Procédures légères
Utilisation d’animaux dans le cadre de la formation et du perfectionnement des expérimentateurs aux gestes techniques et aux techniques chirurgicales chez les rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 500
Former le personnel de l'établissement aux gestes techniques, y compris pour répondre aux demandes de clients, justifie l'utilisation de 500 souris et 500 rats, tous tués à l'issue. 200 d'entre eux sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les autres relevant de procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à trois gestes différents par semaine pendant quatre semaines consécutives, injections, prélèvements de sang, d'urine ou de liquide synovial, ou chirurgie avec réveil. Le remplacement "ne peut pas être assuré" et le recours à des animaux vivants est "nécessaire et indispensable", écrit le porteur, qui précise par ailleurs que les sutures s'apprennent sur peau artificielle et les chirurgies sur cadavres décongelés.
Objectifs
Les recherches menées au sein de notre laboratoire, ainsi que les demandes faites par les clients vont nous amener à former notre personnel sur des techniques d’expérimentation animale. L’objectif du projet est d’avoir du personnel formé mais également que chaque expérimentateur conserve son niveau technique tout au long de l’année. Quel que soit le geste, une injection ou une technique de chirurgie invasive, la formation et l’entraînement des expérimentateurs est très importante. En effet, un expérimentateur formé et entraîné sera confiant, moins stressé, ce qui limitera/induira moins de stress chez les animaux et permettra par ailleurs une meilleure homogénéité des gestes et techniques ainsi qu’une meilleure reproductivité. Les animaux utilisés seront des rats et des souris âgés de 0 à 2 ans mâles ou femelles. Tous ces critères seront choisis en fonction du geste technique à effectuer et du protocole pour lequel l’entraînement ou la formation sera attribué. Cette saisine comprend 3 procédures : Procédure 1 : Formation en expérimentation animale avec une sévérité de classe légère. Cette procédure concernera essentiellement les formations et entraînements qui n’auront pas ou peu d’impact sur le bien-être des animaux. A titre d’exemple, les gestes techniques pourront être des administrations de solvant, des prélèvements de sang, d’urine, de liquide synovial. Procédure 2 (sans réveil) et Procédure 3 (avec réveil) : Formation en expérimentation animale avec une sévérité de classe modérée. Cette procédure concernera toutes les formations et entraînement qui auront au maximum un impact modéré et surtout réversible sur les animaux. A titre d’exemple, cette procédure sera utilisée pour les formations et entrainement aux chirurgies pour lesquelles une douleur post-opératoire transitoire sera présente.
Bénéfices attendus
Ce projet, prévue sur 5 ans, permettra de former les expérimentateurs, de les entraîner et de maintenir et développer leurs compétences/niveau d’expertise sur nos techniques d’expérimentations animales. Ces formations permettent aux expérimentateurs d’acquérir des gestes techniques parfaitement maîtrisés. Ceux-ci visent à limiter au maximum l’inconfort et l’anxiété de l’animal pendant l’expérimentation. De plus, la qualité des résultats expérimentaux obtenus dans les études sera améliorée par la maîtrise de ces gestes et permettra de ne pas réaliser ces expérimentations sur un plus grand nombre d’animaux que nécessaire (réduction du nombre d’animaux utilisés).
Procédures
Selon la procédure à laquelle est affecté l'animal, les interventions pourront être : - des administrations de solvant sur animal vigile ou anesthésié (Procédure 1), 2 fois maximum par semaine, - des prélèvements de sang, d'urine ou de liquide synovial sur animal vigile ou anesthésié (Procédure 1), 1 fois maximum par semaine et dans le respect des volumes maximum recommandés, - un geste chirurgical sans réveil (Procédure 2) ou avec réveil (Procédure 3) sur animal anesthésié et avec une prise en charge de la douleur et un suivi post-opératoire adaptés à la chirurgie pratiquée.
Impact sur les animaux
Les gestes ou actions expérimentales effectuées par une personne peu expérimentée peuvent générer du stress, un inconfort ou une douleur locale. Des effets indésirables attendus liées au geste chirurgical, seront suivis avec rigueur. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux pour estimer une éventuelle gêne ou douleur occasionnée par l’acte chirurgical, tel qu’un traumatisme et une inflammation au niveau de la zone opérée. Aucun signe clinique n’est attendu suite à l’administration de solvant ou le prélèvement de sang sauf un petit hématome au point d’injection ou de prélèvement qui ne doit pas persister sur du long terme.
Devenir
Les mêmes animaux utilisés pour la formation de l’administration peuvent être également utilisés pour les formations de prélèvement. Un maximum de 3 gestes (différents) par semaine, par animal et sur un maximum de 4 semaines consécutives ne sera pas dépassé. Dans la mesure de possible, les animaux sont utilisés pour collecter des organes ou du plasma à la fin de l’ensemble des procédures. A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement mis à mort et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires pourront être utilisés pour doser un marqueur en lien avec le modèle/la chirurgie. Une analyse macroscopique des organes sera réalisée et différents tissus et organes pourront être prélevés en vue de réaliser des analyses histologiques, des analyses par imagerie micro-CT, et/ou des analyses moléculaires.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré car nous avons besoin des animaux vivants pour pouvoir les manipuler et réaliser le geste (chirurgical ou non), faire un suivi post-opératoire et anticiper toute réaction de l’animal lors de nos protocoles par la suite. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. L'utilisation de modèles animaux vivants est donc nécessaire et indispensable.
Réduction
Pour la mise en place de la Procédure 2 (sans réveil) et de la Procédure 3 (avec réveil), le personnel s’entraîne au préalable sur du cadavre animal décongelé ou sur de la peau artificielle (sutures). Le nombre d’animaux est choisi en tenant compte du nombre nécessaire et suffisant pour avoir du personnel formé, compétent et sûr de lui. Le nombre d’animaux vivants est réduit au maximum (en effet tout ce qui peut être réalisé sur cadavre ou sur peau artificielle (comme les sutures) est mis en œuvre) afin d’avoir des expérimentateurs suffisamment entraînés et en maîtrise des gestes techniques (chirurgies, administrations et prélèvements), permettant la mise en place de gestes standardisés et reproductibles dans les études, permettant d’éviter tout éventuel risque de surmortalité pendant les phases d’anesthésie, de chirurgie et d’administration.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat et induisant le minimum de stress. Des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents gestes pour éviter toute souffrance inutile et prolongée seront mises en place. Les conditions d’hébergement seront optimisées : les animaux seront hébergés en groupe (au maximum 4 rats ou au maximum 5 souris par cage avec de la litière en chips spécifique) avec un enrichissement du milieu (tunnel en PVC transparents rouge, carré de cellulose, bâton de bois ou billes de bois, kraft), un accès facilité à la nourriture (quand nécessaire) et/ou ajout de nourriture appétente, et seront surveillés bi-quotidiennement les jours ouvrés et quotidiennement les week-end et jours fériés. Les formations seront données par du personnel expert afin d’assurer au mieux les contentions, les manipulations et les gestes techniques afin d’éviter tout stress et limiter toute souffrance pour l’animal. Par ailleurs, l’acquisition des gestes chirurgicaux sera en priorité acquis initialement sur des cadavres d’animaux décongelés et maîtrisés sur des animaux anesthésiés sans réveil avant une validation finale sur des animaux avec réveil et suivi post-opératoire. Pour tous nos protocoles, y compris les animaux de formation, une grille de points limites est mise en place. La mise en place d’un traitement analgésique et/ou anti-inflammatoire préventif et/ou curatif seront également mis en place en fonction du type d’entraînement. Les animaux seront maintenus le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur. Un suivi sera mis en place afin d’avoir l’historique des gestes effectués sur chaque animal tout au long de sa vie dans notre animalerie. Cela nous permettra de nous assurer qu’un temps de récupération nécessaire a été respecté entre deux gestes effectués sur un même animal (respect du délai entre deux prélèvements de sang, entre deux administrations…).
Choix des espèces
Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque type d’entraînement sur des animaux âgés de 0 à 2 ans. Les besoins de formation et d’entraînement au sein de notre établissement sont sur les espèces de rat et de souris.
Etude des causes génétiques des maladies affectant le cerveau et le muscle dans des modèles de souris transgéniques (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour porter des mutations trouvées chez des enfants atteints à la fois de maladies du cerveau et de faiblesse musculaire, 768 souris vont être utilisées, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un morceau d'oreille leur est prélevé vers 7 à 10 jours de vie pour le génotypage, puis cinq tests de motricité leur sont appliqués entre une et trois semaines d'âge. Un sous-groupe reçoit une injection destinée à déclencher des crises d'épilepsie, avec vingt minutes d'observation ensuite. Toutes sont tuées pour prélever cerveau et muscles, la comparaison de ces deux organes étant l'objet même du projet.
Objectifs
Les maladies du cerveau représentent un enjeu majeur de santé publique. Malgré les progrès récents de la génétique, près d’un patient sur deux ne bénéficie toujours pas d’un diagnostic génétique précis. Cette situation est souvent liée au fait que les gènes impliqués sont encore mal compris, ce qui entraîne des délais prolongés avant que les enfants concernés puissent recevoir un diagnostic. Ces maladies sont très diverses sur le plan génétique. A ce jour, plus de 2 000 gènes sont impliqués dans les maladies du cerveau. De plus, les atteintes du cerveau sont fréquemment associées à des problèmes musculaires, tels que des difficultés de mouvement, de coordination ou une faiblesse musculaire. Ce lien suggère que certains gènes jouent un rôle commun dans le fonctionnement du cerveau et des muscles. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre le rôle de plusieurs gènes récemment identifiés chez des patients présentant à la fois des maladies du cerveau et des atteintes musculaires. Ces gènes ont été choisis car ils sont systématiquement associés à ces deux types de symptômes, ce qui en fait des gènes candidats particulièrement pertinents pour étudier les liens entre cerveau et muscle. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées afin d’analyser le développement moteur, les capacités de mouvement et certaines fonctions cognitives, comme la mémoire, à différents stades de la vie. L’étude portera à la fois sur des stades précoces du développement et sur l’âge adulte, afin d’identifier le moment où apparaissent les anomalies et leur évolution dans le temps. Ce projet qui sera realisé sur deux établissements (EU 1/2 et EU 2/2), vise à améliorer la compréhension des maladies touchant à la fois le cerveau et les muscles chez les patients, souvent des enfants, afin de contribuer au développement futur de meilleures stratégies diagnostiques et, à terme, thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Dans de nombreuses maladies du cerveau, les premiers signes apparaissent d’abord au niveau des muscles, peu de temps après la naissance et avant l’apparition des atteintes cognitives. Ainsi, étudier précocement le développement moteur permettrait de détecter très tôt les signes cliniques qui sont parfois invisibles à l’âge adulte, soit parce qu’elles sont corrigées par l’organisme, soit parce qu’elles s’aggravent avec le temps. Ce projet va permettre d’identifier précisément quand apparaissent les premiers signes de la maladie, d’améliorer la compréhension de son évolution et de disposer d’indicateurs précoces utiles pour mieux orienter le diagnostic et la prise en charge des patients, tout en évitant des méthodes plus invasives.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à des interventions sans chirurgie qui sont basées sur l’observation de leur comportement et de leurs capacités de mouvement. Dans un premier temps, un très petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille de chaque souris afin de caractériser leurs gènes. Ce geste est réalisé une seule fois et dure quelques secondes. Chez les jeunes souris, des observations seront réalisées pour suivre le développement des mouvements, comme la capacité à se déplacer, à se retourner ou à utiliser leurs pattes. Ces tests sont courts et durent moins d’une minute. Le nombre total de tests effectués au stade précoce (entre 1 et 3 semaines d’âge) dans l’EU 1/2 est de cinq, pour une durée totale maximale d’environ cinq minutes, les tests étant réalisés successivement. À l’âge adulte, les mêmes souris participeront à différents tests permettant d’évaluer leur comportement, leur mémoire et leurs capacités physiques. Ces tests consistent principalement à observer leurs déplacements, l’exploration d’un environnement ou la force musculaire. Chaque test dure quelques minutes et les animaux bénéficient de périodes de repos entre les séances. Le nombre total de tests effectués à l’âge adulte dans l’EU 2/2 est de treize. Ils seront répartis sur une période de 10 semaines avec des périodes de repos de 3 à 7 jours entre les tests. Les animaux auront alors entre 10 et 19 semaines d’âge. Pour un nombre limité de souris adultes (un sous-groupe), un test spécifique permettra d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie à l’aide d’une injection unique. Les animaux seront ensuite surveillés en continu pendant 20 minutes après l’injection. Cette étape est importante car, dans de nombreux cas, les crises d’épilepsie représentent un symptôme majeur qui aggrave fortement la maladie et la qualité de vie des patients. Étudier ces crises chez la souris permet donc de mieux comprendre leur origine et leur lien avec les autres symptômes observés. À la fin du projet, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement et l’analyse de certains organes, dont le cerveau et les muscles. Ces analyses sont indispensables pour mieux comprendre les maladies qui touchent à la fois le cerveau et les muscles chez les enfants malades.
Impact sur les animaux
À l’âge d’environ une semaine, un petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille des souris afin d’analyser leurs gènes. Ce geste peut provoquer une douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un léger stress lié à la manipulation. Le risque de saignement est très faible. Tout au long du projet, chez les souris jeunes et adultes, différents tests seront réalisés pour observer leurs mouvements et leur comportement. Ces manipulations peuvent entraîner un stress temporaire, notamment lors de la prise en main ou de l’exposition à un nouvel environnement. Les tests sont courts, espacés dans le temps et les animaux sont habitués au matériel et à la salle d’expérimentation afin de limiter ces effets. Lors de certains tests, notamment ceux réalisés dans l’eau, les souris peuvent ressentir un inconfort passager lié au contact avec l’eau. Ces effets sont limités par une durée d’exposition courte de quelques minutes, une température de l’eau contrôlée, une surveillance continue et un séchage immédiat après chaque session. Pour un nombre limité de souris adultes, un test permettant d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie sera réalisé à l’aide d’une injection unique. Cette injection peut entraîner une douleur légère et transitoire au point d’injection, ainsi que l’apparition temporaire de crises convulsives. Les animaux seront surveillés en continu pendant une période maximale de 20 minutes. Si des signes de détresse sévère apparaissent, le test sera immédiatement interrompu et l’animal pris en charge. Enfin, une lignée de souris particulière peut développer des tumeurs à partir de l’âge de 6 mois. Les animaux utilisés pour les tests seront mis à mort bien avant cet âge. Les animaux conservés en élevage seront également mis à mort avant l’âge limite de 6 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des muscles et du cerveau. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser des analyses anatomiques et moléculaires, permettant d’étudier les similitudes et les différences entre ces deux organes et de mieux comprendre les maladies associées.
Remplacement
Les maladies du cerveau font intervenir des mécanismes complexes qui touchent à la fois le cerveau, les muscles et le comportement. Ces interactions ne peuvent pas être étudiées à l’aide de modèles simplifiés, comme des cellules cultivées en laboratoire ou des simulations informatiques. Même si les études sur cellules permettent de mieux comprendre certains mécanismes biologiques de base, elles ne permettent pas d’observer comment les gènes influencent le développement du cerveau, les capacités de mouvement ou les comportements dans un organisme vivant. Or, ces aspects sont essentiels pour comprendre les maladies étudiées dans ce projet. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable. La souris est particulièrement adaptée, car son fonctionnement biologique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. De plus, il existe déjà un grand nombre de modèles de souris génétiquement modifiées, développés dans le cadre de collaborations internationales, ce qui permet d’étudier de manière ciblée le rôle de nombreux gènes impliqués dans ces maladies. Enfin, ces maladies étant rares et touchant souvent des enfants, il est très difficile de réaliser ce type d’études directement chez l’être humain. Le recours à la souris est donc nécessaire pour améliorer la compréhension de ces maladies et préparer le développement de futures approches diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats fiables, tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Les effectifs ont été déterminés à partir de données issues d’études précédentes et de méthodes statistiques, de manière à utiliser uniquement le nombre de souris strictement nécessaire. Afin de réduire le nombre total d’animaux, les mêmes souris sont suivies tout au long du projet, depuis les premières étapes du développement jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet de recueillir plusieurs types d’informations chez les mêmes animaux, évitant ainsi de multiplier les groupes expérimentaux. Ce suivi sur la durée permet également de mieux comprendre l’évolution des maladies étudiées, en observant comment les symptômes apparaissent et évoluent avec le temps. Chez la souris, l’âge adulte atteint en fin de projet correspond approximativement à un âge avancé chez l’humain, ce qui rend cette approche particulièrement pertinente pour étudier l’évolution des maladies du cerveau associées à des atteintes musculaires. Les analyses des résultats seront réalisées à l’aide de méthodes statistiques adaptées, ce qui permet d’obtenir des conclusions solides sans avoir recours à des animaux supplémentaires. Les souris témoins sont issues des mêmes portées que les souris génétiquement modifiées, afin de limiter la production d’animaux en excès. Au total, ce projet nécessitera un maximum de 768 souris, incluant des mâles et des femelles. Ce nombre correspond au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction.
Raffinement
Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et des expérimentateurs et au contact avant le début de chaque procédure. Un petit tunnel sera utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10jours après la naissance, à un âge où le système nerveux est pas encore complètement développé. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera limité à une seule fois. Il sera réalisé sur une courte distance de moins de 1 km dans des conditions adaptées, en conservant les cages d’origine, la litière et les élèments d’enrichissement habituel afin de maintenir un environnement familier. À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation suffisante avant toute nouvelle manipulation expérimentale. Chez les souris adultes, une phase d’habituation sera mise en place avant le début des tests afin de réduire l’anxiété liée à la nouveauté. Les animaux seront familiarisés avec les dispositifs utilisés et la présence des expérimentateurs. Les évaluations seront organisées de manière progressive, en commençant par les moins contraignantes, avec des périodes de repos suffisantes entre chaque étape pour permettre une récupération complète. Certaines évaluations pouvant entraîner un inconfort temporaire feront l’objet de mesures spécifiques. Lors des tests impliquant une exposition à l’eau, les conditions seront strictement contrôlées, la durée d’exposition sera limitée, et les animaux seront immédiatement séchés et maintenus au chaud après chaque session afin d’éviter toute gêne. Tout au long des manipulations, les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant des abris et des matériaux adaptés, afin de favoriser les comportements naturels et de limiter le stress. Les animaux seront surveillés régulièrement, avec un suivi du poids et de l’état général, afin de détecter précocement tout signe de mal-être, de souffrance ou de détérioration de leur état de santé. Des points limites adaptés permettront d’interrompre la participation d’un animal au projet si nécessaire. En cas de dégradation de l’état général ou de souffrance persistante, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Sur le plan anatomique, même si la surface du cerveau de la souris adulte présente moins de circonvolutions que celle de l’homme, la quasi-totalité des structures cérébrales est commune aux deux espèces. Sur le plan génétique, environ 90% des gènes sont conservés entre la souris et l’homme, ce qui rend les études génétiques particulièrement pertinentes dans ce modèle. Sur le plan comportemental, la souris présente un excellent compromis entre complexité comportementale et proximité phylogénétique, permettant la modélisation de pathologies associées à des comportements complexes tels que la reconnaissance sociale ou la reconnaissance d’objets. Et enfin, contrairement à certains autres modèles expérimentaux, la souris permet également d’étudier les différences liées au sexe, un paramètre particulièrement important dans les troubles du neurodéveloppement, qui présentent une prévalence plus élevée chez les garçons. Les souris seront utilisées à différents stades de développement.
Effet de la réduction de l’expression d’une protéine dérivée du cerveau sur l’hémostase et la thrombose chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Soumis à une chirurgie de 1 h 30 à 2 h sous anesthésie gazeuse pour provoquer un accident vasculaire cérébral, 426 rats passent deux tests comportementaux, une semaine avant l'opération et 48 heures après. Le projet en utilise 654 au total, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, 184 étant saignés sous anesthésie sans jamais se réveiller. Tous finissent par une perfusion intracardiaque, après jusqu'à dix injections, pour prélever sang, moelle osseuse et cerveau. Le RNT annonce que le modèle d'AVC peut provoquer douleur post-opératoire, perte des sensations et des mouvements, perte de poids et déshydratation, sans nommer les deux tests comportementaux qu'il impose.
Objectifs
Les accidents vasculaire cérébraux représentent un enjeu majeur de santé publique avec une incidence annuelle ≥ 140 000 cas en France. 85% de ces accidents sont dûs à la formation d’un caillot de sang dans le cerveau. Il s’agit d’une urgence diagnostique et thérapeutique : chaque retard de rétablissement d’un flux sanguin normal dans le cerveau de 30 min augmente de 20% le taux de mortalité. Comprendre les mécanismes de cette maladie permettra de développer de nouvelles approches diagnostiques et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à comprendre le rôle naissant d’une protéine spécifique dans la formation du caillot sanguin intracérébral. La réalisation de ce projet nous permettra potentiellement de développer de nouvelles stratégies diagnostiques, et/ou d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui seraient facilement transférables en clinique.
Procédures
Une partie des animaux (144 animaux) subiront un prélèvement sanguin sous analgésie et anesthésie générale gazeuse sans réveil. Une partie des animaux (426 animaux) subiront une procédure chirurgicale sous analgésie et anesthésie gazeuse et sera soumise à une série de 2 tests comportementaux, une semaine avant la chirurgie et 48h après la chirurgie. Une partie des animaux (40 animaux) subiront un test de saignement sous anesthésie et analgésie sans réveil. L’ensemble des animaux subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse profonde. Au maximum les animaux subiront 10 injections au cours des procédures.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront être soumis à un stress transitoire lors des manipulations. Les injections sous cutanée engendrent un stress et une douleur légère et de courte durée. L’induction de l’anesthésie pourra induire un stress léger. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse durant 1h30 à 2h. Les modèles d’accidents vasculaires cérébraux peuvent induire une douleur après la chirurgie, une perte des sensations et des mouvements, une perte de poids et une déshydratation. Les tests comportementaux peuvent induire un stress chez l’animal.
Devenir
Pour la procédure 1, les reproducteurs trop âgés sont mis à mort pour éviter le développement de tumeurs spontannées. La mise à mort des animaux des procédures 2 à 6 est nécessaire pour réaliser des analyses sur les différents prélèvements réalisés (sang total et cerveau).
Remplacement
Notre projet fait suite à des études in vitro dans l’équipe, rapportant des effets notoires de notre protéine d’intérêt sur la formation des caillots sanguins et leur dissolution. Notre objectif est maintenant de caractériser les effets de cette protéine dans la formation du caillot sanguin intracérébral et le saignement. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants. Nous ne pouvons pas utiliser de souris car elles ne possèdent pas notre protéine d’intérêt dans leur circulation sanguine. Le choix s’est alors porté sur le rat qui est un modèle largement utilisé pour ce type d’étude.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de rats utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude. De plus, nous envisageons un maximum de tests sur les prélèvements sanguins réalisés chez les rat(te)s sous anesthésie générale et analgésie appropriée. En plus du sang, la moelle osseuse et le cerveau seront prélevés afin de pouvoir répondre à de nombreuses questions scientifiques avec le nombre minimum d’animaux. Les calculs pour estimer le nombre de rats nécessaires dans les différentes expériences ont été réalisés à l’aide d’un logiciel dédié (G*Power).
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée aux expériences, les animaux recevront un traitement antalgique (buprénorphine) au moment des procédures de manière systématique jusqu’à leur mise à mort. Les procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse adaptée (isoflurane). Le bien-être animal avant et après toute procédure sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de papier kraft, bâtonnets de bois, tunnels. Les rats sont placés dans une pièce au calme. En post-chirurgie, une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil, un tapis chauffant thermostaté sera utilisé. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort si nécessaire.
Choix des espèces
La majorité des recherches portant sur le rôle de notre protéine d’intérêt dans le cerveau ont été réalisées chez des souris. Cependant, celles-ci n’ont pas cette protéine au niveau sanguin ce qui empêche leur utilisation dans nos manipulations. Les rats, en revanche, possèdent notre protéine d’intérêt dans leur circulation sanguine, comme les humains, ce qui en fait une espèce appropriée pour notre étude. Les rats génétiquement modifiés pour ne pas exprimer cette protéine, ne peuvent pas survivre. Par contre, ceux exprimant partiellement cette protéine, vivent aussi longtemps que les rats sauvages, avec une quantité de protéine d’intérêt réduite de moitié dans leur circulation sanguine. Ce modèle de rat génétiquement modifié permettra donc d’étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans la propension à développer des caillots sanguins, notamment intracérébraux, et à saigner. Cette pathologie étant essentiellent une pathologie de l’âge adulte, nous utiliserons des animaux adultes agés de 12 à 16 semaines.
MicroTRF: Effets d’une alimentation diurne chez un primate omnivore nocturne
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
24 des 80 microcèbes seront tués pour prélever leur cerveau et y chercher des traces de formation de nouvelles cellules nerveuses, les 56 autres retournant dans la population captive où ils pourront être réaffectés à d'autres projets, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Pendant cinq mois ils reçoivent des régimes alimentaires différents, dont un régime enrichi en graisses servi pendant leur phase de repos diurne, avec prélèvements sanguins toutes les deux semaines, mesures du métabolisme, de la composition corporelle et tests cognitifs. Cinq jours de calorimétrie en cage individuelle interrompent l'hébergement en groupe, les seuls contacts restants étant vocaux et visuels. Le porteur retient cette espèce pour sa proximité phylogénétique avec l'être humain et pour sa flexibilité métabolique, un microcèbe pouvant varier de 10 % de son poids en une semaine sans que cela soit considéré comme pathologique.
Objectifs
Les mammifères présentent un rythme circadien de 24 heures, permettant de synchroniser les fonctions biologiques aux variations environnementales, notamment l’alternance jour/nuit. Cette synchronisation repose sur l’interaction entre l’horloge centrale et les horloges périphériques, et est principalement régulée par la lumière. La régulation du métabolisme est fortement dépendante de cette coordination pour maintenir l’homéostasie énergétique. Cependant, la pollution lumineuse et/ou des rythmes alimentaires irréguliers peuvent perturber cette synchronisation, induisant un désalignement entre horloges centrale et périphériques. La lumière artificielle nocturne inhibe la sécrétion de mélatonine, perturbant le rythme veille/sommeil et les horloges métaboliques (foie, muscles). Ces désynchronisations augmentent le risque de troubles métaboliques, surtout lorsqu’elles sont combinées à une prise alimentaire durant la phase de repos. La flexibilité métabolique dépend des horloges circadiennes, qui optimisent les processus métaboliques selon le cycle jour/nuit, et apparaît comme un facteur clé de prévention des déséquilibres métaboliques. Elle pourrait prévenir l'apparition de troubles associés à la consommation d'un régime riche en graisses, ou à des heures non conformes au rythme endogène. Cette hypothèse sera testée chez un primate omnivore nocturne qui présente une grande flexibilité métabolique associée à un jeûne comportemental diurne strict. En désynchronisant l'accès à la nourriture du rythme endogène de cet animal (nourrissage de jour pendant la période de repos diurne), nous allons vérifier si sa flexibilité métabolique naturelle prévient l'apparition de troubles métaboliques et cognitifs, même avec un régime enrichi en graisses, contrairement à ce qui est observé chez les rongeurs.
Bénéfices attendus
Nos résultats permettront d’évaluer la flexibilité énergétique d’un primate omnivore face aux variations de son régime alimentaire et d'une perturbation du rythme d'alimentation. Ce projet nous permettra de mieux formaliser les relations entre rythmes biologiques, alimentation, métabolisme et fonction cérébrale chez un modèle connu pour sa très grande flexibilité métabolique, chez qui une exposition à un régime enrichi en graisse n'induit pas de troubles métaboliques ou cognitifs, comme observé chez le rongeur.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (N=80) seront exposés à différents régimes alimentaires pendant 5 mois et seront exposés à des prélèvements sanguins réguliers (toutes les 2 semaines), des mesures de leur taux métaboliques, de leur composition corporelle et de leurs capacités cognitives.
Impact sur les animaux
Les possibles effets indésirables attendus résident surtout dans les troubles métaboliques qui pourraient apparaître avec la combinaison d'un régime enrichi en graisses avec un décalage des horaires de prise alimentaire par rapport au rythme circadien naturel de l’animal. Néanmoins, le régime enrichi en graisses a déjà été testé dans un précédent projet et n'a pas induit de troubles physiologiques et cognitifs, même après 5 mois. Le suivi des paramètres sanguins (glycémie et acides gras circulants) ainsi que des indices comportementaux au quotidien (signes de prostration, absence d’alimentation, symptômes apparents de gêne ou de douleur, agressivité, surléchage, etc) permettront de s'assurer du maintien du bien-être des animaux. A cet égard, le microcèbe se caractérise par une très grande flexibilité métabolique; nous faisons l'hypothèse que les changements de régime alimentaire ne devraient pas affecter sur le long-terme l'état de santé des animaux. Nous précisons toutefois que les volumes et fréquences prévues sont très en deçà des volumes maximaux recommandés.
Devenir
A l'issue de l'unique procédure de ce projet qui sera appliquée sur une durée de 5 mois, 56 animaux seront maintenus en vie et retourneront dans la population captive et pourront éventuellement être réutilisés pour d'autres projets en fonction de la compatibilité des procédures. Les 24 autres animaux seront seront euthanasiés dans le but de réaliser des prélèvements de tissus fixés, en particulier pour évaluer par marquage immunohistochimique les effets des régimes alimentaires sur certains processus cérébraux (formation de nouvelles cellules nerveuses par exemple.
Remplacement
Le recours aux animaux se justifie pleinement et ne peut être remplacé car les études physiologiques portant sur des influences métaboliques ne peuvent être réalisées que chez des animaux vivants, dans un système intégré. Par conséquent, l’impact du régime enrichi en graisses et de la synchronisation/désynchronisation de la prise alimentaire avec le cycle circadien de l’animal sur ses capacités cognitives ne sera observable qu’en réalisant des tests de mémoire sur animaux vivants. De même, nous ne pouvons pas mimer la flexibilité métabolique in vitro ou ex vivo, il est donc nécessaire d’utiliser l’animal dans son entier.
Réduction
Pour la majorité des tests effectués dans l’étude (mesure des paramètres sanguins, urinaires, métaboliques, comportementaux et cognitifs), et afin de répondre à l’exigence de réduction du nombre d’animaux, un nombre de 10 animaux adultes par sexe et par groupe expérimental a été déterminé pour assurer un pouvoir statistique suffisant, prenant notamment en compte la variabilité interindividuelle. Pour les mesures immunohistochimiques, nécessitant le recours au sacrifice des animaux, le nombre d'animaux nécessaires a été réduit à 3 par condition expérimentale (N=24 au total), ce qui est classiquement réalisé dans ce type d’étude et permet d’atteindre des seuils statistiques satisfaisants afin de déceler des effets entre les groupes expérimentaux, notamment pour les processus comme la neurogenèse.
Raffinement
Le but de cette étude étant de caractériser l'impact du régime alimentaire sur la physiologie et les capacités cognitives, une grande attention sera portée au maintien des conditions optimales pour le bien-être des animaux en essayant d’être le moins intrusif possible et donc d'observer les animaux dans les conditions les plus physiologiques possibles. Dans cette optique, les animaux seront maintenus en groupe durant la majeure partie de l’étude (et non isolés comme il est souvent le cas dans les protocoles de suivi du régime alimentaire) et dans leurs pièces d'animalerie respectives pour réduire le stress. Cela ne sera pas le cas lors des périodes de calorimétrie indirecte pendant lesquelles les animaux seront hébergés dans des cages individuelles pendant 5 jours, permettant néanmoins des interactions vocales et visuelles. Les animaux bénéficieront donc d'un environnement familier et enrichi selon les pratiques habituelles de l'animalerie. L'ensemble des procédures expérimentales appliquées a été raffiné au cours des dernières années afin de limiter le stress et le mal-être des animaux, en étant notamment pratiquées par des opérateurs expérimentés. Tous les animaux seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer du bien-être des animaux utilisés. Pour cela, des indicateurs comme le poids de l’animal, la prostration, l’absence d’alimentation, des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, etc) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, etc) sont particulièrement suivis. En particulier, chez cette espèce saisonnière, les variations de poids peuvent aller jusqu’à 10% en une semaine. Une perte de poids sera considérée comme pathologique à partir du moment où ce seuil sera dépassé. Dans ce cas, en accord avec la SBEA, l'animal est retiré de l'expérience et on s'assure qu'il récupère correctement (reprise de poids); si tel n'est pas le cas, on procède à l'euthanasie après concertation avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Outre sa proximité phylogénétique avec l’Homme, l'espèce utilisée dans ce projet est particulièrement adaptée à l’étude des mécanismes impliqués dans la flexibilité métabolique. En effet, cette espèce hétérotherme (capable d'exprimer des phases d'hypométabolisme - torpeurs journalières - pour économiser pour économiser de l'énergie) est capable d'ajuster son métabolisme en fonction de la disponibilité alimentaire, comme c'est le cas dans son milieu naturel (variation en qualité et quantité du régime alimentaire au cours de l'année). Par ailleurs, cette espèce exprime une rythmicité circadienne et circannuelle très robuste avec des phases d'activité et de repos très marqués. C'est donc un excellent modèle pour explorer les liens entre horloges biologiques, métabolisme et fonction cérébrale. Toutes les procédures du projet se feront sur des animaux ayant atteint l’âge adulte (entre 2 et 5 ans) pour ne pas perturber la courbe de croissance des animaux et ne dépassant pas la demi-vie de l’espèce afin de ne pas introduire de variabilité à nos mesures qui pourrait être causée par le processus de vieillissement.
Evaluation des métabolites de la vitamine D sur le statut vitaminique et l’homéostasie minérale chez la truite arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Ajuster la forme de vitamine D ajoutée aux aliments d'élevage pour gagner de la croissance et réduire les rejets de phosphore : 160 truites arc-en-ciel vont être utilisées pendant 84 jours dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des filets. Elles subissent un jeûne de 36 heures, sept sorties d'eau pour la pesée par groupe, puis une prise de sang à la veine caudale d'un volume supérieur à 10 % du volume circulant, possible parce que la mise à mort suit immédiatement. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire l'activation de la vitamine D, qui mobilise intestin, foie, reins, branchies, os et écailles. Les bénéfices annoncés sont zootechniques et économiques, de 5 à 10 % de croissance en plus, de 10 à 20 % de rejets de phosphore en moins, une meilleure qualité du produit final.
Objectifs
La vitamine D joue un rôle essentiel chez les poissons en régulant l’équilibre du calcium et du phosphore, deux minéraux indispensables à la formation du squelette et des écailles. Elle intervient également dans la fonction musculaire, l’utilisation des nutriments, la croissance et la survie. Chez les salmonidés, un apport insuffisant en vitamine D peut entraîner des problèmes de minéralisation, une efficacité alimentaire réduite et une plus grande sensibilité aux stress et aux maladies. En aquaculture, la vitamine D est apportée principalement sous forme de vitamine D3 dans les aliments. Cependant, les conditions modernes d’élevage peuvent limiter son efficacité. Les aliments actuels contiennent une part importante d’ingrédients d’origine végétale, ce qui modifie la disponibilité du calcium et du phosphore. De plus, l’élevage intensif, avec une faible exposition à la lumière naturelle et des contraintes sanitaires fréquentes, peut réduire la capacité des poissons à transformer la vitamine D3 en formes actives dans l’organisme. Dans ce contexte, l’utilisation directe de formes plus actives de la vitamine D suscite un intérêt croissant. Le 25 hydroxycholécalciférol, un métabolite de la vitamine D3, est mieux utilisé par l’organisme et a montré des effets positifs sur la croissance, l’efficacité alimentaire et la minéralisation chez plusieurs espèces de poissons, à des doses plus faibles que la vitamine D3 classique. Toutefois, la réponse à ces formes de vitamine D dépend fortement de l’espèce, du stade de développement, de la composition de l’aliment et des conditions d’élevage, et des excès peuvent avoir des effets négatifs. Par ailleurs, bien que la forme hormonale active de la vitamine D soit utilisée chez les animaux terrestres, les connaissances restent limitées chez les salmonidés quant à ses effets sur la santé et la qualité des poissons. Ce projet vise donc à mieux comprendre l’utilisation de la vitamine D chez les salmonidés en comparant, dans des conditions contrôlées, les effets de la vitamine D3 et de ses métabolites sur la santé, les performances de croissance et la qualité des poissons, afin de contribuer à une aquaculture plus performante et durable.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre l’homéostasie du calcium et du phosphore chez les salmonidés en réponse à l’apport de métabolites de la vitamine D3, utilisé comme une stratégie prometteuse pour garantir un statut vitaminique optimal. Aussi, l’efficacité biologique de la vitamine D3 étant fortement dépendante de la source utilisée, une évaluation comparative rigoureuse des métabolites et de leur origine est nécessaire. L’optimisation du statut vitaminique devrait permettre une amélioration mesurable des concentrations circulantes du 25-(OH)D, une meilleure régulation des équilibres phospho calciques et une réduction de l’incidence des troubles métaboliques. Une amélioration de la croissance, pouvant atteindre +5 à +10 % selon les données de la littérature, ainsi qu’une diminution des mortalités et des déformations squelettiques (colonne vertébrale, opercules, mâchoires) sont également attendues. Sur le plan environnemental et économique, une meilleure utilisation des minéraux alimentaires devrait conduire à une amélioration de l’efficacité alimentaire et à une réduction des rejets de phosphore dans l’environnement, estimée jusqu’à 10–20 %. Ces effets contribuent directement à la durabilité des systèmes d’élevage et à l’amélioration de la qualité du produit final. Enfin, le projet permettra de générer des données biochimiques, zootechniques et sanitaires comparables entre différentes sources de vitamine D3, favorisant le développement de stratégies de nutrition de précision adaptées aux différents systèmes de production (systèmes en recirculation, cages marines).
Procédures
Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 84 jours. [[Une mise à jeun de 36 h, correspondant aux pratiques standards de gestion en aquaculture des salmonidés, est appliqué afin de diminuer le stress métabolique avant la mise en place des animaux]]. Sorties hors de l’eau pour la pesée des poissons par groupe (7 fois en 12 semaines, moins de 30 secondes). Prises de sang unitaires au niveau de la veine caudale (durée 30 secondes). Un volume sanguin supérieur à 10% du volume sanguin circulant sera prélevé car les poissons seront immédiatement mis à mort (durée 1 seconde).
Impact sur les animaux
Les animaux seront nourris avec un aliment standard répondant à leurs besoins nutritionnels et supplémenté en métabolites de la vitamine D3 pendant 84 jours après une semaine d’acclimatation. Stress dû à la capture et à la sortie des bassins pour la pesée Douleur transitoire à l’endroit du prélèvement de sang réalisé une fois par animal.
Devenir
Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de muscles (filets).
Remplacement
Au moment de la réalisation de la procédure expérimentale n'existe aucun modèle in vitro ou in silico capable d'imiter tous les facteurs cellulaires et acellulaires impliqués dans l'activation de la vitamine D chez les animaux, le retour endocrinien et l'homéostasie minérale concernent l'intestin, le foie, les reins, les branchies et l'os/écailles, ainsi que des déterminants comportementaux de l'apport alimentaire. Pourtant, la procédure est nécessaire et ne peut être remplacée par une autre stratégie qui n'implique pas l'utilisation d'animaux vivants.
Réduction
Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'apporter de bonnes conditions d'élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possibles par animal.
Raffinement
Les conditions d'hébergement des animaux sont définies de sorte que la densité d'animaux, les paramètres environnementaux (température, luminosité), l'enrichissement des bassins (bâche semi-opaque simulant un refuge, aérateur stimulant les poissons) et la qualité de l'eau offrent un confort maximal aux animaux et restent conforme à la législation en vigueur. Aucun animal ne sera isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, afin de minimiser l'anxiété et le stress des animaux. Avant toute manipulation (pesée ou échantillonnage) au cours de cette étude, les truites arc-en-ciel seront anesthésiées. La capture et le stress liés à la sortie des bassins pour la pesée par groupe des animaux et le prélèvement seront réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l'utilisation de mousse humide pour placer l'animal sur le support de contention et un point de pression sur le site de prélèvement (décrit dans la procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires).
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est utilisée dans cette étude comme modèle animal représentatif pour les salmonidés. La truite est une excellente espèce modèle car elle est elle-même un salmonidé largement élevé et est taxonomiquement proche du saumon, ce qui permet une extrapolation significative des résultats au saumon atlantique. Les truites utilisées dans cette étude présenteront un poids initial d’environ 125 g au début de l’expérimentation et atteindront approximativement 420 g à la fin de la période d’étude. Ces stades correspondent à la phase juvénile tardive à sub-adulte, reconnue comme particulièrement pertinente pour l’étude du métabolisme des micronutriments liposolubles chez les salmonidés.
Generation de lignées transgéniques pour étudier la formation de l’organe olfactif chez le poisson zébre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1 312 poissons zèbres sur 2 920 vont être tués parce qu'ils ne portent pas le bon génotype, les 1 608 autres étant gardés pour la reproduction, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certains individus issus de douze des trente lignées créées subissent une biopsie de moins de deux minutes, seul geste invasif prévu, suivie d'un isolement de moins de trois jours. Les adultes ne servent qu'à produire des embryons, dont le développement externe permet l'imagerie à haute résolution sur le vivant. Le porteur présente ce modèle comme permettant la transgenèse "sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur", dans un projet qui prévoit la mise à mort de 1 312 poissons au tri génotypique.
Objectifs
Notre projet vise à caractériser les mécanismes gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 30 nouvelles lignées pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.
Bénéfices attendus
Le projet nous permettra d’établir de nouvelles lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons à mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. De plus ces lignées seront accessibles à toute la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, d'enzymes ou pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques impliqués dans de nombreux processus et pathologies.
Procédures
Certains individus issus de 12 lignées générées, pourront subir une biopsie. Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Les animaux générés par transgénèse seront observés et sélectionnés dès le 1er jour, ainsi toutes malformations du développement seront écartées rapidement. Ils seront suivis journalièrement, afin de détecter le plus précocement possible tous signes de souffrances, et ce sur 2 générations. Les individus issus de certaines lignées mutantes homozygotes, pourront présenter précocement des signes cliniques liés à l'âge. Le prélèvement de tissu invasif peut provoquer un stress lié à la manipulation (quelques secondes) et à l'isolement (
Devenir
Les animaux n'ayant pas le bon génotype seront mis à mort. Les autres animaux seront conservés à des fin de reproduction.
Remplacement
Des recherches ont montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains parmi lesquels 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, cela en fait donc un très bon modèle pour comprendre le développement de l’organe olfactif et la modélisation des maladies humaines. De plus, le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus intéressante pour l’injection, le suivis du développement embryonnaire et l’imagerie sur le vivant. C’est pourquoi notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre. L’espèce animale et notamment l’organisme entier utilisé ne peut donc être remplacée. Cela nécessite une approche in vivo sur l’animal.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.
Raffinement
Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendre la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.
Choix des espèces
Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif dont la perturbation peut conduire chez l’Humain à des pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques et complexes. Le poisson zèbre présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » à haute résolution grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet également aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse ainsi qu’à la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe, ce qui permet d'avoir accès à ses embryons facilement, et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulent entre le stade 1 cellule (oeuf) et 4 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. En effet, la mise en place du système olfactif s'effectue entre 12 heures post fécondation (hpf) et 36hpf. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives.
Etude des mécanismes et réponses immunitaires des allergies alimentaires chez la souris, test de candidats médicaments et thérapies innovantes MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sensibilisées au beurre d'arachide puis exposées à l'allergène, 2 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélèvement des intestins, de la rate, des ganglions et du sérum. L'administration intragastrique répétée peut léser l'œsophage et le foie, la réaction allergique provoque diarrhée, douleurs abdominales, hypothermie et perte de poids, et les souris génétiquement modifiées utilisées, dépourvues de défenses immunitaires efficaces, peuvent développer des difficultés respiratoires. Le porteur écarte l'apprentissage d'une prise volontaire de beurre d'arachide, qui éviterait le gavage, au motif qu'il demanderait une phase d'entraînement importante et ne garantirait pas les quantités administrées. La rubrique censée décrire les procédures ne dit rien du protocole de sensibilisation ni du nombre d'expositions, elle recopie la liste des effets indésirables.
Objectifs
L’allergie alimentaire et l’anaphylaxie (réaction allergique généralisée, rapide et potentiellement mortelle) qui peut en résulter représentent un problème majeur de santé publique, en raison de leur sévérité potentielle et de l’augmentation constante de leur prévalence. En Europe, on estime qu’environ 3-6 % des adultes et 6-13 % des enfants sont concernés. L’anaphylaxie induite par l’arachide se caractérise le plus souvent par une atteinte gastro-intestinale (vomissements, diarrhée, douleurs abdominales), associée à des manifestations cutanéo-muqueuses (angio-œdème), respiratoires (bronchospasme) et cardiovasculaires (hypotension), pouvant évoluer vers une perte de conscience et, dans certains cas, conduire au décès après ingestion de l’allergène. Les modèles murins d’allergie alimentaire constituent des outils essentiels pour l’étude des mécanismes de l’anaphylaxie et de la sensibilisation allergique. Afin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est crucial de caractériser avec précision les déterminants génétiques, moléculaires et cellulaires impliqués dans ces allergies alimentaires. L’objectif de ce projet, est d’établir et caractériser un modèle murin d’allergie alimentaire à l’arachide (beurre d'arachide), pour mieux comprendre les mécanismes immunologiques impliqués dans la sensibilisation, la réaction allergique, ainsi que les paramètres physiopathologiques associés. Dans un second temps, ce modèle permettra de tester des candidats médicaments et des stratégies thérapeutiques innovantes afin d’évaluer leur efficacité contre l’allergie à l’arachide. Le projet s’articule en 3 procédures autour des objectifs spécifiques suivants : 1. Mise en place du modèle d’allergie alimentaire: o Établir un protocole reproductible de sensibilisation et de provocation allergique avec des extraits/ou beurre d’arachide o Identifier les doses optimales, les fréquences d’administration et les conditions favorisant une réponse allergique robuste et spécifique à l’arachide. 2. Etude de l’efficacité de composés à visée thérapeutique . 3.Etude des voies de signalisation et caractérisation immunologique du modèle.
Bénéfices attendus
L’allergie alimentaire à l’arachide est l’une des plus sévères et potentiellement mortelles, notamment en raison de son caractère persistant à l’âge adulte et du risque élevé de choc anaphylactique. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif, et la prise en charge repose exclusivement sur l’éviction alimentaire et la gestion des urgences. Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : • Mieux comprendre les mécanismes immunologiques impliqués dans la sensibilisation et les réactions allergiques à l’arachide. • Disposer d’un modèle animal validé permettant de tester des candidats médicaments, des stratégies d’induction de tolérance, de désensibilisation, ou d’immunothérapie innovante. • Identifier des biomarqueurs prédictifs de la sévérité de l’allergie ou de la réponse au traitement. Ces avancées contribueront à l’amélioration de la prise en charge des patients allergiques, à la réduction des hospitalisations liées aux chocs allergiques, et au développement de thérapies ciblées mieux tolérées.
Procédures
L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements et le prélèvement submandibullaire (5x maximum, et 1x/semaine) peuvent induire une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et un stress. L'administration intragastrique peut entraîner chez les animaux des lésions au niveau de l’oesophage et du foie, ainsi qu’un stress important lié à la manipulation répétée. Les souris en expérimentation sont observées tous les jours pour identifier d’éventuels effets indésirables et d’éventuels signes de souffrance. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre.
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie par exemple diarrhée, douleurs abdominales comme chez l’homme. La douleur pourra générer une hypothermie et/ou une perte de poids. L'administration par voie intragastrique peut entraîner chez les animaux des lésions au niveau de l’œsophage et du foie, ainsi qu’un stress important lié à la manipulation répétée. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements et le prélèvement submandibullaire peuvent induire une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et un stress. LA PERIODE COURTE DE JEÛNE PEUT INDUIRE UN STRESS.Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet pourront présenter un phénotype dommageable du fait de leur sensibilité plus élevée (diarrhée, mobilité réduite, difficultés respiratoires), car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques nécessaires à la validation du modèle et l’analyse de l’effet des différentes molécules et thérapies testées.
Remplacement
La mise en place d’un modèle murin d’allergie alimentaire à l’arachide implique nécessairement l’utilisation d’un organisme entier. En effet, les mécanismes allergiques requièrent une complexité physiologique et immunologique qui ne peut être reproduite in vitro à ce jour. Néanmoins, une stratégie active de remplacement partiel a été intégrée dans la conception du projet : • Avant de démarrer les phases in vivo, une caractérisation biochimique poussée des extraits /ou beurre d’arachide est effectuée in vitro, afin de valider les lots expérimentaux et limiter les tests sur animaux. • Des cultures cellulaires primaires ou lignées humaines sont utilisées pour tester in vitro la réactivité aux extraits. Ces approches permettent d’optimiser la qualité des extraits et de prédire leur capacité à induire une réponse immunitaire. Cependant, le déclenchement et l’étude fine de la réaction allergique, de l’inflammation intestinale in situ et des paramètres cliniques systémiques nécessitent une approche in vivo. Aucun substitut ne permet actuellement d’évaluer de manière fiable les conséquences physiopathologiques complètes d’une exposition répétée à un allergène alimentaire chez l’humain.
Réduction
Une attention particulière est portée à la réduction du nombre d’animaux utilisés tout au long du projet. Cette réduction repose sur une planification expérimentale rigoureuse, sur l’analyse statistique en amont, et sur l’exploitation optimale des données récoltées. Plusieurs mesures concrètes de réduction sont mises en oeuvre : 1. Tests pilotes préalables : Un petit nombre d’animaux (n=5-10) sera utilisé dans une phase préliminaire pour identifier les doses optimales d’allergène, les modalités de sensibilisation et les fenêtres de provocation les plus pertinentes. Cela évitera les essais multiples à grande échelle. 2. Calcul de puissance statistique : Les effectifs animaux par groupe sont justifiés par une analyse de puissance (power analysis) permettant d’atteindre une significativité statistique avec un minimum d’animaux (généralement 5-10 par groupe selon les variables mesurées). 3. Utilisation de groupes partagés : Certains groupes témoins (souris naïves ou sensibilisées mais non provoquées) peuvent être communs à plusieurs sous-expériences si les conditions restent identiques. Cela limite le nombre total de groupes expérimentaux. 4. Approche longitudinale sur les mêmes individus : Chaque souris est suivie au cours du temps (avant et après sensibilisation, puis provocation), ce qui permet des comparaisons intraindividuelles et donc une meilleure sensibilité statistique, réduisant les besoins d’effectifs supplémentaires. Optimisations des prélèvements par animal : Lors des mises à mort pour toutes les expériences, tous les tissus et fluides biologiques seront récoltés (intestin, rate, ganglions, sérum), permettant d’optimiser les paramètres mesurés. L’ensemble des protocoles est conçu pour limiter le recours aux animaux tout en assurant la validité scientifique.
Raffinement
Le projet intègre de nombreuses mesures de raffinement visant à minimiser la douleur, le stress, et les souffrances potentielles des animaux, tout en améliorant la qualité des données scientifiques obtenues. Les mesures principales ci-dessous listées seront mises en oeuvre: Sélection des méthodes les moins invasives possibles : o La voie intragastrique est privilégiée à la voie intrapéritonéale lorsque possible. o L’utilisation d’aiguilles fines, la réduction du nombre d’injections, et le recours à des formulations douces sont privilégiés. Nous n'envisageons pas de faire un apprentissage d'administration du beurre d'arachide de manière volontaire sans passer par l'administration intragastrique car cela demande une étape d'entrainement importante avant de pourvoir réaliser ce geste et de garantir la quantité prise par administration. Les souris en expérimentation sont observées tous les jours pour identifier d’éventuels effets indésirables et d’éventuels signes de souffrance. MODIFICATION LORS DE LA MISE EN PLACE DE LA COURTE PERIODE DE JEÛNE, LES SOURIS SERONT PLACEES DANS DES CAGES PROPRES AFIN DE LIMIITER LA COPROPHAGIE QUI METTRAIT EN PERIL LA PHASE DE JEÛNE. Nous proposons donc une procédure de suivi utilisant une grille de score avec définition d'un point limite adapté à nos procédures avec mise à mort immédiate. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet pourront présenter un phénotype dommageable du fait de leur sensibilité plus élevée aux infections opportunistes, car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Si nous sommes amenés à en utiliser, elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes manipulations pendant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris s'il y a lieu).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce la plus pertinente pour ce projet en raison de sa réponse immunitaire bien caractérisée et de sa forte sensibilité aux allergènes alimentaires. Certaines souches de souris sont particulièrement adaptées pour modéliser la sensibilisation à l’arachide et les réactions allergiques. La souris permet une reproductibilité expérimentale élevée, un suivi longitudinal individuel, et offre un accès à de nombreux outils immunologiques et génétiques (anticorps, lignées transgéniques). Les animaux sont utilisés au stade adulte, de 7 à 16 semaines à l'arrivée afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).
TOLPREG : Etude de tolérance chez la ratte gestante.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
15 000 rattes gestantes vont être utilisées, chacune gavée quotidiennement pendant seize jours de gestation, avec jusqu'à six microprélèvements sanguins en 24 heures puis un prélèvement pouvant atteindre 15 % de son volume sanguin total. Les substances testées ne l'ont jamais été sur des animaux gestants, à des doses montant jusqu'à 1 000 mg/kg/jour, et le porteur prévient que les effets toxiques attendus sur les mères peuvent être sévères, avec convulsions, prostration, tremblements et pertes de poids. Sur ces 15 000 rattes, 800 relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 800 d'un niveau modéré et 13 400 d'un niveau léger. Toutes sont tuées au vingt et unième jour de gestation pour prélèvement des organes et des fœtus, et les fœtus vivants sont tués aussi, le RNT indiquant qu'ils ne pourraient pas survivre sans leur mère.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de fournir les toutes premières informations in vivo sur le potentiel embryo-foeto-toxique d’une substance chimique au début de son développement, afin de : - Sélectionner au sein d’une famille chimique les molécules les moins risquées. - Identifier et abandonner rapidement les molécules à potentiel embryo-foeto-toxique pour éviter des tests inutiles à plus grande échelle. - Définir la dose maximale tolérée par la femelle gestante et sa progéniture afin de réaliser les études suivantes (études préliminaires et définitives) sans causer de souffrance excessive aux animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet dont le design est basé sur les lignes directrices des études qui seront réalisées par la suite lors du développement du produit mais sont allégées et utilisent un nombre inférieur d’animaux par groupe, permet de sélectionner au sein d’une famille chimique une molécule d’intérêt et de déterminer la dose maximale tolérée par la ratte gestante. Cette étude très précoce permet de mettre en évidence avec une procédure allégée le profil embryo-foeto-toxique du produit afin de pouvoir arrêter le développement de molécules qui pourraient présenter des alertes importantes de toxicité sur la reproduction et le développement et ainsi éviter des études plus importantes avec plus d'animaux.
Procédures
Les femelles gestantes vigiles seront gavées journalièrement à l’aide d’une sonde souple adaptée à leur taille et âge, pendant maximum 16 jours (généralement du jour 6 au jour 20 ou 21 de la gestation). Cette technique est réalisée en moins de 15 secondes. Durant la fin de la période de gestation (entre GD17 et GD21), des prélèvements sanguins, pourront être réalisés sur animaux vigiles et/ou animaux anesthésiés. Ce prélèvement peut être unique ou répété en respectant les durées de la récupération physiologique. Chaque femelle pourra faire l’objet d’un maximum de six micro-prélèvements sanguins (50 µL chacun) en 24h. Un prélèvement sanguin plus important, correspondant à un volume maximal de 15 % du volume sanguin total, pourra être réalisé au jour 20 ou 21 de la gestation. Tous ces prélèvements de sang seront réalisés sur une période d’une durée inférieure à 2 minutes. Pour les prélèvements d’organes et de fœtus, les femelles sont mises à mort (jour 21 de la gestation). Par la suite, les fœtus sont endormis puis à mort pour les examens ultérieurs.
Impact sur les animaux
Un stress léger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention des femelles gestantes. Le gavage effectué à l’aide d’une sonde souple peut induire un léger inconfort et très rarement une irritation de l’œsophage. Plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d'une période de 24h sur animaux vigiles par ponction à la veine saphène. Des prélèvements peuvent aussi être faits en fin de gestation après anesthésie par ponction à la veine submentale ou à la veine sublinguale. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prélèvement. Les effets toxiques attendus sur les femelles gestantes peuvent être sévères car les molécules n’ont jamais été testées au préalable sur des animaux gestants et aux doses choisies (maximum requis par la législation 1000 mg/kg/jour). Les signes de toxicité pouvant apparaître en cours d'études incluent des pertes de poids, une diminution de la consommation de nourriture ou des signes cliniques de type augmentation de salivation, convulsion, prostration, augmentation ou diminution de la mobilité et de l'agressivité, tremblements ou impact sur la température corporelle.
Devenir
En raison du but de l’étude qui est d’évaluer les effets sur la gestation et le développement des fœtus, toutes les femelles gestantes sont mises à mort pour prélèvements d’organes et de fœtus. Les fœtus vivants sont également mis à mort car même s’ils sont viables ils ne pourraient pas survivre sans leur mère.
Remplacement
Avant de réaliser cette étude sur le modèle animal, de nombreux essais in vitro (C. Elegans reprotox assay, Cell line compendium, devTox quick Predict assay, Reprotracker) ou in silico sont utilisés pour prédire le potentiel embryo-foeto-toxiques d’une substance, mais ils ne permettent pas de reproduire la complexité tissulaire ou la composition biologique complète d’un organisme entier, conduisant ou pas à l’induction d’effets embryo-foeto-toxiques, ni la gravité des effets induits par l'exposition au produit. Différents paramètres doivent donc être mesurés chez l’animal. L’étude décrite dans ce projet sert à préparer la réalisation de l’étude préliminaire de choix de doses et l’étude règlementaire de toxicologie du développement, indispensable à l’homologation de substances.
Réduction
Ce projet est réalisé dans le respect des 3Rs avec un nombre minimal d'animaux basé sur l’expérience du laboratoire: 4 femelles accouplées par groupe, en comparaison 8 femelles gestantes par groupe sont utilisées dans les études préliminaires de choix de doses. Plusieurs substances sont testées au sein d’une même étude afin de n’avoir qu’un seul groupe témoin et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif reste également de ne tester chez l’animal que des molécules sélectionnées comme non dangereuses par des méthodes alternatives et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le processus de recherche et développement. Cette étude n’est réalisée que sur certains types de molécules, en fonction des effets embryo-foeto toxiques connus ou suspectés de la famille chimique. Si la substance testée montre une capacité à induire de la mortalité intra utérine et/ou des malformations chez le fœtus, le développement de la substance est immédiatement suspendu afin de ne pas réaliser les études préliminaires de choix de doses et les études réglementaires réalisées avec plus de 20 femelles gestantes par groupe.
Raffinement
Les conditions d’hébergement enrichies et adaptées aux femelles rattes gestantes (matériel de nidifcation), le personnel formé ainsi que l’utilisation d’une manipulation douce des animaux permettent de réduire le stress pré-procédural au strict minimum. Les femelles gestantes sont observées quotidiennement y compris les week-ends, avec une attention plus particulière le 1er jour de traitement (au moins 4 observations dans la journée). Elles sont pesées à intervalles réguliers pendant la gestation pour vérifier leur croissance et leur bien-être. La consommation de nourriture est également mesurée à intervalle régulier. Des points limites suffisamment prédictifs et adaptés aux femelles gestantes seront appliqués. Des micro-prélèvements sanguins seront privilégiés. Lors des prises de sang, l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Le jour précédent leur mise à mort les femelles gestantes sont déplacées dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort.
Choix des espèces
Le rat est le modèle expérimental choisi en raison de sa courte durée de gestation, de son utilisation fréquente dans les études de toxicologie du développement et de la disponibilité de souche suffisamment caractérisée. Les modèles rongeurs et notamment le rat sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précédemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec l’espèce et la souche choisies (Rat Wistar). Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Des jeunes rattes accouplées (âgées de 8-12 semaines au début de l’étude) seront utilisées dans ce projet comme dans les futures études de toxicologie du développement conformément aux recommandations des guidelines internationales (OECD 414). Ces études visent à étudier le potentiel toxique d’une substance sur le développement et seront réalisées pendant la gestation puisque l’objet de l’étude porte sur le développement de l’embryon et du fœtus lors d’une exposition in utero.
Production d’ovocytes de xenopus tropicalis par injection d’hormone et fécondation in vitro
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Les 150 mâles sont tués après stimulation hormonale pour qu'on leur prélève les testicules, les 48 femelles restant en vie et sollicitées à nouveau tous les quatre mois, soit 198 xénopes utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Femelles et mâles reçoivent une injection d'hormone sur animal vigile maintenu en contention de dix à trente secondes, les femelles étant ensuite isolées 48 heures pour finir de se vider de leurs ovocytes, faute de quoi leurs congénères les mordent pour manger les œufs. Le porteur indique que la ponte provoquée n'a pas d'impact négatif sur la santé des femelles et qu'elles peuvent être utilisées ainsi toute leur vie, soit une dizaine d'années en captivité. Cette structure ne mène pas de recherche propre, elle fournit ovocytes et embryons à d'autres équipes.
Objectifs
La plateforme constitue une structure d'appui à la recherche qui a pour mission de fournir des ovocytes et des embryons à la communauté des chercheurs utilisant le modèle xénope dans les domaines de la biologie du développenent et des neurosciences. L'obtention d'oeufs fertilisés nécessiste des injections d'hormones chez la femelle et chez le mâle. Ces hormones stimulent la ponte (femelles) et la maturation des gamètes (mâles) afin d'obtenir des fertilisations in vitro de qualité et en quantité.
Bénéfices attendus
Notre structure d’appui à la recherche a pour mission de fournir des œufs fécondés ou non à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes. Les oeufs non fécondés pourront être utilisés pour des expérimentations de biochimie (quantification de protéines, expériences sur des extraits). Les oeufs fécondés, du fait de leur transparence et de leur facilité d'accès (développement externes) sont des outils puissants pour comprendre les mécanismes du développement embryonnaire. Par exemple, parmis les équipes qui bénéficieront de la production d'ovocytes, certaines utilisent actuellement le xénope pour développer un nouveau système modèle pertinent et robuste pour étudier et comprendre des maladies humaines liées au développement précoce du cerveau et à l'émergence des tumeurs pédiatriques. Une autre équipe étudie les mécanismes fondamentaux de la dépense énergétique dans le développement.
Procédures
Femelles : Les femelles seront soumises à une administration d’hormone sur animal vigile en contention afin de stimuler la ponte. Cet acte dure de 5 à 10 secondes. Après récolte de leurs œufs, les femelles sont ensuite maintenues en hébergement individuel durant 48h pour surveillance. Cette période permet à la femelle de se vider de ses ovocytes matures, ce qui évite que ses congénères ne la mordent en voulant manger les ovocytes. Les femelles retournent ensuite dans leur groupe d’origine. Mâles : Les mâles seront soumis à une administration d’hormone sur animal vigile en contention afin de stimuler la production de sperme de qualité. Cet acte dure de 5 à 10 secondes. Les mâles seront ensuite euthanasiés pour récupérer leurs testicules.
Impact sur les animaux
Les animaux seront hébergés individuellement, mais le stress social n’est pas applicable chez cette espèce. Le Xénope est en effet un animal poïkilotherme, à comportement solitaire en conditions normales d’élevage. Les nuisances attendues lors de la stimulation hormonale des femelles et des mâles vigiles sont principalement de type inconfort et stress, ainsi qu’une douleur légère et transitoire. Le stress et l’inconfort peuvent être liés : 1. à la capture de l’animal dans l’aquarium, 2. au maintien en contention, d’une durée brève (10 à 30 secondes), 3. à la manipulation nécessaire à la récolte des ovocytes chez les femelles. Une douleur légère et transitoire peut également survenir lors de la stimulation hormonale.
Devenir
Chez la femelle Xenopus, la ponte est déclenchée par une injection lorsqu’elle est adulte. En respectant un délai suffisant entre deux stimulations (environ 4 mois), cette procédure n’a pas d’impact négatif sur sa santé et peut être répétée plusieurs fois au cours de sa vie. Les femelles peuvent ainsi être utilisées tout au long de leur durée de vie. Les mâles, quant à eux, sont utilisés pour la production de spermatozoïdes nécessaires à la fécondation in vitro. Après stimulation hormonale, ils sont euthanasiés pour permettre le prélèvement des testicules et ne sont donc pas maintenus en vie après la procédure.
Remplacement
La production d'embryons permettra d'explorer les étapes précoces du développement chez les vertébrés. Nous intervenons sur les animaux adultes dans un seul but : stimulation hormonale de l’ovulation des femelles vivantes dans le but de récolter les ovocytes suite à leur ponte qui seront ensuite fécondés in vitro pour la production des embryons. Il n’y a pas de méthode de substitution possible. Les équipes utilisent au maximum des approches in silico et si possibles des approches dans des cellules mammifères en culture en complément de nos approches in vivo. De plus le vertébré tétrapode non mammifère Xenopus tropicalis répondent idéalement aux recommandations des 3R : Remplacer, Réduire et Raffiner. L'amphibien Xenopus tropicalis possède une longévité et une période de reproduction remarquables (10 ans) ce qui en fait un excellent modèle pérenne pour les études d’ordre génétique.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous nous appuyons sur le fait qu’un petit nombre d’adultes permet d’obtenir un grand nombre d’embryons par fécondation in vitro. Les expériences sont organisées de manière à optimiser l’utilisation de ces embryons, en coordonnant le travail de plusieurs expérimentateurs et en regroupant les essais. Nous adaptons en permanence nos pratiques grâce à une veille scientifique régulière et nous ne réalisons des expériences sur les animaux que lorsqu’elles sont indispensables. Les résultats obtenus sont analysés afin d’ajuster au plus juste le nombre d’animaux nécessaires. En pratique, une à deux fécondations sont réalisées par semaine, en utilisant 3 à 4 femelles, avec généralement un seul mâle suffisant pour chaque série. Les mâles reçoivent également une injection hormonale et sont donc inclus dans le nombre total d’animaux. Les femelles peuvent être sollicitées plusieurs fois, en respectant un intervalle de repos de 4 mois, afin de limiter leur stress et de réduire le nombre total d’individus utilisés. Lorsque cela est possible, des femelles issues de projets précédents sont réutilisées. Au total, sur toute la durée du projet, le nombre maximal d’animaux adultes utilisés est estimé à 48 femelles et 150 mâles, soit 198 animaux. Cette estimation prend en compte la réutilisation raisonnée des animaux, le respect de périodes de repos et l’optimisation des procédures expérimentales.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des aquariums ayant une capacité de 10 litre par aquarium, contenant de l’eau déchlorée, filtrée et oxygénée, à 20 degrés . Des sondes surveillent en temps réel la température, le pH et la conductivité. Les aquariums sont enrichis par des tubes en plastique où certains animaux peuvent se cacher, ainsi que par des aménagements intérieurs (plantes artificielles et petites billes), bien que le comportement majoritaire consiste à rester allongé sur le fond de l’aquarium. La nourriture non consommée et les fèces sont éliminées quotidiennement. Un nettoyage des parois des aquariums est effectué tous les 15 jours. Six à huit animaux sont regroupés par aquarium. Aucun stress n’est observé lorsque le groupe est réduit ou lorsque l’individu est hébergé seul, cette espèce présentant un comportement solitaire. Lors de la réception, les animaux sont placés dans des bacs individuels et observés pendant deux semaines avant leur introduction dans le circuit fermé. Ils sont ensuite acclimatés pendant deux semaines avant d’être intégrés à un protocole expérimental. Les xénopes adultes sont nourris deux fois par semaine à satiété avec des granulés de poisson et des vers de vase et/ou du cœur de bœuf. Les animaux sont prélevés à la main ou à l’aide d’une épuisette, en évitant tout mouvement brusque afin de limiter le stress. Une grille de score est réalisée à intervalles réguliers, avec des points limites définis afin d’assurer le suivi et l’évaluation des paramètres observés.
Choix des espèces
Le xénope est un organisme modèle de choix pour l’étude des processus biologiques. Il a par exemple contribué de manière déterminante à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement embryonnaire. Il fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Outre ces caractéristiques, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses non invasives dès la fécondation et à tous les stades. Pour pouvoir obtenir des pontes les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés de 1 an environ pour X. tropicalis, jusqu’à leur mort (environ 10 ans en captivité).
Comment un manque en oxygène affecte la relation entre le comportement et le métabolisme énergétique : cas d’un poisson côtier le bar commun
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Soumis à une biopsie musculaire sur le flanc gauche, puis à une seconde sur le flanc droit trois semaines plus tard, 25 bars communs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Entre les deux prélèvements ils sont maintenus en hypoxie constante ou en oxygénation normale, puis placés douze heures dans un tunnel de nage avant la mesure de leur performance. Le porteur affirme qu'il est impossible de remplacer les poissons, seule l'expérimentation permettant selon lui d'observer les réponses physiologiques et comportementales dans des conditions fluctuantes. Tous sont tués à l'issue, pour prélever leurs tissus et déterminer leur sexe.
Objectifs
A cause du changement climatique, les phénomènes hypoxiques, durant lesquels la concentration en oxygène diminue, sont de plus en plus fréquemment rencontrés dans le monde marin, notamment à cause du réchauffement global des océans et des vagues de chaleur. Les poissons présentent des degrés de tolérance variables à l’hypoxie (au manque en oxygène), notamment en fonction de la durée et de l’intensité de ces épisodes hypoxiques. Ce projet a pour objectifs de mesurer les conséquences d’une exposition chronique à l’hypoxie sur le métabolisme énergétique et le comportement du bar commun, et de mesurer comment l’hypoxie affecte la relation entre le métabolisme cellulaire et le comportement de nage des poissons. Grâce à ce projet, les changements du comportement et du métabolisme cellulaire face à différentes conditions environnementales seront mesurés à plusieurs reprises chez les mêmes individus, afin de mesurer l’évolution temporelle des réponses physiologiques et comportementales des organismes. De plus, l’établissement de la relation entre comportement et métabolisme est essentiel pour mieux appréhender les effets du changement climatique à différentes échelles biologiques, et pour mieux prédire les effets futurs des changements globaux sur les organismes aquatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra tout d’abord de parfaire la technique de la biopsie pour mesurer le métabolisme cellulaire à plusieurs reprises chez les mêmes individus, et ainsi permettre un suivi temporel de chaque individu. Cela permettra au long terme de mettre en place des protocoles expérimentaux pour un suivi du métabolisme énergétique sur des espèces non modèles, comme des espèces sauvages. De plus, l’établissement de profils physiologiques et comportementaux face à l’hypoxie permettra de mieux comprendre les stratégies mises en place par les individus à différentes échelles biologiques pour faire face aux stress environnementaux.
Procédures
Une étude préliminaire permettra de moduler la durée minimale requise pour que la biopsie cicatrise entièrement et pour que le poisson puisse effectuer une performance de nage à la suite de la biopsie. La durée préétablie est fixée à 7 jours post-prélèvement, en se basant sur de la littérature publiée. Les poissons subiront une biopsie musculaire sur le flanc gauche afin d’étudier les réponses des poissons face à cette intervention, et attester de leur bonne récupération et de la bonne cicatrisation de la zone biopsiée, avant d’effectuer une performance de nage. Les poissons inclus dans le projet principal seront marqués sous anesthésie, grâce à l’implantation d’une puce en intramusculaire. Après quoi une première biopsie musculaire sera effectuée après anesthésie sur le flanc gauche de chaque poisson, afin de mesurer leur métabolisme musculaire. Trois semaines plus tard, après que les poissons auront été exposés à différentes conditions environnementales (normoxie [conditions normales en oxygène] ou hypoxie constante [diminution en oxygène]), une deuxième biopsie sur le flanc droit sera effectuée, puis 7 jours plus tard (ce temps de récupération pourra être modulé en fonction des résultats de l’étude préliminaire), la performance de nage des poissons sera mesurée. Les individus seront ensuite mis à mort afin de prélever leurs tissus pour des analyses a posteriori, et afin de déterminer le sexe des poissons.
Impact sur les animaux
A la suite des biopsies, les effets indésirables pourraient être l’apparition d’infections au niveau des zones biopsiées. Une augmentation du stress due à la manipulation des poissons (mise en place dans le tunnel de nage) pourrait également être visible au niveau comportemental (diminution de l’activité, diminution de la prise alimentaire). La fatigue associée à la mesure de la performance de nage est transitoire, d’une durée inférieure à 5 minutes.
Devenir
Tous les individus seront mis à mort afin de collecter leurs tissus pour des analyses a posteriori et déterminer leur sexe.
Remplacement
A l’heure actuelle, il est impossible de remplacer les poissons car seule l’expérimentation sur animaux permet d’étudier les réponses physiologiques et comportementales des organismes dans des conditions environnementales stressantes et fluctuantes. Cette vision, allant de la cellule à l’individu en entier, permet d’étudier de façon globale les interactions complexes entre les différents niveaux biologiques.
Réduction
L’identification de chaque individu permet un suivi individuel et temporel, en limitant ainsi le nombre d’individus requis. Cependant, nous avons gardé un groupe témoin (en conditions normales en oxygène ou normoxie) en plus du groupe expérimental (en hypoxie constante), ce qui permettra d’estimer la part de variabilité au sein des individus au cours du temps dans des conditions contrôles (donc en normoxie).
Raffinement
Toute manipulation des poissons sera faite avec le port de gants. Lors de l’implantation du marqueur, les poissons seront anesthésiés et analgésiés, puis seront replacés individuellement dans leur bassin d’origine après avoir complètement récupéré. Lors de la biopsie au niveau du muscle sur la ligne latérale, le poisson sera placé sur une alèze humide qui recouvrira également sa tête. La plaie sera recouverte d’un pansement hydrorésistant et désinfectant pour limiter les risques de surinfection et améliorer le processus de cicatrisation. Lors de la manipulation des poissons pour la mise en place de la mesure de performance de nage, les poissons recevront une sédation légère au préalable de leur sortie de l’eau, de leur mesure, et de leur placement dans le tunnel de nage. Le temps d’acclimatation dans le tunnel de nage sera ensuite de 12h avant le début de la mesure de la performance de nage. Le tunnel de nage sera placé dans une salle spécifique sans passage afin de limiter les nuisances sonores, et il sera recouvert d’une bâche noire afin de limiter les nuisances visuelles pendant la période d’acclimatation mais aussi durant la mesure de la performance de nage et pendant la récupération suivant la mesure. Avant d’être replacé dans leur bassin d’origine après la mesure de performance de nage, les poissons récupèreront durant 2h dans le tunnel à une vitesse réduite de courant (0,5 longueurs de corps par seconde). Tout au long du projet, les poissons seront surveillés quotidiennement afin de vérifier des changements potentiels de leur comportement, indices de leur bien-être (activité, alimentation, poids).
Choix des espèces
Le bar commun est une espèce emblématique de la côte Atlantique française, qui est essentielle sur les plans écologique et économique. Comprendre les réponses métaboliques et comportementales du bar face à des variations de la disponibilité en oxygène permettra de mieux caractériser sa résilience face à ces stress environnementaux. Les animaux seront étudiés au stade jeune adulte, avec une taille adaptée aux tunnels de nage que nous avons à disposition aux laboratoires.
Etude des effets cérébraux de l’induction de troubles du spectre autistique par exposition précoce à un polluant chez le rat (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavées quotidiennement pendant 42 jours avec un retardateur de flamme, ou injectées au douzième jour de gestation avec un médicament de référence, 30 rattes ouvrent ce projet qui utilise 362 rats au total, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Leurs 300 petits subissent des tests d'activité de 72 heures, d'anxiété de 10 minutes et d'interactions sociales de 30 minutes, puis une séance d'imagerie cérébrale sous anesthésie après injection d'un traceur radioactif, avant d'être tués à 10, 21 ou 80 jours pour prélèvement des tissus. Les portées de plus de dix ratons sont réduites, les surnuméraires étant tirés au sort puis placés dans une autre portée ou tués. Les 32 rats du test de sociabilité et les 30 mères restent en vie et pourront être réaffectés à d'autres projets.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiés comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à un de ces polluants pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à celles observées dans un modèle d’autisme induit par un médicament utilisé comme modèle de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet visera à utiliser une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant ou au médicament de référence. Un traceur sera utilisé pour mesurer l'activité métabolique du cerveau afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Des prélèvements seront effectués à plusieurs âges afin de suivre l’évolution de cette activité et de l’inflammation au cours de la maturation cérébrale et de l’installation des comportements de type autistique. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, l’animalerie 1/2 sera en charge de la mise en place du modèle animal et l’animalerie 2/2 de l’imagerie cérébrale.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les effets d’un polluant chimique sur le développement du cerveau. Il permettra d’identifier, à l’échelle du cerveau entier, les régions et les fonctions cérébrales pouvant être altérées après une exposition, ainsi que les liens possibles entre ces différentes modifications. Les connaissances obtenues contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les Troubles du Spectre Autistique. À plus long terme, ces résultats pourront soutenir la mise en place de mesures de prévention adaptées, en particulier pour les populations les plus vulnérables telles que les femmes enceintes et les jeunes enfants.
Procédures
Femelles gestantes : Administration quotidienne par gavage (1 minute) du polluant ou de l’huile servant de contrôle pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation. Injection (30 secondes) du médicament de référence induisant des troubles du spectre autistique ou du contrôle (eau injectable) une seule fois au 12ème jour de gestation. Descendants : La réalisation des tests comportementaux pour évaluer les niveaux d’activité (1 fois, 72 heures), d’anxiété (1 fois, 10 minutes) et d’interactions sociales (1 fois, 30 minutes). Imagerie cérébrale : Une séance d'imagerie cérébrale sous anesthésie (1 fois, 30 minutes) après administration d’un traceur radioactif (1 fois, 5 minutes d’anesthésie), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale du médicament de référence entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). L’administration du polluant par gavage (42 fois) et l’habituation à la technique (7 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée. Pour les descendants : L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (3 tests) entraine un stress physique mineur. - L’anesthésie entraine une stress physique mineur de courte durée et un risque léger d’hypothermie. - La mise à jeun des animaux avant les imageries entraine un risque d’hypoglycémie.
Devenir
En cas de portées trop nombreuses (supérieures à 10 ratons), celles-ci seront réduites en plaçant des ratons surnuméraires tirés au sort dans d’autres portées d’effectifs plus faibles (< 10) ou en les euthanasiant. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des rats nés dans cette étude (300) sera euthanasié à 10, 21 ou 80 jours de vie pour analyses des tissus. Enfin les 32 rats ayant participé aux tests de sociabilité ainsi que les femelles ayant servi à la reproduction (30) seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Le modèle d’autisme utilisé dans ce projet est reconnu et validé chez les rongeurs, il permet de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux observés chez l'Homme. Les deux modèles qui seront utilisés (celui exposé au polluant objet de l’étude et le modèle de référence des troubles du spectre autistique) permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.
Réduction
Compte-tenu des objectifs de l’étude (développement de Troubles du Spectre Autistique chez la descendance par exposition maternelle à un polluant), la portée doit être considérée comme l’unité statistique. Le nombre d’animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi, ce projet inclura un total de 30 rat femelles gestantes ainsi que leurs descendants. Chaque portée sera limitée à 10 ratons, soit 300 jeunes. À ce nombre il convient d’ajouter 32 rats (16 femelles et 16 mâles) qui seront utilisés dans le test de sociabilité. Ce protocole impliquera donc au total 362 animaux. Parmi ces animaux, 54 réaliseront des tests comportementaux puis 37 réaliseront les analyses d’imagerie. Les autres ratons des portées seront utilisés pour prélever des tissus et réaliser des analyses ultérieures.
Raffinement
Dans l’EU1/2, les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être en accord avec une grille de score adaptée, et manipulés par un personnel entraîné afin de réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2/2, et hébergés avec des conditions similaires à leur habitat précédent pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Le radiotraceur sera injecté par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications. Après la décroissance de la radioactivité, les animaux seront transportés dans des cages prévues à cet effet pour retourner dans l’EU1/2.
Choix des espèces
Les caractéristiques comportementales du rat, en particulier du point de vue du comportement social font que cette espèce est à privilégier pour l’étude du comportement et l’induction des modèles de Troubles du Spectre Autistique par le médicament de référence ou l’exposition au polluant. Les femelles pour la reproduction seront utilisées au même stade de maturité (11–12 semaines) que dans les études antérieures, afin d’assurer la comparabilité des résultats. Les descendants seront étudiés à différents stades : 10, 21 et 80 jours après la naissance. L’évaluation des modifications métaboliques au moyen de la technique d’imagerie cérébrale aura lieu à 60 jours de vie postnatale. Les âges postnataux de 10 et 21 jours ont été choisis car ils correspondent à une période clé du développement cérébral chez les rongeurs, marquée par une forte formation de connexions entre les neurones, juste avant leur réorganisation autour de 21 jours. La période de 60 à 80 jours correspond quant à elle à une période où les comportements de type autistique sont pleinement établis.
Étude de la prolifération cellulaire ovarienne chez le poisson médaka juvénile
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Capturés à l'épuisette, anesthésiés, amputés d'un fragment de nageoire caudale pour être génotypés, 124 poissons médaka juvéniles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 74 d'entre eux et modéré pour 50. Les femelles ainsi triées passent jusqu'à trente heures immergées dans une solution contenant un marqueur de division cellulaire, ce qui peut modifier leur nage, leur ventilation et leur prise alimentaire. Tous les poissons seront tués, une cinquantaine de femelles pour que leurs ovaires soient prélevés et fixés. Le porteur écrit n'avoir besoin que de dix femelles pour l'analyse finale, les autres poissons étant utilisés pour la mise au point des conditions et pour le tri par sexe.
Objectifs
Chez les poissons femelles, les ovaires produisent des ovocytes (cellules reproductrices femelles) tout au long de la vie. Ces ovocytes se développent à partir de cellules précoces regroupées dans des zones spécifiques de l’ovaire, où elles se multiplient puis se transforment progressivement en ovocytes. Cependant, la manière dont ces cellules se divisent et contribuent à la formation des ovocytes reste encore mal comprise. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment ces cellules se multiplient dans l’ovaire du poisson médaka. L’étude sera réalisée chez de jeunes poissons, à un stade où l’organisation de l’ovaire commence à être visible. Le médaka est un modèle largement utilisé pour étudier la reproduction chez les poissons.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment fonctionne l’ovaire chez les poissons femelles médaka et comment leur capacité à produire des ovules est maintenue tout au long de la vie. En étudiant la division des cellules reproductrices dans l’ovaire à un stade précoce du développement, ce travail permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes à l’origine de la reproduction continue chez les poissons. Le poisson médaka est un modèle particulièrement adapté pour ce type d’étude, car il permet d’observer ces phénomènes directement dans un organisme vivant. Les résultats obtenus contribueront ainsi à une meilleure compréhension générale de la biologie de la reproduction chez les vertébrés. Par ailleurs, la reproduction est un élément clé de l’élevage des poissons. La capacité des femelles à produire des ovules en quantité et en qualité suffisantes conditionne directement le succès de l’aquaculture. En améliorant les connaissances sur le fonctionnement de l’ovaire et sur la production d’ovules chez les poissons femelles, ce projet pourra, à terme, contribuer à une meilleure maîtrise de la reproduction des espèces élevées, et ainsi présenter un intérêt pour des espèces d’importance en aquaculture.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à deux types d’interventions. La première consiste en un prélèvement très limité de nageoire caudale réalisé lors du génotypage, afin d'identifier les femelles nécessaires à l'étude. Cette procédure sera effectuée sur 124 poissons vivants, sous anesthésie générale, et sera de très courte durée (environ 2 minutes par poisson). La seconde intervention correspond au prélèvement des ovaires chez environ 50 femelles, après une immersion de 30 heures maximum dans une solution contenant un marqueur de la division cellulaire, suivie d’une euthanasie réalisée conformément à la réglementation en vigueur. Ces prélèvements permettront d'analyser l'activité proliférative au sein du tissu ovarien.
Impact sur les animaux
D’après les données disponibles dans la littérature, notamment chez le médaka à des stades juvéniles comparables, aucune altération majeure de l’état général ou du comportement n’a été rapportée suite à ce type de traitement. Toutefois, cette procédure peut être associée à certains effets indésirables : - ceux liés au stress de la manipulation lors de la capture à l’épuisette des poissons, qui est très rapide ; - ceux liés au prélèvement de nageoire caudale effectué lors du génotypage afin de sélectionner uniquement les femelles. Ce prélèvement, d’une surface inférieure à 2 mm2, sera réalisé sous anesthésie ; - ceux liés à l’exposition temporaire au composé dans l’environnement aquatique. Les nuisances attendues correspondent principalement à un stress aigu pouvant s’accompagner de modifications comportementales transitoires (activité locomotrice, ventilatoire, prise alimentaire, …). Ces effets resteront limités dans le temps et ne devraient pas excéder la période d’exposition (maximum 30h). Les poissons seront surveillés régulièrement tout au long des procédures, et toute anomalie comportementale ou signe de souffrance entraînera l’arrêt immédiat de la procédure pour les poissons concernés. Aucun effet pathologique tardif ou durable n’est attendu, les poissons étant euthanasiés rapidement après la balnéation, aussi bien lors des phases de mise au point que lors de l’expérimentation finale
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement et la fixation des tissus pour les analyses prévues.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier la prolifération des cellules germinales ovariennes dans un organe fonctionnel et intact. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire de manière pertinente l’organisation tridimensionnelle de l’ovaire, les interactions entre cellules germinales et cellules somatiques, ainsi que les régulations systémiques impliquées dans l’activité ovarienne. Les approches in vitro ne permettant pas de réaliser l’analyse de la prolifération dans des conditions physiologiques, l’utilisation d’animaux vivants est donc indispensable pour répondre aux objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre de poissons utilisés dans ce projet sera limité au strict nécessaire. Lors de la phase préalable de mise au point, une expérience pilote, suivie si nécessaire de quelques essais supplémentaires permettant d’optimiser les conditions de balnéation avec un marqueur de la division cellulaire, sera réalisée sur des lots de taille réduite (n=8 femelles obtenues à partir du sexage de n=20 poissons par condition testée). Les conditions expérimentales retenues à l’issue de cette optimisation seront ensuite appliquées, dans une seconde phase, à un seul lot de poissons (n=10 femelles obtenues à partir du sexage de n=24 poissons), destiné à l’analyse de la prolifération des cellules germinales ovariennes. Cet effectif est justifié par le retour d’expérience de l’équipe en imagerie 3D de l’ovaire, montrant qu’en raison de la variabilité interindividuelle observée, un effectif d’au moins 10 femelles est nécessaire pour obtenir des résultats robustes.
Raffinement
Concernant le sexage des poissons par génotypage, le prélèvement de nageoire caudale sera effectué sous anesthésie générale afin de limiter la douleur et le stress liés à la manipulation. Les manipulations seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, en limitant au maximum la durée de contention des animaux. Pour l’étude de la prolifération des cellules reproductrice de l’ovaire, un marquage par balnéation avec un marqueur de la division cellulaire sera utilisé. Cette méthode, peu invasive, permet un marquage systémique des cellules en division. Les conditions expérimentales seront établies à partir de protocoles déjà décrits dans la littérature chez des médaka juvéniles dans des conditions comparables, pour lesquels aucune altération majeure de l’état général des poissons n’a été rapportée. Les poissons seront régulièrement surveillés pendant la balnéation, et toute anomalie comportementale entraînera l’arrêt immédiat de la manipulation pour les poissons concernés. Des points limites adaptés seront appliqués tout au long du protocole. Tout poisson présentant des signes persistants de détresse ou d’altération de l’état général, tels qu’un déséquilibre de nage, une perte de réactivité, une hyperventilation, une altération marquée du comportement ou de l’alimentation, sera immédiatement euthanasié. Enfin, à l’issue de la balnéation, les poissons seront rapidement euthanasiés afin de permettre le prélèvement des ovaires pour les analyses prévues.
Choix des espèces
Le poisson médaka est un modèle couramment utilisé pour l’étude de la reproduction chez les poissons. Sa petite taille, sa reproduction régulière et la bonne connaissance de sa biologie en font une espèce particulièrement adaptée à l’étude du fonctionnement de l’ovaire. Les conditions d’élevage de cette espèce sont bien maîtrisées au sein des installations, ce qui permet de travailler dans des conditions stables et de limiter le nombre d’animaux nécessaires Les animaux seront utilisés à un stade juvénile d’environ 50 jours après la fécondation. À ce stade, les structures ovariennes sont suffisamment développées pour permettre l’étude de la multiplication des cellules reproductrices.