Procédures légères

2 286 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent des modèles de la maladie d'Alzheimer ou un système immunitaire déficient, et subissent une biopsie sur souriceau vigile, jusqu'à 59 injections dans l'abdomen, des prélèvements sanguins répétés et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le projet vise à évaluer une immunothérapie ciblant les cellules immunitaires liées à la protéine Tau. Le porteur affirme que ces interactions ne peuvent être reproduites en culture cellulaire et juge le modèle animal "totalement indispensable".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive de la mémoire et des fonctions cognitives. Elle est définie par deux types de lésions cérébrales : celles liées à la protéine A-Béta, et celles liées à la protéine Tau. Ces agrégats protéiques induisent une réaction immunitaire à plusieurs composantes. La première composante, consiste en une inflammation chronique cérébrale pouvant avoir des effets bénéfiques ou délétères. Des études récentes ont montré l’existence d’une seconde composante, par laquelle des cellules immunitaires infiltrent le cerveau et promeuvent la progression du déclin cognitif. Plusieurs analyses chez l’Homme et dans des modèles expérimentaux suggèrent que ces cellules ont un rôle délétère dans la MA. Des études ont montré que la modulation de ces cellules immunitaires délétères permet de réduire la perte de mémoire et de modifier l’inflammation cérébrale dans un modèle murin de pathologie A-Béta. Ces cellules immunitaires régulatrices pourraient également contrôler les réactions immunitaires pathogènes liées à la protéine Tau pathologique. Sur la base d’études pré-cliniques dans un modèle murin de pathologie Tau, l’objectif de ce projet est d’évaluer une approche thérapeutique innovante ciblant les cellules immunitaires dans la MA et d’autres pathologies liées à la protéine Tau.

Bénéfices attendus

La Maladie d’Alzheimer (MA) touche environ 1 million de personnes en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Cette maladie, sans traitement, nécessite une prise en charge importante liée à la perte d’autonomie des patients. Des études précliniques antérieures dans un modèle murin de MA ont apporté la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique d’un traitement à faible dose d’une molécule. Cette preuve nous a permis d’initier un premier essai clinique pilote pour évaluer l’efficacité thérapeutique de ce traitement modulant les réponses immunitaires délétères dans la MA précoce. Ce projet vise à présent à évaluer et établir la preuve de concept pré-clinique de l’efficacité accrue d’une nouvelle approche ciblant les réponses immunitaires pathogènes associées aux agrégats de protéine Tau. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.

Procédures

Les animaux modèles de la Maladie d’Alzheimer développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie (inférieur à 1mm) effectuée de manière précoce sur animal vigile. Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des injections répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) à raison d’un maximum d’une injection quotidienne durant 3 semaines à l’âge de 3 mois puis de rappel toutes les 3 semaines durant 5 jours jusqu’à l’âge de 9 mois (environ 20 secondes par injection). Les injections seront réalisées sur animal vigile avec au minimum 1 injection et au maximum 59 injections intra-péritonéales sur la durée du traitement. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile toutes les semaines durant 3 semaines puis au maximum toutes les 2 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement). Les animaux seront prélevés entre 1 et 9 fois sur la durée du traitement. Des tests comportementaux seront effectués à l’âge de 9-10 mois. Ces tests durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 6 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de maintien prévue en vue des prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensible aux infections. La biopsie (

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact du traitement sur les différents marqueurs de progression de la pathologie.

Remplacement

L’ensemble de ce projet vise à mieux comprendre les interactions neuroimmunes au cours des maladies neurodégénératives. Il nécessite donc l’utilisation d’un système expérimental intégré, permettant de comprendre la physiologie du système nerveux central et ses interactions encore mal connues avec le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent être reproduites par des cultures cellulaires, qui ne permettent que l’étude du contact entre les cellules immunitaires et les cellules nerveuses. Or, ce type d’interaction ne constitue qu’une fraction minoritaire des échanges en jeu dans les maladies neurodégénératives. Des simulations informatiques ont également été effectuées et nous ont permis de valider que des réponses immunitaires spécifiques contre la protéine Tau étaient possibles. Cependant, l’effet de la modulation de ces réponses sur les maladies neurodégénératives ne peuvent être évaluées que dans un organisme vivant. Un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.

Réduction

Le projet impliquera un total de 2286 souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux des pathologies neurodégénératives et de lignée immunodéficiente nécessaire à la mise en œuvre de ce projet. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre des traitements, ils seront initiés à l’âge de 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie. Les animaux seront ensuite analysés à 9-10 mois (âge normal d’apparition des troubles cognitifs). Justification du sexe : Concernant les modèles transgéniques utilisés, nos résultats préliminaires indique qu’il existe une différence de phénotype comportemental et neuroimmunitaire entre mâles et femelles. Ainsi, l’ensemble des expériences sera réalisé sur les deux sexes de manière indépendante.

300 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord soumises à une restriction alimentaire, nourries deux jours par semaine seulement, puis servent à prélever ou recevoir par injection des cellules souches musculaires avant d'être tuées trois semaines plus tard. Le porteur indique que ce jeûne provoque une sensation de faim modérée jusqu'à cinq jours par semaine. Il présente d'abord un objectif agronomique, maîtriser la croissance du muscle de truite d'élevage, avant d'évoquer au conditionnel des pistes contre des maladies musculaires humaines.

Objectifs

La croissance musculaire nécessite l'activation et la différenciation des cellules souches musculaires aussi appelées cellules satellites. Chez les poissons, la croissance musculaire est continue tout au long de la vie de l’animal mais la formation de nouvelles fibres (hyperplasie) diminue avec l’âge et(ou) le poids, et les mécanismes cellulaires sous-jacents ne sont pas encore connus. Nous avons mis en place un protocole d'extraction de cellules souches de muscle de truite et de transplantation dans le muscle de ces cellules. Nos premiers résultats montrent que les capacités des cellules souches et de leur niche diminuent rapidement pour atteindre un minimum dès 500g. Notre objectif est de déterminer si cette diminution des capacités myogéniques est due à l’âge des animaux ou au poids.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer si la baisse de capacité myogénique de la niche et des cellules souches est due à l’âge ou bien au poids des animaux. Cette question qui existe également chez les mammifères, ne peut être résolue que grâce à l’utilisation de poissons avec une croissance continue et une très forte plasticité de croissance comme la truite. Cette connaissance devrait permettre d’améliorer les pratiques zootechniques afin de maîtriser plus finement la croissance musculaire et les caractéristiques du muscle de truite. Au-delà de ces aspects agronomiques, une meilleure compréhension des impacts de l’âge et du poids sur les capacités myogéniques, pourrait fournir de nouvelles pistes dans le traitement de certaines pathologies d’atrophie musculaires telles que la cachexie, sarcopénie ou l’amyotrophie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une restriction alimentaire afin de ralentir leur croissance, puis ils seront utilisés pour extraire les cellules souches musculaires ou être transplantés avec des cellules souches musculaires. Nous utiliserons 250 poissons dans la première procédure (restriction) et 60 poissons dans la deuxième (transplantation). Les animaux seront mises à mort 3 semaine après la transplantation.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être nourris uniquement 2 jours par semaine (lundi et jeudi) ce qui pourrait engendrer une sensation modérée de faim pendant au maximum 5 jours par semaine. Pour les animaux qui vont être transplantés, ils pourraient ressentir une légère douleur suite à la piqure par une aiguille pendant quelques secondes.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mises à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés.

Remplacement

Les objectifs du projet étant de déterminer l’impact de l’âge et du poids sur les capacités myogéniques du muscle, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.

Réduction

Pour soumettre le minimum d’animaux à la restriction alimentaire modérée, nous allons utiliser des bacs de petite taille afin de maintenir une densité optimale avec 125 poissons/bac au maximum. Nous avons réduit le nombre d’animaux transplantés à 60, car cela correspond à 10 animaux par point ce qui est suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques de l’étude et détecter des différences de capacités myogéniques

Raffinement

Pour limiter au maximum la blessure lors de la transplantation intramusculaire, nous utiliserons des aiguilles avec un faible diamètre (0,45mm). Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, enrichissement). Pendant la procédure de transplantation, les animaux seront anesthésiés, leur manipulation sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). C’est une des rares espèces qui permet de tester séparément l’effet de l’âge et du poids compte tenu de sa croissance continue et de sa très grande plasticité de croissance. De plus, nous disposons d'une lignée de truites transgéniques mlc2-GFP qui expriment la GFP dans les cellules souches musculaires. Cette espèce n'est pas incluse dans la liste des espèces identifiées comme devant provenir d’élevage ou de fournisseurs agréés. Nous allons utiliser des poissons de 10g et 1kg. Une expérience préliminaire, nous a montré que les capacités myogéniques des cellules souches et de la niche diminuaient rapidement dès 100g et atteignaient un minimum autour de 500g. Ainsi pour maximiser nos chances d'observer une différence de capacité de myogénique nous allons utiliser des animaux de 10g (~5 et 14 mois) et de 1kg (14 mois).

40 souris et 4 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des prélèvements de sang et des injections par plusieurs voies, sous anesthésie, pour que des techniciens s'entraînent aux gestes de routine de l'animalerie. Le porteur signale un risque de lésions oculaires après un prélèvement derrière l'œil et fait de l'euthanasie elle-même un geste à acquérir. Il indique recourir surtout à des animaux commandés pour d'autres études mais restés inutilisés, et présente la mise en situation sur animal vivant comme "essentielle".

Objectifs

Les personnes travaillant avec des animaux de laboratoire doivent maitriser des gestes techniques plus ou moins complexes : administrations, prélèvements, … Leur formation initiale doit parfois être complétée par une formation spécifique, en fonction des études qu’ils seront amenés à réaliser et de l’évolution des connaissances et pratiques. Le but de ce projet est d’acquérir de nouvelles techniques, se perfectionner ou de maintenir la maitrise des gestes techniques faits en routine dans nos animaleries expérimentales par les techniciens. Ces formations doivent leur donner les moyens de raffiner les procédures expérimentales en évitant un stress et une souffrance animale supplémentaires liés à une non maitrise du geste technique et ainsi, réduire le nombre d’animaux nécessaires. Nous ferons appel à une société extérieure pourvue de formateurs experts dans le domaine pour la réalisation des sessions de formation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont une maitrise des gestes techniques utilisés en routine par les techniciens de l’animalerie et un maintien accru des compétences permettant de limiter le nombre d’animaux de nos futurs projets.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins et des injections via différentes voies. Chaque animal aura au maximum 2 prélèvements et 2 injections de quelques secondes. Les gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié sauf si l’anesthésie est plus impactante que le geste réalisé.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues de l’ordre de quelques secondes pourront être : -un stress induit par une contention non maitrisée -une douleur lors des prélèvements ou des injections non maitrisées -un accident lié à une anesthésie mal maitrisée -lésions oculaires après un prélèvement au sinus rétro orbitaire

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des sessions de formation. L’euthanasie fait partie des gestes à acquérir dans le respect du bien-être animal.

Remplacement

Si les gestes techniques de base peuvent être enseignés et appris sur des systèmes inertes d’entrainement ou à l’aide de tutoriels vidéo, la mise en condition réelle sur le modèle animal reste essentielle pour l’apprentissage. La mise en condition sur modèle animal est donc d’une aide fondamentale dans l’apprentissage des conditions réelles d’expérimentation animale. Pour la formation pratique, il n’existe pas de méthode de substitution, qui pourraient restituer fidèlement les comportements et réactions des animaux et/ou la manipulation des tissus vivants.

Réduction

Dans la très grande majorité des cas, il s’agira d’animaux commandés pour une étude mais n’ayant pas été utilisés et devant être euthanasiés ; le formateur est une personne experte, sa supervision étroite garantira une utilisation optimale des animaux en minimisant le risque d’erreur de geste technique qui pourrait entrainer le décès de l’animal. Pour ce projet, nous prévoyons d’utiliser au maximum 40 souris (4 techniciens à former par an et 2 animaux par techniciens) et 4 lapins sur une durée de 5 ans (au maximum 2 sessions de formation en 5 ans et 2 animaux par session).

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux de 8 animaux par cage et bénéficient d'un enrichissement de type bâtons à ronger, cachettes et cabanes. Ils seront euthanasiés après chaque formation. De plus, les animaux seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bon état général et tout geste potentiellement stressant sera réalisé sous anesthésie générale afin de préserver leur bien-être. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire, mais souhaitant acquérir une maitrise supplémentaire ou maintenir leur niveau de compétence. Enfin, la définition de points limites à ne pas atteindre permettra de réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Ces formations sont destinées aux techniciens de notre animalerie travaillant sur le modèle souris et le modèle lapin (bien que très rarement utilisé). Les espèces choisies le sont en conséquence afin de maintenir les compétences des personnels de notre animalerie. Nous prévoyons d’utiliser des animaux adultes, comme c’est le cas dans nos protocoles expérimentaux.

632 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 256 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit des cancers du poumon ou de la vessie par un carcinogène chimique présenté comme identique à celui du tabac, administré par injections ou dans l'eau de boisson pendant plusieurs semaines, pour étudier des fibroblastes qui entourent les tumeurs. Le porteur indique que les tumeurs de vessie peuvent provoquer une occlusion, une rétention d'urine et des douleurs, contenues par une palpation régulière et des points limites. Il reconnaît que des cultures d'organoïdes sont à l'essai mais les juge insuffisantes, et renvoie à une perspective les retombées pour l'immunothérapie.

Objectifs

Les recherches actuelles sur les cancers solides ne se focalisent plus uniquement sur les cellules cancéreuses mais ciblent aussi le microenvironnement tumoral. En effet, ce dernier composé de différents types cellulaires joue un rôle déterminant dans l’initiation et la progression tumorale. Le ciblage des cellules immunitaires (immunothérapie réactivant les lymphocytes T notamment) a conduit à des résultats spectaculaires de rémissions durables dans des tumeurs solides notamment dans le mélanome, le cancer du poumon et plus récemment le cancer de la vessie. Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (20 à 30%), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Des études récentes dans le cancer du poumon ont montré que certaines cellules (fibroblastes) associées aux tumeurs (CAF) forment une barrière autour des ilots tumoraux et empêchent les lymphocytes T de rentrer en contact directe avec les cellules tumorales empêchant leur destruction. Cette exclusion peut expliquer certains de ces échecs thérapeutiques. Deux types de tumeurs solides répondant partiellement à l’immunothérapie seront étudiées dans ce projet : - Le cancer du poumon :principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par chirurgie et radiothérapie conduisent à des rémissions durables mais les stades métastatiques ont une faible survie et restent un enjeu majeur de santé publique. - Le cancer de la vessie qui reste un enjeu majeur de santé publique en cas d’envahissement du muscle ou des ganglions lymphatiques voisins. Ces tumeurs peuvent potentiellement être guéries par l'ablation chirurgicale de la vessie et des ganglions lymphatiques. Cependant, chez plus de la moitié des patients qui subissent ce type d'intervention chirurgicale, des cellules cancéreuses ont déjà métastasé et le pronostic vital reste sombre. L’objectif de ce projet est d’identifier l’origine des fibroblastes capables de générer une barrière autour des ilots tumoraux et d’étudier leur fonctionnalité sur l’initiation et la progression tumorale. Cette recherche fondamentale sur l’origine et la fonction des CAF pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les fibroblastes afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies

Bénéfices attendus

Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et permettre aux lymphocytes T d’atteindre les cellules tumorales permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie, notamment dans un contexte de cancer du poumon ou de la vessie.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront soumis à une biopsie auriculaire, en vue de déterminer leur génotype, avant d’intégrer les différentes procédures. Dans une première expérience, les animaux recevront une injection d’un produit non douloureux directement dans l’abdomen (intrapéritonéale) à raison d’une fois par jour pendant 5 jours. Deux jours après la dernière injection, les animaux recevront un traitement chimique en vue de favoriser le développement de tumeurs pulmonaires. Ce traitement (non douloureux) sera administré directement dans l’abdomen des animaux, à raison d’une fois par semaine pendant 10 semaines. Dans une seconde expérience, les animaux recevront un traitement chimique en eau de boisson pour induire le développement de tumeurs vésicale. Les animaux seront exposés à ce traitement pendant 4 à14 semaines.

Impact sur les animaux

Une légère douleur de courte durée est attendue lors des biopsies auriculaires nécessaire au génotypage des animaux. Les produits administrés aux animaux ne sont pas irritants. Ils sont administrés dans l’eau de boisson ou par injection intrapéritonéale (douleur légère et de courte durée). Les dommages causés par le développement des tumeurs pulmonaires sont à long terme une perte de poids importante et dans les cas extrêmes non étudiés ici une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces et un suivi régulier des animaux permet de ne pas atteindre ces stades avancés et de limiter la survenue de douleur. Suite au développement des tumeurs de vessie, les animaux pourront présenter une occlusion vésicale potentielle engendrée par une tumeur trop volumineuse (>7mm de diamètre). Cette occlusion peut provoquer une rétention d’urine et des douleurs associées. Une palpation régulière des animaux permet d’éviter ce stade terminal et de limiter la survenue de douleur. Aucune métastase n’a été observée dans ce modèle.

Devenir

Mise à mort des animaux d’élevages de génotypes non pertinents Mise à mort des souris pour analyse des tumeurs post mortem

Remplacement

Le rationnel de ce projet a été établi sur des prélèvements de tumeurs humaines étudiés par immunohistochimie. Des essais de culture sous forme d’organoïdes en 3 dimensions sont en cours mais ne nous permettent pas pour l’instant de reproduire les observations réalisées ex vivo chez l’homme. Seuls des modèles de souris transgéniques possédant un marquage des populations de fibroblastes d’intérêt et porteurs de tumeurs pulmonaires et de vessie peuvent nous permettre d’initier cette recherche fondamentale. L’identification des fibroblastes impliqués dans l’initiation et la progression tumorale pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les données de la littérature décrivant les 2 modèles chimioinduits et nécessite au minimum 10 souris/temps d’analyse afin d’obtenir suffisamment de matériel tumoral. Les souris mâles et femelles transgéniques seront inclus afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits en élevage. Aucune différence liée au sexe n’est attendue ici . Les souris non pertinentes d’une même portée seront utilisées en contrôles. Aucun test statistique ne sera envisagé dans cette étude car il s’agit d’une étude qualitative de suivi des fibroblastes par un marqueur sur des coupes d’histologie de tumeurs pulmonaires et de tri de la population tracée. En revanche le faible nombre de tumeurs par souris nous impose d’utiliser un nombre suffisant d‘animaux afin d’avoir le matériel pour conclure.

Raffinement

Les animaux transgéniques utilisés dans cette étude possèdent des fibroblastes marqués par une molécule fluorescente et présentent un état physiologique normal L’exposition au carcinogène chimique n’induit pas de douleur par lui-même, ni de perte de de l’appétit ou de poids. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et l’absence de douleur due au développement des tumeurs. Un suivi régulier des animaux et une définition de points limites précoces permettent de limiter au maximum la souffrance engendrée par le développement des tumeurs. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte d’un point-limite

Choix des espèces

Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser une population de fibroblastes d’intérêt similaires à ceux trouvés chez l’Homme. L’induction de tumeurs (poumon ou vessie) par un carcinogène chimique dans de telles souris transgéniques permet de tracer in vivo le devenir de ces fibroblastes lors de la tumorigenèse et leur implication potentielle dans l’initiation et la progression tumorale. Les carcinogènes utilisés sont identiques à ceux présents dans le tabac et reproduisent des cancers de même type que ceux induits chez l’homme par l’exposition au tabac. De plus, les modèles murins permettent d’utiliser de nombreux outils disponibles (anticorps, cytokines) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Les souris seront génotypées à 3 ou 4 semaines (prélèvement auriculaire) Des souris adultes agées de 8 à 32 semaines seront utilisées en procédures. Cet âge adulte permet d’avoir un système immunitaire fonctionnel.

13 366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 108 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations liées à la dystonie et à la maladie de Parkinson, elles reçoivent jusqu'à trente injections dans le péritoine, des chirurgies du cerveau, neuf prélèvements sanguins et des tests de récompense qui imposent isolement et restriction alimentaire pendant plusieurs semaines. Le porteur indique qu'un tiers des souris d'une lignée cessent de grandir et sont alors tuées. Il affirme que ce réseau neuronal ne peut pas être reproduit in vitro et renvoie au long terme les retombées pour des maladies rares.

Objectifs

L’objectif général de ce projet est de déterminer les conséquences de mutations de gènes impliqués dans des dystonies et dans la maladie de Parkinson sur les circuits moteurs, les circuits de la récompense, l’addiction et de la dépression, ainsi que les anomalies moléculaires dans une zone spécifique du cerveau chez des souris mutantes, modèles de troubles du tonus musculaires (contractions musculaires involontaires par exemple). Puisque les protéines perturbées peuvent être exprimées dans d’autres organes que le cerveau, les altérations métaboliques due à ces mutations seront aussi étudiées. Nous étudierons également les anomalies moléculaires des souris mutées.

Bénéfices attendus

Bénéfices tant scientifiques que thérapeutiques. Mise en évidence des anomalies potentiellement similaires à celles observées chez les patients et essai d'un traitement potentiel de ces anomalies. Ces découvertes bénéficieront à la caractérisation et compréhension des anomalies moléculaires expliquant les symptômes observés chez les patients et permettront de découvrir de nouveaux traitements et d'améliorer la prise en charge des patients qui souffrent d'une maladie rare et orpheline donc nécessitant un effort de recherche pour les soutenir.

Procédures

Prélèvement d'extrémité de queue pour génotypage (durée de quelques secondes). Les animaux ayant un phénotype dommageable (1/3 des animaux au sein d'une seule des lignées participantes) arrêtant leur croissance seront euthanasiés avec appui du personnel en charge du Bien Etre Animal pour la décision. Les injections intrapéritonéales (max30 au total par animal réparties sur une plusieurs semaines - quelques seconde/injection) ainsi que le nouvel environnement dans les appareils expérimentaux pourraient potentiellement introduire un stress chez certains animaux et une fatigue liée aux tâches d'apprentissage sans jamais atteindre l’épuisement mais qui entraînerait un arrêt de la participation à la tâche par l'animal. Les souris qui participeront à un test de récompense seront isolées pour la restriction alimentaire pendant une semaine avant de commencer le protocole de réponse aux récompenses pendant 3 semaines, effectué dans une cage équipée de distributeurs de récompense. Les souris participant au test de préférence à l’eau sucrée seront isolées pendant 4 à 6 semaines, placées dans des cages de plus grande taille avec 2 biberons. Les souris chez qui les paramètres métaboliques seront mesurés auront 9 prélèvements sanguins, sous anesthésies locale, répartis sur 3 jours différents espacés d’une semaine, sur des periodes de 2h lors des jours de prélèvement. Une unique procédure chirurgicale est prévue pour certains des animaux : l’opération chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, durera 30 min environ pour une micro-injection dans une structure cérébrale. En fin de période de maintien, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Le phénotype dommageable observé chez certaines souris (1/3 des animaux au sein d'une seule des lignées participantes) provoquera une perte de poids et un arrêt de croissance. Les animaux seront euthanasiés dès l’observation d’absence de croissance. L'identification génétique (génotypage) des animaux réalisée par prélèvement de quelques millimètres d'extrémité de la queue est susceptible de générer une douleur et un stress de courte durée. Les injections intrapéritonéales, les prélèvements sanguins répétés et l'injection du traitement et le test comportemental répété à plusieurs reprises peuvent également générer du stress et une douleur légère et de courte durée. L’isolement et la restriction alimentaire nécessaires pour certaines tâches comportementales pourrait introduire un stress et une perte de poids limitée. Les injections neurochirurgicales pourraient potentiellement introduire un stress ainsi que de la douleur chez certains animaux dans les heures ou les jours suivants après la chirurgie.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour permettre les analyses scientifiques biologiques par prélèvements de tissus

Remplacement

Notre projet propose de disséquer les mécanismes et les conséquences du rôle de mutations dans des gènes impliqués dans des maladies comme la dystonie et le Parkinson, dans l'apparition de troubles de l’apprentissage par récompense et de troubles du métabolisme, mettant en jeu différents réseaux neuronaux et métaboliques, ainsi que les voies de signalisation moléculaires chez les souris porteuses de ces mutations. Le fonctionnement de ce réseau ne peut, à ce jour, pas être reproduit ni modélisé par des modèles in vitro ou computationnels. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu'à l'aide d'études comportementales au niveau de l'animal. Une fois les acteurs moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures lorsque cela est possible pour limiter le nombre d'animaux utilisés. D'une façon générale, nous nous efforçons continuellement d'évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués est de maximum 13366 pour l'ensemble des procédures. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats

Raffinement

Concernant le raffinement, pour toute cette étude, les conditions d'hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur et d'inconfort possible. Pendant les procédures, les animaux seront observés et manipulés quotidiennement et une pesée sera effectuée régulièreement. Lorsque cela est possible, les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5 animaux, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne nocturne de 12h. L'eau, la nourriture seront fournies ad libitum sauf en cas de procédure avec restriction alimentaire, un carré de coton pour nidifier ainsi qu’un bâtonnet à ronger sont placés dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Si besoin, lors d’un petit effectif ou de tension dans le groupe un complet d’enrichissement peut être apporté par des maisonnettes ou des lanières de kraft. Ils feront l'objet d'un contrôle quotidien. L'évaluation de la douleur et de la détresse est réalisée en observant l'aspect des souris et leur comportement. Des points limites sont définis spécifiquement aux procédures et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Le cas échéant, des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux (injection d'antalgiques) si trouble mineur ou passager, ou bien euthanasie règlementaire. Les mutations dans les lignées transgéniques envisagées ne sont pas dommageables pour l’état de santé de l'animal. Lors des chirurgies : mise en place de diverses mesures préventives des complications.

Choix des espèces

Dans nos études, les souris sont utilisées afin de tirer profit des techniques de transgénèse (souris transgéniques). La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies du mouvement proche de celle de l'homme. Il existe de nombreux tests comportementaux nécessaires pour cette étude qui sont développés chez la souris. La souris est un modèle reconnu d'étude du mouvement, notamment car elles ont des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés et sont déjà utilisées dans des modèles de mouvements anormaux hyperkinétiques, particulièrement pertinents dans l'étude de la pathologie étudiée ici. La souris est aussi très utilisée dans les études de récompense, l’addiction, et l’anxiété. Les protocoles concernant ces aspects sont bien définis et les mécanismes sont également clarifiés. Concernant l’étude de métabolisme, la souris partage beaucoup de similarités physiologiques avec l’humain qui fait que la souris est un très bon modèle pour effectuer des études in vivo et ex vivo concernant la mesure d’insuline, concentration de glucose etc. la zone du cerveau de la souris qui nous intéresse (le striatum) murin, comporte également une organisation anatomo-fonctionnelle proche de celles des primates non humains et des humains, en faisant ainsi un modèle particulièrement utile à l'étude d'une maladie de cette zone , telle que les mouvements anormaux étudiés ici. Expériences chez des animaux adultes. Cette partie du projet s'intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des mouvements anormaux liés aux dystonie et à la maladie de parkinson, exprimés dans un organisme mature, à l'âge adulte, en prenant en compte la variabilité individuelle et le sexe. Afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux, nous utiliserons donc uniquement des animaux adultes.

1 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée pour prélèvement, les autres redirigées vers d'autres projets ou l'élevage. Les mâles subissent une vasectomie, les femelles une superovulation par injections d'hormones puis une chirurgie de réimplantation d'embryons, pour débarrasser des lignées transgéniques de pathogènes et fournir aux équipes des souris au statut sanitaire conforme. Le porteur signale des pertes de sang, des douleurs post-opératoires et un risque d'arrêt cardio-respiratoire lié à l'anesthésie. Ce projet ne produit aucune connaissance en propre, il entretient et assainit un élevage destiné à d'autres expériences.

Objectifs

L'objectif du projet sera de garantir le statut sanitaire de la plateforme animalerie rongeurs. Ceci signifie que nous devons rendre les lignées dépourvues de pathogènes spécifiques car cela pourrait altérer la fiabilité et la reproductibilité des expériences des equipes de recherche.

Bénéfices attendus

Nous pourrons maintenir un elevage de la lignée avec un statut sanitaire conforme à notre plateforme. Les equipes de recherche de notre Institut doivent travailler sur des modèles exempt de pathogènes spécifiques afin que cela n'altère pas leurs projets. Cela evite aux equipes de recherche d'effectuer cette intervention chez un prestataire extèrieurs ce qui induirait un cout supplémentaire et un transport en plus pour les animaux.

Procédures

Une vasectomie sous anesthésie et analgésie (procédure chirurgicale de 10 minutes). Deux injections intra-péritonéales d’hormones sur animal vigile (procédure de 20 secondes à 46h d’intervalle). Cet acte pouvant être renouvelé 3 fois espacé de 15 jours au maximum. Une chirurgie de réimplantation d’embryon sous anesthésie et analgésie (procédure chirurgicale de 20 minutes). . Les animaux seront euthanasiés à la fin de la période de maintien par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

D'une manière générale, la vasectomie et la réimplantation d'embryons sont des chirurgies sans complication. Il peut cependant avoir quelques effets indésirables: perte de sang importante, cicatrisation difficile, douleur post opératoire. Les animaux sont anesthésiés, il y a donc certains risques difficultés d'endormissement, hypoxie, pouvant aller jusqu’à un arrêt cardio-respiratoire). Concernant la superovulation, il y a le stress lié à la contention et la douleur de courte durée liée aux injections d'hormones.

Devenir

Concerant la Vasectomie les animaux seront euthanasiés lorsque nous observerons une baisse de la fertilité (environ 1 an). Concernant la procédure sur les injections hormonales, une partie des animaux sera euthanasié car un prélévement est nécessaire, l'autre partie pourra être réutilisé pour d'autres projets. Concerant la procédure sur la réimplantation d'embryons, aprés le sevrage des animaux, les femelles seront euthanasiées.

Remplacement

Cette technique offre les meilleurs résultats en nombre d'animaux obtenus ainsi que dans la prise de risque sanitaire. Il s’agit de pouvoir mettre à disposition de la communauté scientifique de notre Institut des animaux conformes aux standards de recherche. Les projets qui en découlent seront eux même justifiés dans le cadre d’un projet. Le projet sera réalisé uniquement si aucune lignée avec statut sanitaire conforme n'est disponible, dans ce cas là aucun remplacement n'est possible.

Réduction

La redérivation se fait principalement avec les mâles d'interêt avec lesquels nous accouplons des femelles. Si les femelles ne présentent pas de bouchon vaginal elles seront reutilisées, les mâles sont reutilisés jusqu'au succés de la manipulation, puis redirigés vers d'autres projets. Le nombre totale d'animaux sur la totalité du projet dépendra des demandes d'importation des équipes de recherche. Pour chaque redérivation, nous demandons 3 mâles de la lignée, nous super-ovulons 6 femelles pour les accouplements (selon les projets précédents le minimum requis pour avoir un nombre de femelles avec bouchons vaginaux suffisant) et 15 femelles pour accouplements avec des mâles vasectomisés pour obtention des femelles pseudo-gestantes, sachant que les femelles sans bouchons vaginaux sont utilisées pour d'autre projet de redérivation ou pour des accouplements d'elevage. Le nombre totale d'animaux impliqués est de 1140.

Raffinement

Les animaux ont une pèriode d'acclimation d'une semaine et leur milieux de vie est contrôlé. Lors de la chirurgie, les femelles et les mâles recoivent une anesthésie et une analgésie adéquates pour eviter la douleur. La température sera contrôlée tout au long de la chirurgie. Toutes les cages sont enrichies avec du Kraft et un dôme est mis dans les cages des femelles et des mâles aprés chirurgie, de l'alimentet gelée sont disposées dans la cage. Les animaux sont manipulés par du personnel compétent pour diminuer le stress. Il seront attentifs par une surveillance journalière aux points limites: perte de sang, poils hérissés, animal prostré.

Choix des espèces

La souris est actuellement le modèle génétique de choix pour les expérimentations de notre Institut. La pertinence de ce modèle est justifié par chaque projet en fonction de leur domaine d'expertise. Chaque lignée transgénique que nous aurons décontaminé fera parti d'un projet scientifique d'une équipe de recherche. Les femelles donneuses auront entre 6 et 16 semaines, de manière à garantir une reponse hormonale optimale. Les femelles receveuses auront entre 8 et 26 semaines. Nous avons besoin de femelles matures pour la reimplantation, mais au dela de 6 mois les femelles commencent à avoir une matière grasse importante, ce qui rend la chirurgie plus complexe. Les mâles vasectomisés auront entre 3 et 18 mois, nous avons besoin d'animaux sexuellement mature, aprés 18 mois le taux de bouchon vaginal positif diminue.

78 souris femelles gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections, parfois par chirurgie de la veine jugulaire, six séances d'imagerie sous anesthésie et une ponction cardiaque terminale, pour suivre la distribution de liposomes destinés à traiter des femmes enceintes. Le porteur indique que les procédures peuvent provoquer des avortements spontanés, et que les fœtus sont tués par décapitation pour analyse. Le recours à un "organisme entier" est présenté comme nécessaire pour étudier la mère et les fœtus.

Objectifs

Le développement de médicaments lors de la grossesse est complexe, car il faut à la fois éviter le passage des médicaments du côté du bébé et les concentrer au niveau du placenta pour limiter les effets secondaires chez la mère. Ainsi ce projet s’articule autour du développement de médicaments de tailles nanométriques, qui sont fabriqués pour aller spécifiquement dans le placenta.

Bénéfices attendus

Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques disponibles pour la femme enceinte.

Procédures

Tous les animaux vont être soumis à des interventions suivantes : une seule injection dans la veine de la queue (30 secondes), la souris étant maintenue dans une cage de contention sur une durée totale de 3 minutes, ou injection dans la veine jugulaire qui nécessite une chirurgie (durée 30min), 6 séances d’imageries sous anesthésie générale d'une durée totale de 10 minutes au maximum par séance, une anesthésie profonde avant de procéder au prélèvement sanguin sur les animaux endormis par ponction cardiaque (geste d’une durée d’une minute environ). Les animaux seront ensuite mis à mort dans la même anesthésie. La durée de l'anesthésie et du prélèvement sanguin est d'environ 3-4 minutes par animal. Les embryons seront mis à mort par décaptitation pour l'analyse de ceux-ci.

Impact sur les animaux

La pose de cathéter au niveau de la veine jugulaire nécessite une chirurgie sous anesthésie. Ce projet utilise des femelles gestantes, les procédures pourraient induire des avortements spontanés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour collecter des tissus qui seront analysés pour déterminer la distribution et la toxicité éventuelle des molécules utilisées sur ceux-ci. Les foetus sont euthanasiés pour évaluer la toxicité des molécules utilisées et s’il y a présence de ces molécules dans les tissus fœtaux ou non pour évaluer un potentiel passage des molécules à travers du placenta.

Remplacement

Nous avons préalablement évalué plusieurs formulations par des expériences réalisées en laboratoire pour ne tester chez l’animal, que les formulations optimales. Il nous est nécessaire de disposer d’un organisme entier, car nous souhaitons étudier les effets de l’administration de nos molécules lors la grossesse sur la mère et les bébés. Nous ne disposons pas de méthode alternative permettant de répondre à ces questions.

Réduction

Ce projet a été mis en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Nous utiliserons des tests statistiques afin de définir le nombre minimum d'animaux à étudier pour mettre en évidence les effets de l’administration de nos molécules lors la grossesse. Ainsi, pour l’étude pilote 3 femelles non gestantes par condition seront utilisées. Nous utilisons une technique d’imagerie optique, non invasive, pour évaluer le profil de distribution en fonction du temps. Cela permet de faire plusieurs mesures sur un même animal et donc in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés. En effet, il ne sera plus nécessaire d'euthanasier l’animal pour localiser les molécules fluorescentes puisque leur localisation peut être évaluée en fonction du temps, grâce à l’utilisation de l’imagerie. Pour la deuxième partie des groupes de 15 souris gestantes par conditions seront suffisants.

Raffinement

Les animaux seront placés dans les conditions optimales d’hébergement et auront accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. La souris est placée sur un tapis thermostaté pendant l’imagerie. De plus, elle sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post examen d’imagerie. Des points limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis, surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînerait l'euthanasie anticipée de l'animal.

Choix des espèces

Nous souhaitons évaluer, la distribution des molécules de tailles nanométriques, dans les différents tissus de l'organisme, après injection. La souris est le modèle le plus approprié de par sa physiologie proche de l’homme ainsi que la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Nous analyserons des souris femelles adultes âgés de 10 semaines au moment de l’injection. Les souris femelles gestantes seront en deuxième semaine de gestation. Cette chronologie de gestation est choisie, car c’est le moment où le placenta est le mieux développé et c’est un moment encore assez éloigné pour ne pas risquer un accouchement prématuré.