l’administration, puis une fois par jour pour le reste de l’étude. Lors d’une épreuve virulente, une solution virale est inoculée aux animaux par génération d’un aérosol. Cette manipulation dure environ 1 minute pour chaque animal. Enfin un prélèvement de fibroblastes dermiques par biopsie est réalisé à l’aide d’un punch à biopsie de 10mm sous anesthésie locale. Deux prélèvements sont prévus pour chaque animal à 14 jours d’intervalle. Le geste technique de biopsie doit durer environ 20 secondes, la suture 3 mn.

Impact sur les animaux

Pas ou peu d’effets indésirables sont attendus. Les vaccins sont généralement des évolutions de vaccins plus anciens. On peut s’attendre à une élévation temporaire de la température corporelle, à l’apparition temporaire d’une grosseur au point d’injection. Lors d’une épreuve virulente, on s’attend à l’expression de la maladie principalement dans le groupe témoin. Elévation de la température, écoulement naseaux et/ou oculaires. Les expériences passées montrent de faibles signes cliniques. L’efficacité du vaccin est principalement démontrée par les écouvillons naseaux qui prouvent l’efficacité des vaccins par la baisse de la pression virale. Toute manifestation post traitement (signe clinique, comportement…) est soigneusement enregistrée et fera l’objet d’une évaluation.

Devenir

A l’issu d’un test, les animaux seront soit proposés à l’adoption, soit réutilisés pour le même projet ou un projet différent. Une évaluation vétérinaire est toujours associée à cette décision

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative au recours à l’animal permettant d’évaluer l’efficacité ou l’innocuité des candidats vaccins vétérinaires. Un nouveau vaccin doit être testé dans l’espèce cible avant d’obtenir une autorisation de commercialisation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est limité au mieux, de façon à répondre aux exigences réglementaires et scientifiques des études. La variabilité individuelle des réponses à la vaccination contraint à constituer des groupes représentatifs d’au moins 10 animaux pour les études nécessaires au dossier d’enregistrement des médicaments.

Raffinement

Bien que peu ou pas d’effets indésirables soient attendus, des points limites sont mis en place afin d’éviter aux animaux toutes atteintes potentielles à leur bien-être lors des tests d’efficacité, d’innocuité ou d’épreuve. Dans tous les cas un traitement adapté est prodigué à l’animal en mauvais état clinique, défini par le vétérinaire. Lors des étude les animaux sont hébergés en groupe et observés quotidiennement. Une récompense alimentaire est prévue après chaque geste technique et lors de mouvements d’animaux. Lorsqu’ils sont hébergés en confinement, des jeux (balles à granulés, cônes,…) avec récompenses alimentaires leur sont proposés.

Choix des espèces

Les études d’efficacité et d’innocuité des médicaments et vaccins vétérinaires nécessitent l’expérimentation sur l’espèce cible afin de répondre aux exigences du dossier d’AMM.

9216 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Ils sont infectés vers deux semaines par gavage d'un inoculum de parasites de la coccidiose, pour évaluer des additifs, vaccins ou extraits végétaux contre cette maladie de l'élevage avicole. Le porteur décrit une infection subclinique entraînant une baisse de consommation et un retard de croissance d'environ 20 %, et chiffre le coût mondial de la maladie à plus de 12 milliards d'euros. Les animaux sont ensuite tués puis envoyés à l'équarrissage, et le porteur indique que seuls les poulets hébergent ces parasites hautement spécifiques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de définir différentes stratégies permettant de lutter contre la coccidiose aviaire. Les poulets peuvent être sujets à de nombreuses pathologies de l’appareil digestif, certaines étant d’origine parasitaire, comme la coccidiose. Cette affection parasitaire, présente dans le monde entier, est considérée comme l’une des plus impactantes en aviculture, d’un point de vue sanitaire, mais également d’un point de vue économique, avec un coût mondial de plus de 12 milliards d’euros en 2020. Les parasites responsables de la maladie sont des protozoaires (organismes animaux unicellulaires) du genre Eimeria (appelés coccidies), hautement spécifiques, qui se multiplient et se reproduisent dans les cellules de l’épithélium intestinal de leur hôte, provoquant des lésions de la muqueuse digestive. Ces lésions ont pour conséquence une moindre absorption des nutriments, un défaut de perméabilité de la barrière intestinale, une modification du microbiote intestinal. Sur le plan zootechnique, une coccidiose clinique provoque des retards de croissance importants et de la mortalité. Lors d’infections subcliniques (c'est-à-dire sans symptômes cliniques), des dégradations de l’efficacité alimentaire et des défauts de pigmentation de la peau sont observés. Les animaux peuvent guérir spontanément de cette pathologie au bout de 8 jours. Cependant, en l’absence de traitement, le retard de croissance accumulé n’est pas rattrapé et représente une perte économique importante pour les éleveurs. Pour contrôler ces parasites, des additifs coccidiostatiques (qui stoppent le développement des coccidies) ont été développés. Toutefois, leur utilisation systématique a pu conduire à l’apparition de résistances. Depuis quelques années, des vaccins sont également disponibles, mais leur utilisation est coûteuse et peut parfois provoquer des retards de croissance. Dans ce contexte, il est donc nécessaire de pouvoir reproduire cette pathologie dans des conditions d’infection subclinique et en milieu contrôlé, afin de développer des solutions alternatives (additifs coccidiostatiques ou vaccins de nouvelle génération, extraits végétaux, etc), qui seront utilisables en élevage que ce soit d’un point de vue pratique ou technico-économique. Ainsi, les solutions alternatives suivantes peuvent être testées : des additifs coccidiostatiques, des vaccins de nouvelle génération, des extraits végétaux, des souches de probiotiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise sur le marché de nouveaux moyens de lutte contre la coccidiose du poulet (recherche de nouvelles solutions ou amélioration de solutions existantes, en utilisant par exemple des additifs coccidiostatiques ou vaccins de nouvelle génération, extraits végétaux, etc).

Procédures

Entre 13 et 17 jours d’âge, les poulets sont soumis à un gavage unique par voie orale (inoculum contenant les parasites responsables de la coccidiose ou eau, d’une quantité d’1 mL) d’une durée d’environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Les poulets présentent une forme d’infection subclinique de la coccidiose (c'est-à-dire sans symptômes cliniques). Les nuisances attendues sont une baisse de la consommation d’aliment, un retard de croissance (d’environ 20%) et éventuellement des signes de diarrhées. Les animaux peuvent ressentir de légères irritations lors de l’inoculation, qui est faite par gavage.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés puis partiront à l’équarrissage (afin d’éviter tout risque de transfert de l’agent pathogène).

Remplacement

Avant la mise en place des études sur animaux, des revues bibliographiques sont réalisées afin de cibler les stratégies d’intérêt et en effectuer une première sélection. Pour certaines catégories de produits comme les huiles essentielles, des études in vitro sont réalisées au préalable afin de définir la dose optimale et éviter les effets indésirables. La coccidiose aviaire est une pathologie provoquée par des parasites hautement spécifiques, du genre Eimeria, ce qui nécessite le recours à des poulets puisqu’ils sont les seuls hôtes de ces parasites. Ces parasites ayant des effets à la fois sur le système digestif et le microbiote intestinal, les interactions sont complexes et ne permettent donc pas d’utiliser des modèles alternatifs comme la modélisation ou des études in vitro. Par ailleurs, l'évaluation des paramètres d’intérêt du projet (croissance, ingéré volontaire d'aliment, état sanitaire, …) ne peut être réalisée que sur les animaux de l’espèce cible.

Réduction

Les animaux choisis sont issus du même parquet de reproducteurs, et sont tous des mâles, afin de limiter la variabilité individuelle. En effet, le sexe fait partie des variables indépendantes qui peuvent influencer la digestibilité des nutriments et donc l’efficacité alimentaire. Le logement dans des compartiments de petite taille nous permet d'augmenter le nombre de répétitions par groupe expérimental, et donc de diminuer le nombre total d’études nécessaires et le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Le nombre minimal de répétitions (c’est-à-dire la case de 16 poulets) est estimé à 6 par groupe expérimental. Il a été déterminé par une approche statistique : ceci correspond au nombre nécessaire pour obtenir une différence significative de 5% sur l’indice de consommation des animaux, avec un coefficient de variation de 3% sur ce paramètre, en prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%. Ce nombre de répétitions sera privilégié dans la majorité des études, mais dans le cas où une différence significative de 3.5-4% serait requise sur l’indice de consommation (études dans le cadre de dépôt de dossier d’autorisation d’additif à l’EFSA), le nombre de répétitions passera alors à 10 par groupe expérimental, en baissant le nombre de groupes expérimentaux pour conserver le même effectif global d’animaux par étude. La distribution des données est évaluée selon des diagrammes en boîte à moustache afin d’identifier les données aberrantes. Après élimination des données aberrantes, les données zootechniques sont soumises à des analyses statistiques. Le niveau de significativité est fixé à p

Raffinement

L’état de santé des animaux est vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’établissement utilisateur. Si un poulet présente des signes de stress, des douleurs, alors il est écarté de l’étude. Des points limites stricts et définis à l’avance sont appliqués tout au long du projet. La manipulation des animaux est restreinte afin de limiter le stress. De plus, les animaux sont logés en collectif dans le but de favoriser les interactions sociales, et disposent de litière, afin de leur assurer un confort thermique et de leur permettre d’exprimer leurs comportements exploratoires de fouissage, grattage. Un enrichissement de type chainette est suspendu dans chaque case, afin que les animaux puissent le manipuler.

Choix des espèces

L'espèce choisie pour la réalisation du projet est le poulet car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, immunologiques) étudiés dans le cadre de ce projet lui sont spécifiques. De plus, le poulet est l’espèce cible des solutions testées. Les animaux sont utilisés entre 1 et 35 jours d’âge. Il s’agit de la période classique d’élevage des poulets de chair. Ils pèsent environ 42 g à 1 jour, et environ 2,5 kg à 35 jours.

1150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, pour maintenir une lignée de rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne. Chaque raton subit vers huit à dix jours une biopsie de la queue sous anesthésie locale pour le génotypage, sans analgésie prévue d'emblée. Le porteur indique que les rats au génotype voulu rejoignent de futures études de thérapie génique ou le pool de reproduction, les autres étant mis à mort. Il décrit le rat DMDmdx comme plus proche de la maladie humaine que la souris mdx ou le chien, et affirme qu'aucune méthode alternative ne teste un traitement sur un "organisme entier".

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la plus fréquente des maladies musculaires (1 garçon sur 5000 naissances). Elle est due à un défaut dans le gène codant pour une protéine nommée Dystrophine, situé sur le chromosome X et est à l'orgine d'une dégénérescence progressive du tissu musculaire. La maladie touche tous les muscles de l’organisme, y compris le muscle cardiaque et le diaphragme. Chez les patients DMD, la marche est définitivement perdue avant l’âge de 15 ans et le décès survient généralement avant 30 ans. Aucun traitement n’est disponible à ce jour sur le marché. La thérapie génique, la thérapie cellulaire ou l'utilisation de certaines molécules pharmocologiques font partie des approches envisageables pour le traitement de cette pathologie ou pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. En 2014, un consortium de laboratoires a généré un nouveau modèle animal de la DMD : le rat DMDmdx. Cette lignée de rat, totalement caractérisée, se révèle être un très bon reflet de la pathologie humaine (atteintes supérieures à d'autres modèles animaux, notamment au niveau de l'atteinte cardiaque) . Notre projet vise à maintenir une colonie de rats DMDmdx à partir de femelles porteuses et de mâles sains. Les rats mâles DMDmdx générés et les rats sains issus de portées communes aux rats DMDmdx (rats mâles littermates) seront destinés à être inclus dans des études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques. Certaines femelles porteuses générées seront destinées à devenir à leur tour reproductrices. Afin d'assurer le maintien d'une colonie et de répondre aux besoins des études, nous devons générer au maximum 150 rats mâles DMDmdx par an. Nous estimons qu'il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 40 femelles porteuses et 40 mâles sains par an, soit un total de 400 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 750 rats mâles DMDmdx. La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée sur la base de l'expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat DMDmdx.

Bénéfices attendus

(i) Le maintien d'une lignée de rat DMDmdx présentant une atteinte musculaire proche de la pathologie humaine de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) permettra d'obtenir un modèle animal supplémentaire et complémentaire à ceux existants, afin d'évaluer et définir les doses thérapeutiques des traitements expérimentaux développés (thérapie génique, cellulaire ou pharmacologique) dans des projets pré cliniques. La souris mdx et le chien GRMD (pour Golden Retriever Muscular Dystrophy), tous deux porteurs d’une mutation dans leur gène de la dystrophine, sont 2 modèles largement utilisés, mais présentent cependant un certain nombre d’inconvénients : La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches et une évolution semblable à la maladie des patients DMD, mais reste un modèle de gros animal coûteux et lourd à manipuler. (ii) Un élevage aggrée a arrêté récemment sa production de rats DMDmdx et à ce jour aucun autre fournisseur n'en propose à la communauté scientifique. (iii) Le maintien d'une colonie de rat DMDmdx sur notre Centre permettra de mettre à disposition des équipes de recherche, tant académiques que privées, ce modèle animal pertinent de la DMD et de réaliser sur site les études associées.

Procédures

Une biopsie de queue (prélèvement d'environ 1 millimètre de la queue) sera réalisée sur les ratons de toutes les portées issues des reproductions de la lignée DMDmdx. L'acte sera réalisé une seule fois, précocement au cours de la vie de l’animal, de 8 à 10 jours après la naissance, afin de déterminer son génotypage, c'est à dire identifier si l'animal est atteint de la maladie Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) ou bien s'il s'agit d'un animal sain. Le prélèvement se fera sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

(i) Gestion de la douleur lors des caudectomie : une anesthésie locale est prévue lors de la réalisation des biopsie de queue pour le génotypage chez le raton de 8/10 jours. Pas d'analgésie complémentaire prévue d'emblée , mais une observation bi-quotidienne des animaux sera effectuée par les techniciens animaliers, et si besoin, un traitement adéquat sera mis en place par le vétérinaire du centre. Si nécessaire, en cas de douleur chez le raton, comme le défaut de reptation, l’émission de cris, le fait de rester à l'écart du reste de la portée et la non reprise de la tétée dès la remise au nid, une injection en sous-cutanée de Buprénorphine® pourra être réalisée. (ii) Le phénotype lié à la maladie des rats DMDmdx est évolutif et dégénératif (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation, difficultés à s'alimenter liées à une mauvaise usure des dents / déficits des muscles masticateurs). Cette dégradation devient sévère pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois. Aussi, le plus souvent les animaux générés seront inclus dans les études à un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients DMD pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants ou jeunes adolescents, pré-pubères). Cependant, jusquà inclusion dans une étude, l’aspect et le comportement général des animaux seront observés de façon quotidienne par le personnel animalier. L’appétit, la consommation hydrique, la prise de poids et la capacité de locomotion de l’animal constitueront les principaux éléments surveillés de façon hebdomadaire pour estimer une éventuelle gêne ou douleur liées à l’expression clinique de la maladie. Ces observations seront automatiquement fournies au vétérinaire responsable.. Dans le cas, où l’animal n’arriverait plus à se déplacer correctement, perdrait du poids et présenterait des symptômes laissant penser à l’existence de douleurs chroniques, la mise à mort de l’animal sera anticipée.

Devenir

Suite au génotypage, le devenir des animaux générés lors de notre programme de reproduction sera fonction des besoins des projets dans lesquels ils seront inclus : (i)Les rats mâles DMDmdx, voire les rats sains issus de portées communes aux rats DMDmdx (rats sains littermates) seront inclus dans les études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques au fil de l’eau en fonction du dynamisme de la colonie implantée. (ii)Une partie des femelles porteuses (environ une par portée) obtenue sera conservée en vue d'intégrer le pool des reproducteurs. (iii) Les autres animaux issus des portées et ne pouvant pas être intégrés dans un projet seront euthanasiés dès le rendu des résultats des génotypages.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement sur un organisme complet et ses effets sur les différents organes/tissus. Pour exemple, en thérapie génique , nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs). Cette lignée permet en outres de tester l'effet d'un traitement à la fois dans un contexte malade (rat DMD) et un contexte sain (rat sain littermate).

Réduction

La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée par approche statistique et sur la base de l'expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat DMDmdx. Dans ce projet, afin de générer au maximum 150 rats mâles DMDmdx par an, nous estimons qu'il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 40 femelles porteuses et 40 mâles sains par an, soit un total de 400 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 750 rats mâles DMDmdx. Ce nombre est estimé en fonction de nos connaissances actuelles sur les particularités de reproduction sur ce modèle et en considérant que la lignée génèrera des portées de taille standard.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement de l'environnement mis en place systématiquement, favorisant entre autres la nidation (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisure de papier, cellulose, bûchettes de bois), accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum. Une alimentation convenant à l'élevage sera mise en place dès que la femelle sera gestante. Les prélèvements seront réalisés dans une salle d’expérimentation différente de la salle d’hébergement. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, un tableau de points limites sera miseen place dès que celui-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (cf exemple en annexe 1 de la saisine). 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Le rat DMDmdx possède une mutation dans l’exon 23 du gène dmd codant pour la protéine Dystrophine. Ce modèle a été généré par l’utilisation de TALENs. Dans ce modèle animal de la DMD, l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype l'expression de la maladie sévère. En 2014, un consortium de laboratoires a généré un nouveau modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) : le rat DMDmdx. Dans ce modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD), l’expression d'une protéine, la dystrophine, essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité des fibres musculaires est nulle, d'où une expression sévère de la maladie DMD. Cette lignée de rat, totalement caractérisée, se révèle être un très bon reflet de la pathologie humaine (atteintes ssupérieures à d'autres modèles animaux, notamment au niveau de l'atteinte cardiaque). Les modèles animaux atteints de DMD les plus classiquement utilisés, la souris mdx et chien GRMD (pour Golden Retriever Muscualr Dystrophy), présentent des limites pour les projets pré-cliniques : -La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec une expression de la maladie peu marquée. -Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients DMD et une expression de la maladie sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Pour le programme de reproduction, de jeunes adultes en âge de procréer et adultes pour les animaux reproducteurs sont utilisés : - rats sains provenant d'un fournisseur agréé : entre 12 et 14 semaines - rats femelles porteuses de la maladie : 14 semaines. La fin de la fertilité pour la lignée rat DMDmdx étant entre 10 et 11 mois. Les animaux générés, les rats mâles DMDmdx générés et les rats mâles sains issus des mêmes portées, sont ensuite en général inclus dans les protocoles expérimentaux au moment du sevrage. Selon les projets, les animaux seront utilisés à différents âges, ce qui sera justifié au niveau des saisines de chacun des projets.

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie suit un régime supprimant un gène d'intérêt, d'autres subissent une chirurgie d'injection d'une toxine, avec tatouage des phalanges et prélèvement de la queue pour l'identification, pour étudier le rôle des macrophages du testicule dans la fertilité. Le porteur qualifie ces atteintes d'"inconfort léger" en s'appuyant sur l'absence d'effets observés lors de projets antérieurs. Il affirme que la complexité des interactions cellulaires rend le modèle animal "indispensable" et repose exclusivement sur des souris génétiquement modifiées.

Objectifs

Notre étude se concentre sur la compréhension des interactions entre les cellules immunitaires appelées macrophages, situées dans les testicules, et les cellules avoisinantes. Nous cherchons à mieux comprendre comment ces interactions influent sur le bon fonctionnement des testicules. Les macrophages jouent un rôle clé dans la protection contre les infections et le maintien de l'équilibre dans différents organes. Le développement et le maintien des macrophages résidents dans les tissus dépendent de la disponibilité et de la localisation de facteurs de survie. Dans les testicules, nous avons identifié deux types de macrophages : ceux situés sur les tubes séminifères, appelés macrophages péritubulaires (périMac), et ceux présents dans le tissu conjonctif entre les tubes, appelés macrophages interstitiels (interMac). Ces macrophages pourraient avoir des rôles importants liés à la fertilité. Elles pourraient aussi influencer le devenir des cellules non différenciées voisines en sécrétant des substances spécifiques. Nous avons découvert que les macrophages péritubulaires dépendent de deux molécules spécifiques produites par les cellules du tube séminifère, qui constituent leur source nutritionnelle. Nous avons également identifié trois gènes potentiels qui seraient essentiels dans l'interaction entre les macrophages péritubulaires et leur source nutritionnelle. Nos objectifs sont les suivants : 1. Examiner le rôle des macrophages péritubulaires dans le processus de production des spermatozoïdes et, par conséquent, dans la fertilité. 2. Explorer la possibilité que les macrophages péritubulaires influent sur le recrutement et la différenciation des cellules du tube séminifère, qui constituent leur source nutritionnelle. 3. Investiguer les mécanismes moléculaires des interactions entre la source nutritionnelle et les macrophages péritubulaires, et confirmer l'implication de ces trois gènes potentiels dans cette interaction.

Bénéfices attendus

Les testicules ont un double rôle qui est de 1/ libérer des hormones masculines comme la testostérone et 2/ produire les spermatozoïdes. Si une des deux fonctions est perturbée, la fertilité de l’individu est grandement impactée. Les PeriMacs ont été suggérés comme des cellules importantes et essentielles à la fertilité masculine. Comprendre comment ces interactions ont lieu pourraient avoir un rôle très bénéfique pour le développement de divers traitements contre l’infertilité masculine, qui selon des estimations représenterait près de la moitié des cas de l’infertilité au sein d’un couple .

Procédures

480 souris seront sous régime alimentaire enrichi en une molécule spéciale qui supprimera notre gène d’intérêt. Ce régime durera un mois. 60 souris subiront une procédure chirurgicale pour injecter une toxine qui permettra de supprimer localement des cellules d’intérêt.

Impact sur les animaux

Lorsque les phalanges sont tatouées et des échantillons de queue sont prélevées pour identifier les souris, cela peut leur causer un léger inconfort. Cependant, dans nos expériences passées, aucune conséquence majeure n'a été observée. Quand la molécule spéciale est introduite par voie orale à travers des croquettes spéciales, cela peut entraîner une légère perte de poids temporaire chez les souris en raison d'une diminution temporaire de leur appétit pour ces croquettes. Cependant, aucune conséquence grave n'a été constatée dans nos expériences antérieures. Dans le cadre du projet précédemment validé, qui utilisait des modèles murins impliquant la suppression du gène d’intérêt dans tous les sous-types cellulaires, aucun effet secondaire n'a été observée. Cela suggère qu'il est très peu probable qu'une mutation de ce gène, ciblant un type cellulaire spécifique, ait des effets néfastes. En ce qui concerne les interventions chirurgicales, bien qu'elles puissent causer une légère douleur au niveau de l'incision après la chirurgie, cela n'a généralement pas de conséquences graves sur les souris.

Devenir

A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort afin de prélever les différents tissus pour analyse.

Remplacement

L'utilisation de modèles in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre les macrophages et le microenvironnement (cellules stromales) au sein d’un organe (testicule). Par ailleurs, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l´utilisation de souris génétiquement modifiées. La mise en œuvre d’expériences in vitro sera réalisée quand elle fait sens comme par exemple l’étude su rôle des PeriMacs dans la différenciation vis-à-vis de leur niche nutritive à savoir les cellules péritubulaires myoïdes (ou PTMC).

Réduction

Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide du logiciel http://biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (80%), le niveau de risque acceptable (5%) et l'écart de moyenne attendu entre les groupes expérimentaux et contrôle (40%).

Raffinement

Le statut EOPS de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les conditions d'hébergement des souris respectent la DIRECTIVE 2010/63/UE. Les souris sont élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Du coton ou du sizzel pad ainsi que des dômes pour confectionner des nids seront introduits dans chaque cage. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur et veiller à ne pas dépasser des points limites. Pour les souris qui subissent une procédure chirurgicale, un antalgique sera mis dans les biberons des cages 24H avant l’opération et 72H post opération pour minimiser la douleur suite à l’opération.

Choix des espèces

L´utilisation du modèle animal est indispensable ici car il n´est pas possible de reproduire la complexité des interactions cellules stromales/macrophages in vitro. Par ailleurs, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées repose exclusivement sur l´utilisation de souris génétiquement modifiées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte entre 8-24 semaines car nous nous intéressons aux fonctions des macrophages de testicules à l’âge adulte.