Procédures légères

70 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 10 d'entre eux et modéré pour 60, la plupart tués à l'issue et une dizaine réutilisés pour d'autres projets internes ou des formations. On leur implante par voie endoscopique un ballon gastrique sous anesthésie, avec imagerie et prélèvements sanguins, puis un transport vers un autre établissement pour un suivi de longue durée, pour une étude réglementaire de tolérance d'un dispositif contre l'obésité. Le porteur décrit un inconfort digestif, des vomissements et un stress lié au transport et aux contentions. Il présente cette étude sur animaux comme exigée par la réglementation et sans méthode substitutive.

Objectifs

L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de graisse, représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes qui décèdent de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après la World Health Organization, près de 39% des adultes dans le monde, représentant près de 1,9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Plusieurs études comparant ballon intragastrique (BIG) versus sham (traitement fictif) ont montré que les BIG entraînaient une perte de poids plus importante qu'un régime seul, amélioraient les comorbidités et la qualité de vie des patients obèses. L’objectif du dispositif médical est de proposer un traitement non chirurgical pour les patients non éligibles à la chirurgie bariatrique et pour aider à la perte de poids en favorisant le sentiment de satiété. Le ballon intra-gastrique testé est indiqué de façon temporaire pour : 1) La perte de poids, chez les patients adultes obèses, n’ayant pas réussi à atteindre et à maintenir l’objectif d’un programme de perte de poids sous surveillance médicale 2) Avant chirurgie, chez les patients gravement obèses (IMC supérieur à 35 kg/m2) dans le but de réduire le risque chirurgical. L’objectif de ce projet est de réaliser une étude réglementaire in vivo (sur les porcs) pour la commercialisation sur le marché, laquelle permettra d’évaluer la tolérance locale (effets locaux) au niveau de l’estomac et générale (effets secondaires) en comparant le dispositif testé avec un dispositif de référence. Pour atteindre les objectifs, ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs : l'établissement 1/2 assurera l'implantation des dispositifs et le suivi post-opératoire à court terme et l'établissement utilisateur 2/2 assurera l'hébergement post-opératoire de longue durée avec le suivi associé.

Bénéfices attendus

Obtenir l’autorisation de mise sur le marché des dispositifs médicaux testés. En effet, ce projet va permettre d’évaluer la tolérance locale (effets locaux) au niveau de l’estomac et générale (effets secondaires) en comparant le dispositif testé avec un dispositif de référence.

Procédures

Etablissement utilisateur 1 : L’introduction du ballon dans l’estomac ainsi que l’examen d'imagerie seront réalisés sur des animaux anesthésiés. Les interventions seront de longue durée et seront réalisées par voie endoscopique. Les animaux utilisés seront brièvement anesthésiés avant chaque prélèvement sanguin L’anesthésie va permettre de diminuer le stress de l’animal et faciliter sa contention. Les interventions seront de courte durée, quelques secondes pour le prélèvement et l’anesthésie dure environ 20 minutes (si anesthésie spécialement pour la ponction). Elles ne seront réalisées qu’une seule fois par animal pendant le jour de l’introduction de ballon dans l'estomac et le J+2 semaines. Etablissement utilisateur 2 : Les animaux seront hébergés dans des conditions proches des élevages, sans contraintes particulières. Les animaux seront pesés à 3 différents temps. La pesée est un acte de courte durée (quelques minutes). Des prélèvements sanguins sur animaux non anesthésiés seront également réalisés à 3 différents temps et ces prélèvements sont aussi des actes de courte durée (quelques minutes). Le temps de récupération entre 2 prélèvements sanguins sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Etablissement utilisateur 1 : Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la mise à jeun la veille de la sédation et stress dû à la contention pour la réalisation de la sédation, inconfort digestif transitoire, vomissement les premiers jours de post-implantation ainsi qu’une possible réaction inflammatoire locale des tissus. Etablissement utilisateur 2 : Au bout de 2 semaines environ après la mise en place du ballon, les animaux déclarés aptes au transport partiront pour une autre structure qui assurera l’hébergement de longue durée. Un stress peut être généré par l’arrivée des animaux dans un nouvel environnement. A différents temps post-opératoires, l’animal sera pesé et des prélèvements sanguins seront réalisés. Les différentes contentions pour réaliser ces pesées, ces prélèvements sanguins et l’anesthésie précédant la mise à mort peuvent également générer un stress.

Devenir

Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser les sites d’implantation étudiés (l’estomac et les ganglions lymphatiques autour). Ces prélèvements sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet. Le porc de réserve ne recevra pas de ballon gastrique le jour de l'implantation mais pourra être implanté en cours d'étude si pour l'un des 6 autres porcs du groupe il y'a une complication le jour de mise en place du ballon ou les jours suivants sa pose. S'il n'est pas utilisé pour ce projet, il sera réutilisé pour des projets internes à la structure (autres études, formations).

Remplacement

L’étude de tolérance locale conformément à la norme ISO 10993 -6 est une étude réglementaire demandée par les autorités, dans le cadre de la commercialisation sur le marché de dispositifs médicaux. Ce type d’étude doit se réaliser sur animaux. Cependant, l’un des buts de ces études est de démontrer une bonne tolérance générale et locale au niveau de l’estomac. Afin de démontrer ceci, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’existe. En effet, l’utilisation des animaux dans le cadre de ce projet, ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir des directives mentionnées dans la norme ISO 10993-6, selon laquelle il est nécessaire d’évaluer minimum 10 prélèvements d'estomac étant en contact avec le dispositif par groupe, et à partir des besoins pour le projet (estimation du nombre d’études sur la durée du projet). Nous considérons qu’un porc a deux demi-estomacs, donc 2 sites de prélèvements, afin de réduire le nombre d’animaux. Nous pouvons considérer que l’estomac du porc étant symétrique par rapport à son axe cardiapylorique, la biocompatibilité du dispositif implanté est testée sur chaque côté des parois stomacales. Les sites de prélèvement incluront toutes les parties morphologiques de l’estomac, c’est à dire le fundus, le corps et l’antre pylorique ainsi que la chaine ganglionnaire associée. Trois prélèvements seront ainsi réalisés de chaque côté, afin d’augmenter les sites d’évaluations et d’analyses en contact avec le dispositif, d’inclure toutes les parties morphologiques et physiologiques et de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les études seront réalisées sur minimum 2 groupes avec un groupe test versus un groupe avec un dispositif de référence avec 6 porcs + 1 de réserve inclus par groupe, Par conséquent, sur cinq ans et a raison d'une étude par an, il a été estimé 70 porcs au total. Ce nombre d'animaux permettra de répondre aux exigences de la norme ISO 10993-6 et d'obtenir des données statistiques robustes.

Raffinement

1) Afin de permettre aux animaux de s’adapter à leur environnement et de s’assurer de leur bon état de santé, une période d’acclimatation adaptée à l’espèce et au stade physiologique sera dispensée avant l’implantation des dispositifs médicaux. Avant l’inclusion des animaux, une évaluation de l’acclimatation sera réalisée. Les critères suivants seront observés : - Harmonie du groupe - Bon état de santé - Bonne consommation alimentaire et hydrique. 2) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d'hébergement adaptées et optimales (hébergement, environnement, alimentation, apport en eau, soins), Les paramètres d'ambiance, l'aliment, l'abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les animaux seront hébergés collectivement et disposeront d'un environnement enrichi (exemples : objets à manipuler de type ballon, chaîne associée à une balle en plastique etc, permettant à l'animal de jouer). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils seront hébergés dans des box attenants avecun contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et auront à disposition plus d'enrichissements (enrichissement compensatoire). De plus, la température de la salle sera augmentée (Etablissement utilisateur 1). 3) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement par un personnel habilité et habitué à travailler avec des porcs. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s'il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d'un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l'animal. L'administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 4) Surveillance accrue de l'animal durant les manipulations. Comme les animaux sont conservés longtemps, nous privilégierons des techniques de renforcement positif pour obtenir leur coopération lors des opérations courantes ou de soins. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. 5) Les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique voire remplacées par cette solution : 1- en période post-opératoire immédiate (afin de ne pas solliciter l'estomac avec des éléments solides) 2- en cas de perte de poids prononcée 3- en cas de troubles digestifs chroniques.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle porcin sera utilisé, car le porc est considéré comme le modèle animal le plus représentatif de l’être humain d’un point de vue de l’anatomie et de la physiologie digestive, avec un régime omnivore et un estomac de taille très comparable à celle de l’humain. Conformément à l’anatomie du porc et des dimensions des dispositifs médicaux (longueur de cathéter est 64,5 cm), les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 40 et 50 kg environ le jour de l’implantation des dispositifs médicaux. Lors des implémentations (phase critique), il convient de pouvoir déposer le ballon en intra-gastrique tout en manipulant le cathéter à l’extérieur de la gueule des animaux anesthésiés. Les poids cibles des animaux utilisés correspondent à une longueur d’oesophage environ 40 cm, contre déjà environ 60 cm chez l’animal adulte. L’utilisation d’animaux plus âgés et plus lourds diminuerait fortement l’adéquation de la longueur du cathéter de pose du dispositif et celle de l’endoscope (les deux étant adaptés à la longueur de l’oesophage humain). De plus, l’objectif principal de cette étude est centré sur la biocompatibilité tissulaire et des organes et non sur l’efficacité du dispositif qui est testé par ailleurs lors d’essais cliniques chez l’homme.

9 700 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 200 d'entre eux et modéré pour 7 500. Ils subissent des séances d'imagerie sous anesthésie dès le deuxième jour après la naissance et jusqu'à douze mois, des injections répétées ou un gavage pendant douze semaines et une biopsie de la queue pour le génotypage, pour étudier une valvulopathie cardiaque liée à une mutation. Le porteur signale des risques d'infection, de perte de poids et une douleur légère liée à la biopsie. Il affirme qu'une approche de "physiologie intégrée" est nécessaire et que la maladie ne peut être modélisée in vitro ou in silico.

Objectifs

Le prolapsus valvulaire mitral (PVM) est l’une des pathologies cardiovasculaires les plus fréquentes, et est associé à un haut taux de morbidité et de mortalité. A l’heure actuelle, aucun traitement pharmacologique n’est disponible pour les patients porteurs d’un PVM, la seule option étant la chirurgie valvulaire mitrale, une approche thérapeutique très invasive. Notre projet a pour objectif d'analyser et d’identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la survenue du PVM, mais aussi de la cardiomyopathie associée à cette maladie valvulaire que nous avons récemment décrite chez les patients. Par l’analyse génétique d’une grande famille vendéenne, notre équipe a identifié la première mutation associée au PVM : la mutation P637Q sur le gène FLNA (chromosome X). Un modèle de rat présentant cette mutation a ensuite été généré par l’équipe. Notre projet s’appuie donc sur l’étude de ce modèle unique de rat. Nos premiers résultats nous ont permis d’identifier les voies de signalisation majeures impliquées dans le processus physiopathologique lié au développement de la pathologie valvulaire. L’inflammation et la réponse immunitaire sont apparues comme l’un des acteurs majeurs de ce processus.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement et la progression du PVM, ainsi que l’identification de potentielles cibles thérapeutiques pour traiter les patients.

Procédures

Des approches d’imagerie (échocardiographie et IRM) ainsi que des électrocardiogrammes de surface sont réalisés. Ces approches non invasives sont réalisées, sous anesthésie, dès le jour 2 après la naissance jusqu’à 12 mois (nombre maximal par animal = 8). Des injections répétées (journalièrement ou hebdomadairement) en intra péritonéal ou un gavage chez les rats sont réalisées, sur une durée maximale de 12 semaines, selon les protocoles établis. Une biopsie de queue est réalisée pour le génotypage des animaux.

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effet secondaire n’est attendu lors de la réalisation de l’Axe 1. L’utilisation de traitement (Axe 2 & 3) peut être associée à des effets indésirables de type infection, perte de poids, réduction de la mobilité ou changement de comportement des animaux, même si les données de la littérature sont très rassurantes. Le prélèvement d'une biopsie de queue peut entrainer une douleur légère de courte durée. Ces potentiels effets indésirables seront suivis quotidiennement, et les animaux présentant des point limites seront sacrifiés et le protocole adapté au besoin.

Devenir

Après chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de caractériser l’atteinte valvulaire, par différentes approches expémentales complémentaires.

Remplacement

La modélisation in vitro ou in silico de la pathologie valvulaire cardiaque est limitée. En effet, les valves subissent à chaque cycle cardiaque des stress mécaniques multiples (tension, pression, flux) et répétitifs, qu’il est impossible de modéliser. De plus, le retentissement sur le myocarde de la pathologie, ne peut lui non plus être modélisé in vitro ou in silico. Une approche de physiologie et pathophysiologie intégrée est donc nécessaire pour répondre aux questions auxquelles nous faisons face. La culture primaire de cellules permet de s’affranchir des problématiques liées à la surexpression et sous expression de protéines in vitro, qui dans tous les cas ne permettront pas de modéliser l’effet d’une mutation ponctuelle telle que celle que nous étudions.

Réduction

Des analyses intermédiaires seront réalisées et permettront selon les résultats obtenus de réduire le nombre d’animaux par conditions. De plus, selon l’avancé des expérimentations in vitro et les premiers résultats obtenus en termes de quantité de cellules disponibles, nous pourrons réduire le nombre d’animaux traités chaque semaine, ainsi que le nombre de semaine d’expérimentation.

Raffinement

Les rats sont hébergés en cages ventilées enrichies en tunnel et frisottis, avec un accès à l’eau et la nourriture en continue. Les approches d’imagerie proposées sont non invasives et permettent de suivre un même animal longitudinalement. Elles sont réalisées sous anesthésies à l’isoflurane. Pour ce qui est des protocoles faisant intervenir un traitement, un suivi quotidien durant la phase de traitement sera effectué afin de répertorier l’apparition de points limites. Cette approche permettra de modifier/raffiner le protocole expérimental.

Choix des espèces

De nombreux processus et systèmes biologiques inter-régulés et intégrés sont décrits dans le PVM. Il est donc impossible de substituer ou modéliser par des approches in vitro ou in silico l’ensemble de ces processus. Le recours au modèle animal est donc primordial. L’utilisation d’un modèle KI permet quant à lui d’étudier une protéine mutée endogène, ce qui est primordial au regard de l’activité ubiquitaire et intervenant dans différentes voies de signalisation de la Filamine A (les modèles KO pour ce gène ne permettent pas ce type d’étude). La souche choisie pour générer le modèle est une souche non consanguine de rat Sprague Dawley, qui nous permet donc de mimer au mieux la pathologie humaine (mutation ponctuelle dans un environnement génétique hétérogène). De plus, les potentielles cibles thérapeutiques pourront être testées sur le rat FlnA-P637Q qui récapitule la complexité des processus physiopathologiques en jeu. Rappelons que le modèle de rat est particulièrement bien adapté à l’exploration des valves, qui sont des tissus très petits et difficiles à imager sur les souris. Nos données préliminaires suggèrent la présence de la pathologie valvulaire dès 7 jours post naissance. Nous devons déterminer le stade précis où la pathologie est présente afin d’étudier les mécanismes initiateurs. De plus, l’évolution de la pathologie a un intérêt thérapeutique. Nous allons donc utiliser les rats entre la naissance (J0) et l’âge de 12 mois.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères à modérées. Les souris rendues déficientes pour le gène PTEN développent une leucémie vers onze semaines et sont euthanasiées dès les premiers signes, tandis qu'environ 75 % des animaux générés, dépourvus du génotype recherché, sont tués sans être utilisés. Chaque souris subit une biopsie de la queue et un baguage de l'oreille pour le génotypage, le développement tumoral pouvant entraîner perte d'appétit, de poids et de sociabilité. Le porteur affirme qu'aucune alternative n'existe pour modéliser la leucémogenèse et conclut au caractère "crucial" du modèle murin.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies induites par la prolifération anormale et incontrôlée de cellules lymphoïdes T immatures. Le devenir des patients atteints de LAL-T reste mauvais avec environ 30% de rechute dans les deux ans suivant le diagnostic. Un des défis dans ce domaine est donc d’améliorer la prise en charge thérapeutique de ces patients et cela passe notamment par une recherche fondamentale qui vise à mieux définir les circuits moléculaires oncogéniques responsables de la pathogenèse (avec pour objectif, in fine, de cibler thérapeutiquement ces circuits). Dans ce contexte, le but de ce projet est de mieux comprendre l’oncogenèse des LAL-T en utilisant des modèles murins. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de mimer les LAL-T humaines. Nous nous focaliserons sur le gène PTEN qui est déficient dans environ 20% des LAL-T humaines. Ainsi, les objectifs de ce projet seront de 1°) générer des souris PTEN-déficientes (ces souris développent des LAL-T vers l’âge de 11 semaines); 2°) d’analyser par des technologies de biologie cellulaire et moléculaire différents organes des souris PTEN-déficientes tels que le thymus (organe dans lequel la leucémie se développe) et la rate (organe envahi par les cellules leucémiques). Les souris PTEN-déficientes seront disséquées à différents âges (entre 4 et 11 semaines) ce qui nous permettra d’analyser les stades pré-leucémiques (absence de signes cliniques) et d’étudier les étapes de transformation tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de suivre les processus de leucémogenèse. Nous pourrons analyser des souris aux étapes pré-leucémiques (absence de signes cliniques), ces étapes sont impossibles à étudier avec les échantillons humains. Le modèle murin de LAL-T nous permet également de maîtriser certaines voies telles que la signalisation du récepteur antigénique des cellules T (TCR). Dans ce contexte les souris PTEN-déficientes seront croisées avec des souris exprimant un TCR transgénique d’intérêt. Notre projet contribuera à une meilleure compréhension du processus de leucémogenèse des lymphocytes T et potentiellement il mettra en lumière de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront génotypées, pour cela une biopsie de queue sera réalisée ainsi qu'une identification à l'oreille (bague). La durée du prélèvement caudale est de l’ordre de 5 secondes. Le génotypage sera réalisé une fois dans la vie de l'animal à l'âge de trois semaines.

Impact sur les animaux

Toutes les souris seront soumises à une biopsie caudale entrainant une nuisance sur les animaux. De plus, une partie des souris développeront une leucémie T. Dans le cadre du génotypage, toutes les souris subiront une biopsie de queue ainsi qu’un baguage à l’oreille (afin de les identifier). Grâce à ce génotypage nous saurons précisément quelles sont les souris qui seront leucémiques et nous pourrons les surveiller en conséquence. Dès 10-11 semaines, les animaux seront soumis à des observations et pesées à une fréquence adaptée, qui peuvent être source de stress. Le développement tumoral pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité vis-à-vis de ses congénères. De manière générale, nous prendrons le soin d’évaluer l’apparition des signes de la douleur des animaux grâce à la grille d’évaluation de la douleur/points limites fournie en annexe 1.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. En effet, les souris de génotype homozygote (PTEN-déficientes) développeront une tumeur et seront euthanasiées avant ou dès l’observation des premiers signes cliniques afin de leur éviter une souffrance. Notre procédure impose l’utilisation de souris hétérozygotes pour nos accouplements (car les femelles homozygotes tomberaient malade en cours de gestation). Par conséquent la majorité des animaux générés (environ 75%) ne possèdera pas le génotype d’intérêt, ne développera pas de tumeur et ne sera pas utilisés dans notre étude ; donc ces animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucune alternative à l’expérimentation animale lorsqu’il s’agit de modéliser le processus complexe de leucémogénèse. Le modèle murin est donc crucial pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux impliqué dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre de portées générées. Nous estimons obtenir pour chaque souche 16 portées (d’environ 6 bébés) par an (donc 96 souris). Ainsi 96 souris x 3 souches x 5 ans (durée du projet) généreront au final 1440 souris. De plus, nous limiterons le nombre d'animaux: 1) En réalisant seulement 4 accouplements par an pour chaque souche, ce qui permet d’obtenir un nombre suffisant de souris d’intérêt, car selon la loi Mendélienne, 25% des souris générées posséderont le génotype d’intérêt. 2) En utilisant les deux sexes pour nos expériences de biologie moléculaire et cellulaires. 3) En utilisant les souris ayant un génotype sauvage en tant que contrôles dans nos expériences.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales du projet seront réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. L’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température 20-22°C, renouvellement d’air : 15 volumes/heure, éclairage artificiel lumière avec un cycle de 12h), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Le nombre d’animaux adultes par cage sera au maximum de 5. L’environnement sera enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier et éventuellement d’un dôme. L’état de santé des souris sera quotidiennement surveillé par du personnel compétent afin de déceler le plus précocement une altération du bien- être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage. De plus, nous avons établi des points limites : si les animaux les atteignent, ils seront euthanasiés ce qui mettra fin à la procédure.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l’étude du système immunitaire et des hémopathies. Par ailleurs, la communauté scientifique possède un large spectre de souris mutantes que nous pouvons utiliser dans le cadre de notre projet visant à décrypter l’oncogenèse des LAL-T. Dans ce contexte, le modèle murin est le modèle le plus pertinent pour suivre les processus de leucémogenèse. Dans notre projet nous utilisons des souris dans lesquelles le gène PTEN a été inactivé (souris appelées Ptendel dans notre projet). Nous analyserons des souris adultes, âgées entre 1 mois et environ 3 mois, car notre but est d’étudier des souris à différents stades de la leucémogenèse (de pré-leucémique à leucémique).

332 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères à modérées. Elles portent une mutation reproduisant des comportements répétitifs proches de l'autisme et subissent des tests comportementaux d'exploration, des injections, et pour une partie une chirurgie stéréotaxique intracérébrale de trente à quarante minutes sous anesthésie. Le projet teste si des traitements augmentant une substance du striatum réduisent ces stéréotypies. Le porteur affirme que les méthodes in vitro ne peuvent remplacer l'organisme entier et que des souris vivantes sont nécessaires, les tests comportementaux étant décrits comme sans stress ni souffrance.

Objectifs

Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) sont diagnostiqués sur la base de troubles du comportement, notamment des déficits de la communication et des interactions sociales, ainsi que des comportements répétitifs (stéréotypies) avec des champs d’intérêts restreints. Les causes des TSA sont encore mal connues, mais plusieurs recherches ont établi que de mutations dans certains gènes sont impliquées. Plusieurs de ces gènes participent, d’ailleurs, au développement et au fonctionnement du cerveau. Nos travaux apportent un faisceau d’arguments convergents, à partir d’études menées chez l’Homme et sur des modèles de souris, en faveur de l’existence d’un lien direct entre des mutations d’un gène et les TSA. En particulier, nos souris avec des mutations de ce gène montrent des comportements répétitifs (stéréotypies) qui miment ceux typiques des TSA. Notre hypothèse, basée aussi sur nos travaux précédents, est que ces comportements répétitifs soient dus à une réduction des niveaux d’une substance chimique sécrétée par les neurones d’une zone du cerveau nommée striatum, comme dans d’autres cas de comportements stéréotypés. A l’heure actuelle il n’existe pas des traitements médicamenteux généralisés pour les TSA, cependant certains des symptômes peuvent être pris en charge spécifiquement. Dans ce contexte, nous proposons d’utiliser nos souris afin tester si leurs comportements répétitifs peuvent être améliorés par un traitement qui vise à augmenter les niveaux de cette substance dans le cerveau. Dans ce cadre, nos objectifs principaux sont : 1. Effectuer des tests comportementaux permettant de mettre en évidence des stéréotypies chez les souris mutantes, par rapport à leurs contrôles. 2. Tester des traitements qui augmentent les niveaux de cette substance sont capables d’améliorer ces déficits comportementaux. Cela pourrait fournir des indications thérapeutiques pour le traitement des comportements stéréotypés, associés ou pas aux TSA.

Bénéfices attendus

Des mutations dans plusieurs gènes sont impliquées dans les troubles du spectre de l’autisme (TSA). Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de tester des traitements permettant de corriger des comportements stéréotypés chez la souris modèle des TSA dus à la mutation d’un de ces gènes. Si ces traitements se révèlent efficaces dans cette phase préclinique, ils pourraient être testés en phase clinique afin d’améliorer les comportements stéréotypés chez des patients atteints des TSA. D’ailleurs, un des traitements testés dans ce projet est actuellement utilisé en clinique pour le traitement de certaines formes de TSA et pour la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Ce projet comprend 3 types d’intervention : Intervention 1 : Tests comportementaux sur l’ensemble des animaux qui ne comportent pas de souffrances ou stress, afin de détecter des comportements stéréotypés spontanés typiques des modèles murins des TSA. Un test par souris, durée max 30 minutes. Intervention 2 : Injections systémiques i.p. et s.c. sur animal vigile afin d’induire une anesthésie générale et d’administrer les traitements post-opératoires (analgésiques e anti-inflammatoires) et pharmacologiques. Pour les traitements pharmacologiques d’une partie des animaux : deux injections par souris (1 pour l’habituation et 1 pour le traitement), éventuellement des injections quotidiennes sur 5-7 jours si le traitement unique est inefficace. Durée des injections : quelques secondes. Intervention 3 : Injections intracérébrales par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane) pour une partie des animaux. Une chirurgie (bilatérale) par souris. Durée de la chirurgie : 30-40 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une batterie de tests comportementaux pour évaluer les effets bénéfiques des traitements prévus sur les stéréotypies. Ces tests sont basés sur des comportements spontanés d’exploration et ne comportent pas de stress ni de souffrance des animaux. Une partie des animaux subira des injections i.p. de solution saline ou de produits chimiques qui sont non toxiques et non douloureux ; les injections pourraient engendrer du stress de contention et de la douleur aiguë. Une partie des animaux subira une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale profonde (classée modérée), pouvant engendrer douleur post-opératoire et stress. Cette chirurgie ne comporte pas de lésions ou d’autres interventions qui peuvent affecter le bien-être animal après l’opération.

Devenir

A la fin des procédures, les souris ne seront pas utilisées pour d’autres expériences dans le cadre de ce projet ou d’autres projets de recherche. Par conséquent, toutes les souris seront mises à mort.

Remplacement

Les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des neurones du contexte physiologique. De plus, l’utilisation de souris vivantes est nécessaire pour tester l’efficacité des traitements visant à améliorer les stéréotypies.

Réduction

Nous nous efforçons d’utiliser le moins d’animaux possible (optimisation des conditions d’élevage, des croisements etc.), tout en veillant à ce que le nombre d’animaux utilisé soit représentatif. Ce projet, d'une durée de 5 ans, nécessitera l'utilisation de 332 souris mâles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 12 à 14 par groupe en fonction du type d’expérience). Cela a été estimé sur la base d’expériences antérieures, et grâce à des outils statistiques permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires. Cependant, ce nombre prévu pourra être réduit en fonction des résultats obtenus dans les tests comportementaux. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie du trouble de l’autisme et permettre à terme de développer une approche thérapeutique pour cette maladie.

Raffinement

La chirurgie est optimisée pour réduire la durée de l’opération (environ 30-40 min) et minimiser la souffrance. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie générale profonde gazeuse. Les principaux paramètres vitaux sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique puissant à action prolongée est administré 30 minutes avant la chirurgie. En complément, un analgésique anti-inflammatoire est administré à la fin de l'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal, puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Après le réveil de l’anesthésie, les animaux sont surveillés afin de détecter des signes éventuels de souffrance ou de stress, qui seront pris en charge le cas échéant. Personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Des grilles d’évaluation adaptées sont mises en place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. L’analyse comportementale sera réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale, les souris seront hébergées de deux à quatre par cage avec eau et nourriture à volonté, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques (température, humidité) et sanitaires, ainsi que le bien-être des animaux, sont strictement contrôlés. Ils auront à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi qu’un environnement enrichi par des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC. Afin de diminuer l’inconfort/stress générés par ce type d’expérimentation comportementale, les souris auront une période d’habituation d’une semaine aux salles d’expérimentions où elles seront manipulées par l’expérimentateur en charge de l’étude.

Choix des espèces

Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) ne peuvent être étudiés qu’in vivo, car ils sont définis par des comportements caractéristiques (déficits dans les interactions sociales et mouvements répétitifs ou stéréotypés) qui nécessitent d’animaux vivants pour être mis en évidence. La possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est indispensable pour reproduire les symptômes des TSA dus à la délétion d’un gène. Nous utiliserons donc ces souris pour des expériences visant à mettre en évidence des stéréotypies, afin de tester si des traitements qui peuvent restaurer la fonction d’une région du cerveau impliquée dans les TSA peuvent améliorer ces comportements. L’âge des souris utilisées sera de 12 à 14 semaines au début de la procédure : cela a l’avantage d’avoir des animaux adultes capables d’effectuer les tâches comportementales prévues dans la procédure expérimentale, tout en minimisant la durée de leur stabulation.

70 porcs vont être utilisés, la plupart tués et une dizaine réutilisés, dans des procédures classées légères à modérées. Un ballon intragastrique leur est implanté par voie endoscopique sous anesthésie, avec prélèvements sanguins et transfert vers un second établissement pour un hébergement de plusieurs mois, avant mise à mort pour analyser l'estomac et les ganglions. Le porteur indique des effets attendus tels que vomissements, inconfort digestif et réaction inflammatoire locale, et précise que l'étude vise l'autorisation de mise sur le marché du dispositif. Il affirme que cette étude réglementaire "doit se réaliser sur animaux" et qu'aucune méthode substitutive n'existe.

Objectifs

L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de graisse, représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes qui décèdent de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après la World Health Organization, près de 39% des adultes dans le monde, représentant près de 1,9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Plusieurs études comparant ballon intra-gastrique (BIG) versus sham (traitement fictif) ont montré que les BIG entraînaient une perte de poids plus importante qu'un régime seul, amélioraient les comorbidités et la qualité de vie des patients obèses. L’objectif du dispositif médical est de proposer un traitement non chirurgical pour les patients non éligibles à la chirurgie bariatrique et pour aider à la perte de poids en favorisant le sentiment de satiété. Le ballon intra-gastrique testé est indiqué de façon temporaire pour : 1) La perte de poids, chez les patients adultes obèses, n’ayant pas réussi à atteindre et à maintenir l’objectif d’un programme de perte de poids sous surveillance médicale 2) Avant chirurgie, chez les patients gravement obèses (IMC supérieur à 35 kg/m2) dans le but de réduire le risque chirurgical. L’objectif de ce projet est de réaliser une étude réglementaire in vivo (sur les porcs) pour la commercialisation sur le marché, laquelle permettra d’évaluer la tolérance locale (effets locaux) au niveau de l’estomac et générale (effets secondaires) en comparant le dispositif testé avec un dispositif de référence. Ce projet se déroule dans deux établissements.

Bénéfices attendus

Obtenir l’autorisation de mise sur le marché des dispositifs médicaux testés. En effet, ce projet va permettre d’évaluer la tolérance locale (effets locaux) au niveau de l’estomac et générale (effets secondaires) en comparant le dispositif testé avec un dispositif de référence.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur : L’introduction du ballon dans l’estomac ainsi que l’examen d'imagerie seront réalisés sur des animaux anesthésiés. Les interventions seront de longue durée et seront réalisées par voie endoscopique. Deux prélèvements sanguiins sous anesthésie générale de courte durée (maximum 10 minutes) Dans le deuxième établissement utilisateur : trois prélèvements sanguins sans anesthésie, à raison d'un par mois, de faible volume, qui dure moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la mise à jeun la veille de la sédation et stress dû à la contention pour la réalisation de la sédation, inconfort digestif transitoire, vomissement les premiers jours de post-implantation ainsi qu’une possible réaction inflammatoire locale des tissus. Au bout de 2 semaines environ après la mise en place du ballon, les animaux déclarés aptes au transport partiront pour une autre structure qui assurera l’hébergement de longue durée. Un stress peut être généré par l’arrivée des animaux dans un nouvel environnement. A différents temps post -opératoires, l’animal sera pesé et des prélèvements sanguins seront réalisés. Les différentes contentions pour réaliser ces pesées, ces prélèvements sanguins et l’anesthésie précédant la mise à mort peuvent également générer un stress.

Devenir

Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser les sites d’implantation étudiés (l’estomac et les ganglions lymphatiques autour). Ces prélèvements sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet. Le porc de réserve ne recevra pas de ballon gastrique le jour de l'implantation mais pourra être implanté en cours d'étude si pour l'un des 6 autres porcs du groupe il y'a une complication le jour de mise en place du ballon ou les jours suivants sa pose. S'il n'est pas utilisé pour ce projet, il sera réutilisé pour des projets internes à la structure (autres études, formations).

Remplacement

L’étude de tolérance locale est une étude réglementaire demandée par les autorités, dans le cadre de la commercialisation sur le marché de dispositifs médicaux. Ce type d’étude doit se réaliser sur animaux. Cependant, l’un des buts de ces études est de démontrer une bonne tolérance générale et locale au niveau de l’estomac. Afin de démontrer ceci, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’existe. En effet, l’utilisation des animaux dans le cadre de ce projet, ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir de la norme en vigeur, dans laquelle il est stipulé qu’il est nécessaire d’évaluer minimum 10 prélèvements d'estomac étant en contact avec le dispositif par groupe, et à partir des besoins pour le projet (données statistiquement robuste et estimation du nombre d’études sur la durée du projet). Nous considérons qu’un porc a deux demi-estomacs, donc 2 sites de prélèvements, afin de réduire le nombre d’animaux. Les études seront réalisées sur 2 groupes avec un groupe test versus un groupe avec un dispositif de référence avec 6 animaux + 1 de réserve par groupes. Par conséquent, sur cinq ans et a raison d'une étude par an, il a été estimé 70 porcs au total.

Raffinement

1) Afin de permettre aux animaux de s’adapter à leur environnement et de s’assurer de leur bon état de santé, une période d’acclimatation adaptée à l’espèce et au stade physiologique sera dispensée avant l’implantation des dispositifs médicaux. Avant l’inclusion des animaux, une évaluation de l’acclimatation sera réalisée. Les critères suivants seront observés : - Harmonie du groupe - Bon état de santé - Bonne consommation alimentaire et hydrique. 2) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d'hébergement adaptées et optimales (hébergement, environnement, alimentation, apport en eau, soins), Les paramètres d'ambiance, l'aliment, l'abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les animaux seront hébergés collectivement et disposeront d'un environnement enrichi (exemples : objets à manipuler de type ballon, chaîne associée à une balle en plastique etc, permettant à l'animal de jouer). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils seront hébergés dans des box attenants avec un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et auront à disposition plus d'enrichissements (enrichissement compensatoire). De plus, la température de la salle sera augmentée. 3) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement par un personnel habilité et habitué à travailler avec des porcs. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s'il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d'un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l'animal. L'administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 4) Surveillance accrue de l'animal durant les manipulations. Comme les animaux sont conservés longtemps, nous privilégierons des techniques de renforcement positif pour obtenir leur coopération lors des opérations courantes ou de soins. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. 5) Les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique voire remplacées par cette solution : 1- directement après l'opération (afin de ne pas solliciter l'estomac avec des éléments solides) 2- en cas de perte de poids prononcée 3- en cas de problèmes digestifs.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle porcin sera utilisé, car le porc est considéré comme le modèle animal le plus représentatif de l’être humain d’un point de vue de l’anatomie et de la physiologie digestive, avec un régime omnivore et un estomac de taille très comparable à celle de l’humain. Conformément à l’anatomie du porc et des dimensions des dispositifs médicaux, les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 40 et 50 kg environ le jour de l’implantation des dispositifs médicaux.

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères à modérées. Une colite est induite pendant sept jours, provoquant selles molles ou diarrhées et une perte de poids modérée, avant un gavage unique destiné à mesurer la perméabilité intestinale puis une mise à mort quatre heures plus tard pour prélever les tissus du côlon. Le projet teste l'effet d'une supplémentation en tryptophane et butyrate sur l'inflammation intestinale, dans un contexte d'obésité induite par un régime hyperlipidique. Le porteur affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" pour étudier un écosystème aussi complexe que le microbiote et qu'aucun modèle in vitro ne le reproduit.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des maladies chroniques très invalidantes dont l’origine implique des facteurs environnementaux, en particulier le microbiote intestinal et l’alimentation. Certains produits du microbiote connus pour leur rôle bénéfique dans la santé de la muqueuse intestinale, sont diminués chez les patients atteints de MICI. Plusieurs études ont démontré les propriétés anti-inflammatoires de ces produits du microbiote et confortent l’intérêt de rechercher les effets d’une supplémentation nutritionnelle en produits bactériens bénéfiques pour la muqueuse intestinale dans les MICI. L’autre intérêt d’une supplémentation nutritionnelle dans le traitement des MICI réside dans le fait que ces patients présentent de plus en plus souvent une obésité pouvant représenter un facteur aggravant connu pour générer une modification du microbiote et une inflammation dans différents tissus. L’objectif du projet de recherche est d’évaluer l’efficacité d’une supplémentation nutritionnelle en produits du microbiote sur l’inflammation intestinale et la cicatrisation de la muqueuse intestinale chez la souris ainsi que l’influence d’un contexte « d’obésité » induit par un régime hyper-lipidique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer ou d’infirmer l'effet bénéfique d'une supplémentation nutritionnelle en produits du microbiote sur l’inflammation et la réparation de la muqueuse intestinale et d’apporter des éléments sur le mécanisme d’action. Il permettra également d’évaluer l’impact d’un contexte d’obésité sur l’efficacité de cette supplémentation nutritionnelle. Le projet devrait ainsi fournir des bases rationnelles à des essais cliniques de supplémentation nutritionnelle pour la prévention ou le traitement des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à des manipulations lors de la constitution des groupes et des pesées. Un gavage oral unique avec une solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale se fera sur tous les animaux à l’état vigil. Quatre heures après ce gavage, les animaux auront une anesthésie générale pour un prélèvement sanguin puis seront immédiatement mis à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux auront une inflammation modérée du côlon distal qui durera 7 jours. Cette inflammation peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt du traitement inflammatoire au bout des 7 jours entraine l’arrêt progressif de ces symptômes et une récupération de l’état physiologique normal au bout de 4 jours. Le gavage unique des souris avec une solution pour évaluer la perméabilité intestinale est une procédure de classe légère qui devrait se limiter à un stress au moment du gavage, les animaux étant mis à mort 4 heures après.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour rechercher des différences statistiques de l’impact des différents régimes sur l’inflammation intestinale et sur le microbiote intestinal sur des critères histologiques et moléculaires. Il est indispensable de prélever des tissus coliques pour des analyses histologiques et de marqueurs moléculaires à partir d’ARN et de protéines extraits de ces tissus. L’analyse de la composition et de l’activité métabolique du microbiote intestinale nécessite de recueillir le contenu luminal au niveau du cæcum.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable dans les études évaluant l’impact de la nutrition sur un écosystème physiologique aussi complexe que le microbiote intestinal et la muqueuse intestinale, impliquant des interactions très complexes. Il n’existe pas de modèles cellulaires in vitro pouvant reproduire la complexité de ces interactions.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est de N=8, ce qui représente un minimum nécessaire pour évaluer statistiquement l'effet des régimes alimentaires sur l’inflammation intestinale et la cicatrisation de la muqueuse intestinale. Ce nombre est basé sur des études similaires issues de notre laboratoire ou de la littérature et tient compte d'une variabilité interindividuelle importante dans la sensibilité à l'inflammation des animaux qui impacte les analyses effectuées.

Raffinement

L’environnement des souris sera enrichi (tunnel, bâton à ronger, frisottis) tout au long de la procédure. Les souris seront hébergées à 4 par cage dès leur arrivée jusqu’à l’induction d’une inflammation intestinale. Les animaux seront suivis par un personnel animalier compétent et observés quotidiennement pour détecter d’éventuels signes de souffrance. L’évaluation de l’état des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique (pelage, posture), activité, comportement, fréquence respiratoire). Leur prise alimentaire et leur prise de poids seront mesurées 3 fois par semaine, puis quotidiennement durant la période de 7 jours d'inflammation afin de détecter une éventuelle sous-alimentation ou perte de poids anormale. Si une douleur était constatée chez un animal durant cette période, un analgésique sera administré. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé dans les études nutritionnelles, en particulier pour les régimes obésogènes, mais également dans les études sur l'inflammation intestinale. Les souris commandées auprès de l’établissement éleveur seront âgées de 5 semaines. Après une phase d’acclimatation de 10 jours et une période de régimes alimentaires de 49 jours, les souris seront âgées de 94 jours, soit 3 mois et 10 jours. La procédure expérimentale s’étendant sur 70 jours, les souris seront agées de 15 semaines à la fin l’expérimentation, soit 3,75 mois, ce qui correspond à un stade de jeune adulte fréquemment observé chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et qui plus est chez ceux présentant un phénotype obèse.