Procédures légères
Rôle de l’inflammation dans l’obtention d’un modèle animal pertinent du Moyamoya, une maladie vasculaire cérébrale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 087 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère. Porteuses de mutations liées à la maladie de Moyamoya, elles reçoivent dès l'âge de huit jours, sur animal vigile, des injections mimant une infection, puis des prélèvements sanguins avant mise à mort et prélèvement des organes. Le porteur décrit un stress de séparation, une douleur transitoire et des tremblements possibles si la maladie se développe, et ajoute vingt souris pour la formation de deux expérimentatrices. Il cherche à obtenir le premier modèle animal de cette maladie et juge l'étude "envisageable qu'in vivo".
Objectifs
L’angiopathie de Moyamoya (MMA) est une maladie rare des vaisseaux du cerveau. Cette maladie se définie par : 1/une diminution progressive du diamètre des gros vaisseaux qui apportent le sang au cerveau (artères localisées à la base du cerveau) qui peut atteindre l’occlusion et qui provoque un manque d’oxygène dans le cerveau, 2/la présence d’un réseau de petits vaisseaux fins et anormaux à la base du cerveau, qui se sont probablement formés pour compenser le manque d’oxygène cérébral entrainé par l’occlusion des artères cérébrales atteintes d’anomalie de MMA. Les patients MMA peuvent avoir des accidents vasculaires cérébraux. Les mécanismes de développement de la maladie sont encore largement inconnus aujourd’hui et aucun modèle animal n’existe. Une vingtaine de gènes ont déjà été identifiés comme responsables du MMA chez l’homme. En parallèle de ces données génétiques, de récentes études suggèrent qu’une infection virale ou bactérienne pourrait être un élément déclencheur du MMA chez les patients. Pour avancer dans la compréhension des mécanismes responsables du développement du MMA, l’obtention d’un modèle animal est cruciale aujourd’hui. L’objectif de ce projet est d’obtenir un modèle de MMA chez des souris qui porteront des mutations dans deux gènes déjà identifiés chez des patients MMA. Une infection bactérienne ou virale sera mimée (pour provoquer une inflammation) chez ces souris mutées pour comprendre si cela déclenche ou non le développement du MMA comme suggéré dans les études cliniques chez l’homme. Ce projet propose de caractériser les vaisseaux cérébraux chez ces souris mutées et soumises à une inflammation à la recherche d'une anomalie des vaisseaux du cerveau qui ressemblerait à celle qui se développe chez les patients atteints de MMA. La définition de ce qui serait alors le premier modèle animal de MMA permettrait de faire avancer la compréhension des mécanismes responsables du développement de cette maladie et d’envisager de nouvelles approches pour stopper l’évolution de la maladie chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les mécanismes responsables du développement de la maladie sont largement inconnus aujourd’hui. Il n’existe aucun modèle animal de MMA. L’obtention d’un modèle de MMA chez la souris permettrait : 1-d’étudier comment se développent des lésions MMA au niveau des vaisseaux du cerveau en suivant leur évolution au cours du temps et 2-de mieux comprendre les mécanismes responsables du développement de la maladie. Il est par exemple important de comprendre si l’inflammation provoquée par une infection virale ou bactérienne peut déclencher la maladie. A plus long terme, comprendre comment se développent les lésions des artères du cerveau chez les patients MMA permettra d’envisager des approches médicamenteuses pour limiter voire stopper le développement de la maladie chez les patients.
Procédures
L’ensemble des animaux du projet sera soumis à deux injections en intra-péritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale) d’un composant mimant une infection virale ou bactérienne à 8 jours et 15 jours de vie. L’injection est rapide (30 secondes/souriceau) et réalisée sur animal vigile (c’est-à-dire conscient, en éveil) et sans anesthésie. Les animaux analysés au 15ème jour après la naissance seront euthanasiés et le sang et les organes seront prélevés en post-mortem. Les autres animaux seront analysés à 1, 2, 4 et 6 mois. Un à 3 prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés entre l’âge de 1 et 6 mois, au niveau de la veine faciale (manipulation totale d’1 min/animal). A la fin de l’expérimentation, l’ensemble des animaux sera soumis à une analgésie et à une anesthésie générale. Un petit groupe de souris recevra une injection dans le sinus veineux situé à côté de l’œil, d’un marqueur fluorescent de l’intérieur des vaisseaux après l’anesthésie. Puis, une surdose d’anesthésie sera administrée. Le sang sera récupéré dans la cage thoracique avant de débuter une perfusion intracardiaque de liquide pour éliminer le sang contenu dans les vaisseaux. Les organes seront prélevés post-mortem.
Impact sur les animaux
La séparation des petits de leur mère au 8ème et au 15ème jour après la naissance pour procéder à leur injection peut entrainer un stress transitoire. Les injections réalisées chez ces souriceaux peuvent causer une douleur transitoire et locale. L’inflammation induite peut entraîner une déshydratation transitoire des petits. Si la maladie de moyamoya se développe, les animaux atteints pourraient présenter des tremblements.
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort à l’issu de la procédure, soit au maximum 1067 animaux. 20 animaux supplémentaires ont été ajoutés pour permettre la formation de deux expérimentatrices au prélèvement sanguins en sous-mandibulaire. Ces 20 animaux seront euthanasiés à l’issu de la réalisation du prélèvement sanguin.
Remplacement
Ce projet consiste à étudier les liens potentiels existants entre la présence de mutations dans certains gènes, l’inflammation et le développement de la maladie cérébro-vasculaire de MMA. Il requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet possédant à la fois un système immunitaire et des vaisseaux sanguins dans le cerveau dans un environnement physiologique normal. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux total nécessaire a été prévu pour être limité au maximum. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par des calculs statistiques appelés tests de puissance, issus des résultats déjà connus d’études précédentes. Deux petits d’intérêt seront obtenus par portée et les autres petits des mêmes portées seront tous considérés comme des animaux contrôles. Afin de pallier l’éventuelle mortalité induite par le protocole d’inflammation chez le souriceau, 10% d’animaux supplémentaires sont ajoutés par groupe. Ce taux ne sera sans doute pas atteint dans ce projet puisque le protocole d’induction d’inflammation est plus modéré et réalisé à un stade de développement plus tardif que ceux utilisés pour calculés ces 10% dans des travaux déjà publiés. La caractérisation des vaisseaux cérébraux et rétiniens sera réalisée en priorité dans les groupes de 1 mois et 6 mois. Si aucune anomalie vasculaire n’est observée à 6 mois, les autres groupes ne seront pas réalisés.
Raffinement
Les mères gestantes sont isolées avant la mise-bas, des mouchoirs en papier sont mis à leur disposition pour la confection du nid. Avant chaque manipulation des petits, la mère est isolée dans une cage le temps strictement nécessaire à la procédure. Les gants des expérimentateurs sont passés dans la litière sale pour atténuer leur odeur avant la manipulation des petits. Le nid confectionné par la mère n’est pas détruit, les petits sont manipulés un par un sont tous redéposés dans le nid avant réintroduction de la mère. Le sevrage est effectué après 21 jours de vie, avec un maximum de 6 animaux du même sexe par cage. L’identification des animaux d’intérêt et des animaux contrôles se fait par la technique de génotypage (technique permettant de déterminer la présence ou l’absence de mutations dans les gènes étudiés) réalisée sur des poils prélevés au moment du sevrage des animaux. L’enrichissement de chaque cage est systématique avec du papier absorbant et la présence de petites maisons. Tous les animaux concernés par les procédures sont observés quotidiennement. Ils feront également l’objet d’un examen détaillé hebdomadaire par une personne responsable du projet. L’aspect général (qualité du pelage, absence de larmoiements des yeux, gonflement de l’abdomen), le comportement de l’animal (déplacement, prostration, agressivité) et le poids seront analysés pour déceler précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (suivi définit en fonction de l’âge). En cas de signes de souffrance décelés, un traitement antalgique sera administré. Dans le cas d’une persistance au-delà de 2 jours, l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Choix des espèces
Les vaisseaux du cerveau chez la souris sont très proches de ceux trouvés dans le cerveau humain. Par ailleurs, différentes lignées de souris mutées dans l’un des gènes responsables du moyamoya chez l’homme sont disponibles. Les animaux seront utilisés à différents âges au 8ème et 15ème jours de vie (pour correspondre au moment de la naissance et au jeune enfant chez l’homme) pour l’induction et la caractérisation de l’inflammation et à 1, 2, 4 et 6 mois pour la caractérisation des vaisseaux cérébraux/rétiniens pour pouvoir suivre le développement au cours du temps des anomalies vasculaires. Les groupes 1 mois et 6 mois seront réalisés en premier. En l’absence d’anomalie des vaisseaux ressemblant aux anomalies vasculaires des patients Moyamoya les autres points ne seront pas réalisés.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
18 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie du bout de la queue ou de l'oreille sous simple contention, geste que le porteur décrit comme une douleur légère avec un stress lié à l'immobilisation. Les souris sont gardées vivantes après le prélèvement, leur devenir dépendant ensuite du génotypage, sélection pour d'autres projets, maintien des colonies, ou mise à mort pour prélèvement de tissus ou faute d'usage. Il présente la biopsie comme la méthode la plus performante pour identifier les lignées modifiées et entretenir ces élevages.
Objectifs
Le laboratoire participe à plusieurs projets qui nécessitent le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Ce projet a pour objectif d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Chaque animal, identifié par tatouage aux doigts ou par injection de nanopuces, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie de bout de la queue ou d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour différents projets de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) menés au laboratoire ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; - sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.
Procédures
Une biopsie de la queue ou un bout d’oreille (durée : quelques secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement pourra être envisagé.
Impact sur les animaux
Les biopsies de queue ou d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche (inclus dans d'autres demandes d’autorisation de projet); b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie de queue ou d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Les personnels de l’animalerie établissent, en concertation avec le responsable de la lignée, les plans d’élevage en amont, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et très efficaces. Le temps de génération d’une lignée est court (3 mois) et son élevage en laboratoire simple. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 8 jours. L'essentiel des lignées sont génotypées à cet âge pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.
Analyse d‘une protéine d‘intérêt et de ses variants dans la prolifération de l’ovaire et du testicule chez la souris embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
294 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes reçoivent une injection intrapéritonéale, précédée pour une partie d'un gavage, puis sont tuées quatre heures plus tard pour prélever les embryons et analyser leurs gonades. Le porteur signale un stress de contention et des altérations possibles au site d'injection, sans autre nuisance déclarée. Il cherche à identifier les gènes de la détermination du sexe et affirme que les cultures cellulaires ou organoïdes ne reproduisent pas le développement dynamique de l'organe, ces modèles n'existant "que chez la souris".
Objectifs
Chez l’homme (et la souris) l’appareil génital comprend différents organes, dont les gonades qui sont les organes producteurs des cellules reproductives ou gamètes. Au cours du développement, les gonades indifférenciées vont se différencier en testicule ou en ovaire selon le sexe de l’embryon grâce au processus de détermination du sexe, initiant ainsi tout le développement sexuel de l’individu. Tandis que le gène SRY, responsable de l'initiation du développement testiculaire, a été identifié il y a plus de 30 ans, le déterminant ovarien reste inconnu. Cela montre notre méconnaissance des mécanismes qui contrôlent la détermination du sexe. Notre objectif est d’avancer dans la compréhension des mécanismes moléculaires de la détermination du sexe. Chez l’homme, les mutations de certains gènes induisent des anomalies du développement de la gonade suggérant qu’ils sont impliqués dans la détermination du sexe. Cependant leur mécanisme d’action reste à élucider. Nous analyserons l’impact des mutations des gènes impliqués dans le déterminisme sexuel sur la prolifération et la différenciation cellulaire des gonades de souris portant les mêmes mutations. Cela va permettre d’approfondir notre connaissance des gènes impliqués dans la détermination du sexe mais aussi d’identifier les causes de certains des nombreux cas de troubles du développement sexuel qui n'ont pas encore trouvé d'explication à ce jour.
Bénéfices attendus
De nombreuses pathologies de la détermination du sexe restent incomprises en raison de notre méconnaissance des réseaux génétiques contrôlant ce processus, et les cliniciens restent souvent sans réponse quant au diagnostic et à la prise en charge de bébés atteints d’anomalies du développement sexuel. Ce travail permettra à terme d'avancer dans la compréhension de ces pathologies et de proposer des solutions thérapeutiques et un suivi appropriés des problèmes d'insuffisances hormonales, d'infertilité (devenue un problème majeur en santé publique) et des prédispositions aux cancers gonadiques des patients.
Procédures
Des femelles gestantes seront injectées une seule fois dans la cavité abdominale avec un produit qui permet de suivre la prolifération cellulaire puis mises à mort 4 heures après l’injection pour prélever les embryons et analyser leurs gonades. Cela concerne 240 souris. Dans d’autres cas les femelles (54) seront d’abord soumises à l’administration d’un produit par gavage oral (pour inactiver des gènes spécifiquement dans les gonades embryonnaires) à deux reprises à 24 heures d’intervalle puis à l’injection du produit qui permet de suivre la prolifération cellulaire avant d'être mises à mort 4 heures après l’injection pour prélever les embryons et analyser leurs gonades. Aussi bien l’injection que le gavage oral sont réalisées en 20 à 30 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Le gavage oral nécessite une contention, qui peut induire un stress temporaire. Cette procédure est utilisée en routine au laboratoire, ce qui limite le temps de contention. Les injections par voie intra-péritonéale peuvent entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, ...).
Devenir
Toutes les femelles gestantes traitées seront mises à mort afin de prélever les embryons aux stades embryonnaires précoces nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Ce projet a été élaboré et sera réalisé dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est essentiel pour la biologie du développement et l'étiologie de la différenciation sexuelle: en effet, les techniques de culture cellulaire ou organoïdes ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique de certains organes qui nécessite vascularisation et contexte tridimensionnel et ont montré leurs limites en aboutissant à des résultats erronés. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont élaborées, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats reproductibles nous estimons que nous aurons besoin de 8 embryons par expérience et par génotype, ce qui correspond à trois réplicats pour l’histologie et cinq réplicats pour les analyses d’expression des gènes. En cas d’imprévus, nous anticipons de collecter 10 embryons par expérience et par génotype. Cependant dès que nous obtiendrons des résultats statistiquement significatifs, nous arrêterons nos expériences.
Raffinement
La qualité de la contention, l’usage d’un matériel autoclavable permet d’assurer une un gavage une injection intra-péritonéale efficaces et rapides, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel a été formé pour cela. Les solutions pour injection intra-péritonéale et pour gavage sont maintenues à la température corporelle de 37°C pour éviter tout inconfort de la femelle. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences. Tout comportement anormal indiquant une souffrance constitue un point limite et entrainera la mise à mort immédiate. Les animaux seront hébergés par deux ou par trois dans des cages comportant différents types d’enrichissement comme des objets à ronger et des igloos pour se faire un nid de façon à garantir leur bien-être et leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier ces modèles d’ablation/gain-de fonction conditionnelle inductible dans la souris. Ces modéles n’existent que chez la souris. Les femelles gestantes en procédure seront mises à mort à différents moments de la gestation : 10.5 jpc (jours post conception) (début de la différenciation gonadique), 11.5 jpc (détermination du sexe gonadique et début de la différenciation des cellules testiculaires), 12.5 jpc (début de la morphogenèse testiculaire et différenciation des cellules ovariennes), 13.5 jpc (initiation de la méiose chez la femelle). C’est seulement dans les lignées conditionnelles inductibles que nous étudierons la prolifération des cellules germinales à 13.5 jpc (1 stade de plus que dans les autres lignées).
Evaluation de probiotiques pour contribuer à l’établissement approprié du microbiote précoce chez le nouveau-né 2/2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
539 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Colonisées avec des fèces humaines puis réparties entre régimes riches et pauvres en fibres, elles subissent des gavages répétés et des prélèvements de fèces sur quatre générations, pour tester une souche probiotique. Le porteur les fait tuer parce que leur microbiote fortement modifié les rend inéligibles à d'autres essais. Il affirme que le transfert multigénérationnel du microbiote ne peut pas être simulé in vitro.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la capacité d’une bactérie à améliorer la récupération du microbiote intestinal altéré par un régime pauvre en fibres sur plusieurs générations. La colonisation microbienne du nouveau-né joue un rôle fondamental en santé humaine car elle est un facteur clé dans la mise en place des systèmes digestif, métabolique et immunitaire. Lorsque ce processus est perturbé, il peut y avoir une prédisposition à développer des maladies dites ‘non transmissibles’ telles que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), les allergies et l'obésité plus tard dans la vie. Cette colonisation est fortement influencée par la transmission du microbiote mère-nouveau-né. Les modifications du microbiote accumulées au cours de la vie d'une mère peuvent être transmises à sa progéniture. Une étude récente a montré que des souris ayant reçu un régime pauvre en carbohydrates accessibles au microbiote (microbial accessible carbohydrates, MAC, c’est-à-dire des fibres), une caractéristique des régimes occidentaux, affiche une capacité réduite à transférer les bactéries digérant les MAC d'une génération à l'autre. Ceci entraine un appauvrissement du microbiote intestinal, qui peut alors présenter une fonctionnalité dégradée. Au cours des premières générations, la réintroduction de MAC alimentaires peut restaurer le microbiote ; en revanche, après quatre générations, une telle récupération n'est possible que si ces bactéries manquantes au sein du microbiote sont introduites aux côtés des MAC. Ce projet propose de tester une souche probiotique candidate, isolée de fèces de bébé sain afin d’évaluer sa capacité à limiter ou restaurer l’appauvrissement du microbiote. Pour cela, nous allons coloniser des souris libres de germes en délivrant une solution de fèces humaines provenant de donneurs adultes sains. Les souris seront séparées en 3 groupes : régime riche en fibres, un régime pauvre en fibres et régime pauvre en fibres mais avec un traitement probiotique. Des souris vont être utilisées pour obtenir des portées de souriceaux sevrés sous les régimes respectifs de leurs parents. Cette stratégie d’élevage sera répétée pendant quatre générations. Dans une deuxième partie de projet, le probiotique candidat sera administré à la quatrième génération de souris (ayant consommé un régime pauvre en fibres afin d’évaluer sa capacité à restaurer les bactéries perdues lorsqu’il est réintroduit avec des MAC.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est d’évaluer la capacité d’une potentielle souche probiotique à améliorer la résilience du microbiote intestinal altéré par un régime pauvre en fibres sur plusieurs générations, lorsqu’elle est réintroduite en même temps que les MAC. De manière plus générale ce projet nous permettra d’apporter de nouvelles connaissances concernant le processus d’acquisition du microbiote intestinal et sa transmission à travers les générations.
Procédures
Gavages (- de 5 minutes par administration sur animal vigile): - 3 au total par souris sur 5 jours : 92 souris. - 1 jour sur deux pendant 3 semaines (11 au total) : 110 souris - 1 jour sur deux (3 au total) : 22 souris Prélèvement de fèces (environ 5 minutes par prélèvements, sur animal vigile) : - 2 fois par semaine : 4 prélèvements (92 souris) - 1 fois par semaine : 15 prélèvements (92 souris) 16 prélèvements (100 souris) 16 prélèvements (123 souris) 23 prélèvements (66 souris)
Impact sur les animaux
Les administrations intragastriques génèrent une douleur légère brève, pendant quelques secondes. Le transport d’une animalerie à l’autre peut générer un peu de stress pendant le transport (quelques minutes entre les animaleries) et après celui-ci, le temps que les animaux s’acclimatent. Les prélèvements de fèces peuvent causer aussi un peu de stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car, ayant subi d’importantes modifications du microbiote, ils sont inéligibles pour être inclus dans d’autres essais
Remplacement
Notre projet porte sur la primo colonisation et le transfert multigénérationnel du microbiote intestinal, ceci met en jeu des interactions complexes qui ne peuvent pas être simulées in vitro.
Réduction
Nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. En se basant sur notre paramètre principal, l’alpha-diversité du microbiote, nous voulons mettre en évidence une différence du même ordre de grandeur que celle de l’écart-type. Dans ce cas, les tables pour comparer deux groupes de moyennes pour une variable continue (Snedecor et Cochran 1989) indiquent un besoin de 22 animaux par groupe.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés quotidiennement. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger. Le matériel que nous utilisons (sonde de gavage) est évidemment adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Le transport des animaux d’une animalerie à l’autre se fait sur un temps de quelques minutes (500m à parcourir). Les animaux seront placés dans des containers opaques contenant un peu de leur litière d’origine et leur nid pendant ce transport afin de limiter le stress occasionné. Les containers sont généralement portés, ce qui génère peu de vibrations. Enfin, toutes les personnes manipulant les animaux sont formées et compétentes pour ce type d’expérimentation.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Le besoin de travailler en environnement axénique (complètement stérile), principalement en isolateurs, compatibles avec la taille des animaux, constituent des facteurs imposant le choix de cette espèce animale. La lignée de souris utilisée a été sélectionné car elle a de fortes performances de reproduction et a une bonne taille de portée (6.4 nouveaux nés en moyenne). Les animaux libres de germes seront utilisés entre 5-7 semaines quand il s’agit de reproduire les souris àun âge optimal après les changements successifs de régime alimentaire . Les souris seront utilisées du stade du nouveau-né au stade adulte, durant la gestation, le sevrage et l’allaitement quand il s’agit de l’élevage.
Étude fonctionnelle des gènes d’une famille de facteurs de transcription chez le poissons-zèbre pour l’étiopathogénie de la scoliose idiopathique-EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
780 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Trois lignées mutantes sont créées par inactivation de gènes, avec un prélèvement de nageoire caudale sous anesthésie et des imageries au micro-scanner à huit, douze et seize semaines, pour chercher si ces mutations reproduisent une scoliose. Le porteur annonce comme phénotype attendu une possible déformation de la colonne sans empêcher la nage ni l'alimentation, et euthanasie les poissons présentant des anomalies handicapantes. Il retient le poisson zèbre pour sa colonne longitudinale autorisant une torsion axiale, absente chez les modèles quadrupèdes.
Objectifs
La scoliose, dite idiopathique, qui touche près de 3 pourcents des sujets selon les régions géographiques, comporte une composante génétique. Cependant, les modalités exactes de transmission ne sont pas clairement établies. L’hypothèse sous-tenant le projet « scoliose et génétique » est que s’il existe des gènes de prédisposition à la scoliose « idiopathique », une analyse génétique poussée de familles scoliotiques présélectionnées par leur arbre généalogique permettra de détecter de nouvelles mutations spécifiquement associées à la pathologie par comparaison entre patients atteints et apparentés « sains ». Cette analyse a permis de découvrir une mutation d’un gène codant une protéine impliquée dans la transcription de l’ADN chez plusieurs personnes atteintes de scoliose idiopathique dans deux familles indépendantes. Chez le poisson-zèbre, il existe trois gènes qui pourraient être l’homologue de ce gène chez l’homme. Nous allons donc inactiver ces trois gènes indépendamment afin de générer trois lignées de mutants poissons-zèbres. Les mutants poissons-zèbres ainsi générés seront par la suite analysés cliniquement par l’imagerie afin de vérifier l’absence ou la présence de scoliose chez ces animaux. De ce fait, nous souhaitons utiliser le poisson-zèbre comme modèle animal pour étudier le rôle fonctionnel de cette protéine, et son implication dans la physiopathologie de la scoliose idiopathique. (ce projet se fera dans 2 établissements utilisateurs)
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est la validation du gène exploré dans la genèse de la scoliose idiopathique. Cette hypothèse serait renforcée par le développement de scolioses chez les mutants ainsi créés. La validation de ce variant permettrait d’avancer dans la compréhension de la genèse des scolioses idiopathiques (physiopathologie) et éventuellement à long terme d’avancer dans la prédiction de progression des courbures scoliotiques découvertes. En effet, la progression de l’identification des mécanismes génétiques causaux à la scoliose dite « idiopathique » permettrait de pouvoir proposer aux patients chez qui une scoliose est découverte un séquençage génomique précoce de manière à avoir une meilleure connaissance du risque et donc d’adapter le traitement des patients (agressivité du traitement orthopédique par corset, nécessité de chirurgie correctrice).
Procédures
EU1 : Afin d’identifier le type de mutation porté par les poissons, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale sera réalisé sous anesthésie générale afin de minimiser la souffrance des animaux. Un seul prélèvement de quelques millimètre sera effectué par animal, la manipulation dure 1-2 minutes. Cette intervention n’entraîne pas de séquelles impactant la nage ou les capacités d’alimentation. EU2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (UE1) jusqu’au laboratoire d’imagerie (EU2) pour la réalisation d’une imagerie micro-scanner à 8,12 et 16 semaines de vie. La durée est de 30 minutes maximum par trajet. L’analyse par imagerie micro-scanner, anesthésie incluse aura une durée totale de 3 à 4 minutes. Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Concernant la création d’une lignée mutante, le phénotype (Ensemble des caractères apparents d'un individu) attendu causerait éventuellement une déformation de la colonne vertébrale, il ne devrait pas y avoir d’impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter (classe légère). L’inactivation d’un gène codant pour une protéine qui est impliquée dans la synthèse des neurotransmetteurs pourrait entrainer des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance et leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer, bien qu’ils puissent être de taille plus petite ou avoir un axe corporel incurvé ou déformé. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique est une petite plaie de quelques millimètres suivie ensuite d’un processus cicatriciel, indolore et capable de se regénérer en quelques jours. Le transport jusqu’au lieu du scanner ainsi que la réalisation des imageries peuvent être source de stress ou d’angoisse pour les poissons. Le protocole d’imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin de maintenir les poissons immobiles, ce qui peut entrainer un risque anesthésique. Les animaux sont placés en quarantaine jusqu’à la fin du protocole d’imagerie puis euthanasiés afin d’éviter toute contamination par d’éventuels pathogènes de l’aquarium principal.
Devenir
Nous générons au total 780 animaux, 180 animaux porteurs d’une mutation des gènes cibles seront conservés à l’animalerie. Les autres animaux (soit 600 animaux) seront euthanasiés une fois la génération d’une lignée de mutation de troisième génération, stable sur le plan génétique soit établie. Ces 180 animaux seront euthanasiés après la procédure d’imagerie micro-scanner, un retour de quarantaine au système principal de l'animalerie étant impossible par sécurité sanitaire.
Remplacement
Les études sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la colonne vertébrale en entier et de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de leur forme longitudinale, permettant une torsion axiale de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) sont un modèle de choix pour l’étude des scolioses.
Réduction
Les expériences sont réalisées sur des poissons juvéniles puis adultes. Nous limitons le nombre minimal au maintien d’une lignée, dont 20 poissons par aquarium. Nous avons besoin de 3 générations de 260 individus pour chaque lignée soit au total 780 individus. La population adulte de poissons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées. Concernant la réalisation des scanners : Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses, soit 120 poissons mutants et 60 contrôles sauvages.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des animaux, nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse. L’alimentation sera composée d’aliments secs et de proies vivantes adaptés au stade développemental des poissons-zèbre afin de leur permettre d’exprimer leur comportement naturel de prédateur. Les animaux ne seront jamais hébergés seuls. Dans le cas de l’identification d’un poisson-zèbre exprimant notre mutation d’intérêt, alors nous mettrons en place un enrichissement social en introduisant dans l’aquarium d’autres congénères. Les poissons présentant des anomalies qui les empêcheraient d'appréhender leur milieu normalement seront euthanasiés. De même pour préserver l'ensemble des poissons hébergés et le maintien d'un certain statut sanitaire, une limite d'âge de 18 mois est appliqué pour éviter la propagation d’infections par des animaux vieillissants. Les manipulations nécessitant une immobilisation et les prélèvements de nageoire caudal, seront conduites sur animaux anesthésiés. Nous surveillerons les animaux après le prélèvement de la nageoire caudale pour vérifier qu’il n’y ait pas de saignement et que dans les jours qui suivent la régénération de la plaie se met en place. Dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une euthanasie (présence de points limites).
Choix des espèces
Le modèle poisson-zèbre partage 71pourcents de son génome avec celui de l’homme et celui-ci est facilement modifiable par des techniques de biologie moléculaire. De plus, son élevage et sa reproduction sont rapides et aisés. Dans le cas de notre étude sur la scoliose qui est une déformation en trois dimensions de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont de mauvais modèles d’étude car la présence d’appui sur les pattes avant leur permet de compenser et d’empêcher l’évolutivité d’une telle déformation. Les poissons-zèbres cependant constituent un bon modèle pour ces déformations vertébrales, leur colonne vertébrale comportant de grandes similarités avec l’espèce humaine : une structure vertébrale longitudinale, constituée d’éléments osseux mobiles et de disques intervertébraux, organisée en 4 segments. L’analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par micro-scanner chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études précédentes. Les animaux seront étudiés du point de vue phénotypique (apparition de scoliose) à 3 points cinétiques à 8, 12 et 16 semaines, qui correspondent respectivement à une période de forte croissance, au stade juvénile (parallèle avec l’aggravation pubertaire des scolioses humaines) et une analyse finale au stade adulte. Ceci permettra de suivre l’évolution de la scoliose dans le temps lors de sa phase de constitution puis une analyse finale à l’âge adulte.
Rôle de CD44 dans l’absorption du fer par les cellules érythroïdes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
3 945 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Selon les groupes, elles subissent des saignées, des injections lysant les globules rouges, une amputation du bout de la queue rouverte plusieurs semaines, une inflammation induite par le LPS ou un cancer du foie provoqué par injections répétées, et des femelles gestantes sont tuées pour prélever les embryons. Le porteur qualifie la procédure d'hépatocarcinome de plus lourde et euthanasie les animaux dégradés selon des points limites. Il cherche à établir le rôle d'un récepteur dans l'absorption du fer et juge les modèles de souris "incontournables".
Objectifs
Les globules rouges ont un important besoin en fer afin d’assurer leur fonction de transport d’oxygène aux organes. Ils utilisent le récepteur à la Transferrine (TfR1) pour acquérir le fer depuis la circulation sanguine. Plusieurs études ont déjà suggéré que les globules rouges utilisaient potentiellement un autre système pour l’absorption du fer, indépendamment de TfR1. Notamment, une étude récente a démontré pour la première fois que le récepteur à l'acide hyaluronique CD44 permettait l’absorption du fer par les cellules cancéreuses. Nous avons alors réalisé des expériences préliminaires in vitro qui suggèrent un mécanisme similaire dans les cellules érythroïdes (c’est-à-dire, les globules rouges et leurs précurseurs), dans lesquelles CD44 est très fortement exprimé. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle de CD44 dans l’absorption du fer par les globules rouges in vivo, en conditions physiologiques, et en conditions pathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait mettre en évidence pour la première fois le récepteur CD44 comme transporteur de fer dans les cellules érythroïdes, et ainsi permettre une découverte majeure dans la compréhension du métabolisme du fer. De plus, démontrer que CD44 permet le transport du fer dans les cellules érythroïdes en conditions pathologiques permettrait de l’utiliser comme cible thérapeutique pour les pathologies de surcharge en fer et d’érythropoïèse inefficace qui touchent des dizaines de milliers de personnes dans le monde. Enfin, il est estimé que près d’un million de personnes seront atteintes d’un cancer du foie en 2025, et étant donné l'importance de CD44 dans l'absorption du fer dans les cellules cancéreuses, ce dernier pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique intéressante.
Procédures
ANEMIE : Afin de mimer les conditions d'anémie, nous utiliserons deux méthodes disctinctes. Un groupe d'animaux aura un prélèvement sanguin de 500µl. Ce prélèvement ne sera réalisé qu’une seule fois et les souris seront euthanasiées 0 - 24h - 48h - 72h - 96h après. Un autre groupe d'animaux recevra deux injections d'un produit permettant la lyse des globules rouges. Les animaux seront sacrifiés 1 jour à 1 semaine après la deuxième injection. GLOBULES ROUGES : Pour mesurer la durée de vie des globules rouges, nous réaliserons une injection intraveineuse d'un marqueur fluorescent permettant de marquer les globules rouges. Afin de suivre l'évolution de la fluorescence, nous récupérerons quelques gouttes de sang au niveau de la queue le lendemain de l’injection du produit suite à une petite amputation (0.1mm). Ensuite, la plaie sera gratée 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines et 1 mois après pour récupérer du sang. INFLAMMATION : Pour induire une inflammation aigue et passagère nous injecterons du LPS (produit dérivé bactérien). Les souris seront mises à mort 0 - 1h - 6h - 12h - 24h - 48h - 1 semaine après. HEPATOCARCINOME : Pour induire un cancer hépatique chez les souris, nous injecterons une fois par semaine un facteur pro-fibrotique pendant 6, 12, 18 ou 24 semaines selon les groupes de souris. Les souris sont euthanasiées à la fin des injections. ETUDE DES EMBRYONS : Accouplement des souris, puis euthanasie des femelles gestantes au jour embryonaire E14.5 afin d'étudier l'anémie des embryons.
Impact sur les animaux
Tout d'abord, pour limiter le stress induit par les manipulations chez les animaux, nous allons pour chacun d'entre eux, réaliser des habituations aux expérimentateurs pendant une souris (prise en main des souris, habituation à la voix et à l'odeur...). Les effets indésirables de son projet seront légers et modérés. Tout d'abord, le prélèvement sanguin va induire une légère anémie passagère chez les souris, ainsi qu'une faible douleur due au prélèvement jugulaire. L'injection du produit lysant les globules rouges va entrainer la perte d'une partie de ces cellules, mais les animaux récupèrent la quantité normale de globules rouges 1 semaine après l'injection. Il est nécessaire de placer les souris dans des boîtes de contention pour réaliser l'injection intraveineuse, ce qui entraine un stress chez les animaux. L'induction de l'inflammation systémique, atteint son pic entre 4h et 8h après l’injection, mais est rapidement résolue, avec un retour à la normale 48h après injection. La procédure d'étude de l'hépatocarcinome est la plus lourde, puisqu’elle entraine le développement d’un cancer du foie. L’état général des souris sera évalué quotidiennement et les animaux souffrants seront euthanasiés (prostration, poils ébouriffés, perte de poil…).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures, pour effectuer des prélèvement d'organes. Pour étudier le métabolisme du fer, il est nécessaire de récupérer le sang, pour réaliser des analyses des paramètres hématologiques ; ainsi que plusieurs organes impliqués dans l'homéostasie du fer (foie, rate, duodénum, moelle osseuse, rein). Ils seront récupérés pour analyse ultérieure en laboratoire : expression génique, protéique, histologie, par exemple.
Remplacement
Notre équipe a déjà pu établir que le transporteur CD44 permettait l'absorption du fer dans des cellules érythroïdes en culture. Les modèles in vitro ne permettent cependant pas de reproduire la complexité des mécanismes de régulation de l'homéostasie du fer. Les modèles de souris sont donc incontournables pour étudier précisément les mécanismes mis en place in vivo.
Réduction
L’expérience de la porteuse du projet dans les procédures que nous allons mettre en place nous permet d’optimiser le nombre d’animaux à analyser pour chacune de nos questions de recherche et le nombre de souris sera calculé a minima en tenant compte de la variance biologique des résultats. D'après l'anayse de la variance ANOVA univariée, suivie d'une analyse d'une comparaison multiple de Sidak, nous devrions utiliser 15 souris par lots afin d'obtenir une significativité statistique. De plus, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous allons prélever un maximum d’organes qui seront stockés à -80°C afin de pouvoir être réutilisés sans avoir à répéter les expériences in vivo. Nous sommes dans l'obligation d'utiliser des souris contrôle pour chacun de nos élevages car les fonds génétiques sont différents.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des igloos et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine. Pour chaque procédure, des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale qui permet de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines, et notamment c'est l'espèce qui reproduit le mieux le métabolisme du fer humain. De plus, cette espèce présente de nombreux intérêts pratiques qui justifient son utilisation comme modèle dans nos projets de recherche, notamment, de faibles coûts, un cycle reproductif court, une croissance rapide, une facilité de transport, une facilité de manipulation, et enfin une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Enfin, notre projet de recherche est basée sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées et aucune autre espèce animale n'est disponible. Nous utiliserons des souris adulte, âgées de 8 à 32 semaines selon les procédures. Nous étudierons également le développement embryonnaire.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
3 613 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère, la plupart tuées à l'issue. Le modèle exprime une protéine humaine qui s'accumule dans le système nerveux et provoque une paralysie progressive, dont le porteur bloque l'apparition par antibiotique pendant l'élevage puis la laisse se développer pour tester des candidats médicaments. Les souris malades présentent perte de poids, atrophie musculaire et déficits moteurs, suivies par un score clinique jusqu'à leur mise à mort, les reproducteurs étant conservés pour la lignée. Le porteur qualifie le "besoin médical" d'"immense" et juge le modèle animal "indispensable et non substituable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire à évolution rapide qui conduit au décès des patients dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. Elle se caractérise par une disparition progressive et irréversible des neurones moteurs (les cellules qui commandent les muscles), provoquant une perte progressive des capacités vitales par paralysie des muscles: locomotion, alimentation, respiration,… Bien que les recherches, réalisées ces dernières années, aient permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes mis en jeu au cours de l’évolution de la maladie, les origines de la maladie restent inconnues dans la plupart des cas. Il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Seuls deux composés (qui ralentissent modestement la progression de la maladie dans certains cas) ont été approuvés. Le besoin médical est donc immense et totalement insatisfait. Le modèle murin choisi dans ce projet exprime très fortement une protéine humaine qui va s’accumuler dans le système nerveux central et la moelle épinière. Cette accumulation va entraîner la mort des cellules nerveuses. Ce modèle reproduit la quasi-totalité des signes cliniques de la SLA à travers ses caractéristiques moléculaires - L’accumulation toxique de protéines dans les cellules nerveuses du cerveau et de la moelle épinière, est très représentatif des formes cliniques de SLA (plus de 90% des cas de SLA). - Les signes cliniques sont engendrés par la mort progressive des cellules nerveuses, induite par l’accumulation de protéine, et qui conduit un déficit moteur puis une paralysie musculaire.
Bénéfices attendus
A ce jour il n’existe aucun traitement curatif de la SLA. En parallèle de la prise en charge multidisciplinaire des patients pour diminuer et soulager les symptômes, il existe que deux molécules approuvées qui permettent, au mieux, de ralentir modestement la progression de la maladie. La SLA est une maladie multifactorielle et complexe, dont la plupart des mécanismes sont encore très mal connues. Ce projet permettra : - de mieux comprendre la physiopathologie de la SLA - de développer de nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de la SLA. - La mise en perspective des signes cliniques et des analyses moléculaires effectuées sur les prélèvements de sang permettra de comprendre les mécanismes complexes conduisant à la maladie.
Procédures
Durant l’élevage, tous les souriceaux seront identifiés avec un microtatouage au niveau des doigts puis analysés par génotypage via un prélèvement d’un petit bout de queue. Durant cette phase, aucun animal n’aura de signe clinique, ils seront tous en parfaite santé. Aucun autre prélèvement ne sera réalisé sur ces animaux. Pour l’évaluation des médicaments, les animaux présenteront les signes de la SLA (déficit moteur progressif) et par conséquent seront suivis de manière étroite et rigoureuse afin d’évaluer de manière objective mais non invasive l’évolution de la maladie : - Observation quotidienne des signes cliniques - Evaluation des capacités motrices hebdomadaires (force et endurance musculaire) Les candidats médicaments seront administrés soit par voie oral soit par voie intraveineuse en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques qui seront déterminées. Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. A l’issu de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Durant l’élevage, aucun animal ne développe de signes cliniques dommageables. En effet, le développement des signes cliniques est bloqué par un traitement antibiotique. Tous les animaux seront donc en parfaite santé. Durant la phase de test, les animaux présentent la quasi-totalité des signes cliniques de la SLA après l’arrêt de l’antibiotique : - Perte de poids progressive des animaux - Mort progressive des cellules nerveuses et perte des liaisons nerveuses avec les muscles qui se traduit par des déficiences motrices (tremblements, perte de la coordination des mouvements, pattes postérieurs qui se recroquevillent), une perte de poids et une atrophie musculaire. La toxicité et la tolérance des candidats médicaments seront préalablement déterminées dans des études de tolérance et de pharmacologie. Dans ce projet, aucun effet indésirable n’est donc attendu. Lorsque le produit est administré par voie oral, aucune nuisance n’est attendue. Lorsque le produit est administré par voie intraveineuse, la nuisance est uniquement liée à la piqûre. Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine à l’aide de capillaire, la nuisance est uniquement liée à la piqûre. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. La nuisance est uniquement liée à la piqûre lors d’injection de l’anesthésie par voie intrapéritonéale.
Devenir
A l'issue de la phase d’élevage : - Certains animaux seront utilisés comme reproducteurs pour maintenir la lignée. Les animaux surnuméraires seront euthanasiés. - Certains animaux ne pouvant pas développer la maladie à cause de leur patrimoine génétique seront utilisé dans le groupe contrôle pour les tests d’efficacité (195 animaux). Les animaux surnuméraires seront euthanasiés. - Les animaux développant les signes cliniques de la SLA seront utilisés pour les tests d’efficacité. A l'issue des tests d’efficacité, tous les animaux seront euthanasiés. Ils ne peuvent pas être réutilisés à cause de leur phénotype et l’issue fatale de la maladie.
Remplacement
Les candidats médicaments testés feront l’objet d’une sélection minutieuse avant leur utilisation. Les substances sont préalablement testées, caractérisées et auront fait la preuve de leur efficacité in vitro, avant d’être utilisé sur des animaux. Cependant, aucune étude vitro ou ex-vivo ne peut permettre de faire un lien entre les mutations génétiques, les mécanismes moléculaires et les signes cliniques. La SLA est une maladie multifactorielle complexe. Elle ne peut donc en aucun cas être réduite à une simple mutation ou à un simple mécanisme, le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour : •Etudier, analyser les paramètres physiologiques tels que la réponse immunitaire, le passage de la barrière hémato-encéphalique, l’évolution des biomarqueurs au cours de la maladie ou la correspondance avec les signes cliniques observés. •Valider l’effet thérapeutique sur le phénotype et en confirmer le mécanisme d’action chez l’animal vivant. •Mettre en perspective les effets moléculaires avec les signes cliniques observés et ainsi, comprendre les mécanismes conduisant à la maladie.
Réduction
La phase d’élevage va permettre la génération de souris qui développeront la SLA nécessaire à l’évaluation de l’efficacité des candidats médicaments. Pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux utilisé sera déterminé mathématiquement pour n’utiliser que le strict minimum d’animaux nécessaire mais néanmoins suffisant pour des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. D’après les calculs, le nombre d’animaux à utiliser est de 13 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux est inférieur aux effectifs communément utilisés (± 15 animaux par groupe) dans le cadre des recherches académiques ou dans les ou dans les laboratoires de recherche privés. Pour l’élevage, nous utiliserons la méthode proposée par les éleveurs agréés dans le but de déterminer de manière précise le nombre minimal nécessaire et suffisant de souris reproductrices à la conduite du projet et à la préservation de la lignée.
Raffinement
Pour l’élevage, les animaux seront hébergés en trio de reproducteurs. Dans cette procédure, aucun animal ne développe aucun signe dommageable car l’expression des signes cliniques est bloquée par un traitement antibiotique administré dans l’eau de boisson. Durant la phase de test d’efficacité, les animaux seront observés quotidiennement. Les observations cliniques seront évaluées selon un scoring strict et validé par un grand nombre de laboratoire. Afin de renforcer le suivi des signes cliniques, nous allons donc utiliser plusieurs méthodes de mesures indépendantes : - Score basé sur l’observation clinique - Poids qui reflète l’évolution de la maladie - Evaluation de la force musculaire qui permettra de détecter les signes de faiblesse musculaire et de paralysie - Evaluation de la coordination des membres et des performances motrices Ces mesures permettent de garantir une évaluation précise de l’évolution de la maladie. Le croisement des informations facilitera les analyses et d’étayer les conclusions par plusieurs variables. Cette analyse associée à la parfaite connaissance du modèle, permettra de prévenir de manière plus précoce l’apparition du phénotype dommageable. De plus, une attention particulière sera prêtée à l’environnement local, étant donné que les animaux ayant contracté la SLA présenteront des déficits moteurs significatifs. Les cages comporteront un sol en dur, une litière de sciure, des refuges et des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger. Des croquettes mouillées disposées sur le fond de la cage ainsi qu’une supplémentation en nourriture enrichie humide (complément alimentaire gélifié) sera apportée aux animaux pour faciliter la nutrition et l’hydratation.
Choix des espèces
Pour les maladies neurodégénératives, les signes cliniques dépendent essentiellement de la localisation des lésions (cerveau, moelle, …) et l’efficacité d’un médicament dépend de sa capacité à atteindre les lésions. Le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour évaluer l’efficacité d’un médicament notamment : -la capacité à accéder à la zone d’intérêt (comme franchir la barrière hémato-encéphalique pour accéder au cerveau) - son action au niveau moléculaire et son impact sur les signes cliniques observés. Le modèle animal de souris a été choisi à cause de ses similitudes avec la pathologie humaine : - Au niveau moléculaire : l’accumulation « toxique » d’une protéine humaine dans les neurones du cerveau et de la moelle qui représente, en clinique, 90% des cas de SLA - Signes cliniques: mort des cellules nerveuses de la moelle épinière et perte de la connexion musculaire qui a pour conséquence un déficit moteur progressif menant à la paralysie totale des muscles. Pour l’élevage, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’être en capacité de se reproduire. Pour les tests d’efficacité, nous cherchons à nous rapprocher au plus près du contexte physiopathologique de la maladie qui touche des adultes afin de pouvoir transposer nos résultats à l’Homme. Les animaux des 2 sexes seront utilisés. En effet, d’après les études ayant permis le développement du modèle, les mâles et les femelles développent des signes cliniques comparables, ils peuvent donc tout deux être inclus dans des analyses groupées.
Le rôle de la protéine C activée dans le développement de l’arthropathie hémophilique chez des souris hémophiles A sévères – Projet Multi-établissement EU 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
88 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Elles subissent des ponctions du genou provoquant des saignements articulaires répétés, des injections, une IRM de deux heures et des prises de sang, avant dissection des pattes arrière. Le porteur décrit comme seule nuisance une gêne locomotrice et applique un point limite de perte de poids de 20 %. Il vise à étudier le rôle d'une protéine dans la destruction articulaire et justifie le recours à l'animal par le "besoin d'un modèle vivant, dynamique et doté d'un système vasculaire et locomoteur".
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Pour cela, l’étude du rôle de l’APC nous semble intéressante puisque cette protéine régule d’autres qui sont chargées de la dégradation et du remodelage du cartilage articulaire. Si notre hypothèse est confirmée, alors un inhibiteur de l’APC peut être un candidat thérapeutique pour l’atteinte articulaire chez les hémophiles.
Procédures
Afin de mimer la maladie chez l’homme, les souris vont développer une atteinte articulaire suite à des saignements articulaires répétés. Le rôle de la protéine C activée (APC) va être étudié 7 et 30 jours après 2 ponctions du genou induisant un saignement articulaire. Cette atteinte articulaire va être étudiée en utilisant des méthodes complémentaires : mesures de marqueurs d’inflammation, de dégradation cartilagineuse, l’étude de modification des ARN au niveau des tissus articulaires et du sang, étude histologique avec marquage de molécules responsables de la dégradation articulaire. L’APC sera bloquée par un inhibiteur spécifique et les conséquences de cette inhibition seront comparées à la situation où l’APC est active au niveau du sang et du liquide synovial. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et si douloureux après administration d’un médicament anti-douleur. Après anesthésie et antalgie, les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrières seront disséquées pour l’étude histologique après marquages et colorations spécifiques. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min), la mesure du genou droit (30 sec), une injection (1-2 min), une IRM du genou (120 min), une prise de sang et mise à mort (3-5 min). Les temps exprimé ne comptent pas l’induction et la vérification de la profondeur de l’anesthésie, compter 5min. Afin d’éviter de multiple anesthésie générale, le maximum de geste est groupé comme suit • Anesthésie générale + mesure du genou droit + ponction articulaire à J0, J15 et J30 : temps estimé : 9 min • Injection seule tous les 4 jours: temps estimé : 7 min • Injection d’inhibiteur tous les 4 jours: temps estimé : 9 min • Imagerie par IRM à J42 : temps estimé : 125 min • Prise de sang : 10 min. tous les gestes sont effectués dans l'UE1 à l'exception de l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qsui sont réaisée dans l'UE2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
Les animaux ne ressortent vivant de cette procédure car des prélèvements terminaux pour analyses histologiques et immunohistochimies sont prévus.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie préalables. Au cours de l'étude, les points limites sont appliqués avec comme limite stricte une perte de poids de plus de 20% due à une gêne locomotrice, gravité d'un hématome au point d'injection si les actions de corrections ne sont pas suffisantes.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Evaluation de la capacité de souches recombinantes de BCG, pro-autophagie, à mieux protéger contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Vaccinées avec des BCG recombinants, quatre-vingt-quatre d'entre elles sont ensuite infectées par la tuberculose en aérosol, maintenues en chambre de contention pendant quarante minutes, l'infection provoquant une inflammation pulmonaire et des lésions tissulaires. Le porteur les fait toutes tuer, faute de replacement possible en contexte infectieux. Il teste si l'induction de l'autophagie améliore la protection vaccinale et affirme que ce travail ne peut être envisagé que sur un modèle animal.
Objectifs
Le BCG (Bacille de Calmette et Guérin) est un vaccin utilisé dans la lutte anti-tuberculeuse depuis un siècle. Cependant son efficacité chez l’adulte est modérée et doit être accentuée par l’utilisation de nouvelles stratégies. Une de celles-ci, qui sera évaluée dans cette étude dans un modèle murin, est d’induire l’autophagie, un mécanisme physiologique de défense de l'hôte. L'objectif du projet est donc d’utiliser des BCG produisant un peptide inducteur de l’autophagie (BCG recombinants) et de comparer leur pouvoir immunogène et leur capacité à protéger des souris infectées avec le bacille tuberculeux par rapport au BCG. Une augmentation de la protection antituberculeuse est escomptée. Si tel est le cas, l'innocuité (absence d’effet toxique) des BCG recombinants sera évaluée également chez la souris.
Bénéfices attendus
La tuberculose, causée par Mycobacterium tuberculosis, demeure un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale, avec plus d’un million de décès par an. La difficulté à éradiquer la maladie est liée à trois facteurs principaux : la faible efficacité du vaccin BCG chez l’adulte, la co-infection avec le virus de l'immunodéficience humaine et l’apparition croissante de souches de Mycobacterium tuberculosis multirésistantes aux antibiotiques. L'amélioration du vaccin et la découverte de nouvelles voies thérapeutiques, notamment celles basées sur l’immunité de l’hôte, demeurent donc une priorité. L'autophagie est un mécanisme fondamental de défense de l'hôte notamment impliqué dans la lutte contre les infections. Des résultats expérimentaux obtenus in vitro et in vivo suggèrent fortement que l’autophagie pourrait augmenter l’efficacité de la vaccination par le BCG. Ainsi si les souches de BCG recombinants, qui vont être utilisées dans ce projet, augmentent l’immunogénicité et/ou la protection des souris contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis, cela démontrera le rôle bénéfique de l’autophagie dans la vaccination. A plus long terme, si l’innocuité de ces souches est démontrée, leur utilisation en vaccination humaine pour la protection anti-tuberculeuse pourra être envisagée et pourrait donc augmenter la protection contre l’infection tuberculeuse.
Procédures
Une seule injection, d’une durée inférieure à 2 minutes, des différentes souches de BCG sera réalisée sur toutes les souris. 84 souris seront infectées par voie aérosol avec 100 bacilles tuberculeux. Cette infection sera réalisée sur animaux vigiles placés dans des chambres de contention pendant 40 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux seront induits à deux niveaux : 1) Lors de la réalisation des procédures 2) Par la pathologie induite par l’infection Lors de la réalisation des procédures, il s’agit d’un stress faible et de courte durée généré par les gestes techniques tels que la contention et les injections lors de la vaccination et l’infection des animaux. La vaccination des souris par le BCG sera effectuée par injection sur animal vigile après une légère contention. Cette opération indolore induit un léger stress de courte durée. Lors de l’infection par les bactéries par aérosol les animaux sont maintenus immobiles dans des chambres avec le nez pointant vers le flux d’air. Cette opération d’une durée d’environ 40 minutes (introduction et sortie des animaux des chambres et temps d’exposition à l’aérosol) induit un stress modéré. Suite à l’infection des souris par le bacille tuberculeux, les bactéries se multiplient dans les poumons de l’animal générant une inflammation et des lésions tissulaires. Pour les animaux immunocompétents, les effets attendus sont une gêne respiratoire modérée et un léger affaiblissement de l’animal se traduisant par des signes cliniques d’aspect (pelage) et de comportement (posture, mobilité). Ces signes cliniques apparaissent tardivement au cours de la procédure, et seront donc de courte durée de l’ordre de quelques jours. Pour les animaux immonodéficients, en plus des nuisances précédemment citées, une perte de poids pourra être enregistrée. La pesée des animaux ne génère pas de nuisance.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort car il n’y a pas de possibilité de replacement vu le contexte infectieux.
Remplacement
Ce travail d’investigation ne peut être envisagé que sur un modèle animal. En effet il s’agit de démontrer que l’activation de l’autophagie permet d’accroitre l’effet de la vaccination et ainsi d’aider le système immunitaire à mieux combattre l’infection par une meilleure élimination des bactéries. Or la vaccination est un procédé qui consiste à stimuler le système immunitaire afin qu’il développe une réponse adaptée et spécifique à un agent infectieux. Cette réponse nécessite de nombreux acteurs moléculaires et cellulaires dont le fonctionnement concerté ne peut se faire qu’in vivo. En amont de cette étude, des expériences in vitro et in vivo suggèrent fortement, mais sans le démontrer clairement, que l’autophagie pourrait avoir un effet bénéfique sur l’efficacité vaccinale du BCG.
Réduction
Les procédures mises en œuvre dans ce projet sont basées sur un nombre de 5 souris par condition. Dans ce modèle expérimental comme dans la plupart des modèles d’investigation in vivo, et bien que l’expérimentation soit réalisée sur des animaux issus d’une lignée, la variabilité inter individuelle en réponse à un stimulus est importante et ne nous permet pas de diminuer le nombre d’animaux par groupe en dessous de cette valeur afin d’obtenir une puissance statistique satisfaisante. Afin de réduire le nombre d’animaux, deux souches de BCG recombinants, exprimant les peptides les plus efficaces pour activer l’autophagie, parmi ceux décrits dans la littérature, seront testées. De plus cela permettra également de limiter le nombre d’animaux utilisés comme témoin car ainsi toutes les souris peuvent être infectées en même temps limitant ainsi la variabilité.
Raffinement
Dans ces expériences, les souches de souris ont été choisies en fonction de l’objectif de l’expérimentation. L’état sanitaire et le bien-être des animaux sont évalués tout le long de l’expérience par des personnels formés. Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances : anesthésie, limitation des temps de contention au minimum, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d’une grille de scoring et de points limites précoces.
Choix des espèces
Plusieurs modèles animaux de tuberculose humaine existent mais l’espèce murine est la plus utilisée dans la littérature. Les données préliminaires existantes suggèrent que l’autophagie pourrait être impliquée dans l’accroissement du pouvoir vaccinal du BCG ont été obtenues, in vitro, grâce à l’utilisation de cellules murines et, in vivo, avec des souris. Les expériences seront réalisées sur des animaux âgés de 8 semaines. Il s’agit donc d’animaux adultes afin que leur système immunitaire soit totalement fonctionnel. En effet le but du projet est d’évaluer l’impact de l’autophagie sur le pouvoir vaccinal du BCG pour lutter contre l’infection tuberculeuse. La vaccination étant un procédé permettant à l’organisme de développer une protection spécifique vis-à-vis d’un agent infectieux grâce à son système immunitaire, les expériences doivent être réalisées avec des animaux ayant un système immunitaire parfaitement développé.
Méthode d’identification et de caractérisation génétique chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 1000
75 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est contenu quelques secondes pour un tatouage et une biopsie d'oreille destinée au génotypage, sous isoflurane au-delà de quatorze jours. Le porteur réutilise environ 1 100 animaux pour d'autres projets ou pour la formation, et fait tuer les autres, notamment les génotypes non souhaités et les animaux d'élevage trop âgés. Il caractérise génétiquement quatre-vingts lignées de son animalerie et affirme qu'identifier les individus est "nécessaire" à leur utilisation scientifique.
Objectifs
L'objectif est de caractériser génétiquement les 80 lignées de notre animalerie pour gérer nos élevages et être utilisés dans des projets scientifiques (ex: identifier des biomarqueurs de l'hypoxie, étudier des gènes de l'infertilité, étude de l'arthrite, étude de cancérologie pour trouver et mettre au point des traitements, ...).
Bénéfices attendus
Notre établissement utilise en routine pour l'élevage des lignées génétiquement altérées: l'identification par tatouage des phalanges et la biopsie d'oreille pour le génotypage. Ce projet permettra de caractériser génétiquement les 80 lignées de notre élevage de souris et rats génétiquement altérées nécessaires à différents projets de recherche.
Procédures
L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Impact sur les animaux
La contention pouvant engendrer un stress et des douleurs légères au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d'oreille), nous serons vigilant à effectuer cette méthode d 'identification de façon rapide et avec précision. L’anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux agés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés. Le geste sera réalisé par du personnel dûment formé ayant suivi un tutorat relatif à ce geste technique.
Devenir
Mise à mort des animaux pour les génotypes non souhaités, les animaux d'élevage trop âgés, les animaux au cours de leur élevage fin d'éviter des situations de souffrance. Gardés en vie pour une utilisation continue pour l'élevage ou vers les projets prévus pour ces animaux et réutilisation vers les projets non prévues pour ces animaux pour la formation.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs à des fins scientifiques nécessite de pouvoir identifier les individus et de les caractériser d’un point de vue génétique le cas échéant. L’identification permet de repérer un animal parmi ses congénères et de le suivre tout au long de sa vie expérimentale. En plus de cette identification, une caractérisation génétique moléculaire est nécessaire lorsque l’on utilise des lignées de rongeurs génétiquement modifiées afin de s’assurer de la présence ou de l’absence d’une mutation d’intérêt dans leur génome ou pour suivre une sélection sur marqueurs génétiques par exemple. De plus ,il n'est pas possible dans le cadre de l'expérimentation des chercheurs de la plateforme de remplacer le modèle animal par un autre (in vitro, in silico,..)
Réduction
Une caractérisation génétique moléculaire est nécessaire lorsque l’on utilise des lignées de rongeurs génétiquement modifiées afin de s’assurer de la présence ou de l’absence d’une mutation d’intérêt dans leur génome ou pour suivre une sélection sur marqueurs génétiques par exemple. Seuls les animaux ayant besoin d'etre génotypés subiront une biopsie d 'oreille , les autres seront identifiés uniquement par technique du tatouage aux phalanges. La gestion des élevages se fait de façon raisonnée afin d'éviter au maximum la génération d'animaux surnéméraires non utilisés par la suite dans les expérimentations.
Raffinement
Le geste technique sera réalisé rapidement à l'extrémité de l'oreille ,afin de réduire supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse nous pratiquerons une anesthésie gazeuse par inhalation d'isoflurane lors du tatouage et de la biopsie de tissu pour les animaux agés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de produire et d'identifier des lignées de souris et rats génétiquement modifiées par croisement et ceci afin de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche des instituts comme par exemple en oncologie, sur les maladies neurodégénératives , sur des pathologies de la grossesse ou sur des modèles de différentes pathologies touchant les organes. Les animaux seront identifiés à partir du 5ème jours jusqu'au 14ème jour, au dela la biopsie et l'identification par tatouage pourra se faire uniquement sous anesthésie volatile à l'isoflurane.
Validation de l’irradiation à ultra-haut débit de dose chez la souris: expérience pilote
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont anesthésiées à l'isoflurane puis irradiées à ultra-haut débit de dose lors d'une expérience pilote de radiothérapie FLASH. Le porteur indique qu'aucune nuisance n'est attendue et que l'irradiation est imperceptible, mais que les souris ne peuvent être gardées vivantes en raison des effets secondaires à long terme et seront tuées par dislocation cervicale. Il cherche à valider la faisabilité des irradiations avant une étude à plus grande échelle.
Objectifs
La radiothérapie FLASH est une nouvelle méthode d'irradiation à très haut débit de dose. Elle est décrite pour déclencher moins d'effets secondaires sur les organes sains tout en conservant la même efficacité anti-tumorale. Cependant, de nombreux aléas demeurent, parmi lesquels le type de particules ou encore la structure du faisceau. Nous disposons d'un cyclotron (accélérateur de particules) capable de contrôler certains de ces paramètres et ainsi permettre la validation à différents niveaux de la radiothérapie FLASH.
Bénéfices attendus
Ce projet validera la bonne réalisation des irradiations et la maitrise de la sécurité des animaux avant de passer à l'étape d'expérimentation à plus large échelle. Les procédures sont complexes au sein du cyclotron. Cette mise en oeuvre test permettra d'écarter ou corriger tout problème logistique imprévu pendant le parcours des animaux. Il n'y cependant aucun risque d'accident d'exposition.
Procédures
Les animaux seront transportés (30 min), anesthésiés (isoflurane, 12 min total) et irradiés (imperceptible).
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n'est attendue. L'irradiation est imperceptible et il n'y a pas de procédure invasive.
Devenir
Il n'est pas possible de réutiliser ou conserver un animal irradié en raison des risques d'effets secondaires à long terme. Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.
Remplacement
Le bénéfice de la radiothérapie FLASH n'est pas visible in vitro. Il n'existe donc pas de procédure de remplacement possible.
Réduction
Le nombre de 6 animaux est le strict minimum possible afin de répéter l'irradiation pour s'assurer que le processus est reproductible (2 animaux seulement par condition). Il n'est pas possible de réduire.
Raffinement
La radiothérapie sera réalisée sous anesthésie isoflurane à 4% pour l'induction et 2% pour le maintien dans le but d'immobiliser l'animal, la radiothérapie étant imperceptible. Le réveil des animaux s'effectue sous contrôle visuel avec équipement chauffant à 37°C. Les animaux seront hébergés en groupes de 3 à 5/cage avec enrichissement (tunnel, dôme ou frisottis), accès à l'eau et la nourriture à volonté, et cycle jour-nuit 12h/12h. La dominance est observée et un groupe est recomposé uniquement en cas d'incompatibilité entre deux individus.
Choix des espèces
La souris, par son faible encombrement et sa vitesse de reproduction/développement, est le modèle de mammifères le plus pratique au laboratoire et le plus décrit en cancérologie. Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. Les organes d'intérêt pour notre étude sont particulièrement ressemblant à l'homme. De plus, la souris tolère l'homozygotie et permet de travailler sur des lignées pour des résultats scientifiques reproductibles. Les modèles immunodéficients tolèrent la greffe de cellules tumorales humaines. Enfin, ce modèle est accepté dans les phases de validation thérapeutique pré-clinique à visée humaine. De surcroit, la souris est un modèle qui a déjà été validé en radiothérapie FLASH ce qui permet d'effectuer un comparatif inter-études. Aucun pré-requis pour l'âge et le sexe. Les animaux seront récupérés de surplus d'élevage tels qu'ils sont pour éviter un suremploi.
Effets d’une alimentation riche en cholestérol pendant plusieurs générations chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
832 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Nourries au cholestérol sur plusieurs générations, elles subissent des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec injections et prélèvements sanguins à la queue, avant d'être tuées à cinq mois pour prélever aorte, cœur, foie et autres organes. Le porteur indique avoir d'abord utilisé un petit ver, Caenorhabditis elegans, pour limiter le recours aux vertébrés. Il étudie l'hérédité épigénétique paternelle des maladies cardiométaboliques et renvoie au conditionnel les retombées thérapeutiques.
Objectifs
La prévalence de l'obésité s'est accrue de manière épidémique dans les pays développés. Compte tenu du lien étroit entre l'obésité et les maladies cardiovasculaires, l'une des premières causes de mortalité en France, cela pose un grave problème de santé publique. Bien qu'une mauvaise alimentation et la sédentarité sont des facteurs de risques importants pour le développement des maladies cardiovasculaires, de plus en plus de données épidémiologiques et expérimentales convergent vers la même idée : nos gènes se "souviennent" de l'hygiène de vie de nos parents ou en d'autres termes d'un phénotype nouvellement acquis. Dans le présent projet, il s'agit d'un désordre métabolique, peut être transmis via la lignée germinale paternelle et/ou maternelle. Ce type d'hérédité non-génétique est un processus nouveau mettant en jeu des mécanismes "épigénétiques" qui font appel à des modifications qui ne sont pas codées directement par l’ADN. Depuis plusieurs années, nous avons développé un modèle d'hérédité où l'obésité paternelle induite par une alimentation riche en graisse est transmise par le père via les spermatozoïdes. Cependant, faute de modèles expérimentaux adéquats, très peu de données existent concernant l'hérédité épigénétique des maladies cardiométaboliques et les éventuels mécanismes moléculaires impliqués dans ce type d'hérédité sont très mal connus.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à évaluer si la susceptibilité à développer des pathologies cardiométaboliques (notamment les cardiopathies coronariennes et maladies du foie gras) est modulée par l'héritage épigénétique paternel. Les bénéfices susceptibles d’émerger de notre projet consiste essentiellement en une meilleure compréhension des facteurs de risques héréditaires des maladies liées à un taux trop élevé de cholestérol (comme l’athérosclérose) qui pourra éventuellement déboucher sur une prise en charge thérapeutique améliorée de ces maladies.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à 3 séries de prélèvements. A l'âge de 4 mois, les souris subissent un test de tolérance au glucose (Test GTT) et à l'âge de 4mois 1/2 un test pour mesurer leur sensibiltié à l'insuline (test ITT). Au total, les souris subiront 2 injections intrapéritonéales, à savoir une injection de glucose et une injection d’insuline. Pour réaliser ces injections, seules quelques secondes (5-10s) suffisent. Pour ces 2 tests, du sang sera prélevé au niveau de la queue . La glycémie est vérifiée toutes 15min la 1ère heure et toutes les 30 min la 2ème heure. A l'âge de 5 mois, les souris seront mises à mort et un prélèvement de sang sera effectué.
Impact sur les animaux
L' Injection Intrapéritonéale de Glucose ou d'Insuline et le prélèvement à la queue, associés aux tests GTT et ITT, induisent une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en fin de procédure induit également une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Cela nous permettra de prélever plusieurs tissus (Aortes, Coeur, reins, tissus aadipeuc, pancréas, cerveau, foie). Certains seront directement congelés pour des analysies moléculaires et d'autres seront fixés pour analyses histologiques. Ce matériel biologique nous est indispensable pour réaliser les analyses moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'hérédité épigénétique des maladies cardio-métaboliques.
Remplacement
L'hérédité transgénérationnelle est un mécanisme complexe d'interaction pour lequel il n'existe pas, à l'heure actuelle, de modèles in vitro. L'emploi d'un modèle animal comme la souris récapitulant la physiopathologie des maladies cardiovasculaires (notamment les cardiopathies coronariennes) chez le mammifère est donc essentiel.
Réduction
Avant ces expériences, nous avons utilisé, parallèlement à notre modèle murin et en collaboration, un modèle non-vertébré, Caenorhabditis elegans, un petit ver transparent et nonparasitaire. Ce modèle nous a permis d’étudier certains aspects des mécanismes moléculaires de cette hérédité sans avoir recours au modèle animal vertébré. D’autre part afin de calculer la taille de l’échantillon nécessaire (15 animaux/groupe), nous avons réalisé un calcul de puissance basé sur nos précédentes expériences, test qui permet de minimiser le nombre d’échantillons et donc d'animaux nécessaires pour valider ou non notre hypothèse de départ.
Raffinement
Dans un souci de Raffinement, voici les dispositions que nous mettrons en place pour minimiser les souffrances éventuelles et le stress qui pourraient être générées par nos expériences : • Nous nous attendons à ce que nos souris deviennent obèses. Pour éviter de les séparer lorsqu’elles vieillissent (et ainsi de respecter le maximum de souris autorisées par cage) et de les stresser inutilement (en évitant de perturber la dominance déjà établie), les souris seront regroupées par 4 dans une cage dès leur sevrage. Ces animaux seront observés hebdomadairement pour pouvoir détecter d’éventuels problèmes. Si un de nos animaux est gravement blessé (bagarre ou autres), et/ou perd 10% de son poids pendant 2 semaines consécutives, cet animal sera mis à mort et répertorié. • Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test GTT et ITT. • Les souris seront identifiées par punch au sevrage. Cette identification est définitive et ne peut pas induire d’infection. • Afin de limiter le stress lors des tests GTT et ITT, chaque souris sera identifiée par 0, 1, 2 ou 3 traits au feutre au niveau de la queue pour accélérer leur identification (feutre inodore spécial et non toxique). Si lors des tests ITT, la glycémie est faible (
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle en raison de ces similarités génétiques, et physiologiques avec l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peutt être modifié et analysé. C'est, par ailleurs, la raison pour laquelle l'ensemble des techniques de transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. En plus, nous pourrons avoir d’une façon relativement rapide les 5 générations indispensables pour achever l'étude. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 3 semaines jusqu'à l'âge de 5 mois. L'âge de 3 semaines correspond à la puberté la souris. A cet âge, les cellules qui génèrent les spermatozoïdes sont très sensibles à divers stress environnementaux. A l'âge de 4 mois, les mâles seront croisés afin d'obtenir les futures générations. En maintenant une nourriture riche en cholestérol pendant 4 mois, nous pensons que des marques non-génétiques peuvent être induites par l’alimentation et sont susceptibles d’être transmises à la nouvelle génération. Les croisements seront effectués comme suit: un male préalablement nourri en HCD sera croisé avec une femelle C57BL/6J. Lors du croisement la nourriture sera la nourriture standard. Le lendemain après le croisment si un bouchon vaginal est observé le mâle sera remis dans sa cage avec ses comparses sous un régime HCD. Après avoir été croisés, les animaux agés alors de 4 mois 1/2 subiront les tests de GTT et ITT.