Procédures légères
Identification et caractérisation préclinique de conopeptides antalgiques (CONIDOL)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 986 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 3 020 un niveau modéré. On leur induit des douleurs inflammatoires, post-opératoires, arthrosiques et neuropathiques pour mesurer leur seuil de douleur et tester des peptides tirés de venins de cônes marins. Le porteur indique que la nécessité d'évaluer la douleur empêche de mettre en place un traitement antalgique, les souris atteignant une perte de poids de 20 % ou d'autres points limites étant alors tuées. Les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre la douleur chronique, sont formulées comme une perspective.
Objectifs
La dernière Classification Internationale des Maladies (CIM-11) réalisée par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) reconnait enfin la douleur chronique. C’est une avancée importante pour des millions de personnes : on estime en effet à l’échelle mondiale qu’une personne sur 5 souffre de douleurs chroniques, et que 2 personnes sur 3 ne sont pas satisfaites par leur traitement. Les coûts directs et indirects résultant sont importants pour nos sociétés. Face à ce constat, le nombre réduit de molécules antalgiques à la disposition des praticiens et leur ratio bénéfice/risque insuffisant motivent la recherche de nouveaux candidats médicaments. Dans cette quête, les substances d’origine naturelle ont démontré leur potentiel. En particulier, la diversité et l’efficacité des toxines contenues dans les venins de cône marin représentent une opportunité. Le ziconotide, un analogue synthétique de conotoxine bénéficie d'ailleurs d'une autorisation de mise sur le marché en 2004 pour le traitement des douleurs réfractaires à la morphine, mais son utilisation est restreinte en raison d’un mode d’administration contraignant. L'objectif de ce projet est donc d'identifier de nouveaux conopeptides ou d'améliorer des conopeptides connus (optimisation chimique, formulation, mode d'administration) pour le développement d'antalgiques innovants, efficaces et bien tolérés.
Bénéfices attendus
Notre objectif est l'identification et la caractérisation de conopeptides naturels ou modifiés ayant de bonnes propriétés antalgiques tout en étant bien toléré par les animaux. Ces composés pourront devenir des candidats-médicaments et faire l'objet d'études précliniques ultérieures plus approfondies. De plus, le mode d'administration actuel du ziconotide (intrarachidien), seul conopeptide antalgique sur le marché, est risquée et contraignante. Nous nous intéressons particulièrement à cette problématique et évaluerons des modes d'administrations plus sûrs et confortables.
Procédures
486 souris feront l'objet d'une euthanasie (anesthésie sans réveil) pour prélèvement de tissus post-mortem. 120 souris feront l'objet d'enregistrements électrophysiologiques in vivo sous anesthésie générale et terminale. Une inflammation plantaire sera induite chez 1600 souris (injection carragénine) pendant 6h30. Un peptide sera administré chez ces animaux par voie intrapéritonéale, intrathécale, intraplantaire, intra-articulaire ou topique. Une mesure de seuils de douleur sera réalisée chez ces animaux pendant 3h après traitement. 200 souris seront soumises à des tests de locomotion après administration de peptide. Un modèle de douleur sera induit chez 1400 souris (post-opératoire : 24h, arthrose : 7 jours, neuropathique : 14 jours). Le peptide sera administré chez ces animaux le dernier jour et les seuils de douleur des animaux seront suivis pendant 3h. 300 souris seront incluses dans un protocole de pharmacocinétique impliquant des prélèvement de sang, cerveau et peau, qui seront réalisés après euthanasie.
Impact sur les animaux
Les conopeptides n'ont pas de toxicité centrale dû à leur incapacité à passer la barrière hémato-encéphalique. Ils peuvent cependant induire une toxicité périphérique, notamment musculaire ou cardiaque. La toxicité cardiaque sera évaluée chez l'animal anesthésié avant toute administration à un animal vigil. Des échelles de doses seront réalisées pour observer d'éventuelles modifications du comportement et déterminer la tolérance aux produits. Ce projet nécessite l'induction de modèles de douleur neuropathique et inflammatoire. Ces procédures, de fait, constituent une nuisance pour les animaux. Les animaux seront donc euthanasiés immédiatement après l'expérience, dont la durée sera réduite au minimum (fonction du temps nécessaire à l'induction). Seuls des tests comportementaux visant à atteindre le seuil de douleur de l'animal sans le dépasser seront utilisés. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur et si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue des expérimentations car les traitements réalisés ne permettent pas leur réutilisation. De plus, les procédures impliquent l'induction d'un modèle de douleur, ce qui rend leur euthanasie obligatoire en fin d'expérience.
Remplacement
Les peptides seront sélectionnés par une approche in vitro, favorisant l'utilisation de lignées cellulaires et les cellules souches différenciées. Nous utiliserons également des cultures primaires de neurones pour confirmer les résultats obtenus sur les lignées. Ces cultures nécessitent l'euthanasie d'animaux, mais permettent d'obtenir une grande quantité de résultats par animal (42 peptides ou concentrations différentes peuvent-être testés grâce aux neurones obtenus d'une souris).
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Certaines procédures sont adaptées pour obtenir plus d'information à partir des mêmes animaux (par exemple test de nociception, puis test de sédation et enfin mesure de la température rectale).
Raffinement
Les premiers tests in vivo seront réalisés sous anesthésie (enregistrement de l'activité nerveuse sensorielle périphérique sous anesthésie kétamine/xylazine, 1 mg/kg intrapéritonéal), et couplés à un monitoring cardiaque. Cela permettra de ne tester chez l'animal vigil que les toxines ayant un effet avéré sur l'hyperexcitabilité neuronale et n'ayant pas de toxicité cardiaque. En raison de la nécessité d'évaluer la douleur chez les animaux, nous ne pouvons pas mettre en place de traitement pharmacologique de la douleur. Cependant, afin de prévenir une éventuelle souffrance qui irait au delà du modèle de douleur utilisé, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie, et euthanasiés si un point limite est franchi. En effet, si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié. Les animaux seront au maximum 6 par cage en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront un enrichissement de type maisonnette ainsi que du coton pour la constitution d'un nid.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur le modèle souris car c'est sur ce modèle qu'ont été mis au point au laboratoire toutes les techniques d'investigation comportementale et électrophysiologique ainsi que les différents modèles de douleur utilisés. C'est également le modèle pour lequel nous disposons du plus de données dans la littérature. Enfin, notre animalerie est une animalerie petit rongeur concue pour l'hébergement des souris, modèle sur lequel notre personnel a le plus d'expertise. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes (8-12 semaines). Si la douleur touche essentiellement des personnes âgées, travailler sur la souris âgée représenterait un risque et surcoût extrêmement important qui mettrait en péril le projet dans son ensemble (coût d'achat d'animaux âgés et surmortalité de ces animaux). L'animalerie et son personnel ne sont pas en mesure d'accueillir à grande échelle des animaux âgés demandant une surveillance et des soins accrus et adaptés. Enfin, les tests et modèles utilisés, comme les données disponibles dans la littérature, concernent sauf cas très spécifiques des animaux jeunes.
Évaluation des propriétés antiépileptiques de composés nouvellement identifiés dans un modèle murin du syndrome de Dravet
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
636 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 576 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant le syndrome de Dravet, elles reçoivent des injections, subissent des crises d'épilepsie déclenchées par hyperthermie et des tests comportementaux d'exploration et de nage, pour évaluer trois composés antiépileptiques. Le porteur indique que le modèle entraîne des crises spontanées et une mort subite chez 40 % des souris, qu'il décrit comme survenant "sans aucune souffrance". Il justifie la souris par le fait qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les crises d'un "organisme entier", et annonce une transposition possible à l'humain au conditionnel.
Objectifs
Le syndrome de Dravet est une épilepsie génétique sévère qui se développe avant l'âge de 1 an. Outre les crises d'épilepsie, ce trouble se caractérise par des comorbidités comportementales, telles qu'un déficit cognitif et une déficience motrice. Dans 80% des cas, ce syndrome est causé par une mutation d'un gène codant pour un canal sélectif au sodium. Ces canaux sont principalement localisés dans les neurones inhibiteurs du cortex et de l'hippocampe et jouent un rôle clé dans la régulation de leur excitabilité. Plusieurs équipes ont montré que les mutations de ces canaux identifiées chez des patients atteints du syndrome de Dravet provoquaient une hypoexcitabilité des neurones inhibiteurs induisant un déséquilibre excitation/inhibition qui conduit à des crises d'épilepsie. Une grande partie des patients atteints du syndrome de Dravet n'ont pas d'amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises avec les traitements pharmacologiques actuels. Les souris reproduisant la mutation humaine ont un phénotype qui récapitule les symptômes observés chez les patients atteints du syndrome de Dravet. Nous allons tester 3 composés qui ont montré un potentiel antiépileptique, réduisant efficacement la fréquence des crises dans un modèle d'épilepsie chez le poisson zèbre. Notre projet de recherche vise à évaluer l'efficacité d'un traitement pharmacologique précoce avec les 3 composés sur le développement de différents symptômes dans un modèle de souris du syndrome de Dravet, confirmant, espérons-le, les résultats prometteurs obtenus à partir d'un modèle de poisson zèbre.
Bénéfices attendus
Nous présentons une nouvelle approche expérimentale, ainsi qu'une nouvelle version de la ligne de traitement existante, l'une ou l'autre pouvant améliorer la résistance aux médicaments observée chez les patients atteints du syndrome de Dravet. La majorité des traitements pharmacologiques actuellement disponibles se sont avérés peu ou pas efficaces dans le syndrome de Dravet. Nos traitements proposés ont déjà montré des résultats prometteurs dans un modèle de poisson zèbre du syndrome de Dravet, réduisant efficacement la fréquence et la gravité des crises. Nous nous attendons à observer un effet similaire dans notre modèle de souris, en testant en outre l'effet du traitement sur les anomalies comportementales, ce qui, dans l'état actuel, n'est pas possible chez les poissons. De plus, si les résultats sont confirmés chez un mammifère comme la souris, le potentiel thérapeutique a plus de chance d'être transférable à l'homme.
Procédures
A 6 jours les animaux sont biopsiés pour analyse du génotype, puis les souris entrent en procédure à l'age de 15 jours. La totalité des souris recevra une injection en intrapéritonéal ou intranasal (durée 3 à 5 s) qui peut provoquer une inflammation locale. 6 groupes de 23 souris mutantes subiront une induction de crise induite par l'hyperthermie. Il s'agit d'une procédure unique qui dure environ 20 minutes et se termine lors d'une crise tonico-clonique généralisée ou lorsqu'elle atteint 43 degrés. La majorité des tests comportementaux, qui seront utilisés sur 363 souris, sont basés sur la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement et se feront en une seule séance (5 à 30 min). Un test d'apprentissage qui consiste à faire nager les souris pendant au maximum 1 minute est réalisé sur 5 jours.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons une lignée de souris avec une modification génétique du gène codant pour un canal sodium qui provoque des crises tonico-cloniques spontanées à partir de l'âge de 3 semaines environ. Ces crises peuvent provoquer une mort subite chez 40% des animaux sans aucune souffrance (cette mortalité est également observée chez les enfants atteints du syndrome de Dravet). Les crises durent peu de temps (entre 20 et 30 s) et les souris récupèrent rapidement (2 à 5 min). En d'autres termes, les souris reprennent lentement conscience et recommencent à bouger sans aucun signe de douleur (pas de posture, de cri ou d'expression faciale de douleur). La fréquence moyenne des crises spontanées dans ce modèle de souris est de 1 crise tous les 2 jours.
Devenir
Toutes les souris prévues pour les procédures seront euthanasiées car elles ne peuvent pas être réutilisées dans une autre procédure à cause des effets possibles des molécules injectées .
Remplacement
L'utilisation d'un modèle animal in vivo mimant le phénotype clinique observé chez les patients atteints du syndrome de Dravet est cruciale pour l'objectif de notre projet qui est de tester l'efficacité de nouveaux traitements pharmacologiques sur l'ensemble des symptômes (épileptiques et non épileptiques) qui surviennent dans ce syndrome. Aucun modèle in vitro ne peut récapituler les réponses d'un organisme entier en terme de crises d'épilepsie et leurs conséquences sur le comportement.
Réduction
Nous avons minimisé le nombre d'animaux nécessaires dans chacune des procédures tout en nous assurant d'en avoir suffisamment pour faire l'analyse statistique de nos expériences (analyse de puissance a priori). Dans toutes les procédures, nous comparerons les souris mutantes avec les souris controles des mêmes portées. Dans toutes les procédures, nous utiliserons des femelles et des mâles issus des mêmes portées.
Raffinement
Nous prendrons toutes les mesures d'affinement appropriées pour éviter toute souffrance ou inconfort pour l'animal (anesthésie pendant les procédures et analgésie post procédure si nécessaire). Une grille de score permettra le suivi et la mise en place d'actions correctives en cas d'anomalie et les points limites. Ainsi, toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et nous manipulerons les animaux régulièrement pour réduire leur stress. L'induction des crises spar hyperthermie e fera une fois que les animaux se seront habitués à l'équipement et ils seront refroidis à la fin de l'expérience. Enfin, les souris mutantes ayant des crises tonico-cloniques spontanées, nous porterons une attention particulière aux critères de poids, de stress et d'hyper-réactivité comme le suggèrent les NC3Rs pour les modèles d'épilepsie avec crises spontanées.
Choix des espèces
Le modèle de souris portant une mutation humaine est très informatif car 1) les animaux présentent des symptômes quasiment identiques à ceux des humains et dans la même gamme d'âge, nous utiliserons les animaux à l'âge de développement de l'épilepsie et d'apparition des symptômes (entre 21 et 30 jours), 2) les animaux issus de la même portée mais sans la mutation sont d'excellents controles. La souris est une espèce très intéressante pour les expériences de comportement car ce sont des mammifères qui ont des capacités d'apprentissage, et pour l'observation des crises d'épilepsie car elles sont courtes et indolores comme chez les humains.
Etude de la biologie des tumeurs pédiatriques et développement de nouvelles approches thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de fragments de tumeurs d'enfants ou une injection de cellules tumorales, puis des injections répétées et des prélèvements sanguins, pour étudier le sarcome d'Ewing et tester des traitements. Le porteur décrit des greffes et injections jugées peu gênantes et des prélèvements sanguins brièvement douloureux. Sur le remplacement, il affirme que ces modèles reproduisant l'écosystème tumoral sont les seuls proches des tumeurs de patients et restent nécessaires avant les essais chez l'humain.
Objectifs
Les tumeurs pédiatriques sont rares, puisqu’en France, un enfant sur 440 va développer un cancer avant l’âge de 15 ans, mais elles représentent 28 % de la mortalité enfantine ce qui en fait la 2e cause de décès chez les 1-14 ans après les accidents. Le sarcome d’Ewing est la seconde tumeur osseuse maligne pédiatrique la plus fréquente après l’ostéosarcome et touche environ 80 à 100 nouveaux patients par an en France. Malheureusement, 20 % des patients présentent des métastases au diagnostic ce qui diminue drastiquement leur chance de survie. Génétiquement, le sarcome d’Ewing a bien été caractérisé et est lié à une fusion entre deux gènes, aboutissant à l’expression d’une protéine anormale. Cependant, les mécanismes d’action de cette protéine dans la transformation tumorale doivent encore être élucidés. Afin de comprendre cette transformation tumorale et identifier les meilleures pistes thérapeutiques pour ces patients, l’utilisation des modèles animaux est primordiale pour nos projets. Nous utilisons des modèles de PDX (patient derived xenograft) qui sont générés après une greffe chez la souris d’un fragment de tumeur issu de patients. A l’heure actuelle, ces modèles animaux n’ont pas d’équivalence qui leur permettrait d’être remplacés par des approches alternatives de type in vivo puisqu’ils sont les seuls qui se rapprochent le plus de la tumeur de patients. . L’objectif du projet est d’identifier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - la génération de nouveaux modèles d’étude de cancers pédiatriques (PDXs ainsi que de nouvelles lignées cellulaires dérivées de PDX) qui sont limitants aujourd’hui. En effet, les modèles de PDX nous permettent d’obtenir du matériel tumoral suffisant pour réaliser nos études puisque nous ne pouvons pas les effectuer sur les tumeurs de patient, vu la quantité de matériel obtenue et la rareté des échantillons. De plus, les modèles PDX sont les seuls modèles qui se rapprochent le plus aux tumeurs de patient. - Etudier la structure 3D de la chromatine sur ces échantillons de PDX pourra générer un maximum de données qui seront primordiales à la compréhension de la biologie des tumeurs d’Ewing et des Ewing-Like. Ces résultats et analyses vont nous permettre de répondre à nos questions biologiques et par la suite, ces données pourront être utilisées par toute la communauté scientifique afin de répondre à leur propre hypothèse. - La validation des nouvelles molécules identifiées sur des modèles de PDX. En effet, les découvertes qui seront réalisées grâce à ces nouvelles technologies et grâce au criblage in vitro, vont nous permettre l'identification de nouvelles molécules. Il sera donc important de valider ces dernières in vitro sur des cellules dérivées de PDX et in vivo sur des modèles de xénogreffe/PDX avant de passer aux tests cliniques chez l’homme.
Procédures
Une partie des souris de ce projet sera opérée sous anesthésie (1 fois) pour recevoir un fragment tumoral en sous-cutanée au niveau du dos (durée de l’anesthésie : 15 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine. (durée du geste inférieure à 30 sec) Une autre partie des souris sera injectée avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée aux animaux anesthésiés (1 fois – durée de l’anesthésie inférieure à 1 min). Certains de ces animaux seront ensuite traités à raison de 3 injections par jour (injections des traitements en sous-cutanée sur animaux vigiles) ou de 2 fois par jour pour les traitements administrés par voie orale (durée de chaque geste inférieure à 10 sec). La durée du traitement variera en fonction de la molécule administrée et sera en accord avec la littérature. Des prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux vigiles à raison d’une fois par semaine (durée du geste inférieure à 30 sec)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues au cours de la greffe de fragments tumoraux seront celles liées à l’incision de la peau sur des animaux anesthésiés (gène d’intensité faible et de courte durée). Suite à ces greffes, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du dos qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales seront celles à l’injection de produits non toxiques et non douloureux (gène d’intensité faible, de courte durée). Suite à ces injections, les souris développeront des tumeurs en sous cutanée au niveau du flanc qui ne devraient pas induire de gêne particulière. Les prélèvements de sang au niveau de la joue entraineront une douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques dans l’abdomen des souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L'utilisation de modèles pré-cliniques pertinents de la maladie est nécessaire, pour étudier les mécanismes qui sont impliqués dans la transformation tumorale et de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. En particulier, l'utilisation de la souris qui est un organisme vivant, mammifère intégré et autonome, présente de nombreuses similitudes avec l’homme. L’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques ne peut se limiter à des expériences in vitro. En effet, nous réalisons d’ores et déjà pour nos différentes études des expériences in vitro pour tester par exemple des molécules sur des lignées cellulaires. Aussi, nous réalisons en collaboration, des expériences ex-vivo en microfluidique en utilisant des cellules dérivées de PDX. La microfluidique permet de miniaturiser l’expérience afin de tester un grand nombre de molécules avec peu de cellules ce qui permet de réduire le nombre de souris à utiliser pour ces tests. Nous effectuons également des expériences sur des tumeurs de patients pour caractériser l’expression des gènes. Cependant, la rareté des échantillons humains et la faible quantité obtenue ne nous permettent pas de réaliser des expériences complémentaires sur ces échantillons. D’où l’importance d’utiliser ces - modèles murins, reproduisant au mieux la complexité de l’écosystème tumoral, incluant cellules tumorales et cellules du microenvironnement, avant d’envisager des tests chez l’Homme dans le cadre d’essais cliniques.
Réduction
Toutes les précautions seront prises pour réduire le nombre d’animaux utilisés, tout en assurant une valeur significative des résultats obtenus. Les tests préliminaires in vitro permettent de limiter le nombre de molécules à tester sur les souris. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.
Raffinement
Les souris recevront anesthésique et analgésique au moment de la greffe. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, lors des greffes ainsi que des traitements, les animaux auront une surveillance accrue afin d'assurer leur bien-être. Une observation et une notation de leur état général seront évaluées de façon objective en utilisant une grille de score. Les expérimentations sont arrêtées dès l'atteinte d'un point-limite.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent pour les expériences menées en oncologie. En effet, les souches murines sont parfaitement définies (modèles génétiquement modifiés, souches immunodéprimées permettant le développement de tumeur d'origine humaine) et présentent une parenté biologique avec l’Homme (génome murin/humain, physiologie). Ceci est vrai pour la tumeur que nous étudions, à savoir le sarcome d’Ewing. Nous utilisons des modèles PDXs reproduisant la diversité des tumeurs de patients. Dans le contexte préclinique du cancer, les PDXs reconstituent l’écosystème tumoral avec ses différentes composantes, incluant cellules tumorales et autres cellules présentes de la tumeur tel qu’il existe chez les patients. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance, l'adolescence et les jeunes adultes. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des animaux âgés de 5 semaines (réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation) à 8 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement de ces tumeurs pédiatriques.
Rôle d’une voie de l’inflammation dans l’immunodépression suite à une infection chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, la quasi-totalité en gravité sévère. Elles subissent soit une péritonite provoquée par perforation du tube digestif, soit une injection d'un composant bactérien, pour étudier le rôle d'une voie de l'inflammation dans l'immunodépression qui suit une infection grave. Le porteur indique que la péritonite peut provoquer des douleurs, une perte de poids et une réduction de la mobilité. Sur le remplacement, il affirme que des cellules isolées ne refléteraient pas la complexité de la réponse immunitaire et conclut que le modèle murin est "indispensable".
Objectifs
Chez les patients de réanimation présentant une infection sévère, des altérations de la réponse immunitaire se développent responsables de la majorité des décès. Les mécanismes à l’origine de ces dysfonctionnements des cellules du système immunitaire restent mal connus. L’activation d’une voie de signalisation particulière de l’inflammation pourrait participer à ce phénomène. Cette voie est activée chez des patients présentant une infection sévère hospitalisés en réanimation. Dans d’autres contextes cliniques que les infections sévères et notamment en cancérologie, des données de la littérature associent l’activation de cette voie et la survenue d’altérations du système immunitaire. L’hypothèse de recherche est que cette activation au cours des infections sévères est responsable du développement des altérations du système immunitaire. Au cours de ce projet, le rôle de cette voie de l’inflammation dans le développement des dysfonctionnements du système immunitaire après le sepsis sera déterminé en utilisant un modèle murin d’infection sévère par péritonite ou par injection d’un composant bactérien (lipopolysaccharides). L’activation de cette voie et les altérations immunitaires présentées par ces souris dans différents organes (rate, moelle osseuse, sang, péritoine, poumon) seront étudiées. Des dosages sanguins de marqueurs d’activation de l’inflammation seront également réalisés.
Bénéfices attendus
Les infection sévères sont une pathologie fréquente à l’origine d’une morbi-mortalité considérable. Le pronostic des patients développant ces infections sévères est principalement grevé par le développement d’une immunodépression à l’origine à moyen terme d’infections secondaires nosocomiales et à long terme du développement de maladies cardiovasculaires et de cancers. Une meilleure compréhension des mécanismes de cette immunodépression post-septique est jugée nécessaire par l’Organisation Mondiale de la Santé pour progresser dans la prise en charge de cette pathologie. En focalisant les efforts sur une voie de l’inflammation clé au cours des infections, cela permettra de générer des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir les dysfonctions immunitaires et d’améliorer le devenir de ces patients. L’existence de médicaments capables d’inhiber cette voie de l’inflammation utilisés en pratique clinique et bien tolérés dans d’autres indications rend cette perspective très concrète. Ces stratégies thérapeutiques innovantes auraient un effet préventif des conséquences à moyen et long terme de ces infections sévères.
Procédures
Le projet s’appuie sur 2 modèles murins d’infections. Le premier modèle est une infection au niveau abdominal (péritonite) créée par perforation du tube digestif (durée de la procédure : 5 minutes), les souris contrôles subissant exclusivement une incision de la paroi abdominale (durée de la procédure : 3 minutes). Cette intervention est réalisée une seule fois en début de procédure, à J0. Le deuxième modèle consiste en l’injection d’un composant bactérien (injection sur 10 secondes), les souris contrôles recevant une injection d’eau et de sel. Cette injection est réalisée une seule fois en début de procédure à J0. Les prélèvements sanguins seront réalisés exclusivement sous anesthésie générale le jour de la mise à mort (1 mL, 10 secondes) et les différents autres prélèvements en post-mortem.
Impact sur les animaux
La péritonite peut être à l’origine de douleurs, d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité. Il existe également une douleur au point d’injection lors de l’injection d’anesthésique. L’injection du composant bactérien est à l’origine d’une perte de poids, d’une douleur au point d’injection lors de l’injection et d’une réduction de l’activité et de la mobilité.
Devenir
Une mise à mort sera réalisée à l’issue des procédures du fait du prélèvement nécessaire d’organes vitaux (poumon par exemple) ne permettant pas d’envisager une autre issue.
Remplacement
Un modèle utilisant uniquement des cellules isolées ne pourrait refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire contre les infections sévères et les relations entre les cellules de l’immunité. L’utilisation d’un modèle murin est donc indispensable.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, de multiples analyses utilisant des techniques différentes seront réalisées sur les différents prélèvements afin de minimiser le nombre de souris utilisé.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être, une prise en charge de la douleur (anesthésie générale lors de l'intervention, administration d’antalgiques) et une prise en charge de la déshydratation seront réalisées. A l'issue de la chirurgie, les souris seront replacées dans leurs cages avec un aménagement spécifique pour garantir leur confort. La cage sera placée dans une armoire chauffante. Une surveillance quotidienne avec pesée des souris et grille d'évaluation spécifique sera effectuée jusqu'à mise à mort. En cas de douleur ou d’inconfort trop important, une mise à mort anticipée des souris sera réalisée.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement et des modèles génétiquement modifiés sont d’ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (8-12 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.
Angiographie par résonance magnétique avec injection de produits de contraste chez le porc
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
7 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sains, ils reçoivent sous anesthésie générale deux injections de produits de contraste espacées de 48 heures, pour comparer un agent de routine à un nouveau candidat en imagerie par résonance magnétique. Le porteur juge la toxicité attendue très faible, et justifie la mise à mort par l'impossibilité d'un retour à l'élevage pour "raisons sanitaires". Sur le remplacement, il affirme que des tests in vivo sont "indispensables" et retient le porc pour sa proximité anatomique avec l'humain.
Objectifs
L’angiographie par résonance magnétique (MRA) avec injection d’un agent de contraste est une technique qui permet de détecter des lésions vasculaires chez des patients atteints de pathologies artérielles, en utilisant l’Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM). L’objectif de ce projet est de comparer 2 produits de contraste, un utilisé en routine et un nouveau candidat, potentiellement plus efficace à demi dose. Il s’agit ici de confirmer l’efficience de cette demi dose, afin de garantir son innocuité et sa sécurité d’emploi en clinique humaine, ainsi que son efficacité sur des lésions vasculaires. Dans cette étude le recours à l’animal (porc sain) a été choisi car l’imagerie peut s’effectuer avec des protocoles d’angiographie transposables directement à l’Homme.
Bénéfices attendus
Sur le court terme, ce projet va permettre de documenter l’efficacité d’un nouvel agent de contraste lors d’une angiographie par résonance magnétique et de déterminer ses performances et ses limites dans cette application médicale. Sur le plus long terme, ce projet s’inscrit dans l’intérêt clinique des patients, en effet le praticien hospitalier pourra déterminer la meilleure posologie à attribuer aux patients tout en préservant les mêmes performances que les agents de contraste actuellement sur le marché.
Procédures
Les animaux subiront 2 injections par la veine auriculaire, sous anesthésie générale, à 48 heures d'intervalle. La procédure totale dure environ 2h, répétée 2 fois.
Impact sur les animaux
Les complications d’une anesthésie sont rares. En cas d’irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation), un anti inflammatoire non stéroïdien sera administré. Des complications infectieuses pourraient également survenir : un antibiotique serait alors administré. L’injection des produits de contraste à la veine auriculaire ainsi que les médicaments par voie intraveineuse peuvent entrainer un hématome. Les produits qui seront injectés aux sujets sont des agents de contraste destinés à l’usage chez l’homme. Ils ont globalement un excellent profil de tolérance, avec une élimination rapide. Concernant les effets potentiels chez l’animal, ils sont considérés comme très faibles. Par conséquent, il n’est pas attendu de toxicité particulière dans cette étude chez le porc.
Devenir
Une fois la procédure d’imagerie effectuée, les animaux seront euthanasiés. En effet aucun replacement ni adoption n’est possible après des injections d’agents de contraste, et le retour à l'élevage d'origine est impossible pour des raisons sanitaires.
Remplacement
Pour s'assurer de l'efficacité réelle des agents de contraste, des tests in vivo sont indispensables. En effet, le recours aux animaux permet d’avoir des modèles ayant de fortes homologies avec l’Homme, soulignant ainsi le transfert possible des résultats vers l'Homme. Cela permet également de prendre en considération le comportement des agents de contraste au sein des différents organes. Le projet sera conduit sur des porcs ayant un poids d’environ 40 kg. Le modèle porcin est déjà validé pour les études cardiovasculaires. Le choix de cette espèce nous permettra de comparer nos résultats aux données de la littérature et d’avoir des résultats proches de ceux attendus chez l’Homme. Nous avons décidé d’utiliser des porcs sains de 40 kg car ils présentent des homologies avec l’Homme, notamment un rapport poids du cœur sur poids du corps équivalent. En effet, la majorité des études sur le système cardiovasculaire sont effectués chez des porcs compris dans cette fourchette de poids. De plus, l’étude en imagerie in vivo s’effectuera avec des protocoles d’angiographie par résonance magnétique directement transposables chez l’Homme.
Réduction
Un groupe de 6 animaux a été prévu. Le calcul du nombre d’animaux a été déterminé selon l’expertise du laboratoire d’accueil et de notre laboratoire. En effet, un groupe de 6 animaux est suffisant pour mettre en avant des différences significatives lors de l’évaluation d’un agent de contraste. Afin de limiter le nombre d’animaux, tous les animaux recevront deux injections de produits de contraste différents par voie intraveineuse. Ce protocole expérimental permettra de faire des comparaisons intra-individuelles. L’injection des deux agents de contraste (une référence et le nouvel agent) sera espacée dans le temps de 48H. Le volume d’injection de chaque composé sera ajusté pour être identique afin de ne pas apporter un biais à l’étude. Une telle étude permet de standardiser un protocole pour comparer dans les meilleures conditions possibles différents agents de contraste au sein des mêmes individus. En effet, ce projet évaluera l’efficacité de différents produits de contraste injectés chez le même animal.
Raffinement
La procédure sera réalisée par du personnel expérimenté, ayant une expertise de l'anesthésie et de l’euthanasie chez des modèles porcins. Nous avons fait le choix de passer par la veine auriculaire, et non la veine jugulaire, pour l’injection des produits de contraste afin de limiter au maximum la douleur pouvant être infligée à l’animal. En outre, les deux examens en imagerie réalisés sur chaque animal seront espacés de 48H pour éviter des anesthésies trop rapprochées. Les séquences en angiographie par résonance magnétique dès l’injection du produit de contraste sont très courtes (20-30 sec), ce qui permet de répéter les mesures tout en limitant la durée totale de l’anesthésie. Des mesures seront prises dès la prise en charge de l’animal jusqu’à la réalisation de la procédure en imagerie in vivo : Pré-examen imagerie/Anesthésie: les animaux arriveront la veille, et seront mis à jeun 24h avant l’intervention, avec abreuvement à volonté. - Anesthésie (induction par voie intraveineuse), puis intubation, ventilation et maintien de l'anesthésie par voie gazeuse - Per-imagerie - Anesthésie par voie gazeuse. Post imagerie - Les animaux sont logés en cases par groupes de 3 animaux et l’enrichissement du milieu sera réalisé à l’aide d’une quantité de paille suffisante pour qu’ils puissent jouer avec. Ils seront surveillés quotidiennement.
Choix des espèces
Nous avons décidé d’utiliser des porcs sains d’environ 40 à 50 kg car ils présentent des homologies avec l’Homme, notamment un rapport poids du cœur sur poids du corps équivalent. En effet, la majorité des études sur le système cardiovasculaire sont effectués chez des porcs compris dans cette fourchette de poids. Dans notre étude nous allons nous intéresser à l’arbre artériel, notamment l’aorte, ce qui rend ce modèle d’étude pertinent. De plus, l’étude chez le porc peut être effectuée avec des protocoles IRM directement utilisables chez l’Homme. Des porcs compris entre 40-50 kg seront utilisés dans l’étude. A ce stade de développement, le porc présente plus de caractéristiques communes avec l’Homme que le porc adulte pesant entre 80-100 kg.
Réaction inflammatoire lors de la toxoplasmose oculaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
2836 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection dans chaque œil pour une infection à Toxoplasma gondii, avec un suivi par fond d'œil répété cinq fois sur quatorze jours, pour étudier la réaction inflammatoire de la rétine. Le porteur indique qu'avec les souches virulentes l'inflammation oculaire s'aggrave au-delà du septième jour, et précise ne pas administrer d'analgésique de crainte de fausser la réponse immunitaire. Sur le remplacement, il affirme que seuls des modèles vivants permettent d'étudier les interactions entre le parasite et l'organisme hôte, et retient la souris comme espèce la mieux caractérisée sur le plan immunologique.
Objectifs
L’infection au parasite protozoaire Toxoplasma gondii est la première cause infectieuse d’inflammation rétinienne chez l’Homme. Or, les mécanismes physiopathologiques de cette maladie sont mal connus. Ceci est avant tout dû à la difficulté d’accès aux yeux humains. Ces contraintes rendent difficile de trouver un consensus sur le traitement. Notre recherche vise à trouver des cibles spécifiques pour l’intervention médicale. Pour des raisons évidentes, le modèle humain ne peut pas être étudié en grand détail, même si nous avons réussi à tirer des conclusions importantes de l’analyse des médiateurs inflammatoires dans l’humeur aqueuse des patients. Pour les questions plus détaillées, nous avons établi un modèle de souris, sur lequel nous avons déjà démontré le rôle de plusieurs médiateurs inflammatoires. Nous nous posons maintenant la question comment cette inflammation est contrôlée dans la rétine. L’œil est considéré comme organe où les réactions inflammatoires pourraient provoquer des dommages irréversibles et qui sont donc bien contrôlées. Or, le mécanisme précis de ce contrôle est mal étudié, surtout lors d’une infection toxoplasmique. Les candidats classiques d’une telle réaction anti inflammatoire, sont des récepteurs et d’autres facteurs immunosuppressives. Ces facteurs sont effectivement exprimés ou sécrétés par des cellules de la barrière oculaire. Ils feront donc partie de notre étude. En plus, nous venons de publier une étude in vitro qui décrit pour la première fois les rôles des interférons de type I et III. Comme il n’avait aucune étude sur ces interférons lors d’une toxoplasmose oculaire, l’étude de leurs fonctions sera au centre de nos expériences. Enfin, une infection toxoplasmique peut avoir des conséquences cliniques très variées selon la souche de T. gondii infectante. Cette différence est aussi observée au niveau oculaire. Les raisons physiopathologiques de ces différences n’ont pas été étudiées dans des modèles animaux. Nous envisageons donc de comparer les infections avec quelques souches isolées des patients et ayant provoquées des manifestations cliniques différentes et bien caractérisées.
Bénéfices attendus
Malgré l’importance clinique de la toxoplasmose oculaire, les mécanismes immunologiques de cette pathologie ne sont que peu connus, malgré quelques progrès ces dernières années. Nous regardons spécifiquement la réaction anti-inflammatoire dans l’œil lors de l’infection. La question derrière est : Comment cet organe particulièrement sensible peut-il se défendre contre une infection, sans trop de destruction par une inflammation trop prononcée ? Les retombés et les bénéfices attendus du projet sont multiples. Nous avons récemment publié un article basé sur des expériences in vitro sur le rôle des interférons dans les mécanismes immunologiques de la toxoplasmose oculaire. Ce projet va donc nous permettre de confirmer, de renforcer et de compléter nos résultats obtenus in vitro. Les résultats ainsi obtenus seront ensuite partagés avec la communauté scientifique par la publication d’un article dans un journal international indexé et revue par des paires. Le projet permettra donc de faire évoluer la connaissance générale dans différent domaines : La toxoplasmose oculaire, mais également plus largement de la réponse immunitaire oculaire. D’autres retombés à plus long terme sont également à prévoir. En effet, une meilleure compréhension des mécanismes de réponse immunitaires peut servir à améliorer ou à mettre en place des nouvelles stratégies diagnostique et thérapeutique. L’objectif à long terme, nécessitant une compréhension très détaillée de l’ensemble des mécanismes impliqués est d’avoir un traitement personnalisé et adapté au besoin du patient. Cela nécessite notamment une bonne compréhension des marqueurs souche-dépendants de la toxoplasmose oculaire, étudiés au cours de ce projet. Ensuite, une connaissance approfondie des interactions entre le parasite et l’expression de certains facteurs immunomodulateurs est également très intéressante. En effet, de nombreuses thérapies visant les check-points immunitaires sont déjà sur le marché traitant une multitude d’atteintes allant du cancer ainsi que certaines immuno-pathologies.
Procédures
Toutes les souris dans ce projet sont anesthésiées (générale) pour une durée de 5 minutes. Durant ce temps, elles reçoivent une injection intraoculaire dans chaque œil. Ensuite, une petite partie de souris sont de nouveau soumises à une anesthésie générale, pour une durée de 3 minutes. Durant cette période, les souris reçoivent une injection de traceurs fluorescents. Finalement, en utilisant une technique d’analyse non invasive, certaines souris sont anesthésiées pour une durée de 5 minutes durant laquelle un fond d’œil est réalisé. Cette procédure est réalisée 5 fois sur une période de 14 jours.
Impact sur les animaux
Les différentes nuisances potentielles pour les animaux sont : L’injection intra-oculaire n’est pas spécifiquement douloureuse, en effet, cette procédure est effectuée sans anesthésie générale chez l’homme. La manipulation de la souris est une source de stress. - L’infection intraoculaire d’une souche toxoplasmique non-virulente Me49. Par expérience, nous savons que le pic de l’inflammation est à 7 jours post-injection, ensuite elle rediminue progressivement pour atteindre un retour à la normale aux alentours du jour 14 post-injection. Sauf cas rare, au pics de l’inflammation, aucune dégradation de l’état générale de la souris n’est observable. Les souris gardent un comportement normal, sont curieuses et explorent leur environnement. Les poils ne sont pas non plus hérissés. Une légère augmentation de la sécrétion lacrymale ainsi que des foyers infectieux de la rétine sont observation en histologie. Ces foyers infectieux ne sont pas douloureux (asymptomatique chez l’Homme) mais peuvent causer une réduction de l’acuité visuelle. - L’infection intraoculaire avec des souches toxoplasmiques virulentes. La principale différence est la cinétique de l’inflammation. Pour la souche non-virulente l’inflammation de la rétine diminue à partir de jour 7. Pour les souches virulentes, l’inflammation devient de plus en plus importante après jour 7.
Devenir
L'étude se termine par la mise à mort des animaux pour prélèvements oculaires.
Remplacement
Nous utilisons en parallèle des modèles in vitro afin d’identifier les mécanismes au niveau cellulaire. Par contre, comme la rétine est un organe complexe, seulement des modèles in vivo peuvent identifier les interactions entre le parasite et l’organisme hôte, d’autant plus que nous étudions la réponse immunitaire. Nous veillons à faire un maximum d’expériences et de mise à point expérimentale sur nos modèles in vitro et d’utiliser le modèle animal pour des études d’interactions au niveau physiologique. Dans l'autre sens, les connaissances obtenues dans notre modèle animal permet de plus en plus d’expériences ciblées in vitro.
Réduction
Nous utilisons, si possible, des techniques multiplexes, pour détecter plusieurs paramètres dans un même échantillon. Nous nous basons sur nos précédentes études chez la souris pour définir nos effectifs minimaux permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’utilisation des techniques non-invasives, comme le fonds d’œil, nous permet de suivre le cours de l’infection sur une même souris et donc de minimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera assuré par l’enrichissement de l’environnement (lanières de carton, coton, tunnels, dôme) et la formation des groupes sociaux. Le protocole d’infection, avec inoculation d’une faible dose de parasites, et la durée limitée des expériences, résultera, par expérience, en une infection peu ou pas douloureuse pour les souris. Cette injection se fait sous anesthésie générale, ce qui diminue très grandement le stresse induit par la procédure. L’injection n’étant pas douloureuse et les foyers infectieux de la rétine ne provoquant pas de douleur, l’utilisation d’analgésique n’est pas nécessaire ici. Chez l’homme c’est une procédure réalisée sous anesthésie locale sans prescription d’analgésique. De plus, l’utilisation d’analgésique pourrait influencer la réaction immunologique, rendant les données non-interprétable. Enfin, pour les procédures de neutralisation de cytokines, l’injection intravitréenne des parasites et des anticorps neutralisants se fait au même temps. Nous avons inclus dans le projet l’utilisation d’une technique de fond d’œil non-invasive afin de faire un suivi de l’infection au cours du temps sur une même souris. Les résultats ainsi obtenue pourrons être utilisé pour perfectionner notre modèle d’infection actuel. Néanmoins, cette procédure sera faite en collaboration avec un spécialiste des pathologies oculaires chez les rongeurs qui apporte son matériel. Nous ne pouvons donc pas employer cette technique pour les autres expériences. Néanmoins, nous avons un protocole de point limite que nous utilisons et perfectionnons depuis longtemps au sein du laboratoire pour diverse projets très similaires. Ce protocole détaillé dans une section dédiée permet une détection précoce de la souffrance chez la souris dans le cadre de nos procédure expérimentale. Pour sa mise en œuvre nous sommes notamment assistés et conseillés par un ophtalmologue faisant partie de notre équipe.
Choix des espèces
La souris est l'animal le mieux caractérisé au niveau immunologique, ce qui facilite l'interprétation des résultats. En plus, l'immense majorité d'études sur la toxoplasmose dans la littérature ont été fait chez la souris, où les cinétiques d’infection sont les mieux connues. Tout cela fait de la souris l'espèce la plus propice de donner des résultats significatifs. Des animaux adultes de 6 à 12 semaines d’âge sont utilisés, pour avoir des souris avec un système immunitaire développé et des groupes homogènes
Nouvelles approches pour l’évaluation et le traitement des douleurs arthritiques chez les ovins. Partie 01
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
68 brebis vont être utilisées, 34 tuées à l'issue et 34 renvoyées dans leur élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au sévère. Une arthrite est déclenchée par une injection dans l'articulation sous anesthésie, suivie d'une IRM, de prélèvements sanguins, d'injections et de quinze administrations intranasales d'ocytocine, avec quatre tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur décrit une boiterie et un œdème articulaire pendant quatorze jours et prévoit une mise à mort si le score de douleur reste élevé plusieurs jours. Il affirme que le remplacement du mouton est impossible car l'espèce est "l'objet de l'étude", ce projet étant la partie 01 d'un travail mené dans deux établissements.
Objectifs
Chez les animaux d’élevage, la douleur reste un concept délicat à aborder. En effet, l'évaluation de la douleur chez ces animaux repose sur l'évaluation subjective de quelques critères zootechniques, cliniques et comportementaux (productivité, postures, etc.) dont les conclusions vont significativement varier en fonction de l'expérience et de la sensibilité des professionnels et qui ne permettent pas d’évaluer la douleur dans toutes ces dimensions (cognitive/émotionnelle/sensorielle). L'absence de biomarqueurs spécifiques permettant de réaliser un diagnostic précis de l'état douloureux d'un animal et/ou de quantifier l'intensité douloureuse conduit à un déficit d'évaluation. Ce déficit d'évaluation limite la prise en charge précoce des douleurs favorisant le développement de douleurs chroniques avec pour conséquence une augmentation de l'anxiété et du stress de l'animal douloureux mais également de ses congénères via des mécanismes de contagion émotionnelle, encore largement incompris. Par ailleurs, ce déficit d'évaluation ne permet pas de valider de manière précise l'efficacité des traitements antalgiques conventionnels chez les animaux d'élevages or, l'utilisation de ces traitements est limitée 1/ par leurs effets secondaires notamment sur la reproduction (ex : AINS), 2/ par la réglementation qui limite la présence de résidus médicamenteux dans les produits animaux de consommation et 3/ par le coût de ses traitements qui restent à la charge des professionnels. Ensemble, ces contraintes font que la prise en charge de la douleur des animaux élevages est limitée. Il existe donc un besoin impérieux d'innovation pour améliorer d'une part, l'évaluation de la douleur avec pour objectif de tester l'efficacité réelle des antalgiques sur ces animaux et d'autre part, pour stimuler le développement de nouvelles molécules plus efficaces, dépourvues d'effets secondaires et qui satisfassent les contraintes spécifiques de l’élevage. Dans ce contexte, ce projet propose de combiner des approches d’imagerie médicale, d’éthologie et de pharmacologie afin de 1/ mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spécifiques de l’état douloureux dans un modèle d’arthrite inflammatoire chez le mouton et 2/ démontrer l’efficacité antalgique de l’ocytocine, un composé déjà présenté comme antalgique sur les douleurs inflammatoires chez les rongeurs et dont l’utilisation pourrait satisfaire aux contraintes de l’élevage. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet auront plusieurs bénéfices aussi bien d'un point de vue scientifique que du point de vue de la médecine vétérinaire. D'un point de vue scientifique ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes de contagion émotionnelle de la douleur et de son impact sur l’expression des comportements sociaux chez les animaux. D’un point de vue de la médecine vétérinaire, si les résultats de ce projet démontrent l’efficacité antalgique d’un traitement intranasal d’ocytocine, alors nous aurons alors fourni les premiers arguments pour un repositionnement de l’ocytocine comme analgésique pour le traitement des douleurs inflammatoires chez les ovins.
Procédures
Au sein de l'EU1 les interventions suivantes seront réalisées: Huit prélévements sanguins (veine jugulaire) durant quelques secondes / Deux injections sous cutanées durant quelques secondes / Quinze administrations intra nasales durant quelques secondes / Quatre tests comportementaux qui seront réalisés 8 fois. Un test ne sera effectué qu’une seule fois et durera 5min ; les 3 autres seront effectués 8 fois et ils dureront 3min, 10min et 30min. Au sein de l'EU2 les interventions suivantes seront réalisées: Une injection intraarticulaire réalisée au sein de l'EU2 sous anesthésie générale et sous analgèsie (45 min) pour l'induction d'un modèle d'arthrite / Une procédure d'imagerie médicale IRM réalisée sous anesthésie générale (1h45) dans lEU2
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'arthrite induit l'apparition d'une boiterie, un œdème articulaire et des signes de douleur à la flexion modérée pendant 14 jours. Les différents actes expérimentaux peuvent engendrer du stress pour l’animal. L'administration intra nasale peut être un acte désagréable pour l’animal mais l’ocytocine ne présente pas d'effet secondaire. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire peuvent entrainer une légère douleur ainsi que l’apparition d’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement. Les injections sous cutanées réalisées de part et d’autre des flancs de l’animal ainsi que l’injection intra-articulaire (tibiotarsiennes) pour induire le modèle d'arthrite peuvent également engendrer une douleur légère au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger. Le transport des brebis d’un établissement utilisateur à l’autre peut générer du stress pour l’animal.
Devenir
34 brebis seront replacées dans leur élevage et 34 autres brebis seront euthanasiées afin de récolter les tissus d’intérêt (articulation, moelle épinière, cerveau) pour des études ultérieures.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du mouton est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage et la médecine vétérinaire de cette espèce. De plus, nous souhaitons étudier l'impact d'une douleur modérée sur l'expression des comportements sociaux dans cette espèce et cette question ne peut pas être abordée par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=4x8 animaux). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « arthrite-serum physiologique » (i.e. traitement avec l’impact le plus négatif) correspondent à la réalité observée naturellement, voire moins douloureux puisque nos animaux ne développeront pas d'atteinte sur d'autres articulations ou encore des atteintes pulmonaires comme observées lors des infections à agalacticae sur les exploitations. La taille de nos effectifs (8 individus par groupe) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si ces conditions ne sont pas remplies, nous utiliserons des tests non-paramétriques tels que les tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité intra-groupe le permet.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. Ils seront hébergés dans le bâtiment conditionnés de l'EU1 et auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. L'enclos des animaux sera enrichi avec un promontoire permettant à l'animal de monter et descendre afin qu'il puisse changer son point d'observation et faire de l'exercice. Lors du transport des animaux entre les deux unités expérimentales, les animaux recevront une injectionde neuroleptique afin de limiter le stress. Lors de l'induction du modèle les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de limiter l'induction de douleurs inutiles liés à l'injection intrarticulaire de BCII. Tous les animaux seront visités quotidiennement et une surveillance accrue sera réalisée post induction du modèle. Deux expérimentateurs indépendants utiliseront deux échelles d'évaluation publiées et validées pour évaluer la douleur chez les animaux Expérimentateurs. Ainsi, si un animal Expérimentateurs présente pendant plus de trois jours un score supérieur à 5 sur l'une de ces deux grilles l'animal recevra une injection d'antalgique et sera euthanasié par un employé qualifié de l'EU1. L'animal Observateur sera replacé au sein du cheptel de l'EU1 et sortira de l'expérimentation. Lors des prélèvements, des tests comportementaux, et des injections intranasales, les animaux recevront une récompense sous forme d'aliments juste après les procédures afin de réduire le stress engendré par la procédure.
Choix des espèces
Le mouton est utilisé dans cette étude à cause de la forte incidence (jusqu'à 40% des jeunes animaux dans certaines fermes) des pathologies l'arthritiques observées dans cette espèce. Ces arthrites sont causées par plusieurs bactéries et cette situtation sanitaire présente une sérieuse atteinte au bien-être des animaux. Ainsi l'utilisation du mouton est nécessaire car cette espèce est l'objet de l'étude. Les animaux utilisés seront des femelles de race Ile de France agées entre 9-10 mois. Ce projet sera réalisé chez des jeunes animaux car la prévalence des arthrites infectieuses est plus importante chez les jeunes ovins.
Nouvelles approches pour l’évaluation et le traitement des douleurs arthritiques chez les ovins. Partie 02
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
68 brebis vont être utilisées, 34 tuées à l'issue et 34 renvoyées dans leur élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au sévère. Une arthrite est déclenchée par une injection dans l'articulation sous anesthésie, suivie d'une IRM, de prélèvements sanguins, d'injections et de quinze administrations intranasales d'ocytocine, avec quatre tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur décrit une boiterie et un œdème articulaire pendant quatorze jours et prévoit une mise à mort si le score de douleur reste élevé plusieurs jours. Il affirme que le remplacement du mouton est impossible car l'espèce est "l'objet de l'étude", ce projet étant la partie 02 d'un travail mené dans deux établissements.
Objectifs
Chez les animaux d’élevage, la douleur reste un concept délicat à aborder. En effet, l'évaluation de la douleur chez ces animaux repose sur l'évaluation subjective de quelques critères zootechniques, cliniques et comportementaux (productivité, postures, etc.) dont les conclusions vont significativement varier en fonction de l'expérience et de la sensibilité des professionnels et qui ne permettent pas d’évaluer la douleur dans toutes ces dimensions (cognitive/émotionnelle/sensorielle). L'absence de biomarqueurs spécifiques permettant de réaliser un diagnostic précis de l'état douloureux d'un animal et/ou de quantifier l'intensité douloureuse conduit à un déficit d'évaluation. Ce déficit d'évaluation limite la prise en charge précoce des douleurs favorisant le développement de douleurs chroniques avec pour conséquence une augmentation de l'anxiété et du stress de l'animal douloureux mais également de ses congénères via des mécanismes de contagion émotionnelle, encore largement incompris. Par ailleurs, ce déficit d'évaluation ne permet pas de valider de manière précise l'efficacité des traitements antalgiques conventionnels chez les animaux d'élevages or, l'utilisation de ces traitements est limitée 1/ par leurs effets secondaires notamment sur la reproduction (ex : AINS), 2/ par la réglementation qui limite la présence de résidus médicamenteux dans les produits animaux de consommation et 3/ par le coût de ses traitements qui restent à la charge des professionnels. Ensemble, ces contraintes font que la prise en charge de la douleur des animaux élevages est limitée. Il existe donc un besoin impérieux d'innovation pour améliorer d'une part, l'évaluation de la douleur avec pour objectif de tester l'efficacité réelle des antalgiques sur ces animaux et d'autre part, pour stimuler le développement de nouvelles molécules plus efficaces, dépourvues d'effets secondaires et qui satisfassent les contraintes spécifiques de l’élevage. Dans ce contexte, ce projet propose de combiner des approches d’imagerie médicale, d’éthologie et de pharmacologie afin de 1/ mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spécifiques de l’état douloureux dans un modèle d’arthrite inflammatoire chez le mouton et 2/ démontrer l’efficacité antalgique de l’ocytocine, un composé déjà présenté comme antalgique sur les douleurs inflammatoires chez les rongeurs et dont l’utilisation pourrait satisfaire aux contraintes de l’élevage. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet auront plusieurs bénéfices aussi bien d'un point de vue scientifique que du point de vue de la médecine vétérinaire. D'un point de vue scientifique ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes de contagion émotionnelle de la douleur et de son impact sur l’expression des comportements sociaux chez les animaux. D’un point de vue de la médecine vétérinaire, si les résultats de ce projet démontrent l’efficacité antalgique d’un traitement intranasal d’ocytocine, alors nous aurons alors fourni les premiers arguments pour un repositionnement de l’ocytocine comme analgésique pour le traitement des douleurs inflammatoires chez les ovins.
Procédures
Au sein de l'EU1 les interventions suivantes seront réalisées: Huit prélévements sanguins (veine jugulaire) durant quelques secondes / Deux injections sous cutanées durant quelques secondes / Quinze administrations intra nasales durant quelques secondes / Quatre tests comportementaux qui seront réalisés 8 fois. Un test ne sera effectué qu’une seule fois et durera 5min ; les 3 autres seront effectués 8 fois et ils dureront 3min, 10min et 30min. Au sein de l'EU2 les interventions suivantes seront réalisées: Une injection intraarticulaire réalisée au sein de l'EU2 sous anesthésie générale et sous analgèsie (45 min) pour l'induction d'un modèle d'arthrite / Une procédure d'imagerie médicale IRM réalisée sous anesthésie générale (1h45) dans lEU2
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'arthrite induit l'apparition d'une boiterie, un œdème articulaire et des signes de douleur à la flexion modérée pendant 14 jours. Les différents actes expérimentaux peuvent engendrer du stress pour l’animal. L'administration intra nasale peut être un acte désagréable pour l’animal mais l’ocytocine ne présente pas d'effet secondaire. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire peuvent entrainer une légère douleur ainsi que l’apparition d’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement. Les injections sous cutanées réalisées de part et d’autre des flancs de l’animal ainsi que l’injection intra-articulaire (tibiotarsiennes) pour induire le modèle d'arthrite peuvent également engendrer une douleur légère au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger. Le transport des brebis d’un établissement utilisateur à l’autre peut générer du stress pour l’animal.
Devenir
34 brebis seront replacées dans leur élevage et 34 autres brebis seront euthanasiées afin de récolter les tissus d’intérêt (articulation, moelle épinière, cerveau) pour des études ultérieures.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du mouton est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage et la médecine vétérinaire de cette espèce. De plus, nous souhaitons étudier l'impact d'une douleur modérée sur l'expression des comportements sociaux dans cette espèce et cette question ne peut pas être abordée par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=4x8 animaux). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « arthrite-serum physiologique » (i.e. traitement avec l’impact le plus négatif) correspondent à la réalité observée naturellement, voire moins douloureux puisque nos animaux ne développeront pas d'atteinte sur d'autres articulations ou encore des atteintes pulmonaires comme observées lors des infections à agalacticae sur les exploitations. La taille de nos effectifs (8 individus par groupe) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si ces conditions ne sont pas remplies, nous utiliserons des tests non-paramétriques tels que les tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité intra-groupe le permet.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. Ils seront hébergés dans le bâtiment conditionnés de l'EU1 et auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. L'enclos des animaux sera enrichi avec un promontoire permettant à l'animal de monter et descendre afin qu'il puisse changer son point d'observation et faire de l'exercice. Lors du transport des animaux entre les deux unités expérimentales, les animaux recevront une injectionde neuroleptique afin de limiter le stress. Lors de l'induction du modèle les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de limiter l'induction de douleurs inutiles liés à l'injection intrarticulaire de BCII. Tous les animaux seront visités quotidiennement et une surveillance accrue sera réalisée post induction du modèle. Deux expérimentateurs indépendants utiliseront deux échelles d'évaluation publiées et validées pour évaluer la douleur chez les animaux Expérimentateurs. Ainsi, si un animal Expérimentateurs présente pendant plus de trois jours un score supérieur à 5 sur l'une de ces deux grilles l'animal recevra une injection d'antalgique et sera euthanasié par un employé qualifié de l'EU1. L'animal Observateur sera replacé au sein du cheptel de l'EU1 et sortira de l'expérimentation. Lors des prélèvements, des tests comportementaux, et des injections intranasales, les animaux recevront une récompense sous forme d'aliments juste après les procédures afin de réduire le stress engendré par la procédure.
Choix des espèces
Le mouton est utilisé dans cette étude à cause de la forte incidence (jusqu'à 40% des jeunes animaux dans certaines fermes) des pathologies l'arthritiques observées dans cette espèce. Ces arthrites sont causées par plusieurs bactéries et cette situtation sanitaire présente une sérieuse atteinte au bien-être des animaux. Ainsi l'utilisation du mouton est nécessaire car cette espèce est l'objet de l'étude. Les animaux utilisés seront des femelles de race Ile de France agées entre 9-10 mois. Ce projet sera réalisé chez des jeunes animaux car la prévalence des arthrites infectieuses est plus importante chez les jeunes ovins.
GastroNano-2 : Traitement des métastases péritonéales d’origine gastrique (VX2) par chimiothérapie pédiculée et pressurisée par aérosol sur modèle de lapins
- Recherche appliquée
- Cancers
58 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur greffe des tumeurs dans le péritoine par chirurgie, puis ils reçoivent trois séries de chimiothérapie pressurisée par aérosol sous anesthésie, avant d'être tués pour l'examen des organes. Le porteur décrit une douleur modérée possible, une anorexie, une perte de poids et d'éventuels troubles respiratoires si des métastases pulmonaires apparaissent. Il présente ce test comme "indispensable" avant tout essai chez l'humain et affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la réponse d'un "organisme entier".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’implication de la réponse aux traitements par nanomédicaments de platine/doxorubicine administrés via PIPAC (Chimiothérapie intrapéritonéale pressurisée par aérosol) dans un modèle animal immunocompétent. Cette approche validera l’utilisation de l’approche chimiothérapeutique pour traiter les métastases péritonéales d'origine gastrique. L’évolution de la tumeur primaire et des métastases péritonéales (PM) sera étudiée dans un modèle animal lapin. Des lapins présentant des tumeurs (carcinome à cellules squameuses de lapin transplantables) implantées à différents sites abdominaux (péritoine pariétal +/- viscéral +- viscères) vont être traités par chimiothérapie pressurisée par voie coelioscopique (groupe test) versus contrôle (injection de sérum physiologique).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un traitement anticancéreux mini-invasif dans un essai comparatif des différents drogues/formulations chimio-thérapeutiques. Il est indispensable avant de réaliser les tests d'efficacité de traitements chimiothérapeutiques sur des individus qui ne sont pas pris en charge par la thérapie curative de nos jours. Au-delà de la valorisation scientifique, les applications en santé humaine seront facilement transposables en raison de l'absence d'études dans ce domaine.
Procédures
Procédure 1 : les animaux sont soumis à une unique intervention (injection percutanée du muscle) de 5 min environ. Procédure 2 : les animaux sont soumis une unique intervention chirurgicale pour l’injection péritonéale des cellules tumorales de 30 min environ, ainsi qu’un contrôle de la tumeur par imagerie sur animal vigile (échographie et ou scanner), puis les animaux ont 3 séries de traitement par laparoscopie sous anesthésie générale (procédure d’une heure).
Impact sur les animaux
Il est possible que la maladie engendrée (MP) cause une douleur modérée par la suite aux animaux. L’expérience ne se prolongera pas au-delà de 5 semaines après la greffe des tumeurs ce qui limite l'étendue de la maladie et l'effondrement des constantes de l'animal non traité (fonction digestive par exemple). Une attention particulière est portée sur le comportement alimentaire : anorexie, perte de poids supérieure à 20%, sur l'altération de l’apparence physique et celle du comportement (repli dans un coin, prostration, …). Une prise de poids est néanmoins possible en raison de la croissance des MP et de la possible accumulation du liquide d'ascite dans la cavité péritonéale, en particulier les dernières semaines post greffe. Le fonctionnement du transit intestinal peut aussi être perturbé et l'aspect des selles sera surveillé. Des troubles respiratoires peuvent apparaitre si des métastases pulmonaires se développent au cours de l’expérimentation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever les organes traités (tumeur, foie, muscle) et pour évaluer par examen nécropsique les éventuelles lésions sur les organes à distance. Les paramètres histologiques évalués sur les prélèvements nécropsiques concernent les réactions tissulaires associées au traitement (nécrose tumorale ou du tissu saine, œdème, fibrose, inflammation…).
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse histologique d’un organisme entier face à l’administration de thérapeutiques, et encore moins en prenant en compte l'environnement tumoral (une métastase 3D ne répondra pas aux traitements chimiothérapeutiques de la même façon qu'une culture 2D) et la coopération avec le système immunitaire. Ils sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Le modèle lapin de carcinose péritonéale présenté permet de mimer le phénomène pathologique et la procédure de traitement observé chez l’Homme.
Réduction
Une implantation de 2 tumeurs par animal donneur sera effectuée pour réduire le nombre total de donneurs. Des études de faisabilité ont été effectuées afin de diminuer le risque d’échec et limiter le nombre total d’animaux à utiliser. Ainsi nous estimons que 5 lapins par groupe permettront d’avoir des résultats qui permettent d’apporter des conclusions. Néanmoins, si les résultats ne sont pas concluants du fait du nombre faible de lapins par groupe, une nouvelle expérimentation pourra être réalisée (permettant de doubler le nombre d’animaux par groupe).
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, présence systématique d’enrichissement, vidange et nettoyage régulier du bac de déjection, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un protocole de suivi des animaux et de prise en charge de la douleur par un système de scoring et des traitements analgésiques systématiques et symptomatiques est mis en place. Des points-limites avec évaluation des paramètres de suivi sont utilisés afin de réduire au maximum la douleur animale. Une attention particulière sera apportée au bac recueillant les crottes et l’urine pour surveiller indirectement l’état l'hydratation et les troubles urinaires et les éventuels troubles du transit. De plus, l’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie, analgésique per opératoire). Lors de précédentes études, les points limites n’ont pas été atteints et aucun signe clinique d’une occlusion intestinale ou pylorique n’a été observé. Les animaux ont gardé un appétit et un transit intestinal normaux, aucun signe de douleur n’a été signalé. Les lésions péritonéales étaient des tumeurs en évolution localisées à l’endroit de l’implantation, sans envahissement métastatique incontrôlé du péritoine ou des organes de la cavité abdominales. D’une façon générale et moins sévère, l’appétit des animaux peut être diminué pendant les 2-3 premiers jours suivant les procédures chirurgicales.
Choix des espèces
L’utilisation de cellules tumorales chez le lapin comme modèle de tumeur a été développée dans les années 50. Le modèle présente l’avantage d’être reproductible, facilement implantable, à croissance rapide et transplantable dans de nombreux organes. De plus, contrairement aux rongeurs, la taille du lapin permet l’utilisation des mêmes appareillages que chez l’homme. Il n’existe pas de modèle de tumeur reproductible chez le gros animal (cochon, mouton, chèvre). La taille et l’anatomie du lapin permettent d’utiliser le même matériel que dans la plupart des procédures cliniques de type PIPAC. Le modèle de tumeur chez le lapin est aujourd’hui largement utilisé pour l’évaluation des thérapies chirurgicales mini-invasives et de radiologie interventionnelle.
Méthotrexate pour le traitement de l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B – Projet Multi-établissement EU 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
21 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère. L'arthropathie est provoquée par trois ponctions du genou, puis les souris reçoivent des traitements pendant six semaines, subissent une IRM des genoux de deux heures sous anesthésie et des prises de sang, avant d'être tuées et disséquées. Le porteur justifie la mise à mort par un prélèvement d'un millilitre de sang "non compatible avec le maintien en vie". Il fonde le recours à l'animal sur le "besoin d'un modèle vivant" et présente la souris comme un modèle "éprouvé et fiable".
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur IX (FIX) et dont la sévérité est définie par la quantité de FIX restant dans le sang. La forme la plus sévère, où le taux de FIX est in détectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Ces saignements spontanés peuvent se répétés au niveau des articulations et conduire à la présence de sang dans le liquide articulaire, induisant une inflammation et une dégradation de l’articulation qui est handicapante pour le patient. Cette atteinte répétée porte le nom d’arthropathie hémophilique (AH) et est une complication grave de la maladie. L'AH partage certaines caractéristiques avec d’autres maladies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR) dont une inflammation importante au stade précoce de la maladie. A ce jour, le traitement de l’hémophilie comprend des injections de facteur manquant pour éviter tous saignements donc ceux responsables de l'arthropathie. Cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire qui apparait au stade précoce de l’AH. Dans le cadre du traitement de la PR, le méthotrexate est largement utilisé en tant que médicament de première intention. Le méthotrexate est un médicament visant à contrôler l’inflammation qui à montrer 34% de rémission et 50% d’amélioration de la PR dans des études conduites chez des patients atteints de PR. Nous avons fait l’hypothèse que le méthotrexate pourrait réduire l’inflammation de l’articulation chez les hémophiles et empêcher l’évolution de cette arthropathie handicapante, comme il fait dans la PR. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité du méthotrexate pour traiter l’AH et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B. l'étude s'effectue dans deux animalerie distincxtes avec : l'induction de la maladie et le traitement qui se font à l'UE1 (animalerie 1) et l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qui se font à l'UE2 (animalerie 2).
Bénéfices attendus
La comparaison entre le traitement habituel par facteur de coagulation et le méthotrexate, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ce médicament dans le contexte d’arthropathie hémophilique. le méthotrexate est un médicament couramment utilisée dans la polyarthrite rhumatoïde dont les dégâts articulaires sont similaires à ceux causés par l’hémophilie. Si les résultats de l’étude montre une efficacité suffisante du méthtrexate dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité du méthotrexate chez des patients hémophiles.
Procédures
Au sein de l'UE1 Au sein de l'UE1, l’arthropathie hémophilique est induite chez des souris hémophiles B par 3 ponctions articulaire (J1, J15 et J30) avec une surveillance et mesure du diamètre du genou les 15 premiers jours. Par la suite, le premier groupe reçois un traitement anti-hémophilique de référence tous les 4 jours et ce durant 6 semaines. Le deuxième groupe reçois également le traitement anti-hémophilique de référence (même durée et fréquence) mais également un traitement de référence utilisé dans la polyarthrite rhumatoïde une fois par semaine. Une prise de sang est réalisée à J0, J15 et J30 pour surveiller la possible toxicité du traitement de référence utilisé dans la polyarthrite rhumatoïde. Après 6 semaines de traitement, les souris sont transférées à l'EU2 où elles bénéficieront d’une IRM des genoux pour évaluer l’atteinte articulaire. Ensuite, une prise de sang sera réalisée pour la mesure des marqueurs inflammatoires ainsi que les marqueurs d’atteinte cartilagineuse et osseuse. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale après administration d’un médicament anti-douleur. Les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrière seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche d’une inflammation articulaire. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min) (UE1), une prise de sang (1 min) (UE1), la mesure du genou (30 sec) (UE1), une injection seule ou double (1-2 min)(UE1), une IRM du genou (120 min)(UE2), un prélèvement total de sang et mise à mise à mort (3-5 min)(UE2).
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaire handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments anti-hémophiliques et d’étudier l’arthropathie hémophilique. L’absence des facteurs anti-hémophiliques murins analogues à nos facteurs anti-hémophiliques est un prérequis pour l’induction de l’hémarthrose et pour la mesure de l’activité des molécules prophylactiques testées. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette altération génétique, n’est pas victime de saignement spontané et tout saignement provoqué sur la souris hémophile est résolutif sans prise en charge particulière. Souris matures (8-9 semaines) de 25-30g. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car les cartilages sont en cours de maturation durant la croissance et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible des taux de certains facteurs de coagulation avec l’âge, comme le fibrinogène, facteur Willebrand et le FVIII qui peuvent modifier la capacité hémostatique globale du modèle et par conséquent la tendance hémorragique.
Développement d’un vaccin thérapeutique dans le mélanome à l’aide de longs peptides synthétiques artificiels (aSLP).
- Recherche appliquée
- Cancers
186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent jusqu'à six injections sous-cutanées et une greffe de cellules tumorales qui forme une tumeur sur le flanc, puis sont suivies trois fois par semaine pendant près de trois mois avant d'être tuées par dislocation cervicale. Le projet teste un vaccin fait d'un peptide couplant un antigène tétanique et un antigène de mélanome, avec l'espoir de freiner la croissance de la tumeur. Le porteur indique que l'évaluation du bénéfice vaccinal passe "nécessairement" par l'animal et vise à terme un brevet et un développement clinique.
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer in vivo l'efficacité d'un nouveau type de vaccin contre le cancer. Ce vaccin est constitué d'un long peptide synthétique qui comprend un antigène de la toxine tétanique contre lequel la plupart les individus ont déjà été vaccinés et un antigène spécifique de la cellule tumorale. L'avantage attendu de ce type de vaccination est de profiter de la réponse préexistante contre la toxine tétanique pour augmenter l'efficacité de l'immunisation contre l'antigène tumoral et ainsi générer une réponse des lymphocytes T qui puissent détruire la tumeur. Nos résultats préalables ont démontré l'efficacité de ces vaccins synthétiques pour stimuler les cellules immunitaires in vitro et nous devons désormais valider notre approche in vivo pour pouvoir espérer la mettre en œuvre ensuite chez l'homme. Notre modèle d'étude est un modèle de souris vaccinées contre le tétanos auxquelles nous transplanterons une tumeur exprimant un antigène de mélanome bien caractérisé et qui seront ensuite vaccinées avec notre vaccin synthétique (toxine tétanique +antigène de mélanome). Nous espérons démontrer ainsi l'efficacité de ce vaccin pour limiter la croissance tumorale chez ces souris.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d’obtenir, à l’aide de modèles pré-clinique in vivo, des preuves de concept justifiant la mise en place d’immunothérapies par vaccination à l'aide de longs peptides synthétiques optimisés dans le traitement des mélanomes. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront permettre d'aller vers un dépôt de brevet et un développement clinique du produit.
Procédures
Les animaux sont soumis à des injections par voie sous-cutanée de peptides formulés en émulsion (composition proche d'un vaccin). Les animaux reçoivent au maximum 5 injections de peptides, une toutes les 2 semaines. L'injection en elle-même dure 3-5 secondes. Certains animaux reçoivent aussi par voie sous-cutanée une petite quantité de cellules tumorales qui vont générer une tumeur sur le flanc de l'animal. Cette injection se fait sous anesthésie générale. Le suivi de la croissance tumorale et le poids des animaux est effectué 3 fois par semaine, les souris sont donc manipulées régulièrement. La durée de l'expérience n'excède pas 87j.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont identifiées: - douleur intrinsèque à la piqûre (toutes les injections, de peptide et de cellules tumorales sont réalisées en sous-cutané). Selon les lots, les souris subiront au maximum 6 injections (2 pre-immunisations, 1 injection de cellule tumorale, 3 vaccinations). - développement d'une tumeur de type sarcome sur le flanc.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux sont sacrifiés par dislocation cervicale. Des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem (sur les tumeurs et la rate).
Remplacement
Les résultats attendus dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures in vitro. L'évaluation du bénéfice thérapeutique de la vaccination thérapeutique passe nécessairement par l'utilisation de modèles animaux. Ce projet s'appuie sur des données préliminaires in vitro attestant l'immunogénicité du produit. Notre étude permettra d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration de lymphocytes T induits par la vaccination sur le site tumoral). Ces résultats auront une importance capitale lors de la valorisation du produit et de son transfert espéré en clinique.
Réduction
Le nombre de lot d'animaux est réduit le plus possible: 2 lots pour évaluer l'immunogénicité (peptide vaccin comparé à peptide contrôle) et 2 lots pour évaluer le bénéfice thérapeutique (1 lot vacciné et 1 lot non vacciné). Le nombre total d'animaux prévoit l'évaluation de 4 peptides vaccinaux qui seront testés en séquentiel selon l'avancée du projet. Les expériences préliminaires ne seront pas répétées pour chaque vaccin testé.
Raffinement
Le recours à des expériences préliminaires réalisées sur un petit nombre de souris nous permet de valider les paramètres expérimentaux et de prendre en main le modèle expérimental. Cette précaution doit nous permettre de réduire la variabilité sur les procédures complètes (procédures 2 et 4) et doit également limiter le risque de résultats non concluants. Les souris qui vont recevoir les cellules tumorales sont rasées la veille de l'injection et l'injection se fait sous anesthésie gazeuse ce qui permet une implantation tumorale plus précise, avec une croissance plus homogène et donc une évaluation de la taille tumorale plus précise. Nous raffinons également nos procédures expérimentales par la définition de points limites adaptés à un modèle de croissance tumorale, ce qui permet un arrêt de la procédure si des souffrances sont suspectées.
Choix des espèces
Le modèle animal dont nous avons besoin ici est un modèle de souris dont le génome a été modifié pour produire des réponses immunitaires contre des antigènes humains. Nous travaillons sur des souris adultes mâles et femelles car les traitements de vaccination anti-tumorale dans le mélanome sont proposés à des hommes et des femmes adultes.
Etude du rôle de différents signaux pro-inflammatoires dans l’accouchement prématuré
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
55 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, les femelles tuées et les mâles réutilisés. Les femelles gestantes reçoivent une injection de LPS déclenchant un accouchement prématuré, puis sont tuées pour prélever cornes utérines et placenta. Le porteur indique attendre une douleur liée aux spasmes abdominaux, avec des saignements utérins possibles, et administre un antalgique au-delà d'un score clinique. Il affirme avoir déjà travaillé sur cellules et tissus humains in vitro et vouloir confirmer ces résultats sur un modèle vivant, malgré des mécanismes de parturition différents entre l'humain et la souris.
Objectifs
La menace d’accouchement prématuré représente la première cause de mortalité néonatale et d’hospitalisation en cours de grossesse. Les médicaments actuellement utilisés pour éviter un accouchement prématuré présentent une efficacité limitée et de nombreux effets indésirables. Il est donc impératif de développer de nouveaux traitements plus efficaces et moins toxiques. Pour cela, la compréhension des mécanismes impliqués dans la mise en route du travail et l’identification de nouvelles cibles sont indispensables. Il a été démontré que des cytokines pro-inflammatoires sont impliquées dans l’activation du travail. Ces cytokines sont, entre autres, générées par l’intermédiaire de l’inflammasome. Compte tenu du rôle majeur de ces cytokines dans la mise en route du travail, il apparait donc essentiel d’étudier le rôle de l’inflammasome dans ces mécanismes. Notre hypothèse de travail est que la mise en route prématurée du travail est associée à une augmentation, entre autres, de la production d’IL1β consécutive à l’activation de l’inflammasome dans le myomètre. Nos résultats préliminaires in vitro, réalisés sur un modèle validé de stimulation des cellules musculaires utérines au LPS, montrent que la cytokine IL1β est produite en réponse à cette stimulation et est capable d’induire les mécanismes cellulaires associées au travail. Nous avons également pu montrer que l’inhibition de l’inflammasome est associée à une inhibition des mécanismes cellulaires associés au travail. Nos résultats in vitro impliquent donc la cytokine IL1β et l’inflammasome dans différentes étapes de l’accouchement prématuré. Afin d’étudier les mécanismes de l’accouchement prématuré in vivo, nous souhaitons utiliser un modèle d’accouchement prématuré couramment utilisé. Ce projet permettrait alors d’étudier l’effet sur l’accouchement prématuré du blocage de la cytokine IL1β et de l’inhibition de l’inflammasome en utilisant des traitements pharmacologiques. L’ensemble de ces résultats permettrait le développement d’un nouveau traitement de la menace d’accouchement prématuré.
Bénéfices attendus
L’accouchement prématuré est la première cause d’hospitalisation au cours de la grossesse et représente la première cause de mortalité néonatale. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes de mise en route du travail et d’identifier de nouvelles cibles pour le développement de médicaments. Avec ce projet, nous pourrons donc mieux comprendre les mécanismes de mise en route du travail liés à la cytokine IL1-β et à l’inflammasome. Nos travaux pourront ensuite servir à d’autres équipes pour développer de nouvelles molécules qui pourront agir sur les cibles que nous aurons identifiées.
Procédures
Les souris recevront une injection unique de LPS par voie i.p. ou s.c. (selon les données obtenues lors de la procédure 1). Si les scores « analgésie » sont dépassés, les souris recevront une injection unique de buprénorphine en sous-cutanée. Aucun prélèvement ne sera effectué sur animaux vigiles. Les interventions dureront moins d’une minute
Impact sur les animaux
L’injection de LPS va induire une mise en route du travail précoce mimant un accouchement prématuré. D’après nos précédentes études et la littérature, nous nous attendons à ce que les souris traitées au LPS ressentent de la douleur qui pourra se manifester par différents signes cliniques (transpiration, poils hirsutes, prostration, tremblement) liés aux spasmes abdominaux qui s’installent au cours de l’accouchement. Les souris pourront également avoir des saignements utérins.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale, nous souhaitons récolter différents tissus (cornes utérines, placenta) et vérifier l’absence de fœtus resté dans les cornes utérines. Pour cela, toutes les femelles seront mises à mort à la fin de l’étude. Les mâles seront réutilisés dans d’autres études.
Remplacement
Le rôle de l’inflammasome et de l’IL1 dans la menace d’accouchement prématuré a été démontré in vitro en utilisant des cellules primaires humaines et ex vivo sur des explants tissulaires humains. Nos résultats préliminaires, sur les tissus humains, montrent que l’IL1 est produite dans le tissu utérin au cours d’une pathologie inflammatoire (chorioamniotite) ou à la suite d’un traitement par le LPS. In vitro, nous avons montré que la cytokine IL1induit des modifications des cellules myométriales (morphologie, fonction) nécessaires à la mise en route du travail. Enfin, nous avons démontré, dans un modèle in vitro d’accouchement prématuré, que le blocage pharmacologique de l’IL1et l’inhibition pharmacologique de l’inflammasome sont associés à une inhibition des mécanismes cellulaires associés au travail. Ces études in vitro de remplacement nous ont donc permis de mieux connaitre la physiologie et les acteurs impliqués dans la menace d’accouchement prématuré. L’objectif est maintenant de confirmer ces résultats dans un modèle in vivo qui reproduira la physiopathologie de l’accouchement prématuré. Même si les mécanismes de parturition sont différents entre l’Homme et la souris, nous nous plaçons ici dans un cadre pathologique d’inflammation induite avant terme et la chute hormonale observée au cours de la parturition chez les souris n’interviendra pas. Ainsi, nous pourrons extrapoler les résultats obtenus sur la souris à l’Homme. Nous pourrons donc évaluer l’effet du blocage de l’IL1 et l’inhibition de l’inflammasome. Nos résultats permettront donc d’identifier une nouvelle cible thérapeutique, l’inflammasome, dans la menace d’accouchement prématuré. De plus, aucune étude in vivo n’a encore été réalisée avec un inhibiteur de l’inflammasome dans cette pathologie.
Réduction
Afin de réduire les biais expérimentaux, les souris gestantes seront randomisées après l’accouplement. Le travail se fera également en aveugle : une personne induira l’accouchement prématuré par injection de LPS et une seconde suivra le délai entre l’accouchement et l’injection. Les souris non traitées au LPS seront réutilisées pour un second accouplement et un traitement au LPS.
Raffinement
Avant le début de la procédure, les animaux seront entraînés à être manipulés afin de limiter le stress qui pourraient survenir au cours de la procédure expérimentale et qui pourraient fausser les résultats. Afin de réduire au maximum les nuisances causées aux animaux, les souris gestantes seront hébergées deux par deux pour leur permettre d’être au calme et seront pesées tous les 2 jours après accouplement pour suivre la gestation. Du matériel sera également apporté dans les cages pour permettre la construction du nid (une poignée de sizzle-dri lanières de papier kraft et 4 cylindres de coton par femelle) la nourriture non enrichie et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. L’étude préliminaire de la voie d’injection du LPS nous permettra d’envisager une voie d’administration moins douloureuse pour les animaux. Après l’injection de LPS, les souris seront surveillées toutes les deux heures pour vérifier la parturition et contrôler le bon état des souris. Des points limites « analgésie » seront établis en utilisant une grille de score clinique et les souris dépassant ces points limites seront traitées avec un antalgique non stéroïdien en injection sous-cutanée. Les souris ne seront pas pré-médiquées puisque les signes cliniques de mise en route du travail seront un des paramètres étudiés dans ce projet. En dernier recours, si les point limites « mise à mort » sont dépassés, les souris seront mises à mort pour limiter la souffrance.
Choix des espèces
L’étude de l’accouchement prématuré nécessite l’utilisation de mammifères dont la durée de gestation est courte et connue. Le modèle choisi est largement décrit dans la littérature et couramment utilisé dans cette thématique. Nous utiliserons des souris âgées d’environ 8 semaines correspondant à un stade de développement adulte et de maturité sexuelle de l’animal.