Procédures légères

980 diamants mandarins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 510 tués, 420 réutilisés et 50 placés chez des particuliers. Ils sont exposés à un mélange de métaux lourds sur plusieurs générations, avec pose de puces, prises de sang, prélèvements de plumes et de sperme, pour mesurer les effets de la pollution urbaine sur leur physiologie et leur reproduction. Le porteur s'appuie sur des expériences antérieures pour affirmer n'attendre ni mortalité ni douleur importante, seulement un stress lié à la manipulation. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne rend compte de "l'organisme entier" d'un oiseau vivant.

Objectifs

Les activités humaines sont une source de stress pour la faune sauvage. Cependant, il est difficile de mettre en évidence les effets dissociés de différentes sources de stress dans le milieu naturel. Pour établir des relations causales, des études en laboratoire sont nécessaires. C’est pourquoi dans ce projet nous adoptons une approche écotoxicologique en laboratoire sur le modèle d’étude diamant mandarin (Taeniopygia guttata) qui est une espèce d’oiseau modèle en écophysiologie. Nous nous concentrerons sur les effets de la pollution en éléments traces métalliques, comme le plomb, le cadmium, le cuivre. Ces éléments peuvent avoir des effets importants sur la santé humaine et sur celle de la faune sauvage. Dans des expériences précédentes nous avons testé l’hypothèse que le stress oxydatif est le mécanisme physiologique sous-jacent à ces effets négatifs sur la santé. Le stress oxydatif résulte d’une surcharge des défenses antioxydantes par des espèces réactives de l’oxygène et peut causer des dommages sur les lipides, les protéines et l’ADN. Nous avons notamment montré un lien entre expositions aux polluants et dommages sur l’ADN chez les mâles adultes de diamant mandarins. A la suite de ces études, nous allons maintenant travailler à l’échelle de plusieurs générations, notamment car certains polluants peuvent avoir des effets uniquement sur certains stades de développement ou pendant certaines périodes du cycle de reproduction, ou des effets sur les cellules germinales qui ne se détectent qu’à la génération suivante. Le premier objectif de ce projet est donc de tester les possibles effets sur plusieurs générations de l’exposition aux polluants : des effets sur le développement des jeunes aux effets à long terme qui peuvent être aussi transmis aux descendants. Notre deuxième objectif est de travailler à la fois sur des jeunes et des adultes mâles et femelles pour étudier l’effet sexe et aussi les effets des polluants sur la reproduction.

Bénéfices attendus

Habituellement les études en écotoxicologie se limitent à un seul polluant, un seul sexe et une seule génération. Notre projet permet de répondre à toutes ces limites en étudiant des effets à long terme sur plusieurs générations d’un mélange de polluants metalliques représentatif du milieu urbain. Les résultats attendus nous permettrons donc de mieux comprendre la complexité des réponses des organismes à ce type de pollution. Notamment nous pourrons identifier des relations causales entre un mélange de polluants et les paramètres physiologiques des oiseaux. Nous pourrons également déterminer si la sensibilité des mâles et des femelles est identique et quel stade de développement est le plus vulnérable face à ces polluants. Enfin, même s’il est connu que certaines molécules peuvent avoir des effets sur les générations suivantes, comme le DDT (insecticide) sur les coquilles d’œufs, les effets inter-générationnels sont encore peu étudiés. Notre étude permettra d’une part de mesurer ces potentiels effets mais aussi de mieux comprendre les modes d’action (distinction des effets pré et post nataux par exemple). A long terme notre projet permettra d’apporter des clés de compréhension sur les effets de l’urbanisation sur les populations d’oiseaux. Par exemple, certaines des mesures physiologiques utilisées sont réalisables sur des animaux sauvages (prise de sang, plumes, morphométrie) ce qui permet d’envisager de les utiliser comme marqueur des effets de la pollution sur la santé des oiseaux in situ.

Procédures

Les différentes interventions sur les oiseaux : - pose de puces d'identification (30 secondes) – mesures morphométriques et pesées (entre 6 et 8 mesures, 3 minutes, animal vigile) - imagerie médicale sous anesthésie générale (10 oiseaux et 4 mesures par oiseau pour les tests et 40 oiseaux et 2 mesures par oiseau pour l'expérience principale, la prise d'image dure environ 3 min) - mesure de la coloration du bec (3 mesures, 2 min, animal vigile). Tous les prélèvements seront effectués sur des animaux vigiles : - prise de sang (entre 1 et 5 prélèvements, environ 30 secondes) - plumes (entre 1 et 5 prélèvements, environ 1 seconde) - sperme (1 prélèvement, 1 à 3 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à un mélange de polluants représentatif d’une pollution urbaine caractérisée par une faible concentration de chaque polluant. De ce fait, et aussi d’après nos précédentes expériences (APAFIS#26929), nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs (mortalité, perte de poids conséquente, perte de mobilité), de douleur ou de stress chronique. Les différents prélèvements (plumes, sang…) et manipulations (pose de puces d'identification, pesée…) ne sont pas invasifs et ne génèrent pas de douleur importante, néanmoins il y a quand même un stress pour les oiseaux liés à leur prise en main. Nos précédentes expériencesmontrent que ce type de prélèvement et le stress associé n’engendrent pas d’effets indésirables ou chroniques sur les oiseaux.

Devenir

Les animaux seront soit gardés en vie jusqu’à leur mort naturelle, soit réutilisés dans d’autres projets, soit replacés chez des particuliers.

Remplacement

Les méthodes actuelles de remplacement in vitro et in silico ne sont pas utilisables car on s’intéresse aux effets sur l’organisme entier et les modèles actuels ne permettent pas de prendre en compte la complexité d’un oiseau vivant et les polluants en mélange. Notre étude sur la physiologie et le comportement doit donc être réalisée sur des oiseaux vivants. Nous avons choisi une espèce modèle en laboratoire pour ne pas impacter la faune sauvage.

Réduction

Pour les tests de nouvelles méthodes sur les adultes (métabolisme, cytomètre) nous avons prévu une taille d'échantillon minimale avec réutilisation des animaux entre les deux tests (total de 10 individus). Pour le test de la technique d'imagerie nous avons là aussi 10 individus avec des mesures répétées sur chaque individu pour limiter le nombre total d'oiseaux utilisés. Pour l'expérience principale, la taille d’échantillon proposé (20 couples par groupe) permet d’avoir un échantillon suffisant pour réaliser des analyses statistiques en prenant en compte les aléas possibles liés au travail sur des animaux vivants. Effectivement, certains couples ne se reproduiront pas ou auront des pontes stériles. Cette proportion est estimée à 30% des couples. De plus, nous souhaitons travailler sur plusieurs générations et il faut donc qu’à chaque génération nous ayons suffisamment d’individus. Les tests statistiques prévus sont des modèles linéaires mixtes pour prendre en compte les mesures répétées sur un même individu. Nous mettrons des covariables dans les modèles quand cela est pertinent, par exemple : poids de l’oiseau, nombre d’œuf pondus.

Raffinement

Les différentes phases du protocole ont été conçues avec soin pour favoriser le bien-être des animaux : - Enrichissement structurel (branchages et perchoirs, litière pour fouiller au sol, nichoirs et fibres de coco lors de la reproduction, baignoires dans les volières extérieures) et enrichissement alimentaire (millet, os de seiche, gravier) - Attention particulière portée à l’état du plumage et à la posture des oiseaux lors des visites quotidiennes (indicateurs majeurs du bien-être) - Écartement de la procédure d’un animal si signe de souffrance (voir les indicateurs de bien être ci-dessus) et/ou perte de masse > 20% (= points limites) - Surveillance accrue au réveil de l’anesthésie lors des mesures par imagerie - Les oiseaux seront dérangés au minimum pendant l’expérimentation, c’est-à-dire que les mesures, prises de sang et autres prélèvements (plumes, œufs…) seront regroupés autant que possible. Le stress des oiseaux est donc limité en réduisant la fréquence des dérangements. Les dérangements sont aussi réduits de par l’utilisation d’antenne RFID pour enregistrer le comportement d’incubation. - transport des oiseaux dans des boîtes de transport individuelle. Les boîtes sont opaques pour limiter le stress et elles sont rembourrées avec de la fibre de coco pour garantir le confort des oiseaux.

Choix des espèces

Espèce modèle largement utilisée en laboratoire dans des études en écologie et évolution, notamment sur le stress oxydant, le comportement social, la sélection sexuelle et les effets maternels. Cela nous permet d’avoir des valeurs de référence 2) Continuité avec nos travaux précédents Nous travaillerons sur des adultes (âgés entre 1 et 3 ans au début de l’expérience) pour étudier les effets sur la reproduction et sur des jeunes (de la naissance à la mort) pour étudier les effets du traitement sur le développement

24 jeunes bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, seize retournant au circuit de consommation humaine et huit tués faute d'autorisation de mise sur le marché du produit reçu. Ils reçoivent des antibiotiques par voie intramusculaire et intraveineuse et jusqu'à trente prises de sang, pour comparer le devenir de trois associations sulfamides-triméthoprime dans l'organisme. Le porteur indique des prises de sang provoquant une douleur modérée de courte durée et pose un cathéter pour éviter les ponctions répétées. Il affirme qu'il n'est "pas possible de se passer d'animaux" car la pharmacocinétique n'est pas prévisible in vitro.

Objectifs

Suite à la réduction de la possibilité pour les vétérinaires d'utiliser des antibiotiques d'importance critique, l'usage d'antibiotiques anciens comme les sulfamides a dû être reconsidéré. En médecine vétérinaire, ces sulfamides sont majoritairement associés à un antibiotique de la classe des diaminopyrimidines, le triméthoprime, pour obtenir un effet synergique et bactéricide sur les bactéries pathogènes. La proportion de doses sulfamides/triméthoprime est de 5/1 dans la quasi-totalité des formulations vétérinaires mises sur le marché. Cette proportion est une transposition directe de celle utilisée chez l'Homme. Un biais majeur de cette transposition réside dans le fait que le devenir de ces antibiotiques dans l’organisme (pharmacocinétique) peut être très variable selon l'espèce animale. Chez les bovins par exemple, certains sulfamides sont éliminés beaucoup plus lentement que le sulfaméthoxazole et que le triméthoprime, d'où une perte probable de l'effet synergique recherché lorsque sulfamides et triméthoprime sont utilisés en mélange. D’autre part, la synergie entre les sulfamides et le triméthoprime n'a jamais été évaluée sur des pathogènes d'intérêt vétérinaire. L'objectif de ce projet est alors de déterminer chez le jeune bovin la pharmacocinétique de l'association sulfaméthoxazole/triméthoprime et de la comparer à celle de deux associations couramment utilisées en élevage (sulfadiazine/triméthoprime et sulfadiméthoxine/triméthoprime). Ce projet sera réalisé sur des animaux sains. Les tests impliquant des bactéries pathogènes seront faits in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de proposer des ratio des doses sulfamides/triméthoprime adaptés à l'espèce bovine et pour des pathogènes d'intérêt vétérinaire. Le bénéfice final sera une meilleure exposition des animaux, une mauvaise exposition des animaux étant un des facteurs de l'émergence de résistances aux antibiotiques en élevage. Ce bénéfice servira autant les animaux (augmentation de l'efficacité des traitements antibiotiques) que l'Homme (diminution de la résistance aux antibiotiques au niveau de produits de consommation humaine et diminution du transfert de résistances à l'Homme).

Procédures

1. Administration par voie intramusculaire, une fois, maximum 1 min; 2. Administration intraveineuse lente, une fois, 4-5 min après pose d'un cathéter dans une des veines jugulaires (environ 1 min); 3. Contention des animaux, à chaque prise de sang, au maximum entre 30 sec-1min entre contention et prise de sang; 4. Prises de sang, entre 12 et 15 * 2 cinétiques avec 1 semaine de pause, soit au maximum 30 prises de sang sur la totalité du projet, au maximum 30 sec-1min entre contention et réalisation de chaque prise de sang. Toutes les interventions sont réalisées sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les traitements antibiotiques administrés sont des médicaments vétérinaires ou humain prévus pour des administrations intramusculaires et intraveineuses. Il ne devrait donc pas y avoir d'effets indésirables lors de ces administrations. Elles seront de courte durée et peu voire pas douloureuses. En effet, les volumes à administrer par voie intramusculaire sont très faibles et les intraveineuses seront réalisées via un cathéter placé dans une des veines jugulaires afin d'éviter toute administration périveineuse. Nous ne prélèverons pas plus de 1.1% du volume sanguin au maximum, les prises de sang engendrant une douleur modérée de courte durée, notamment pour les premiers prélèvements qui seront réalisés via un cathéter placé dans une des veines jugulaires pour éviter de multiples ponctions.

Devenir

A la fin de l'expérimentation, les veaux recevant les associations sulfadiazine/triméthoprime et les associations sulfadiméthoxine/triméthoprime pourront retourner dans le circuit de consommation humaine car ils auront reçu des médicaments vétérinaires avec autorisation de mise sur le marché (AMM). Les veaux recevant les associations sulfaméthoxazole/triméthoprime ne pourront pas retourner dans le circuit de consommation humaine car cette association n'a pas d'AMM chez les bovins, ils seront alors mis à mort.

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet car le devenir d'un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) n'est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale, ...). Cependant, le test de différents ratio de sulfamides/triméthoprime et l'optimisation de doses, ainsi que la mesure des effets de ces ratio sur différents pathogènes seront faits in vitro. Cela permettra de ne pas multiplier les expérimentations sur animaux et de ne pas faire d'expérimentation sur animaux malades.

Réduction

Il n'est pas possible de réaliser les 6 administrations sur les mêmes animaux car leur croissance au cours de l'étude pourrait impacter le devenir des antibiotiques dans l’organisme et car il serait nécessaire de faire un trop grand nombre de prises de sang par animal. Pour estimer correctement le temps pour que les concentrations en sulfamides et en triméthoprime diminuent de moitié et pour déterminer quelle fraction de la dose atteint la circulation sanguine après une administration par voie intramusculaire, le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par des méthodes statistiques à 8 animaux par groupe. Grace à un plan expérimental en cross-over dans lequel, pour chaque association d’antibiotiques, 4 veaux reçoivent une intramusculaire et les 4 autres une intraveineuse, puis un traitement inverse une semaine après, on a réduit de 36 à 24 le nombre total d’animaux pour la totalité du projet.

Raffinement

Les veaux seront hébergés en groupe en liberté dans une stalle. La stalle sera équipée de brosses, d'une pierre à lêcher, de ballons et de balles de foin à faire rouler. Les animaux seront observés au moins une fois par jour, y compris les weekend et jours fériés. Pour limiter leur stress et faciliter les administrations par voie intramusculaire, ils seront habitués à venir se placer d'eux-mêmes dans un cornadis et à y rester le temps de la distribution de l'aliment concentré. Les manipulations réalisées sur les animaux ne devraient pas engendrer de douleur ou de stress majeur mais des traitements ont été envisagés en cas de réaction allergique lors des administrations ou de formation d'un hématome lors des prises de sang. La mise en place des traitements sera décidée conjointement entre le responsable de l'expérimentation et le vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur.

Choix des espèces

Les bovins sont les animaux pour lesquels nous souhaitons revoir les ratio de doses sulfamides/triméthoprime dans ce projet Veaux sevrés car il est nécessaire de mener l'étude sur des veaux ruminants et non au stade pré-ruminant pour pouvoir extrapoler les données aux utilisations en élevage. Cependant, pour des raisons pratiques, nous ne mènerons pas l'étude sur des animaux de plus de 100-150 kg.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une partie reçoit pendant la gestation une injection intra-abdominale d'un traceur, les descendants subissant ensuite des prélèvements de sang sous anesthésie et une batterie de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, jusqu'à douze mois. Le porteur relie ce projet à un précédent et cherche à établir si une carence en vitamines B pendant la gestation aggrave la maladie de Huntington. Il affirme qu'aucun modèle non-animal ne convient à cette approche développementale et comportementale.

Objectifs

Ce protocole in vivo est complémentaire du premier de même type précédemment validé (2020-2023). Le précédent projet a confirmé que la carence en vitamines B pendant la vie adulte était un facteur aggravant de la maladie de Huntington, notamment en terme de précosité des symptômes. Mais, alors qu'il est connu que les carences en vitamines B sont en lien avec des effets à long terme de type "programmation foetale", nous émettons l'hypothèse qu'une carence géstationnelle en vitamines B pourrait avoir une influence sur les mécanismes de développement embryonnaires et post-embryonnaires, sur la survenue et la gravité de la maladie de Huntington, dont les manifestations sont plutôt caractéristiques des âges adultes. Or cette maladie est incurable et cette étude pourrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes liant la carence en vitamines B12/B9 et la mise en place éventuellement précoce de la maladie. L'objectif final serait alors de trouver des potentiels cibles thérapeutiques pour freiner la progression de la maladie.

Bénéfices attendus

La maladie de Huntington est incurable et cette étude pourrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes liant la carence en vitamines B12/B9 et la mise en place éventuellement précoce de la maladie. Et ainsi trouver des potentiels cibles thérapeutiques pour freiner la progression de la maladie.

Procédures

30 souris seront injectées (cavité abdominale) avec 200 µl d'une solution aqueuse d'un traceur de multiplication cellulaire, une seule fois pendant la gestation, durée de l'intervention moins d'une minute. 240 animaux nés et suivis au cours de leur vie seront prélevés d'une goutte de sang (100µl) sous anesthésie une seuls fois à 3, 6 et 9 mois d'âge; intervention d'une durée d'environ 1 minutes (hors temps d'anesthésie). 240 animaux nés et suivis au cours de leur vie passeront une batterie de tests comportementaux observationnels; chaque test ponctuel ayant une durée relativement courte (5 minutes ou moins).

Impact sur les animaux

Le seul effet indésirable prévisible sera l'injection ponctuelle intra-abdominale du traceur de prolifération cellulaire chez les mères et le prélèvement de d'une goutte de sang chez les animaux après la naissance. Une étude du même type précédemment autorisée a montré que parfois certaines souris âgées de plus de 12 mois peuvent présenter des démangeaisons cutanées. Cependant, pour ce projet, nous n'irons pas au delà de 12 mois d'âge.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour effectuer les prélèvements de tissus nécessaires à l'étude.

Remplacement

Il n’est pas possible de faire cette étude sur des modèles non-animaux, en raison de l'approche développementale puis comportementale. L’utilisation du modèle murin de la maladie permet de mimer au mieux la phytopathologie de la maladie de Huntington retrouvé chez l’Homme. Ce modèle nous permet de suivre la mise en place et la sévérité des symptômes moteurs, cognitifs et/ou psychiatriques retrouvés chez l’Homme, au cours d’une temporalité, elle aussi, semblable à celle retrouvée chez l’Homme. Ceci nous permet de mieux comprendre les mécanismes impliqués et d’espérer trouver des nouveaux biomarqueurs et/ou cibles thérapeutiques chez la souris mais transposables à l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est calculé au plus juste avec l'utilisation d'un logiciel statistique et selon (1) l'expérience des porteurs du projet sur les carences vitaminiques et (2) l'analyse des résultats de la précédente étude du même type. D'après notre prospective, 10 individus par groupe sont suffisants, alors qu'auparavant, certaines études comportementales proposaient 12 à 15 individus par groupe.

Raffinement

Un enrichissement des conditions d'hébergement est prévu avec buchettes de bois et du papier absorbant. Lors des procédures d'injection et de prélèvement de sang, les animaux seront anesthésiés à l'aide d'isoflurane (5% air) et ces actes ne dureront que très peu de temps (moins d'une minute hors temps d'anesthésie). Les points limites sont déterminés à l'aide de différents paramètres observables, dont la posture, les comportements quotidiens et l'évolution de la masse corporelle de l'animal (frêle, inactif, peu ou pas de prise de poids, voir perte de poids).

Choix des espèces

La souris est le seule espèce permettant une étude de la maladie de Huntington selon un modèle génétiquement modifié. L'étude à long terme dite "de programmation foetale" se déroule en 2 temps: 30 souris (gestantes) seront mises à mort pour prélèvement des embryons au jour embryonnaire 12 et au jour embryonnaire 19. Pour la cinétique post-natale, l'étude sera menée dès la naissance, durant la lactation des souris, et après le sevrage à 21 jours et jusqu'à 12 mois d'âge. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer les effets de la carence et les symptomes comportementaux de la maladie de Huntington. Plusieurs tests comportementaux s'enchaineront de 5 à 65 jours d'âge, puis à 270 et à 360 jours d'âge. Des prélèvements d'une goutte de sang (100 µl) seront réalisés pour suivre l'aspect carence à 90, 180, 270 jours d'âge.

200 chiens adultes vont être utilisés, réutilisés ou adoptés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent l'injection d'un antigène réputé fortement immunogène, le KLH, et des prises de sang répétées à la jugulaire sous simple contention, pour évaluer si un médicament vétérinaire module la réponse immunitaire. Le porteur signale que des chocs anaphylactiques ont été observés dans des modèles antérieurs au KLH chez le chien, tout en affirmant que cet antigène semble aujourd'hui bien supporté. Il indique qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives" pour mesurer cette réponse chez l'espèce cible.

Objectifs

Les études de toxicologie visent à établir les organes cibles de la molécule et les doses toxiques pour un organisme vivant. Pendant la phase de développement préclinique, des essais d’innocuité et des études de résidus sont réalisés sur l’animal de l’espèce concernée par le médicament. Pour certains produits biologiques, le système immunitaire pourrait être affecté par la présence d’anticorps étrangers, c’est pourquoi des études d’immunotoxicité peuvent être réalisées (par exemple in vivo, la réponse anticorps liée aux lymphocytes T (TDAR) a été recommandée pour évaluer une potentielle immunomodulation de la réponse immunitaire acquise chez les espèces utilisées dans les études toxicologiques précliniques).

Bénéfices attendus

L’immunogénicité d’un médicament se définit par sa capacité à induire une réaction immunitaire spécifique au sein de l’organisme dans lequel il est introduit. Cette fonction peut s’avérer problématique si elle n’est pas attendue et s’avère délétère, on parle alors d’immunotoxicité. Pour étudier ce mécanisme, il est important d’avoir en main un modèle au sein duquel il est possible de mesurer une activité immunitaire connue, comme la réponse anticorps liée aux lymphocytes T (TDAR) par exemple, causée par l’injection d’un produit réputé fortement immunogène comme le KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin). Les études d’immunotoxicité sont conduites pour évaluer la capacité, ou non, d’un médicament à moduler la réponse immunitaire au KLH, supposément indépendante vis-à-vis du mode d’action dudit médicament.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention légère ne visant qu’à restreindre ses mouvements pour sa sécurité et celle des manipulateurs, selon les procédures en vigueur sur le site et selon les recommandations de la réglementation en vigueur. Des prises de sang pourront être réalisées afin de suivre l’état immunitaire ou de santé des chiens. Ils seront généralement réalisés à la veine jugulaire (ponctuellement un autre site : veine céphalique) et effectués en quelques minutes par chien, au maximum une fois par jour. La fréquence et le volume des prélèvements seront définis et justifiés dans le plan d’étude.

Impact sur les animaux

Dans les modèles antérieurs au KLH pour l’étude du TDAR, des chocs anaphylactiques ont pu être observés chez les chiens suite à l’injection de SRBC (Haggerty, 2007 et Lebrec, 2014). La bibliographie actuelle relative à l’utilisation de KLH chez l’espèce canine ne relate aucun fait similaire et cet antigène semble bien supporté par les chiens. En humaine, l’utilisation de KLH en injection n’a pas engendré d’importantes douleurs au site d’injection.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les euthanasies ne sont pas prévues. Ils seront réintroduits dans la colonie des animaux hébergés dans l'animalerie ou adoptés. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives pour déterminer la réponse anticorps liée aux lymphocytes T (TDAR) d’un produit chez l’animal de l’espèce cible.

Réduction

Dans le plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié (selon les recommandations de la bibliographie et toutes autres données pertinentes) de manière à optimiser l’utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre d’animaux permette d’atteindre l’objectif de l’étude. Il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale.

Raffinement

Ces études ne requièrent qu’une contention légère des animaux pour l’administration du traitement et les collectes (ex. sang) et n’induisent pas de stress aux animaux autre que celui d’être maintenus pendant des temps très courts à quelques reprises. Les volumes de sang prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être animal ne sera pas altéré. Depuis leur inclusion dans l’étude jusqu’au dernier prélèvement, les animaux sont observés au moins 2 fois par jour par le personnel dédié et formé aux soins des animaux. Des observations plus fréquentes sont prévues dès que requis, particulièrement après les administrations des traitements, pour s’assurer qu’aucune réaction non attendue n’est observée. Toute observation d’un état de santé ou d’un comportement anormal d’un animal fait l’objet d’un examen par un vétérinaire qui proposera les mesures adéquates pour protéger l’animal en lui administrant un traitement si nécessaire et décidera de son maintien ou non dans l'étude.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination cible. Afin d'avoir une réponse immunitaire stable et également pour être plus représentatif dans la population ciblée sur le marché, des animaux avec un système immunitaire mature donc des chiens adultes seront privilégiés.

200 lézards de dix espèces sauvages vont être capturés puis utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avant d'être relâchés à leur point de capture. Seuls des mâles sont capturés sur le terrain, gardés cinq à sept jours et soumis à des mesures répétées de pertes en eau cutanée et à des mesures morphologiques, pour relier la topographie des écailles à l'adaptation à l'aridité. Le porteur indique que les nuisances tiennent surtout au stress de la capture, du transport et des contentions, qu'il déclare réversible. Il justifie le recours à des animaux sauvages par l'absence d'élevage de ces espèces et affirme que les collections de muséum ne permettent pas de mesurer les pertes hydriques.

Objectifs

Les variations spatiales de la disponibilité en eau et des conditions thermiques dans l'environnement favorisent l'évolution de tactiques spécifiques de conservation de l'eau et d'optimisation de son utilisation pour les besoins métaboliques. Chez les animaux ectothermes terrestres, la balance hydrique dépend de l'équilibre entre l'apport d'eau par l'alimentation et la consommation d'eau de pluie, d'eau stagnante ou d'humidité, la production d'eau métabolique et la perte d'eau par évaporation respiratoire, ainsi que la perte d'eau par évaporation cutanée, oculaire ou cloacale (perte d'eau cutanée). La perte d'eau cutanée est par ailleurs un élément prépondérant dans la perte évaporative totale. Ainsi, les adaptations à l’aridité chez ces organismes devraient impliquer des mécanismes de réduction des pertes hydriques cutanées et/ou respiratoires, ainsi que des modifications du métabolisme basal. Des adaptations structurelles du tégument semblent minimiser la perte d'eau et maximiser la locomotion et la résistance à la déshydratation chez les reptiles, dont la résistance cutanée à la perte d'eau dépend de l'épaisseur de la peau, des lipides de la couche cornée et de la couverture de la surface par les écailles. À ce jour, il n'existe aucune étude liant la caractérisation de la diversité interspécifique des pertes hydriques cutanées avec des mesures topographiques des écailles chez les reptiles. De fait, nous proposons ici d'analyser et de mesurer conjointement les pertes hydriques totales et cutanées et la topographie des écailles associées sur des lézards de différentes espèces de Lacertidae. En utilisant des espèces venant de milieux contrastés, nous pourrons ainsi mieux comprendre les mécanismes de résistance aux contraintes hydriques le long des gradients d'aridité et identifier les caractères et les espèces les plus sensibles à l'altération des conditions climatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de faire progresser la compréhension du rôle de la peau dans les adaptations aux contraintes hydriques le long des gradients d'aridité. Des premières études chez les reptiles montrent une relation négative entre les pertes hydriques totales et la température de l’environnement, et quelques travaux ont mis en évidence des relations entre l'aridité et la topographie des écailles, mais aucune étude n'a encore fait le lien entre les pertes hydriques cutanées et la topographie des écailles dans un contexte comparatif. Après l'achèvement de ce projet, ces données pourront être utilisées pour effectuer des modèles prédictifs afin d'étudier l'influence des variations climatiques futures sur la distribution de ces espèces. Enfin, ce projet va également fournir des données uniques sur une dizaine d'espèces de lézards, ce qui permettra de mieux comprendre l'écophysiologie hydrique comparative de ces espèces, certaines pouvant occuper des régions très arides.

Procédures

Nos protocoles impliqueront des captures sur le terrain, le transport des animaux et des mesures morphologiques (3 séries de mesure de 30 secondes le jour de la capture ou le lendemain), une acclimatation pendant 1 ou 2 journées, des mesures de perte hydriques cutanées (6 mesures successives de 3-4 minutes pendant une journée) et des mesures de pertes de pertes hydriques totales au repos (1 mesure pendant la nuit avec deux pesées avant et après le protocole) en cumulatif sur chaque individu de chaque espèce et chaque population du projet. Après 2 à 4 journées d'acclimatation et de surveillance, les animaux seront relâchés sur leur site de capture

Impact sur les animaux

Les mesures sont faiblement invasives et les nuisances seront essentiellement liées au stress de la capture et du transport et aux contentions. Les mesures répétées induisent un stress léger pour les animaux principalement du fait des contentions et du cumul des actes. Le stress induit par la contention est parfaitement réversible et n'entraîne pas de conséquences à long terme. Par ailleurs, le stress lié à l'hébergement sera réduit car les animaux seront gardés au maximum 5-7 jours en captivité puis relâchés.

Devenir

Tous les animaux seront relaché à l’endroit exacte de la capture. Les mesures effectuées comportent une part de stress; cependant, elles ne produisent aucune séquelle durable pour les animaux qui seront tous gardés en vie.

Remplacement

L'objectif de l'étude est de comprendre les adaptations physiologiques des lézards sauvages dans leurs environnements naturels. Nous ne disposons pas d'élevage de ces espèces et les collections de Muséum ne permettent pas de faire des mesures de pertes hydriques. Les animaux vivants capturés sur le terrain ne peuvent donc être remplacés par un équivalent cellulaire ou in silico ni par des individus élevés en captivité pour ce projet.

Réduction

Afin de garantir la puissance statistique de l'étude tout en réduisant l’effectif de l’étude, nous proposons d’échantillonner entre 1 et 2 populations de chaque espèce le long d'un gradient d'aridité de l'habitat entre les 10 espèces (depuis des espèces de milieux continentaux humides jusqu’à des espèces de milieux arides) et en capturant un nombre limité mais homogène de mâles dans chaque population (10 adultes). En matière d'analyse, cela impliquera une analyse de variance avec 10 espèces x 2 populations x 10 individus soit 200 individus.

Raffinement

Les individus maintenus en captivité seront acclimatés avant les mesures puis suivis quotidiennement. Les conditions d'hébergement seront enrichies (présence d’abris et de substrat) en suivant les recommandations zootechniques pour l'espèce. Nous nous appuierons sur un suivi journalier et scoré des individus pour quantifier plusieurs paramètres. Les comportements des animaux seront contrôlés visuellement chaque jour pour détecter l'apparition de comportements anormaux tels que prostration, léthargie, ou agitation. La masse corporelle sera suivie régulièrement (tous les 2 jours) afin de détecter toute perte soudaine de masse. Après les mesures, l’animal sera surveillé pendant 2-4 jours puis replacé dans son habitat naturel au point de capture.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies sont le lézard des souches (Lacerta agilis), le lézard des murailles (Podarcis muralis), le lézard vivipare (Zootoca vivipara), le lézard vert (Lacerta bilineata), le lézard ocellé, (Timon lepidus), le lézard de Bonnal (Iberolacerta bonnali), le lézard catalan (Podarcis liolepis), le lézard de Bédriaga (Archaelacerta bedriagae), l’Algyroïde de Fitzinger (Algydroides fitzingeri) et le lézard tyrrhénien (Podarcis tiliguerta). Ces espèces font partie de la famille des Lacertidae qui dispose d’une phylogénie complète et récente et est distribuée en Eurasie et en Afrique. Elle représente 360 espèces répartie dans 30 genres différents distribués sur un gradient d’aridité et dans une grande diversité d’habitats. Cette famille comprend de nombreuses espèces menacées d’extinction en Europe et à valeur symbolique et écologique forte. Ce projet visera à quantifier le rôle de la peau dans l'adapation à l’aridité et pour aider à identifier les epsèces les plus sensible au réchauffement climatique. Dans ce projet, uniquement des mâles sexuellement matures vont être mesurés afin de limiter la variabilité de taille, de statut physiologique et de cycle reproducteur entre individus pouvant influencer les pertes hydriques cutanées.

1080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des mères gestantes ingèrent des nanoparticules de dioxyde de titane mêlées à de la pâte chocolatée, et l'activité respiratoire des nouveau-nés est mesurée sans intervention pendant onze jours, pour évaluer l'effet d'une exposition périnatale sur les réseaux respiratoires. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable majeur, seulement une légère hausse transitoire de la fréquence respiratoire des petits. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit "la complexité d'un organisme entier" et justifie l'essai par la définition de valeurs limites d'exposition pour l'humain.

Objectifs

Au cours de ces dernières années, le domaine de la nanotechnologie et des nanoparticules a subi une croissance fulgurante. Les propriétés uniques des nanoparticules ont permis de très nombreuses avancées dans les domaines technologiques (informatique, électronique), agroalimentaire, cosmétique ou encore médical. Cependant, du fait de leur taille extrêmement réduite (

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux appréhender les risques, durant la période périnatale, d’une exposition chronique aux nanoparticules de métal, telles que celles présentent dans l’alimentation ou certains produits tels que les médicaments ou encore le dentifrice. Ces travaux sont nécessaires afin de définir des valeurs limites d’exposition pour l’humain et identifier les conséquences de ce type d’exposition sur la mise en place et le fonctionnement des réseaux neuronaux vitaux tels que les centres respiratoires.

Procédures

Les expérimentations auront lieu essentiellement suite à la mise à mort des animaux, ou sur animal vigile qui ne subiront pas d'intervention (mesure de l'activité respiratoire de manière non invasive), durant 5 minutes, de manière quotidienne sur 11 jours. Des groupes d'animaux auront une alimentation normale à laquelle sera ajoutée une dose de pâte chocolatée seule ou associée à des nanoparticules de dioxyde de titane.

Impact sur les animaux

Nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs. Les animaux (mères et petits) ne montrent pas de déficit fonctionnel majeurs. Il n’y a pas de surmortalité des petits, pas de modification de leur développement (poids corporel, taille). Il est attendu une légère augmentation de la fréquence respiratoire des petits mais sans conséquence sur leur bien-être. Cette modification de la fréquence respiratoire ayant disparu au 7ème jour post-natal.

Devenir

Mise à mort

Remplacement

Il n’y a au jour d’aujourd’hui aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, que ce soit les approches in vitro, ou in silico, qui ne peuvent pas reproduire, ou modéliser la complexité d’un organisme entier. Néanmoins afin de remplacer au maximum l’utilisation d’animaux, nous utilisons un modèle informatique pour prédire la distribution des nanoparticules de dioxyde de titane dans les différents organes.

Réduction

Les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux n'excèdera pas 12 animaux, c'est à dire le nombre d'échantillon permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine lors de l’étude de l’activité respiratoire chez le nouveau-né. Par ailleurs afin de limiter le nombre d'animaux que nous serons amenés à utiliser, une banque de tissus (cerveau + moelle épinière) sera constituée afin de pouvoir mener ultérieurement des analyses immunohistochimiques complémentaires sans devoir sacrifier d'animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux sont placés dans des cages adaptées par deux ou trois afin de maintenir la vie en collectivité dans un milieu enrichi (papier, abris). Les animaux engagés dans cette procédure seront habitués aux dispositifs expérimentaux autant que possible. Les animaux néonataux seront testés dans un environnement chauffé (lampe chauffante) pour prévenir les chutes de température et seront immédiatement remis à leur mère après l'expérimentation. Les procédures mises en place suivent également les normes en matière de raffinement des pratiques expérimentales, par exemple en utilisant une méthode volontaire per os de prise de nanoparticules, celle-ci se substituant aux méthodes "classiques" d'injections pouvant, quand elles sont réalisées sur le long court entrainer stress ou mal-être chez l'animal. En outre, nous utilisons une méthode de mesure de l'activité respiratoire in vivo non stressante et non invasive, où l'animal est placé dans une chambre d'enregistrement. Cette méthode est substituée aux méthodes classiques utilisant un masque, évitant ainsi une situation pouvant induire mal-être et stress chez l'animal.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est motivé par le fait que la souris est un animal docile, facile à manipuler, ayant une bonne qualité maternelle, et résistant aux infections d'une façon générale, ce qui est un plus certain pour la réalisation de projets tels que le notre associé à un aspect développemental. En outre, nous disposons aujourd’hui d’un nombre conséquent de données sur ce modèle, ce qui justifie nos travaux sur ce modèle animal. Ce projet vise à étudier les conséquences de l'administration de nanoparticules sur le développement embryonnaire et ses conséquences post-natales. Les animaux exposés (femelles) le seront dès le début de la gestation jusqu'à la fin de celle-ci. L’étude se portera donc aux stades néonataux et embryonnaire puisqu’elle vise à étudier la mise en place des réseaux respiratoires.