Procédures légères

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un tatouage et une biopsie d'oreille, des injections de tamoxifène puis une injection de cardiotoxine dans les muscles des deux pattes arrière pour provoquer une lésion, avec risque de boiterie et de douleurs musculaires persistantes. Le projet étudie les cellules souches qui réparent le muscle et le déclin de cette réparation avec l'âge. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne dépassent pas quelques jours et que la souris reste "essentielle" pour étudier la régénération musculaire.

Objectifs

L’objectif est de mieux comprendre les processus impliqués dans la régénération du muscle squelettique. Après la naissance, des cellules souches musculaires vont se placer en position satellite autour des fibres musculaires et sont appelées cellules satellites (CS). Elles constituent la réserve de cellules qui permet de réparer les muscles tout au long de la vie. En cas de lésion musculaire, les cellules satellites sont activées et se multiplient et permettent de réparer les fibres musculaires ou d’en former de nouvelles. Cependant, le potentiel de régénération du muscle squelettique décroit avec l’âge, ce qui participe au déclin de la masse musculaire. Des travaux précédents ont montré l’activation spécifique d’une signalisation cellulaire dans le muscle âgé. Pour comprendre les conséquences de cette dérégulation, un nouveau modèle de souris génétiquement modifié sera généré. Ce modèle permettra de cibler les cellules satellites adultes grâce à un système inductible par une molécule qui sera injectée à la souris adulte. La capacité de régénération du muscle sera évaluée en condition normale et lors d’une réponse à un dommage musculaire réalisé par une injection d’une molécule altérant l’intégrité du muscle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’altération de la capacité de régénération du muscle au cours du vieillissement. Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués et donc le développement de nouvelles perspectives diagnostiques ou thérapeutiques pour limiter le déclin de la masse musculaire au cours du vieillissement et dans les maladies chroniques.

Procédures

Tous les animaux seront tatoués au niveau des phalanges et subiront une biopsie d'oreille (1mm), à 21 jours; le temps des gestes par animaux sera < 1min. Tous les animaux recevront 4 injections consécutives à l’âge de 10 semaines environ, espacées de 24heures. 1 semaine après ces injections, un lot d'animaux recevra 1 injection dans un des muscles des membres inférieurs sous anesthésie générale de 1h30 à 2h obtenue par une injection. Toutes les souris seront mises à mort entre 3 jours et 28 jours après l'injection dans le muscle. Les injections ne durent que quelques secondes et sont réalisées par des personnels expérimentés.

Impact sur les animaux

Des nuisances seront liées à l'inconfort et la douleur lors de la contention pour le tatouage et la biopsie d'oreille, nécessaires à l'identification des animaux et le génotypage. Des nuisances seront liées à l'inconfort et aux douleurs des injections IP de tamoxifène associées à la contention et la blessure potentielle d'un organe au passage de l'aiguille. Des nuisances seront liées à l'inconfort et les douleurs liées à l'anesthésie, la réalisation d’une lésion musculaire par l’injection intramusculaire de la cardiotoxine dans un muscle spécifique des deux pattes postérieures. Les effets indésirables pourraient être le développement de boiterie et de douleurs musculaires persistentes, notamment chez les animaux mutants s'ils présentaient un défaut de régénération du muscle.

Devenir

mise à mort afin de collecter les muscles pour des analyses de biologie moléculaire, de biochimie, et d'histologie et la préparation de cultures de cellules.

Remplacement

Des expériences dans les cellules seront réalisées en amont quand cela sera possible. Cependant, les modèles in-vitro ne permettent pas une étude de traitement au-delà de quelques jours. Le modèle murin est essentiel pour produire les cultures primaires de cellules génétiquement modifiées et étudier le processus de régénération musculaire.

Réduction

Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs; le personnel est formé aux tests statistiques. Le maximum de données pouvant être généré à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une consultation approfondie de la littérature permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Si le processus de régénération musculaire est inhibé chez la souris mutante, alors les temps d'analyse les plus longs seront supprimés, le nombre d'animaux sera donc réduit.

Raffinement

Un personnel expérimenté pratiquera les injections sur les animaux. Des anesthésiques et analgésiques sont utilisés pendant les expérimentations afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux. Après anesthésie, les animaux seront placés dans une armoire chauffante jusqu’à leur réveil. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée après les injections et après la lésion musculaire pour détecter les signes de souffrance. Les animaux seront pesés 1 fois par semaine après le début des expérimentations et jusqu'à leur euthanasie. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront mis à mort immédiatement si signes de souffrance. Si les animaux mutants montrent des signes de souffrance liés à un défaut de régénération musculaire, la cinétique d'analyse des muscles après lésion musculaire sera écourtée.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d'animaux génétiquement modifiés. La physiologie musculaire des souris est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour que l’on puisse en tirer des données extrapolables. La souris est un modèle très accessible, de maintien aisé et manipulable génétiquement afin de répondre au questionnement scientifique. Le projet concerne des animaux adultes. Le muscle termine sa croissance aux alentours de 8 à 10 semaines, les animaux seront traités à l’âge de 10 semaines environ. A cet âge les cellules satellites ont fini de participer à la croissance musculaire et rentrent en dormance.

240 agneaux vont être utilisés, gardés vivants et engraissés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur coupe la queue à la pince hémostatique ou à l'élastique, cette dernière pouvant provoquer une douleur chronique jusqu'à quinze jours, puis on réalise jusqu'à douze prises de sang pour doser le cortisol et l'haptoglobine. Le projet mesure la douleur d'une pratique d'élevage courante et teste des analgésies utilisables par les éleveurs, en vue d'une fiche de "bonnes pratiques". Le porteur affirme qu'on "ne peut pas remplacer l'espèce ovine" pour étudier la douleur liée à cette pratique.

Objectifs

Des travaux ont été réalisés au niveau international pour objectiver la douleur au cours de la caudectomie chez les ovins (chirurgicale, au fer chaud ou au couteau) mais généralement en la réalisant conjointement à la castration. Aucune étude n’a été réalisée à ce jour en France sur la caudectomie des ovins (par pince hémostatique et élastique) et la prise en charge de la douleur lors de cette procédure. Or, la filière ovine a besoin de disposer d’éléments sur ce sujet pour identifier les leviers d’action qui permettront de faire progresser les éleveurs sur les pratiques mises en œuvre et la prise en charge de la douleur. Concernant la prise en charge de la douleur au cours de cette intervention, si la douleur aigüe provoquée par la caudectomie à la pince hémostatique semble possible à prendre en charge, la douleur chronique provoquée par la caudectomie à l’élastique semble plus complexe à gérer, cette douleur pouvant durer jusqu’à 15 jours post-intervention. Des méthodes de prise en charge de la douleur ont été testées dans différents pays mais sont couplées à la castration réalisée en même temps et leur faisabilité sur le terrain par les éleveurs du territoire reste à tester. Compte-tenu que ces procédures d’élevage vont être de plus en plus réglementées et que la prise en charge de la douleur au cours de ces interventions pourra être imposée dans un futur plus ou moins proche, acquérir des références sur la gestion de la douleur adaptée aux pratiques d’élevage en France semble indispensable. L’élaboration d’une fiche technique co- construite avec un groupe d’acteurs et visant à diffuser les bonnes pratiques de caudectomie des ovins et de prise en charge de la douleur permettra d’améliorer les pratiques mais également de communiquer sur ces bonnes pratiques de prise en charge de la douleur au cours de la caudectomie en France. L’objectif du projet est donc d’objectiver la douleur lors de la caudectomie des ovins par les méthodes les plus utilisées en France : la pince hémostatique et l’élastique. Le projet permettra aussi d’évaluer la prise en charge de la douleur et l’efficacité des analgésies possibles utilisables par les éleveurs.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés pour l’homme sont l’élaboration de bonnes pratiques de caudectomie des ovins et de prise en charge de la douleur qui seront diffusées via une fiche technique co- construite avec un groupe d’acteurs. Ces recommandations permettront d’améliorer les pratiques mais également de communiquer sur ces bonnes pratiques de prise en charge de la douleur au cours de la caudectomie en France. Cela contribuera aussi à améliorer le Bien-être des animaux en diffusant de meilleures pratiques.

Procédures

Les prises de sang pour le cortisol seront réalisées à -2min, 30 min, 45 min, 60 min, 90 min, 138 min après intervention, soit 6 prélèvements de 2 ml. Les prises de sang pour l’haptoglobine auront lieu une fois tous les 3 jours pendant les 15 jours de procédure soit 6 prélèvements de 1 ml par animal. Les prises de sangs seront sur 32 agneaux pour la première année et 88 agneaux pour la deuxième année. La caudectomie sera réalisée sur 12 lots de 16 animaux, soit 192 animaux.Un traitement analgésique est effectué 20 minutes avant la caudectomie et postérieurement à la première prise de sang le cas échéant. Il comprend : • Une anesthésie locale sur site de caudectomie : Procamidor® (20 mg/mL – principe actif : procaïne) par injection sous-cutanée en anneaux autour de la queue (environ 0.5 à 1 mL) à environ 0.5 à 1 cm en amont de l’endroit de pose de l’élastique. • Un traitement AINS : Metacam® (5 mg/mL – principe actif : méloxicam), injection intramusculaire à 1 mg/kg. Le poids pris en compte est celui de la pesée de mise en lot à J-1.

Impact sur les animaux

Les dommages de l’expérimentation sur l’animal ont été réduits au maximum grâce aux 3R : Remplacement : La caudectomie étant une pratique d’élevage, on ne peut pas remplacer l’espèce ovine pour la réalisation de celle-ci et l’étude de la douleur associée. Réduction : la taille des effectifs (avec 16 sujets par groupe expérimental) a été déterminée par un calcul d’effectifs et est optimisée pour garantir un nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour obtenir une bonne puissance statistique. Raffinement : Les conditions d’élevage des animaux seront optimales : les recommandations en matière de logement sont respectées : les parcs sont composés de 8 mères et de 16 agneaux. Ceux-ci auront le lait maternel durant la période expérimentale (qui a lieu avant le sevrage). Les agneaux seront en groupes sociaux et manipulés calmement. Il y a un abreuvoir et un râtelier pour 8 brebis.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux ne quittent pas leurs groupes et sont élevés afin d'être engraissés

Remplacement

La caudectomie étant une pratique d’élevage, on ne peut pas remplacer l’espèce ovine pour la réalisation de celle-ci et l’étude de la douleur associée.

Réduction

La taille des effectifs (avec 16 sujets par groupe expérimental) a été déterminée par un calcul d’effectifs et est optimisée pour garantir un nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour obtenir une bonne puissance statistique.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales : les recommandations en matière de logement sont respectées : les parcs sont composés de 8 mères et de 16 agneaux. Ceux-ci auront le lait maternel durant la période expérimentale (qui a lieu avant le sevrage). Les agneaux seront en groupes sociaux et manipulés calmement. Il y a un abreuvoir et un râtelier pour 8 brebis.

Choix des espèces

Le projet nécessite d’utiliser des animaux vivants afin de comparer les réactions (tant physiologiques que zootechniques et comportementales) des animaux après une caudectomie à l’élastique ou à la pince hémostatique et avec différentes méthodes de prise en charge de la douleur

448 souris vont être utilisées, tuées à l'issue de chaque procédure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, un groupe étant conservé pour entretenir la lignée. Elles subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau, un traitement dans l'eau de boisson qui peut faire perdre du poids et des tests comportementaux dont un apprentissage sur roue complexe avec isolement partiel pouvant provoquer des "troubles dépressifs". Le projet cherche à réactiver un levier moléculaire, TET1, pour "rajeunir" des cellules du cerveau et améliorer la mémoire de souris âgées, les retombées cliniques restant renvoyées au long terme. Le porteur indique que les organoïdes ne suffisent pas à saisir les fonctions cognitives et affirme qu'il reste "nécessaire" d'utiliser des souris.

Objectifs

La cognition et son déclin avec le vieillissement font partie intégrante des maladies psychiatriques et neurodégénératives liées au développement et à l'âge. Si les circuits neuronaux sont à la base de l'organisation cérébrale, une accumulation de preuves a désormais mis en évidence le rôle potentiel des cellules protégeants les neurones (les oligodencrocytes) dans la cognition, comme la mémoire et l'apprentissage. Récemment, un levier moléculaire (TET1) nécessaire à la réactivation de ces cellules de soutien a été observé comme déficitaire au cours du vieillissement. Nous avons ainsi développé une lignée de souris modélisant une perte de ce levier Tet1 dans les oligodendrocytes seulement, imitant donc un profil âgé, même dans les animaux jeunes. Dans ce projet, nous allons tentons de rajeunir ces oligodendrocytes en réactivant TET1, afin de tester si cela est suffisant pour améliorer les fonctions cognitives chez des animaux âgés. Ce projet est divisé en plusieurs étapes 1/ Caractériser l'efficacité et la spécificité de notre réactivation ; 2/ Caractériser l'effet de la réactivation de TET1 sur les fonctions de mémoire et d'apprentissage sur le modèle murin ; 3/ Identifier les cibles moléculaires et protéiques de TET1. En caractérisant l'effet de TET1 sur les oligodendrocytes et son potentiel rajeunissement de la cognition chez les souris vieillissantes, notre projet pourrait donner lieu à des développements cliniques à fort impact.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle de TET1 dans la réactivation - et l'identification des voies moléculaires de réactivation - des oligodendrocytes dans des modèles de souris âgées. À long terme : développer des stratégies translationnelles basées sur ce levier pour rajeunir rajeunir les cellules du cerveau et donc limiter les pertes de fonctions cognitives au cours du vieillissement et dans les maladies neurodégénératives. Le déclin de la cognition représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.

Procédures

Quelques souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille pour le génotypage. Ces souris seront aussi soumises à un traitement dans l'eau de boisson (2 semaines, une fois). Les souris seront soumises à des tests comportementaux (1 à 2 semaines, une fois). Les souris seront injectées chirurgicalement dans une zone du cerveau (chirurgie de 30 minutes, comprennat le temps pré- et post-opératoire, une fois). Les souris seront anesthésiées avant d'être euthanasiées (1 minute, une fois).

Impact sur les animaux

Lors du génotype avant sevrage ou pendant la chirurgie, on pourrait noter quelques saignements. Le traitement dans l'eau de boisson peut induire une perte de poids. Lors des tests comportementaux, les souris seront partiellement isolées et peuvent donc présenter des troubles dépressifs. Après la chirurgie, les animaux pourraient ressentir de la douleur, qui devrait etre limitée par les traitement anti-douleur prévus.

Devenir

Toutes les animaux expérimentaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Un groupe de souris sera conservée dans notre animalerie, afin de préserver la lignée de souris générée pour des études ultérieures.

Remplacement

Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans des modèles de cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions cognitives au niveau de l'organisme. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, nous exploitons des modèles in vitro de co-cultures primaires, de lignées cellulaires et de cellules pluripotentes humaines. En effet, nous allons d'abord optimiser notre protocole sur des lignées cellulaires Olineu, afin de limiter les étapes d'optimisation sur des cultures cellulaires primaires de souris.

Réduction

Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 5 à 10 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos groupes de souris seront donc composées de souris des deux sexes.

Raffinement

Les animaux sont sous la surveillance et l'observation quotidiennes de soigneurs animaliers formés et chargés de veiller à leur bien-être. Pour la chirurgie, les souris recevront une injection d'analgésique, une heure avant la chirurgie et deux fois par jour les 2 jours suivants. Les animaux seront anesthésié pendant toute la procédure. Les animaux seront placés sur un tapis chaufant pour maintenir leur température corporelle. Une pommade ophtalmique sera appliquée sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée et les yeux seront ensuite couverts pour éviter une exposition intense à la luminosité pendant la procédure. La chirurgie sera réalisée dans des conditions stériles (gants, outils, instruments,...). Après la chirurgie, les animaux seraont placés sous une lampe chauffante jusqu'au réveil. Des granulés alimentaires ramollis et de l'eau supplémentaires seront fournis à l'intérieur de la cage, afin de facilité leur alimentation et hydratation, et donc limiter leur perte de poids. Pour la procédure d'apprentissage de la roue complexe, les animaux seront hébergés individuellement jusqu'à 7 jours dans une cage enrichie, dans laquelle nous n'observons normalement aucun phénotype d'isolement social. A noter que l'isolement est ici partiel : les cages sont transparentes donc l'animal a des contacts visuels et auditifs avec ces congénères. Cependant, si nous observons un changement de comportement ou un manque d'intérêt pour la roue, l'animal sera exclu de la procédure et replacé dans une cage en groupe. Les souris peuvent perdre du poids quand leur eau de boisson est supplémentée. Si l'état général du corps atteint des points limites, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie.

Choix des espèces

Les modèles de souris sont pertinents car ils sont couramment utilisés dans les études comportementales portant sur les fonctions et les déficits cognitifs. Comparer des souris jeunes et âgées, ici à l'âge de 2 moisou de 18 mois respectivement, nous permet de caractériser au mieux le déclin des fonctions d'apprentissage et de mémoire avec l'âge. Ces âges sont idéaux pour notre étude, car les souris jeunes possèdent de bonnes capacités d'apprentissage et de mémoires, alors que les souris âgées présentent des capacités réduites.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit pendant un à trois mois un régime enrichi à 60 % de lipides pour développer une obésité avec insulinorésistance ou diabète, et toutes passent des mesures de composition corporelle qui les enferment seules dans un tube environ 80 secondes. La mise à mort sert à prélever sang et tissus pour situer une apolipoprotéine, l'ApoM, dans le tissu adipeux et son inflammation. Le porteur décrit des retombées de "connaissances théoriques" sur la biologie du tissu adipeux et indique que de nouvelles explorations physiologiques "nécessitent" le recours à l'animal.

Objectifs

L’obésité, caractérisée par un excès de tissu adipeux, s’accompagne à long terme de complications métaboliques et cardiovasculaires dont les mécanismes d’installation sont encore à clarifier. D'autre part, cette pathologie est décrite comme étant associée à une inflammation à bas niveau avec un recrutement de macrophages pro-inflammatoires. Longtemps considéré comme un tissu de réserve énergétique, le tissu adipeux est maintenant reconnu comme un organe central du métabolisme énergétique qui produit et sécrète des facteurs. Nommés adipokines, bénéfiques ou délétères, ces facteurs peuvent agir à distance ou au sein même du tissu. Une meilleure connaissance de ces adipokines participe à la compréhension des complications métaboliques associées à l'excès de masse grasse ainsi qu'à l'inflammation systémique ou adipocytaire souvent associée. Nous avons mis en évidence une nouvelle adipokine, l'ApoM,dont les caractéristiques fonctionnelles ont été très peu explorées dans le domaine de l’obésité; elle a été initialement décrite produite par le foie. Nous émettons l’hypothèse qu’une altération de la production de l'ApoM par le tissu adipeux pourrait contribuer au développement d’une inflammation locale voire sytémique. D'autre part, nous souhaitons étudier la localisation de cette adipokine au sein du tissu adipeux, mais également dans les adipocytes, cellulesconstituant majoritaires, ce qui pourrait nous aider à mieux comprendre son rôle dans ce tissu et cette cellule.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles conaissances théoriques sur la biologie du tissu adipeux et mieux caractériser le lien entre l'ApoM et l'inflammation d'une part et l'ApoM et la fonction lipolytique (cette activité consiste en l'hydrolyse des triglycérides, réserves énergétiques de l'organisme, mobilisés lors des périodes de déficit énergétique comme après un jeûne, un exercice physique,...) des tissus adipeux d'autre part.

Procédures

Les principales interventions sont les suivantes : alimentation de certains animaux par du régime enrichi en lipides à hauteur de 60% pendant 1 ou 3 mois; mesure de la composition corporelle de manière mensuelle sur tous les animaux de la procédure n°1, mesure qui dure en moyenne 80 secondes par animal.

Impact sur les animaux

Des nuisances seront à noter lors de la mesure des compositions corporelles des animaux qui sont alors contraints dans un tube et isolés de leurs congénères pendant environ 80 secondes. Des nuisances, liées à la mise en régime enrichi en graisses pendant plusieurs mois pourront survenir, tels que développement d'une obésité associée à une insulino-résistance ou à un diabète.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. En effet, le sang et de nombreux tissus seront prélevés pour des analyses d'expressions géniques, protéiques, de cytométrie en flux, histologiques ou immunocytochimiques de marqueurs ou cellules impliqués dans les processus inflammatoires ou permettant de visualiser des changements de localisation de notre apolipoprotéine d'intérêt.

Remplacement

Une corrélation négative entre l'expression de l'APOM dans les tissu adipeux blancs et l'indice de masse corporelle a été décrite chez l'Homme. Ainsi chez des personnes obèses présentant la plus forte inflammation le niveau de l'ApoM adipocytaire est grandement diminué par rapport à des sujets normo-pondérés pour lesquels le tissu adipeux est extrêmement peu inflammé. Pour mieux comprendre les liens entre ces deux phénomènes des analyses sont menées chez l'Homme mais de nouvelles explorations physiologiques nécessitent l'usage de modèles animaux. Ces expériences seront également complétées par des approches utilisant des cultures cellulaires et la mise en contact de milieux conditionnés d'adipocytes sur des lignées de macrophages.

Réduction

Grâce à l'utilisation du Minispec, appareil permettant de mesurer la répartition des masses grasse et maigre, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal mensuel de l'évolution des ces paramètres sans avoir à mettre à mort les animaux. Comme l'animal est son propre contrôle, des analyses statistiques appariées type test de Wilcoxon pourront être utilisées. Sinon, la plupart du temps nous utiliserons des analyses à comparaisons multiples (ANOVA à une ou deux voies) grâce à un logiciel que nous maîtrisons bien depuis plusieurs années.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie, dans des cahes sur portoirs ventilés en respectant le nombre maximal indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnets en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootcehnie soit par les expérimentateurs en charge du projet.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Les animaux sont mis en régime dès leur sevrage et seront hébergés ainsi au maximum pendant 3 mois. Lors d'une précédente étude, nous avons pu montrer, par l'expression de quelques marqueurs, que le pic de l'inflammation était atteint dans les conditions décrites ci-dessus. Pour ce qui concerne la localisation cellulaire d'ApoM, il n'est pas nécessaire d'attendre si longtemps. Le tissu adipeux doit rester dynamique et répondeur aux divers stimulis, ce qui est constaté chez des animaux jeunes.

2 185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent en intraveineuse des cellules tumorales humaines ou murines pour reproduire des leucémies, des lymphomes ou des métastases sanguines, puis subissent des injections répétées, des prélèvements de sang à la veine saphène et des séances d'imagerie sous anesthésie deux à trois fois par semaine. Le projet ne teste aucun traitement, il cale les conditions de greffe comme la densité cellulaire et la souche en amont d'études pharmacologiques menées ailleurs. Le porteur affirme que la recherche d'efficacité chez l'animal reste "indispensable" et présente cette mise au point comme un moyen de réduire le nombre d'animaux des études futures.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste en la mise en place d’un modèle tumoral « orthotopique » ou « métastatique » chez la souris par injection de cellules tumorales (humaines ou murines) par voie intraveineuse (IV) dans le but de mimer des tumeurs hématologiques (leucémies, lymphomes,…) ou des métastases expérimentales en « court-circuitant » les premières étapes du phénomène métastatique pouvant provenir de tumeurs solides (migration dans la matrice extracellulaire, intravasation dans le vaisseau sanguin) pour ne mimer que la dissémination dans la circulation sanguine. La mise au point et la caractérisation de ce modèle se situe en amont des études d’activité et d’efficacité anti-tumorale, afin de définir les caractéristiques de croissance, les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, souche de souris, …), ainsi que la durée limite de l’étude sur laquelle nous pourrons réaliser les études pharmacologiques ultérieures. Ces études de mises au point sont primordiales puisqu’elles permettent d’acquérir une bonne connaissance des modèles et constituent un paramètre essentiel pour une évaluation pharmacologique optimale de nos produits anti-cancéreux. Des cellules cancéreuses humaines ou murines vont être greffées par injection intraveineuse, chez des souris soit immunodéprimées (c’est-à-dire avec un système immunitaire déficient voire absent) pour permettre la greffe de tumeurs humaines, soit immunocompétentes (c’est-à-dire avec un système immunitaire parfaitement fonctionnel) pour permettre la greffe de tumeurs murines. Ce second modèle permettra l’évaluation de produits anti-cancéreux ayant recours au système immunitaire pour être actif et efficace (comme l’immunothérapie ou les thérapies ciblées). Ce projet décrit deux modalités de suivi de la dissémination tumorale au cours du temps ; la première, qui sera privilégiée, utilise l’imagerie optique, mais ne peut être mise en œuvre que selon la disponibilité de lignées tumorales génétiquement modifiées pour être bioluminescentes. La seconde se basera sur des analyses ex-vivo après prélèvement des tissus et organes des souris

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en oncologie. Les bénéfices attendus du projet sont la détermination des conditions optimales de greffe en intraveineuse (limitation de la variabilité inter individuelle et temps d’expérimentation correct pour pouvoir ensuite faire une étude pharmacologique) pour ensuite évaluer et sélectionner sur ces modèles, le meilleur candidat médicament (études réalisées dans le cadre d’un autre projet autorisé) . Ces modèles permettront de déterminer l’indication thérapeutique du candidat médicament, en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules pour son développement clinique futur.

Procédures

Injection intraveineuse des cellules tumorales sur animal vigile (1 fois, moins de 30 secondes)) Injection intra-péritonéale de l'agent réactif pour les mesures en bioluminescence , 2 à 3 fois par semaine (moins de 10 secondes) ; 1 à 2 prélèvements de sang par microsampling par semaine à la veine saphène (moins de 30s) suivant les recommandations de la structure de bien-être animale ; anesthésie générale pour l'imagerie par bioluminescence, quelques minutes, 2-3 fois/sem.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress/douleur peut provenir : De l’envahissement tumoral/ mestastases lié au modèle pathologique recherché. De la greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse. La contention d’une durée maximale de 30s peut générer du stress et l’injection (moins de 30s) de la douleur. De l’injection en intra-péritonéale du substrat réactif (luciférine) pour les mesures d’imagerie par bioluminescence : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur. Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de tondre les pattes arrières de l’animal. La contention ainsi que la tonte de la patte d’une durée maximale de 30s peuvent générer du stress. Du prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur. De l’induction de l’anesthésie pour la mesure d’imagerie : l’induction qui est rapide peut générer du stress.

Devenir

Toutes les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude et les organes et le sang pourront être prélevés afin de vérifier l’envahissement tumoral et/ou métastatique via des analyses qualitatives.

Remplacement

La recherche d’efficacité de candidats chez l’animal reste aujourd’hui indispensable, c’est pourquoi les conditions expérimentales doivent être le plus possible fiabilisées afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux pour les études pharmacologiques ultérieures. Ce projet permet de déterminer ces conditions.

Réduction

Le système d’imagerie optique est non invasif et permet de suivre un même animal au cours du temps, réduisant considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. Concernant les procédures pour lesquelles nous utiliserons des lignées tumorales non génétiquement modifiéesne permettant donc pas des mesures par imagerie bioluminescence, si les méthodes de détection des cellules tumorales dans le sang prélevé par microsampling (prélèvement de petits volume de sang, répétés au cours du temps sur un même animal) sont validées et corrélées avec l’envahissement tumoral réel, alors cette méthode pourra permettre d’effectuer le suivi de l’évolution sur un même animal et réduira donc considérablement le nombre d’animaux utilisés. Ce projet sert à définir les conditions expérimentales optimales de greffe et leurs caractéristiques de progression tumorale en amont des projets de recherche de traitements efficaces. Il contribue ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ces futures études en permettant une bonne connaissance des caractéristiques expérimentales comme la variabilité et de définir ainsi les designs et effectifs adaptés afin de garantir la réussite de ces études. Un accompagnement par le service bio-statistiques permettra de déterminer les meilleures conditions de expérimentales.

Raffinement

L’évaluation de la dissémination tumorale par bioluminescence est une technique non invasive pour l’animal et qui ne requiert qu’une simple anesthésie de courte durée. Le suivi du développement tumoral en imagerie sera effectué 2 à 3 fois/semaine, sous anesthésie gazeuse, sur une surface plane et thermostatée. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence. La mesure du poids corporel sera effectuée 2 à 3 fois/semaine ainsi que le suivi des signes cliniques. Cette surveillance accrue vise à suivre et anticiper l’application des points limites si nécessaire. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de les protéger de tout risque d’infection et/ou contamination. Des prélèvements de sang « en microsampling » peuvent être mis en œuvre afin de réaliser le suivi de la dissémination cellulaires dans le cas où l’utilisation de l’imagerie n’est pas possible et que la détection des cellules dans le sang est possible. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement, peu invasive, rapide, et pour de très petits volumes, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal. Dans le cas de greffes de cellules sans possibilité d’imagerie, les organes et tissus d’intérêt doivent etre prélevés en fin d’étude. Ces prélèvements terminaux sont réalisés sous anesthésie complétée d’une analgésie et sans réveil des souris. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Un enrichissement de milieu (éléments de nidification) adapté va également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage étudiés et donc déployés chez la souris que chez le rat. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie. Le choix du modèle animal est dicté par la tolérance des cellules à proliférer dans l’organisme de l’animal (souris immunocompétentes et/ou immunodéprimées) et le choix de la souche par les études de dissémination tumorale qui permettent de définir les conditions optimales de greffe. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous n’excéderons pas 10 mois d’âge à la fin des études.