Procédures légères

57 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une alimentation enrichie en cyanate de sodium, des injections d'une sonde fluorescente dans la veine de la queue, des épilations à la crème dépilatoire et des séances d'imagerie sous anesthésie, pour étudier le rôle du vieillissement des protéines dans l'athérosclérose. Le sang et l'aorte sont prélevés après la mise à mort. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'un modèle in vitro ne suffit pas à représenter l'"organisme entier" et conclut qu'il n'a "pas d'autre choix" que la souris.

Objectifs

Avec 17,7 millions de décès en 2017, les pathologies cardio-vasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. C’est donc un enjeu de santé publique de mieux comprendre et caractériser les causes de ces maladies. L’athérosclérose est une maladie complexe touchant principalement les artères de moyen et gros calibre marquée par une modification importante de la structure des vaisseaux sanguins et caractérisé par la formation de plaques. Au cours du temps, ces plaques s’épaississent et gênent la circulation sanguine. Elles peuvent également se rompre, entraînant alors la formation d’un caillot provoquant des accidents vasculaires cérébraux, des infarctus du myocarde, ou des ischémies périphériques. En vieillissant, les protéines subissent des modifications pouvant affecter leurs structures et leurs fonctions. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le rôle du vieillissement des protéines présentes au niveau des vaisseaux sanguins. En effet, les vaisseaux sanguins sont principalement composés de cellules et de protéines. Lors du processus athérosclérotique, ces cellules vont se déplacer autour de la plaque afin de l'isoler. Notre projet vise à déterminer si le vieillissement des protéines joue un rôle dans le remodelage du vaisseau et sur le déplacement des cellules permettant d'isoler la plaque de la circulation sanguine au cours du développement de l'athérosclérose. Ce projet est multisite et se déroulera dans deux étuablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet d'expérimentation animale permettra de faire progresser les connaissances scientifiques sur les pathologies cardiovasculaires et de mieux comprendre l’impact du vieillissement des protéines sur le remodelage de la paroi des vaisseaux dans le développement, l’évolution et les complications de l’athérosclérose afin de trouver, in fine, de nouvelles pistes thérapeutiques dans le but de mieux diagnostiquer et donc mieux traiter les pathologies cardiovasculaires.

Procédures

Voici toutes les interventions auxquelles les animaux seront soumis : - Anesthésie générale : Lors de l’injection de la sonde fluorescente et lors des acquisitions d’imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale. L’état d’anesthésie sera obtenu par inhalation d’isoflurane à 4% et maintenu par inhalation d’isoflurane 2%. - Injection au niveau de la veine de la queue : Injection d’une sonde fluorescente pour l’acquisition des images au tomographe moléculaire de fluorescence. Cette injection se fera sur animal anesthésié par isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%). Ce geste sera réalisé une fois pour chaque souris pour la procédure 1 (9 souris X 3 groupes X 1 intervention = 27 fois) et deux fois pour chaque souris pour la procédure 2 (c’est-à-dire : 7 souris X 3 groupes X 2 interventions = 42 fois). - Épilation : L’épilation est nécessaire pour l’acquisition des images à l’échographe et au tomographe moléculaire de fluorescence. Cette intervention rapide se fera à l’aide d’une crème dépilatoire pour peaux sensibles sur le thorax et l’abdomen de la souris. Ce geste sera réalisé sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%) sur une plateforme chauffante afin de maintenir la température de l’animal. Ce geste sera réalisé trois fois pour chaque souris de la procédure 1 (c’est-à-dire : 9 souris X 3 groupes X 3 épilations = 81 fois) et deux fois pour chaque souris de la procédure 2 (c’est-à-dire : 7 souris X 3 groupes X 2 épilations = 42 fois) - Injection intrapéritonéale : L’euthanasie nécessite l’injection d’un agent anesthésique. Ce geste sera réalisé sur les animaux anesthésiés par inhalation d’isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%). Ce geste sera réalisé une fois pour chaque souris pour la procédure 1 (c’est-à-dire 27 fois au total) et une fois pour chaque animale pour la procédure 2 (c’est-à-dire 21 fois au total). Par souris : Chaque souris de la procédure 1 subira : 1 injection au niveau de la veine de la queue, 3 épilations, 1 injection intrapéritonéale. Tout ces gestes seront réalisés dans l’établissement utilisateur 2. Chaque souris de la procédure 2 subira : 2 injections au niveau de la veine de la queue, 2 épilations, 1 injection intrapéritonéale. Tout ces gestes seront réalisés dans l’établissement utilisateur 2.

Impact sur les animaux

L’alimentation supplémentée en cyanate de sodium et l’injection de la sonde fluorescente ne produisant pas d’effet toxique chez les animaux. Voici la liste des nuisances attenus : -Stress au moment du transport (5,3km pour 11 minutes de trajet) - Stress au moment de l’anesthésie et de son réveil, le stress d’une anesthésie dure en général quelques minutes avant l’endormissement et au réveil de l’animal.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Après la mise à mort des animaux, le sang sera prélevé au niveau de l’aorte afin d’évaluer la quantité d’homocitrulline (produit de carbamylation) retrouver, les aortes thoraciques seront récupérées afin d’étudier la rigidité des vaisseaux via l’utilisation d’un microscope à force atomique, puis les compositions cellulaire et protéique des aortes et des plaques d’athéromes seront étudiées via des techniques histologiques et immunohistochimiques. La queue des animaux sera également prélevée afin d’en analyser le taux de carbamylation du collagène.

Remplacement

Nous travaillons actuellement sur un modèle in vitro avec des cellules provenant d’aortes humaines et murines cultivées sur du collagène carbamylé ou non, mais une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques mis en jeu au niveau d’un organisme entier et les approches informatiques in sillico ne permettent pas à ce jour de mimer le fonctionnement de l’organisme entier et sa réaction face au traitement. Ainsi, nous n’avons pas d’autre choix que d’utiliser le modèle animal, puisque les résultats obtenus avec cette approche globale in vivo seront complémentaires à nos résultats in vitro et permettront d'apporter une réponse complète à notre hypothèse. Nous sommes actuellement les seuls à utiliser ce modèle animal (modèle carbamylation + athérosclérose), nous ne pouvons donc pas faire de projet commun afin de réutiliser des animaux inscrits dans une procédure d’un autre projet.

Réduction

Nous avons décidé de faire deux procédures, dont une 1ère en étude préliminaire avec peu de souris (9 par groupes) avec une approche de « Go/no go » pour notre seconde procédure. En effet, la première procédure servira à confirmer une bonne démarche expérimentale et définir plus précisément les différents temps d’acquisitions pour la seconde procédure. Nombre de souris totales pour la procédure 1 : 9 souris X 3 groupes = 27 souris. Pour la seconde procédure, nous n’avons aucune donnée préliminaire nous permettant de calculer la puissance statistique de notre expérience via le logiciel GPower. C’est pourquoi nous avons décidé de réaliser une étude préliminaire en 1ère procédure, afin d’avoir la possibilité de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en évitant d’utiliser beaucoup d’animaux pour affiner la cinétique de la procédure. De plus, les données issues de la seconde procédure viendront compléter les données issues de la première aux points de la cinétiques les plus intéressants pour atteindre une puissance statistique suffisante. Après avoir analysé les données issues de la 1ère procédure, nous pourrons alors calculer la puissance statistique afin de définir le nombre optimal d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Nous utiliserons au maximum 10 souris par groupe pour la seconde procédure (avec une potentielle diminution du nombre de souris en fonction des résultats issus de la 1ère procédure). Nous nous engageons à analyser les résultats de la première procédure et de calculer notre puissance statistique avant de commander les animaux de la deuxième procédure afin d’en utiliser le moins possible. Nombre maximal de souris au total pour la procédure 2 : 7 souris X 3 groupes = 21 souris. L’utilisation de souris exclusivement mâles, nous permet également de réduire le nombre d’animaux nécessaires puisqu’utiliser des animaux du même sexe permet de s’affranchir d’une variable biologique supplémentaire et de limiter l’hétérogénéité de nos résultats.

Raffinement

Quotidiennement : Les cages transparentes seront équipées de divers équipements d’enrichissement (tubes de jeu, niche, papier, bâton à rogner, coton …) afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité et en procurant un sentiment de sécurité à l'animal. Une surveillance quotidienne sera mise en place par une collaboration étroite avec les animaliers afin de prévenir et de traiter toutes manifestations de douleur ou de stress chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages de 30x40cm à raison de 5 souris par cage au maximum. Les animaux seront séparés selon leur groupe dans différentes cages (2 par groupe). Nous identifierons les animaux à l'aide de traces réalisées au marqueur indélébile au niveau de la queue. Le tableau présenté en Annexe 3 présente une grille de score adaptée qui sera suivie afin d’identifier des douleurs potentielles. Étape 1 : Le traitement ne produira pas de nuisance à l’animal. Afin de vérifier la bonne hydratation des souris, les biberons seront pesés tous les jours ouvrés et changés tous les deux jours. Étape 2 & 3 : L’utilisation du tomographe moléculaire à fluorescence (FMT) et de l’échographe nécessite un transport des animaux sur le campus Moulin de Housse (où se trouvent les appareils). Une surveillance accrue sera effectuée pendant le trajet et un morceau de pomme sera placé dans les cages afin de permettre aux animaux de continuer à s’hydrater et s’alimenter. L’utilisation ces appareils nécessite également une anesthésie générale de l’animal avec de l’isoflurane (4% pour l’induction et de 2% pour le maintien), une surveillance accrue sera effectuée pendant l’anesthésie, et l’état d’endormissement de l’animal sera confirmé par pincement des espaces interdigitaux. Enfin pour un réveil optimal des animaux concernés, l’animal sera placé sous lampe chauffante puis surveillé. Afin d’éviter le stress des animaux aux changements d'environnement, les souris seront emmenées sur le site Moulin de la Housse 24h avant l’acquisition pour qu’elles découvrent et qu’elles s’habituent aux salles de manipulation, afin que le jour de la manipulation il n’y ait pas de biais sur nos résultats. Lors de l’analyse à l’échographe, les animaux seront placés sur une plateforme chauffante composée de capteurs permettant de suivre les paramètres vitaux. Ces paramètres (fréquence respiratoire, électrocardiographie et la température corporelle de l’animal) seront surveillés pendant toute la durée de l’acquisition.

Choix des espèces

Le modèle choisi est le modèle murin dont le gène de l'apolipoprotéine E est non fonctionnel. Ce modèle est un modèle de référence pour l’étude de l’athérosclérose qui est très bien caractérisé. En effet ces souris développent la maladie sans avoir besoin de leur apporter un régime gras (non compatible avec l’utilisation du FMT puisqu’il faut un régime sans chlorophylle et qui rajouterait une variable supplémentaire à nos expériences et donc un groupe témoin supplémentaire). Nous commanderons des souris à l’âge de 4 semaines, c’est-à-dire des jeunes sevrés. Nous sommes obligés de commander des souris non adultes puisque ces souris mâles développent spontanément des plaques d’athéromes à partir de 7 semaines de vie. Nous n’avons pas le choix de commander des animaux au stade « jeunes sevrés » puisque nous voulons étudier l’impact de la carbamylation des protéines sur le développement des phases précoces de l’athérosclérose, il faut donc induire la carbamylation des protéines avant le développement de la pathologie. Toutes les expérimentations et les mises sous anesthésies se feront sur un animal adulte (âgé de 9, 13 et 16 semaines pour la procédure 1 et âgé de 9 et 13 ou 16 semaines pour la procédure 2).

6 702 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués et 680 femelles réutilisées. Les femelles reçoivent des injections d'hormone tous les quatre mois pendant toute leur vie pour produire des ovocytes, tandis que les mâles et les larves sont tués pour prélèvement. Un test de réponse à la lumière évalue la vision des larves. Le porteur présente le xénope comme une "méthode alternative de remplacement" des modèles mammifères.

Objectifs

Ce projet englobe les questions scientifiques de notre institut utilisant le modèle Xénope et qui sont développé avec l'objectif de réduire en les mutualisant les expériences. Les objectifs sont l’étude : a) de la division des cellules de l'épiderme embryonnaire par des approches d’imagerie en temps réel dans des larves aux stades neurula. b) de la cataracte dans la larve de xénope. Le développement du cristallin est aisément observable dans l’embryon de xénope et dépend de l’expression de gènes dont la mutation est à l’origine de cataracte humaine. Les études dans la larve de xenope permettent d’analyser la fonction de ces gènes dans le développement de l’œil in vivo. c) au cours du développement (stades 1 à 45) de l’expression d' ARN circulaires pouvant servir de régulateurs de l'expression des gènes. d) du controle du fuseau de division cellulaire par des approches de microscopie electronique. Le fuseau permet la répartition fidèle du matériel génétique entre deux cellules filles. La taille et la structure du fuseau sont essentielles pour sa fonction. Cependant, malgré des décennies d'étude, on ignore comment le fuseau adopte une morphologie optimisée pour sa fonction.

Bénéfices attendus

Les 4 sujets de recherche développés dans cette demande d’autorisation de projets visent à l’avancée des connaissances scientifiques sur des sujets liés à la Biologie/Santé. En particulier le projet a) vise à préciser le rôle des acteurs de la cytokinese des épithéliums. La majorité des cancers provenant de tissus épithéliaux, la connaissance des mécanismes contrôlant ces divisions participent à la lutte anti-cancéreuse. Le projet b) vise à identifier et caractériser des gènes potentiellement impliqués dans le développement des cataractes et ainsi à ouvrir la voie à l’identification de cibles potentielles pour le traitement ou la prévention de la cataracte. Le sujet c) vise à décrire de nouveaux acteurs des régulations des gènes lors du développement embryonnaire et à analyser les mécanisme contrôlant leur production. Le sujet d) vise à la compréhension des mécanismes de contrôle de l’architecture du fuseau mitotique en tirant profit d’une comparaison inter-espèce.

Procédures

Une solution d'hormone (HCG) est injectée afin d'induire la ponte ou la spermatogenese. Cette opération dure une quinzaine de seconde. Pour les males il s'agit d'une injection unique. Dans le cas des femelles cette procédure est répétée environ tous les 4 mois tout au long de leur vie pour obtenir des ovocytes. Les larves issues de fécondation in vitro sont injectés au stade 1 à 8 cellules (environ 30' à 2h30min après fécondation, à un stade larvaire non autonome). Dans le cadre du sujet cristallin, un test comportemental unique de réponse à la lumière permet d'évaluer la fonction visuelle de chaque larve.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites dans cette demande impliquent l'administration d'hormones par injection sous cutanée dans l'animal. Les nuisances associées à ces injections sont a) l'isolement temporaire des animaux et le stress induit par la maniupulation et la contention le temps de l'injection. La procédure s'appliquant aux larves de stades supérieurs à 45 est une procédures d'évaluation de la fonction visuelle par des test comportementaux sans nuisances particulières associé à ce test. Les larves expérimentales ont été microinjectés aux stades 2-8 cellules puis se sont développés jusqu'au stade 48. Les phénotypes attendus sur ces animaux devrait etre associés à la fonction visuelle sans préjudice autre a priori.

Devenir

Xenopus laevis ne peut être adopté puisqu'il s'agit d'une espèce invasive. Les animaux femelles sont en utilisation continue pour la production d'ovocytes (680 animaux) tout au long de cette DAP. La durée de vie de ces animaux étant supérieure à 10 ans, et les procédures étant légères, les animaux sont conservés à l'issue du projet et réutilisés dans le cadre des nouveaux projets. Les males et les larves sont sacrifiés pour prélèvement.

Remplacement

Le modèle xénope permet par sa capacité de ponte élevé l’obtention de nombreuses larves dont le développement est externe. Ceci permet donc l’étude des phénomènes complexes impliqués sont le développement embryonnaire. L’utilisation du modèle xénope dans un contexte d’étude du développement embryonnaire en général est donc en soi une méthode alternative de remplacement de modèles mammifères, murins en particulier. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle de gènes d’intérêt dans l’organogenèse (épithélium, cristallin, embryon entier), ces processus complexes ne peuvent être reproduits en leur globalité en culture cellulaire et nécessite donc l’utilisation de ce modèle animal. L’une des forces de ce modèle est de permettre, en intervenant dans le cadre de procédures sur quelques animaux adultes, d’obtenir en quantité de nombreux stades larvaires permettant l’expérimentation et une bonne puissance statistique des analyses. Par ailleurs, l’utilisation du modèle Xénope nous permet d’obtenir les ovocytes servant à la préparation d’extraits cytoplasmiques capables de reproduire in vitro les évènements du cycle cellulaire associé à la formation du fuseau de division et de les observer par microscopie electronique. La génération in vitro de tels fuseaux ne peut être réalisée qu'avec ces extraits d’ovocytes, de plus ce projet repose sur l'étude comparative entre X. laevis et X. tropicalis. C’est pourquoi aucune autre méthode, y compris les extraits de cellules en culture, ne peut être utilisée comme substitut.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les expériences, nous cherchons à mutualiser entre les différents sujets l’utilisation des animaux entrant dans le cadre d’une procédure. 1) Pour cela les larves obtenues lors d’une FIV seront potentiellement utilisées pour tous les sujets. En effet, en microinjectant les larves à différents stades de développement nous pouvons étaler les expériences et ainsi utiliser au mieux les larves produites lors d’une FIV. De ceci découle que le nombre de procédures FIV et le nombre d’utilisations d’animaux adultes sera diminué. 2) Des mâles doivent être mis à mort pour la collecte des testicules nécessaire aux FIV. L’utilisation des testicules issus de ces mâles est mutualisée lors de la réalisation des FIV et les testicules sont conservés au froid pour permettre la réalisation de FIV sur environ 2 semaines. 3) Le travail expérimental utilisant un nombre d’échantillons élevé pour l’analyse statistique est réalisé uniquement sur des stades larvaires. 4) Les femelles Xénopes ont une espérance de vie en captivité de l’ordre de 20 ans. Ces animaux subissant pour toute procédure des injections d’Hormone Chorionique Gonadotrophique (HCG) tous les 4/5 mois sont réutilisés tout au long de leur vie.

Raffinement

Le milieu est enrichi par l'adjonction d'artéfacts permettant aux animaux de se dissimuler, tandis que les aquariums sont partiellement dissimulés par des plaques opaques afin de limiter l’apport de lumière directe dans les aquariums. Les espaces d'élevages sont séparés des espaces de manipulation et à l’écart des bruits et circulations parasites. Les femelles en procédures sont isolées en bacs individuels lors de cette période qui s'étend au maximum sur 48 heures.

Choix des espèces

De par son mode de fécondation externe, il est possible de récupérer les ovocytes de Xénope après une simple stimulation hormonale, sans chirurgie ni mise à mort. Ces ovocytes permettent soit la réalisation d’extraits cytoplasmiques reproduisant le cycle cellulaire, soit, après fécondation in vitro, d’obtenir de nombreuses larves au stade une cellule qui peuvent être microinjecté par des molécules traceurs ou des molécules interférant avec l’expression des gènes afin d’analyser l’impact de certains produits de gènes sur l’expression des gènes, le développement embryonnaire et l’organogenèse, ou la dynamique des divisions cellulaires des épithéliums. Seuls des animaux adultes sexuellement rentrent dans nos procédures expérimentales. Les stades larvaires expérimentaux sont généralement arrêtés avant le stade 45, les larves allant au stade 48 sont utilisés pour un test fonctionnel non invasif. Les larves surnuméraires non expérimentales pourront être utilisées pour générer des animaux adultes.

57 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour développer une athérosclérose, elles reçoivent une alimentation enrichie en cyanate de sodium, des injections d'une sonde fluorescente et des épilations sous anesthésie répétée, avant d'être tuées pour prélever aorte, sang et queue. Le projet étudie l'effet du vieillissement des protéines sur la paroi des vaisseaux. Le porteur affirme qu'une étude in vitro seule ne peut représenter les mécanismes d'un "organisme entier".

Objectifs

Avec 17,7 millions de décès en 2017, les pathologies cardio-vasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. C’est donc un enjeu de santé publique de mieux comprendre et caractériser les causes de ces maladies. L’athérosclérose est une maladie complexe touchant principalement les artères de moyen et gros calibre marquée par une modification importante de la structure des vaisseaux sanguins et caractérisé par la formation de plaques. Au cours du temps, ces plaques s’épaississent et gênent la circulation sanguine. Elles peuvent également se rompre, entraînant alors la formation d’un caillot provoquant des accidents vasculaires cérébraux, des infarctus du myocarde, ou des ischémies périphériques. En vieillissant, les protéines subissent des modifications pouvant affecter leurs structures et leurs fonctions. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le rôle du vieillissement des protéines présentes au niveau des vaisseaux sanguins. En effet, les vaisseaux sanguins sont principalement composés de cellules et de protéines. Lors du processus athérosclérotique, ces cellules vont se déplacer autour de la plaque afin de l'isoler. Notre projet vise à déterminer si le vieillissement des protéines joue un rôle dans le remodelage du vaisseau et sur le déplacement des cellules permettant d'isoler la plaque de la circulation sanguine au cours du développement de l'athérosclérose. Ce projet est multisite et se déroulera dans deux étuablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet d'expérimentation animale permettra de faire progresser les connaissances scientifiques sur les pathologies cardiovasculaires et de mieux comprendre l’impact du vieillissement des protéines sur le remodelage de la paroi des vaisseaux dans le développement, l’évolution et les complications de l’athérosclérose afin de trouver, in fine, de nouvelles pistes thérapeutiques dans le but de mieux diagnostiquer et donc mieux traiter les pathologies cardiovasculaires.

Procédures

Voici toutes les interventions auxquelles les animaux seront soumis : - Anesthésie générale : Lors de l’injection de la sonde fluorescente et lors des acquisitions d’imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale. L’état d’anesthésie sera obtenu par inhalation d’isoflurane à 4% et maintenu par inhalation d’isoflurane 2%. - Injection au niveau de la veine de la queue : Injection d’une sonde fluorescente pour l’acquisition des images au tomographe moléculaire de fluorescence. Cette injection se fera sur animal anesthésié par isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%). Ce geste sera réalisé une fois pour chaque souris pour la procédure 1 (9 souris X 3 groupes X 1 intervention = 27 fois) et deux fois pour chaque souris pour la procédure 2 (c’est-à-dire : 7 souris X 3 groupes X 2 interventions = 42 fois). - Épilation : L’épilation est nécessaire pour l’acquisition des images à l’échographe et au tomographe moléculaire de fluorescence. Cette intervention rapide se fera à l’aide d’une crème dépilatoire pour peaux sensibles sur le thorax et l’abdomen de la souris. Ce geste sera réalisé sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%) sur une plateforme chauffante afin de maintenir la température de l’animal. Ce geste sera réalisé trois fois pour chaque souris de la procédure 1 (c’est-à-dire : 9 souris X 3 groupes X 3 épilations = 81 fois) et deux fois pour chaque souris de la procédure 2 (c’est-à-dire : 7 souris X 3 groupes X 2 épilations = 42 fois) - Injection intrapéritonéale : L’euthanasie nécessite l’injection d’un agent anesthésique. Ce geste sera réalisé sur les animaux anesthésiés par inhalation d’isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%). Ce geste sera réalisé une fois pour chaque souris pour la procédure 1 (c’est-à-dire 27 fois au total) et une fois pour chaque animale pour la procédure 2 (c’est-à-dire 21 fois au total). Par souris : Chaque souris de la procédure 1 subira : 1 injection au niveau de la veine de la queue, 3 épilations, 1 injection intrapéritonéale. Tout ces gestes seront réalisés dans l’établissement utilisateur 2. Chaque souris de la procédure 2 subira : 2 injections au niveau de la veine de la queue, 2 épilations, 1 injection intrapéritonéale. Tout ces gestes seront réalisés dans l’établissement utilisateur 2.

Impact sur les animaux

L’alimentation supplémentée en cyanate de sodium et l’injection de la sonde fluorescente ne produisant pas d’effet toxique chez les animaux. Voici la liste des nuisances attenus : -Stress au moment du transport (5,3km pour 11 minutes de trajet) - Stress au moment de l’anesthésie et de son réveil, le stress d’une anesthésie dure en général quelques minutes avant l’endormissement et au réveil de l’animal.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Après la mise à mort des animaux, le sang sera prélevé au niveau de l’aorte afin d’évaluer la quantité d’homocitrulline (produit de carbamylation) retrouver, les aortes thoraciques seront récupérées afin d’étudier la rigidité des vaisseaux via l’utilisation d’un microscope à force atomique, puis les compositions cellulaire et protéique des aortes et des plaques d’athéromes seront étudiées via des techniques histologiques et immunohistochimiques. La queue des animaux sera également prélevée afin d’en analyser le taux de carbamylation du collagène.

Remplacement

Nous travaillons actuellement sur un modèle in vitro avec des cellules provenant d’aortes humaines et murines cultivées sur du collagène carbamylé ou non, mais une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques mis en jeu au niveau d’un organisme entier et les approches informatiques in sillico ne permettent pas à ce jour de mimer le fonctionnement de l’organisme entier et sa réaction face au traitement. Ainsi, nous n’avons pas d’autre choix que d’utiliser le modèle animal, puisque les résultats obtenus avec cette approche globale in vivo seront complémentaires à nos résultats in vitro et permettront d'apporter une réponse complète à notre hypothèse. Nous sommes actuellement les seuls à utiliser ce modèle animal (modèle carbamylation + athérosclérose), nous ne pouvons donc pas faire de projet commun afin de réutiliser des animaux inscrits dans une procédure d’un autre projet.

Réduction

Nous avons décidé de faire deux procédures, dont une 1ère en étude préliminaire avec peu de souris (9 par groupes) avec une approche de « Go/no go » pour notre seconde procédure. En effet, la première procédure servira à confirmer une bonne démarche expérimentale et définir plus précisément les différents temps d’acquisitions pour la seconde procédure. Nombre de souris totales pour la procédure 1 : 9 souris X 3 groupes = 27 souris. Pour la seconde procédure, nous n’avons aucune donnée préliminaire nous permettant de calculer la puissance statistique de notre expérience via le logiciel GPower. C’est pourquoi nous avons décidé de réaliser une étude préliminaire en 1ère procédure, afin d’avoir la possibilité de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en évitant d’utiliser beaucoup d’animaux pour affiner la cinétique de la procédure. De plus, les données issues de la seconde procédure viendront compléter les données issues de la première aux points de la cinétiques les plus intéressants pour atteindre une puissance statistique suffisante. Après avoir analysé les données issues de la 1ère procédure, nous pourrons alors calculer la puissance statistique afin de définir le nombre optimal d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Nous utiliserons au maximum 10 souris par groupe pour la seconde procédure (avec une potentielle diminution du nombre de souris en fonction des résultats issus de la 1ère procédure). Nous nous engageons à analyser les résultats de la première procédure et de calculer notre puissance statistique avant de commander les animaux de la deuxième procédure afin d’en utiliser le moins possible. Nombre maximal de souris au total pour la procédure 2 : 7 souris X 3 groupes = 21 souris. L’utilisation de souris exclusivement mâles, nous permet également de réduire le nombre d’animaux nécessaires puisqu’utiliser des animaux du même sexe permet de s’affranchir d’une variable biologique supplémentaire et de limiter l’hétérogénéité de nos résultats.

Raffinement

Quotidiennement : Les cages transparentes seront équipées de divers équipements d’enrichissement (tubes de jeu, niche, papier, bâton à rogner, coton …) afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité et en procurant un sentiment de sécurité à l'animal. Une surveillance quotidienne sera mise en place par une collaboration étroite avec les animaliers afin de prévenir et de traiter toutes manifestations de douleur ou de stress chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages de 30x40cm à raison de 5 souris par cage au maximum. Les animaux seront séparés selon leur groupe dans différentes cages (2 par groupe). Nous identifierons les animaux à l'aide de traces réalisées au marqueur indélébile au niveau de la queue. Le tableau présenté en Annexe 3 présente une grille de score adaptée qui sera suivie afin d’identifier des douleurs potentielles. Étape 1 : Le traitement ne produira pas de nuisance à l’animal. Afin de vérifier la bonne hydratation des souris, les biberons seront pesés tous les jours ouvrés et changés tous les deux jours. Étape 2 & 3 : L’utilisation du tomographe moléculaire à fluorescence (FMT) et de l’échographe nécessite un transport des animaux sur le campus Moulin de Housse (où se trouvent les appareils). Une surveillance accrue sera effectuée pendant le trajet et un morceau de pomme sera placé dans les cages afin de permettre aux animaux de continuer à s’hydrater et s’alimenter. L’utilisation ces appareils nécessite également une anesthésie générale de l’animal avec de l’isoflurane (4% pour l’induction et de 2% pour le maintien), une surveillance accrue sera effectuée pendant l’anesthésie, et l’état d’endormissement de l’animal sera confirmé par pincement des espaces interdigitaux. Enfin pour un réveil optimal des animaux concernés, l’animal sera placé sous lampe chauffante puis surveillé. Afin d’éviter le stress des animaux aux changements d'environnement, les souris seront emmenées sur le site Moulin de la Housse 24h avant l’acquisition pour qu’elles découvrent et qu’elles s’habituent aux salles de manipulation, afin que le jour de la manipulation il n’y ait pas de biais sur nos résultats. Lors de l’analyse à l’échographe, les animaux seront placés sur une plateforme chauffante composée de capteurs permettant de suivre les paramètres vitaux. Ces paramètres (fréquence respiratoire, électrocardiographie et la température corporelle de l’animal) seront surveillés pendant toute la durée de l’acquisition.

Choix des espèces

Le modèle choisi est le modèle murin dont le gène de l'apolipoprotéine E est non fonctionnel. Ce modèle est un modèle de référence pour l’étude de l’athérosclérose qui est très bien caractérisé. En effet ces souris développent la maladie sans avoir besoin de leur apporter un régime gras (non compatible avec l’utilisation du FMT puisqu’il faut un régime sans chlorophylle et qui rajouterait une variable supplémentaire à nos expériences et donc un groupe témoin supplémentaire). Nous commanderons des souris à l’âge de 4 semaines, c’est-à-dire des jeunes sevrés. Nous sommes obligés de commander des souris non adultes puisque ces souris mâles développent spontanément des plaques d’athéromes à partir de 7 semaines de vie. Nous n’avons pas le choix de commander des animaux au stade « jeunes sevrés » puisque nous voulons étudier l’impact de la carbamylation des protéines sur le développement des phases précoces de l’athérosclérose, il faut donc induire la carbamylation des protéines avant le développement de la pathologie. Toutes les expérimentations et les mises sous anesthésies se feront sur un animal adulte (âgé de 9, 13 et 16 semaines pour la procédure 1 et âgé de 9 et 13 ou 16 semaines pour la procédure 2).

240 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 220 d'entre eux sont infestés par des vers intestinaux par voie orale ou cloacale, puis abattus à 84 jours pour dénombrer les vers dans leur tube digestif. L'objectif est de mettre au point un modèle d'infestation reproductible pour l'élevage de volailles. Le porteur met en avant un enjeu "technico-économique" et présente le parcours extérieur, obligatoire en élevage biologique, comme un réservoir de parasites.

Objectifs

En élevage avicole biologique et label, l’accès à une zone herbagée extérieure (appelée aussi parcours extérieur) pour les animaux est une obligation réglementaire. Le parcours contribue en partie au bien-être animal car il apporte un environnement adapté à l’expression naturelle de leur comportement exploratoire. Cependant, le parcours de volailles constitue également un réservoir de parasites qui peuvent représenter un facteur de risque pour la santé animale. Parmi eux, les helminthes (vers parasites intestinaux) peuvent avoir un effet négatif sur le bien-être animal, mais également un impact technico-économique considérable dans les élevages de volailles : diminution de la consommation alimentaire, surconsommation d’eau, diminution de la prise de poids, amaigrissement, déséquilibre digestif, diarrhées, voire mortalité dans les cas les plus graves… L’objectif de ce projet est de mettre au point, chez le poulet de chair, un modèle d’infestation par les helminthes, pour reproduire une infestation d’un niveau comparable à ce que l’on peut trouver sur le terrain, mais sans atteindre de mortalité. Afin de trouver un modèle robuste, répétable et en adéquation avec la réalité du terrain, nous testerons plusieurs modèles d’infestation en prenant en compte 4 paramètres principaux : la voie d'administration (orale ou intra-cloacale), le choix du type d’helminthes (œufs ou larves), la fréquence des inoculations et le nombre d’helminthes administrés. Les modalités d’infestations testées au cours de ce projet seront définies à partir de la littérature. Ce modèle permettra par la suite de développer et mettre au point des solutions efficaces pour lutter contre l’helminthiase du poulet, mais également de documenter l’impact du parasite Ascaridia galli sur les performances d’élevage.

Bénéfices attendus

En trouvant le bon modèle d’infestation expérimental, c’est-à-dire une infestation par les helminthes qui entraine des baisses de performances, notre projet offrira la perspective de réaliser des études plus poussées dans la recherche de solutions efficaces contre l’helminthiase du poulet, d’apporter des solutions concrètes aux éleveurs et de documenter les niveaux d’infestation tolérables dans les élevages. Aussi, dans le contexte actuel où la recherche de solutions naturelles est un enjeu de société, notre projet pourra aboutir, à plus long terme, au développement de solutions naturelles pour la lutte contre les helminthiases.

Procédures

Les 240 poulets du projet seront pesés individuellement à 3 reprises entre le début de la procédure à 36 jours et leur abattage à 84 jours, afin de connaitre et comparer leur performance de croissance. La durée d’une pesée est inférieure à 10 secondes par poulet. Parmi les 240 poulets, 220 seront soumis à une infestation par des helminthes. L’infestation se réalisera par inoculation orale ou intra-cloacale sur animaux vigiles. Chaque inoculation (au nombre de 1 ou 5/animal à raison d'une par jour) durera moins de 20 secondes.

Impact sur les animaux

Les effets négatifs sur les animaux sont liés à la contention lors des inoculations, des pesées et de la pose de bague d’identification, et au stress léger et passager que cela peut engendrer pour l'animal. L’infestation pourra entrainer une légère diminution de la consommation d’aliment et un poids des animaux légèrement inférieur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à des fins de prélèvements du tube digestif pour la recherche et le dénombrement de vers d’Helminthes dans les contenus digestifs.

Remplacement

Notre projet a recours à des méthodes alternatives du type « in vitro » pour le développement des œufs d’helminthes, le développement des larves en larves infestantes au sein de ces œufs, ainsi que pour leur maintien en vie. Cependant, il n’existe à ce jour, pas de méthodes in vitro ou in silico pour étudier les réponses physiologiques des individus face aux parasites (ici les helminthes) auxquels ils sont exposés. En effet, le développement d’une helminthiase au sein d’un organisme et la réaction des animaux sont très variables et dépendants de l’animal. Aussi, l’analyse des contenus digestifs en fin de procédure, nécessitent obligatoirement le recours à des animaux.

Réduction

Nous avons choisi d’étudier 11 modèles d’infestation (et 1 modalité témoin non infestée) parmi toutes les possibilités qui combinent le type d’infestation (œufs ou larves), la voie d'innoculation, le nombre d’helminthes inoculés et le nombre d’inoculations (de 1 prise unique à 5 prises). Nous avons sélectionné les modèles qui nous paraissent être les plus pertinents, en combinant la réalité du terrain, la réalité de l’expérimentation et les résultats d'études antérieurs. Nous aurons besoin de 20 animaux dans chacune des 12 modalités (soit 240 animaux au total). Ce nombre de 20 animaux par modalité est optimisé pour réaliser des statistiques fiables et trouver des différences significatives pour évaluer l'effet de l’infestation sur la croissance des animaux et évaluer le degré d’infestation généré par les modèles par dénombrement du nombre de vers retrouvés dans les contenus digestifs à 84 jours d’âge.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des parquets (petits enclos où se trouvent les poulets), au sol sur des copeaux, en groupe de 20 par parquet afin de créer des relations sociales. Des ficelles et des pierres à piquer seront installées dans chaque parquet en tant que matériel d’enrichissement. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d’alimentation et de soins. Dans ce projet, nous avons porté une vigilance particulière aux conséquences des modèles d’infestation que nous avons choisis : aucun d’entre eux n’entrainera de mortalité, ni de signes cliniques sévères. Seules des réductions de consommation alimentaire et des ralentissements de croissance sont attendues. Toutes les contentions (inoculations et pesées) seront réalisées dans le calme par des personnes expérimentées. Le matériel de pesée sera adapté à la taille et à la morphologie des animaux. Des points limites sont déterminés et une évaluation du bien-être des poulets sera complétée quotidiennement par le personnel animalier pour permettre de détecter précocement toute altération de leur état de santé ou de leur comportement. Pour chaque paramètre d’atteinte au bien-être, des actions seront prises sans délai.

Choix des espèces

S'agissant d'un objectif finalisé sur la santé des volailles, le choix du poulet (gallus gallus) a été fait car il s’agit de l'espèce majeure sur le terrain et d'un modèle reconnu par la filière. Les poussins arriveront dans notre élevage à 1 jour d’âge, mais ne seront étudiés que sur la période 36-84 jours. En effet, l’infestation n’aura lieu qu’à partir de 36 jours d’âge car c’est à partir de cet âge que les animaux ont accès au parcours extérieur, et qu'ils vont potentiellement commencer à ingérer des œufs d’helminthes. Nous étudierons ensuite les animaux infestés sur toute la durée d’élevage, c’est-à-dire jusqu’à 84 jours qui correspond à l’âge classique d’abattage pour cette souche à croissance lente.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent des gavages quotidiens pendant cinq jours et un enregistrement de l'activité de la rétine sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever leurs rétines. Le projet cherche à vérifier in vivo l'effet d'un complément alimentaire pour les yeux déjà largement vendu en ophtalmologie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer cette confirmation dans un "contexte physiologique complexe".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de compléter des expérimentation mener in-vitro sur les cellules de Muller et des cellules d'épithélium pigmentaire rétinien (RPE). En effet nous avons pu mettre en évidence que l'apport d'un complément alimentaire à visée oculaire, enrichi en acide gras polyinsaturés, antioxidants et vitamines, induit des modifications du métabolimse glutamatergique et présente un effet protecteur contre le stress oxydant in-vitro en culture de cellules. La question est donc maintenant de savoir si ces effets sont similaires in-vivo.

Bénéfices attendus

Les compléemnts alimentaires à visée oculaire sont largement utilisés en ophtalmologie sans que leurs effets soient clairement identifiés. Par conséquent, ce projet permettra d'éclaircir le mécanisme d'action de ce complément et de mettre en évidence ses éventuelles limites.

Procédures

Les animaux seront soumis à des gavages quotidiens de complément alimentaire ou d'eau pour les animaux contrôles pendant 5 jours. Le gavage est un geste durant moins d'une minute. Les enregistrements électrorétinographiques sur animal anesthésié durent maximum 30 minutes, mise en place comprise.

Impact sur les animaux

Lors du gavage il peut se faire que les animaux bougent et s'irritent au niveau de la trachée ce qui conduirait alors à un défaut d'alimentation et une perte de poids. Toutefois, notre expérience de gavage nous permet de maitriser cet acte de manière à être confiant sur l'absence d'effet indésirable sur les animaux. Toutefois, le comportement des animaux sera évalué quotidiennement et ils seront pesés quotidiennement afin de vérifier une prise de poids adéquate au cours de l'expérimentation.

Devenir

Après les électrorétinogrammes réalisés sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés pour prélever les rétines et réaliser des analyses de biologie moléculaire et biochimiques

Remplacement

A ce stade aucune méthode alternative actuelle ne permet de remplacer les protocoles et procédures décrits ci-dessous. En effet, il est nécessaire de confirmer que les observations faites in-vitro sont similaires chez l’animal in vivo dans un contexte physiologique complexe.

Réduction

Les enregistrements électrophysiologiques seront réalisés sur les animaux avant de les euthanasier. Les analyses de biologie moléculaire seront réalisées sur le même échantillons dans la mesure du possible afin de limiter le nombre de souris à euthansier pour le prélèvement des échantillons. Effectuer les enregistrements électro physiologiques et les prélèvements pour analyses sur le même échantillon, dans la mesure du possible, permet de limiter le nombre de souris. Nous travallions avec un nombre d'animaux le plus faible possible mais de manière à ne pas compromettre la pertinence des résultats.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux, les souris seront surveillées et manipulées tous les jours par l’expérimentateur et les personnes compétentes. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, et auront un environnement enrichi (des rouleaux en carton et des bandes de papier pour réaliser leur nid) avec accès libre à la nourriture et l’eau. Leur état physique sera évalué avant chaque et après chaque manipulation expérimentale pour détecter toute lésion, signe clinique ou comportemental traduisant l’inconfort, le stress, ou une maladie (liés ou non à l’étude). Un tableau d'évaluation avec les critères suivants permettra d'objectiver la décision : dégradation de l’état physique, manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue). Dans le cas où l’animal montre au moins un de ces signes cliniques, soit il pourra être soigné (administration des antalgiques contre la douleur, désinfection des blessures, réhydratation par administration de saline sous-cutané, etc.) sans compromettre les résultats et il sera gardé dans l'étude, soit il ne peut pas être soigné, alors sa manipulation sera arrêtée et nous procèderons à sa mise à mort. Dans le cas où l’animal présente trois ou plus des signes cliniques nous procèderons à sa mise à mort. Des points limites seront mis en place pour chaque procédure.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet nous utilisons des souris car c'est cette espèce qui a été utilisée pour les cultures primaires de RPE et de cellules de Muller.