Procédures légères

240 porcelets vont être utilisé·es, dont 78 tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent jusqu'à trois prélèvements de fèces par stimulation rectale à l'écouvillon et des collectes d'urine par une poche collée sous l'abdomen, sous contention par une cordelette serrée autour du groin. Le protocole dégrade volontairement les conditions d'élevage, température de 16 à 33°C, hygiène réduite, densité supérieure au seuil réglementaire de l'expérimentation et rationnement alimentaire, pour se rapprocher d'un élevage commercial et tester des additifs destinés à la "production porcine". Les 162 porcelets gardés vivants repartent dans le circuit de production, et le porteur affirme que le porcelet, "espèce cible", ne peut être remplacé.

Objectifs

Ce projet vise à prélever des échantillons biologiques (fèces et urine) chez le porcelet sevré âgé de 21 à 70 jours et élevé dans différentes conditions d’élevage afin de pouvoir évaluer la fermentation d’ingrédients in vitro. Des bénéfices in vivo de ces ingrédients sont attendus sur la santé et les performances des animaux. En effet, les fermentations des fibres telles que les prébiotiques induisent la production d’acides gras à chaine courte et promeuvent la croissance des bactéries commensales d’où les bénéfices attendus en termes de santé digestive chez les animaux. Ces métabolites produits lors des fermentations peuvent également être utilisés comme source énergétique par l’hôte et ainsi contribuer à l’apport nutritionnel de la ration. De plus, la mise en contact in vitro de fèces et d’urine permet d’évaluer l’impact d’un aliment sur les émissions de gaz dans l’environnement (ammoniac, sulfure d’hydrogène…) et donc de concourir à l’amélioration de l’impact environnemental de la production porcine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise en marché d’une ou plusieurs solutions nutritionnelles ou additifs permettant d’améliorer la santé des porcelets par la modulation de la composition et de l’activité du microbiote intestinal pendant la phase de post-sevrage et/ou de réduire les émissions de gaz et autres polluants dans l’environnement.

Procédures

Un maximum de 3 prélèvements de fèces pourra avoir lieu sur les porcelets par essai. Les sessions de prélèvement de fèces seront espacées d’au moins 5 jours. La récolte des fèces se fait par légère pression sur l’abdomen du porcelet ou par légère stimulation rectale pendant une minute à l’aide d’un écouvillon introduit dans le rectum. Les prélèvements de fèces seront réalisés à l’intérieur de la case afin de limiter le stress ressenti, soit sans contention particulière dans les bras de l’opérateur, soit à l'aide d'une cordelette placée autour du groin et fixée à l'extrémité d'un bâton avec lequel l'animalier serre le nez des animaux. De plus, jusqu’à 3 collectes d’urine pourront avoir lieu sur les porcelets par essai. Les sessions de prélèvement d’urine seront espacées d’au moins 5 jours. La récolte des urines se fera grâce à une poche de collecte d’urine (type poche de stomie comme utilisé chez l’homme) collée grâce à du sparadrap sous l’abdomen des porcelets mâles. Pour cela, l’animal est porté dans les bras par un opérateur puis un second vient coller cette poche sous l’abdomen. Le porcelet est ensuite remis dans sa case. Le décollage de la poche de collecte d’urine s’effectue de la même manière. Cette dernière sera gardée maximum 7 heures, afin d’obtenir un volume suffisant d’urine. Les prélèvements de fèces et d’urine pourront être réalisés indépendamment les uns des autres.

Impact sur les animaux

La modification des conditions d’élevage pourra concerner 60 porcelets. Ces modifications des conditions d’élevage impliquent la modulation des conditions d’hygiène (présence ou absence de nettoyage et/ou désinfection), la variation de la température de 16°C à 33°C et/ou de la ventilation. Ainsi, ces modifications peuvent créer des situations d’inconfort sanitaire pour les porcelets. En effet, des températures plus faibles en dessous de la zone de thermoneutralité (< 24°C) et de mauvaises conditions d’hygiène peuvent engendrer des troubles digestifs comme de la diarrhée. Des températures au-dessus de la zone de thermoneutralité placent l’animal en situation de stress thermique, ce qui peut induire une fréquence respiratoire plus élevée et un appétit plus faible. De plus, la densité à partir de 55 jours d’âge, c’est-à-dire lorsque les animaux atteignent environ 20 kg, sera plus élevée que ce qui est exigé dans la réglementation expérimentation puisqu’elle sera de 0,36 m²/porc. Cette densité n’est autorisée en expérimentation animale que pour des porcelets jusqu’à 20 kg et doit ensuite être de 0,50 m²/animal pour des porcelets entre 20 et 30 kg. Toutefois, la réglementation élevage exige une surface minimale de 0,30 m²/animal pour des porcelets jusqu’à 30 kg, ce qui correspond à nos conditions. En effet, le but est de se placer dans des conditions proches d’un élevage commercial. L’utilisation d’additifs alimentaires non enregistrés dans l’Union Européenne pourrait également engendrer une baisse de la consommation entrainant un ralentissement de la croissance d’environ 10-15%. Il faut toutefois préciser qu’il existe une forte variabilité de la croissance des porcelets en élevage commercial. Les additifs qui seront testés pourront être des additifs ayant déjà été testés sur animaux ailleurs que dans l’Union Européenne ou déjà utilisés en nutrition humaine. Au maximum, 18 porcelets pourront recevoir des additifs non enregistrés. Les animaux pourront être rationnés entre 75% et 95% du niveau ad libitum observé dans l’élevage. Cela pourra créer de la compétition à l’auge pouvant entrainer de l’agitation et de légères griffures. Enfin, les prélèvements d’échantillons biologiques peuvent induire un stress lors de la manipulation des animaux (prélèvements de fèces et d’urine). Les prélèvements de fèces seront réalisés par stimulation rectale à l’aide d’un écouvillon introduit dans le rectum pouvant créer de légères irritations.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et exclus du circuit de consommation humaine s’ils ont reçu un additif non enregistré au sein de l’Union Européenne ou lorsque des prélèvements d’organes, de contenu intestinal ou d’autres tissus sera nécessaire. Ainsi, au maximum, 60 porcelets (10 essais x 6 porcelets) pourront être euthanasiés afin de prélever des échantillons biologiques (tissus, contenu caecal…) post-mortem et 18 porcelets (3 essais x 6 porcelets) ayant reçu un additif non enregistré pourront également être euthanasiés, soit un total de 78 porcelets mis à mort. Les autres animaux seront maintenus en vie et continueront leur cycle de production dans un élevage commercial.

Remplacement

Ce projet vise à développer des méthodes non animales (in vitro) en s’appuyant sur des échantillons d’urine et de fèces qui permettront de ne plus utiliser l’animal pour l’étude de certains aliments, matières premières ou additifs. Ainsi, il n’est pas possible de prélever d’autres animaux car le porcelet est l’espèce cible du projet. A ce jour, ces prélèvements ne peuvent pas être obtenus autrement que via un animal vivant. En effet, il existe des spécificités d’espèce, notamment avec un microbiote spécifique et des mécanismes de régulation physiologiques (endocrinologie, métabolisme digestif…) propres au porcelet.

Réduction

Le nombre de 5 porcelets (+ 1 porcelet remplaçant en cas de problème sanitaire ou mort de l’un des porcelets) a été défini comme étant le nombre minimal pour préparer un inoculum digestif (fécal…) de bonne qualité, c’est-à-dire présentant une diversité microbienne suffisante afin d’être représentative d’un microbiote moyen et une quantité de matière suffisante permettant la mise en culture in vitro de 30 flacons. Un flacon constituera donc une unité expérimentale. La littérature scientifique n’indique pas de nombre minimal d’échantillons à prélever pour mener à bien un essai in vitro et constituer un inoculum. Les données trouvées citent entre 5 et 15 porcelets prélevés. Le nombre de modalités expérimentales variera entre 2 et 6, c’est-à-dire que nous comparerons entre 2 et 6 groupes expérimentaux in vitro. Afin de disposer de suffisamment de réplicas (= flacons) pour chaque groupe expérimental considéré (15 minimum afin de détecter comme significatives des différences de l’ordre de 10%), ce suivi des fermentations pourra être répété 2 à 3 fois sur les mêmes animaux (donc âge des animaux évoluant entre les 3 prélèvements). Si l’on souhaite disposer d’inoculum obtenu sur des animaux de même âge, il conviendra alors de réaliser 2 ou 3 essais successifs impliquant ainsi 2 ou 3 lots de 6 porcelets différents. Dans ce cas, les animaux ne seront prélevés qu’une seule fois par essai. Notre modèle in vitro permet donc de limiter le recours à des animaux puisqu’à partir de 5 porcelets (+ 1 remplaçant), 30 flacons contenant l’inoculum pourront être préparés puis attribués à l’une des modalités expérimentales comparées. En ayant recours à des études in vivo, ces 30 flacons issus de 5 porcelets auraient été remplacés par un minimum de 30 animaux donneurs. L’exploitation des données par un test statistique ne se fait que sur les données produites (volume de gaz, microbiote…) par la mise en culture in vitro et non pas sur les données collectées sur les animaux.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’EU. Des points limites stricts et définis à l’avance sont appliqués tout au long du projet. De plus, le nombre de tentatives de collectes d'échantillons biologiques sera limité et la manipulation des animaux sera restreinte afin de réduire la souffrance ou le stress appliqué à ces animaux.

Choix des espèces

L'espèce choisie pour la réalisation du projet est le porc car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) pouvant interférer avec le microbiote fécal sont hautement spécifiques de l'espèce porcine. De plus, la spécificité des conditions d'élevage de cette espèce de rente ne permet pas de la remplacer par une autre espèce modèle. Enfin, le porc est l’espèce cible des traitements testés. Les animaux utilisés seront des porcelets sevrés âgés de 21 à 70 jours.

486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une drépanocytose, elles reçoivent des injections sous anesthésie et, pour une partie, sont placées trois heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène afin de déclencher des crises d'occlusion des vaisseaux, avant une mise à mort sans réveil. Le porteur reconnaît que ces crises provoquent douleur, perte de poids et baisse de mobilité, atténuées par un antidouleur puissant. Il affirme que la complexité des crises vaso-occlusives ne peut être reproduite in vitro et que seule cette souris génétiquement modifiée reproduit fidèlement la maladie.

Objectifs

L’un des projets de recherche de notre unité de recherche consiste à développer un nouveau traitement contre la drépanocytose, une maladie génétique du sang qui touche les globules rouges et qui est associée à des complications récurrentes, graves et parfois mortelles. De plus, l’espérance de vie des patients drépanocytaires est réduite. Actuellement, cette maladie ne peut pas être guérie et elle se traite très difficilement. Ceci souligne le besoin pour les patients de pouvoir bénéficier de nouveaux traitements plus efficaces, ou qui pourraient être utilisés en combinaison avec les médicaments déjà existants, pour augmenter leur efficacité. Dans ce projet, nous nous proposons de démontrer l’efficacité de plusieurs médicaments que nous avons avons développés au laboratoire. Nous souhaitons également déterminer comment, et à quelle dose, devront être pris ces potentiels médicaments, lors de futures études cliniques chez les patients drépanocytaires. La drépanocytose étant une maladie particulièrement complexe, nous devrons tester nos molécules chez des souris drépanocytaires, qui sont les seuls animaux disponibles qui reproduisent fidèlement la maladie chez l'Homme. Si les résultats obtenus chez la souris sont convaincants, nous poursuivrons ensuite les tests de ce médicament potentiel, chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Si nos résultats sont positifs, ce projet pourrait clairement avoir un bénéfice pour la qualité de vie et l'espérance des patients drépanocytaires. Nous avons, d'ailleurs, obtenu un financement par une entreprise pharmaceutique qui est intéressée pour développer nos médicaments et les tester chez les patients.

Procédures

Une partie des souris utilisées (drépanocytaires ou non) seront injectées (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis au maximum 2 prélèvements de sang (durée de 30 s chacun) seront réalisés sous anesthésie générale. Les souris seront immédiatement mises à mort, sans retour à la conscience, après le dernier prélèvement de sang. Pour une des interventions cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 2 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis seront placées, ou non, dans des conditions dans lesquelles l'oxygène de l'air sera diminué (de 21 à 8%), pendant 3 h, et enfin replacées à l'air ambiant pendant 1 h. Toutes les souris seront ensuite immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), le sang sera prélevé (durée d’1 minute), et les souris euthanasiées. Finalement, les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés. Pour l’autre intervention cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 3 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, et 3 h après la dernière injection, toutes les souris seront immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), et le sang sera prélevé (durée d’1 minute). Les souris seront finalement euthanasiées et les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés.

Impact sur les animaux

Les souris drépanocytaires développent une maladie similaire à la drépanocytose humaine, avec en particulier une anémie chronique, mais sans effet majeur chez des souris jeunes (< 10 semaines), qui ont été choisies pour notre projet. Au cours de leur 10 semaines de vie, les souris drépanocytaires pourront développer des "crises vaso-occlusives" (comme les patients), engendrant pendant quelques jours une douleur, une perte de poids, une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Ces crises sont transitoires, mais seront soulagées avec l'administration d'un anti-douleurs puissant. De même, quand nous induirons les crises vaso-occlusives chez les souris drépanocytaires, ceci engendrera une douleur d'une durée au maximum égale à la durée de l'intervention (3-4 h), ainsi qu'une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Cette douleur sera prise en charge par administration préventive d'un anti-douleur puissant, avant le déclenchement de la crise. Dans ce projet, d'autres nuisances sont attendues pour les souris drépanocytaires ou non drépanocytaires, et sont liées à la préhension/contention des animaux, aux injections (introduction d'une aiguille sous anesthésie), ainsi qu’au prélèvement final de sang, à la perfusion intracardiaque, au prélèvement d’organes, et au sacrifice (tous sous anesthésie).

Devenir

Toutes les souris utilisées dans ce projet seront systématiquement euthanasiées en fin d'expériences. En effet, des analyses post-mortem sur des organes seront nécessaires pour certaines expériences. Pour le reste des expériences, les souris drépanocytaires (génétiquement modifiées), ou non drépanocytaires, ne pourront être ré-utilisées ou replacées car elles auront été injectées avec des molécules expérimentales dont les effets à long terme ne sont pas connus.

Remplacement

Les crises vaso-occlusives (CVOs) chez les patients drépanocytaires sont très complexes. Les cellules constituant les vaisseaux sanguins, mais également de nombreux types de cellules sanguines différentes, sont impliquées dans les mécanismes qui déclenchent ces crises. Ce système complexe ne peut à l'heure actuelle être remplacé par des systèmes in vitro, étant données les interactions multiples qui existent entre toutes ces cellules. L'évaluation de l'efficacité de nouveaux traitements dans la drépanocytose nécessite donc le recours à un modèle animal de cette maladie, et la souris est le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible.

Réduction

Le but de notre projet est de déterminer si nos molécules pourraient être utilisées chez les patients drépanocytaires, avec des injections les moins fréquentes possibles, et si oui, à quelle dose. Dans un premier temps, nous partirons d'un dose classiquement utilisée en thérapeutique pour d'autres maladies, et nous évaluerons quelles molécules restent détectables dans le sang 96 h après l'injection, à cette dose. Seules les molécules respectant ce critère seront étudiées plus en détail dans ce projet, ce qui permettra de limiter le nombre de molécules testées, et donc le nombre de souris utilisées. Ces molécules seront ensuite testées pour savoir si elles sont efficaces pour limiter l’ampleur des crises vaso-occlusives chez des souris drépanocytaires. Pour répondre à cette question, le nombre de souris à utiliser pour obtenir des résultats robustes a été déterminé en nous basant sur des expériences similaires qui nous ont ensuite permis d’utiliser des logiciels de statistiques spécifiques pour estimer ce nombre. Au total, 360 souris devront ainsi être utilisées, mais uniquement si toutes les molécules répondent à nos critères initiaux. De plus, le maximum d’organes seront prélevés pour ne pas avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris. Il est aussi prévu, en fin de nos expériences, de prélever une quantité de sang suffisante pour pouvoir répéter les analyses sur le sang, sans avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, un enrichissement est prévu dans les cages. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, avec un nombre d’individus par cage compris entre 3 et 5 (pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une population trop importante). Toute injection ou tout prélèvement sera effectué sous anesthésie générale. Lors des modèles d'induction des crises vaso-occlusives (CVOs) chez les souris drépanocytaires, qui sont douloureuses, les animaux resteront sous la surveillance continuelle de l'expérimentateur, et tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, seront recherchés. Si ces changements et ces signes sont trop importants, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Surtout, un médicament anti-douleur très puissant sera administré aux souris, en prévention, avant de déclencher la CVO. Il est également possible que les souris drépanocytaires élevées dans notre animalerie développent spontanément une CVO douloureuse, en raison de leur maladie. C’est pourquoi ces souris drépanocytaires seront quotidiennement surveillées, y compris pendant leur hérbergement, et elles seront traitées par un anti-douleur très puissant quand des signes évoquant des COVs seront constatés.

Choix des espèces

Seule cette espèce possède un modèle génétiquement modifié mimant la drépanocytose, et qui reproduit de façon fidèle les manifestations cliniques de la maladie. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines maximum seront utilisées, car les souris drépanocytaires développent ensuite des atteintes d’organes sévères au cours du vieillissement.

2 190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont infectées par la bactérie Citrobacter rodentium ou reçoivent du sulfate de dextran sodique qui provoque une colite, avec pertes de poids, atteintes intestinales et parfois la mort, et subissent une imagerie quotidienne sous anesthésie pouvant durer jusqu'à quatorze jours. Le porteur reconnaît que l'infection conduit à la mort d'une partie des animaux et fixe des points limites, dont une perte de poids de 20 pour cent. Il affirme que les organoïdes in vitro ne reproduisent pas la propagation de l'infection à plusieurs organes, ce qui rendrait "essentiel" le recours à la souris.

Objectifs

L'objectif global de ce projet est de comprendre l'interaction entre la formation immunitaire au début de la vie et l'infection. Il aura deux objectifs principaux : (i) comprendre quelles cellules, bactéries, métabolites et molécules immunitaires sont impliqués pendant la réaction de sevrage pour entraîner les réponses à l'infection à l'âge adulte ; (ii) examiner comment l'infection au début de la vie affecte la réaction de sevrage. En fin de compte, nous voulons identifier de nouveaux traitements ou biomarqueurs du microbiote et du système immunitaire au début de la vie pour améliorer la réponse immunitaire à l'infection.

Bénéfices attendus

Le projet peut faire progresser les connaissances scientifiques et profiter à la santé humaine. On sait peu de choses sur la façon dont le microbiote intestinal au début de la vie forme l'immunité à l'infection tout au long de la vie. Ce projet a le potentiel d'ajouter des données importantes au domaine scientifique en fusionnant la microbiologie, l'immunologie et la recherche sur le développement précoce de la vie. Ce projet vise à identifier à la fois les biomarqueurs d'une formation immunitaire saine ou perturbée, ainsi que les composés potentiels qui peuvent restaurer une empreinte immunitaire saine. En recherchant et en testant différentes bactéries, métabolites et composés immunitaires, ce projet a le potentiel d'identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés en médecine humaine comme de nouvelles thérapies de prévention de la dysrégulation immunitaire et des infections.

Procédures

Gavage oral, en une seule fois, de la bactérie, qui durera quelques secondes et échantillons fécaux non invasifs seront prélevés. Anticorps administrés par injection i.p. qui durera quelques secondes, une fois par jour pendant un maximum de 6 jours. Les souris sans germes seront traitées avec des composés dérivés du microbiote (des acides gras à chaîne courte et/ou bactéries filamenteuses administrés respectivement via six injections intrapéritonéale sur 14 jours ou par un unique gavage) de la naissance à 28 jours. Les animaux seront également soumis à une anesthésie à l'isofluorane pendant l'imagerie in vivo de l'infection et durera 5 à 10 minutes. Cela se produira tous les jours jusqu'à 14 jours pendant l'infection.

Impact sur les animaux

Un traitement antibiotique chronique chez les mères entraîne une prise de poids réduite chez les souriceaux qui se rétablit à l'âge adulte après l'arrêt du traitement antibiotique. Ce retard de prise de poids dure donc jusqu'à 4 semaines (0-4 semaines d'âge) chez les souriceaux. L'infection à C. rodentium entraîne une perte de poids, une réduction de l'activité, une pathologie intestinale et la mort. L'infection par C. rodentium sera menée jusqu'à 12 jours (pic d'infection) avec une surveillance quotidienne des souris. Le traitement au sulfate de dextran sodique (DSS) entraîne une perte de poids et une pathologie intestinale chez les souris. Le DSS sera utilisé jusqu'à 7 jours consécutifs à la fois (14 jours au total par souris) avec une surveillance quotidienne.

Devenir

Toutes les expériences nécessitent l'analyse des cellules immunitaires dans les tissus intestinaux et d'autres organes, ainsi que l'évaluation de la propagation de l'infection aux organes périphériques. La seule façon d'évaluer cela est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience. Tout sera mis en œuvre pour respecter les principes des 3R.

Remplacement

Aucune alternative non-animale n'est actuellement disponible pour mener cette recherche. Bien que les nouveaux modèles organoïdes tridimensionnels puissent partiellement reproduire in vitro les réponses d'un seul organe à une infection en combinaison avec des cellules immunitaires particulières, ces systèmes ne sont pas en mesure de reproduire la propagation systémique des infections à différents organes, ni le recrutement de la grande variété de cellules immunitaires dans l'intestin ou d'autres sites immunitaires tout au long de la période d'infection. Par conséquent, pour répondre à ces questions concernant la formation par le microbiote de l'immunité au début de la vie et des réponses aux infections, il est essentiel d'utiliser des modèles animaux.

Réduction

D'après la littérature (1, 2), les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et le caractère doublement emboité du plan d'expérience (via les effets portée et cage). Le calcul de ce nombre tient compte d'un minimum de sang, de cellules et d'organes à prélever pour analyse et inclut pour chaque série d'expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il prend également en compte la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure les artefacts expérimentaux et donc les erreurs d'interprétation. Nous avons utilisé l'outil statistique G*power pour déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs, en tenant compte de la variabilité inhérente à l'expérience. Ces tests ont été développés à partir d'outils référencés. Les données seront analysées grâce à des modèles d’ANOVA ajustés sur plusieurs facteurs (sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte grâce à des modèles emboîtés (modèles mixtes) tels que l’effet portée, cage et répétition de l'expérience.

Raffinement

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences conduisant à une infection et une maladie inflammatoire, dont la gravité peut être facilement suivie par la perte de poids, l'aspect général et le marqueur d'inflammation et donc la douleur estimée. Dans ces expériences, l'état des souris sera contrôlé quotidiennement par la pesée, l'aspect général et l'inspection des selles. Si la perte de poids dépasse 20%, si la souris présente des signes de détresse clinique grave (léthargie, posture voûtée permanente, piloérection marquée, absence de toilettage), ou si les selles contiennent du sang, l'expérience sera arrêtée et les souris souffrantes seront mises à mort.

Choix des espèces

Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire et le microbiote. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico, d’autant plus que relativement peu de choses sont connues dans ces interactions. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences concernant le système immunitaire et le microbiote intestinal. Les souris que nous utiliserons seront des souris gestantes, des souris de naissance, des jeunes souris entre la période postnatale et le péri-sevrage (0-4 semaines), et des souris adultes (6-10 semaines). Ce projet étudie l'influence du microbiote intestinal pendant la grossesse et au début de la vie sur les résultats des infections à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'utiliser des souris gestantes et de tester leur progéniture tout au long de la vie jusqu'à l'âge de 10 semaines.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 420 femelles donneuses sont tuées pour collecter leurs ovocytes et 180 receveuses subissent une chirurgie de transfert d'embryons d'une heure, pour comparer des milieux de culture de fécondation in vitro. Le porteur indique une douleur modérée liée au transfert chirurgical et un stress léger lié aux manipulations. Toutes les souris sont euthanasiées à l'issue, le porteur affirmant que seuls des animaux peuvent fournir les gamètes nécessaires.

Objectifs

Nous enregistrerons par imagerie dès la fécondation les signaux du fonctionnement de l’œuf de souris nécessaires au développement embryonnaire en fonction du milieu de culture dans lequel ils sont incubés. Nous évaluerons après transfert d’embryons dans une souris receveuse les taux de naissance ainsi que les croissances des animaux issus des œuf incubés selon les différents milieux. Ce qui permettra d’établir une correspondance entre le fonctionnement de l’œuf, la croissance des animaux adultes et la composition du milieux de culture utilisé. Les objectifs sont : 1. Enregistrer dès la fécondation, les signaux déclenchés dans l’œuf et liés à son métabolisme qui provoquent le développement embryonnaire. Puisque ces signaux sont connus pour être sensibles à la modification du microenvironnement , nous les utilisons comme des indicateurs du fonctionnement de l'œuf en fonction de la composition du milieu de culture. 2. Obtenir des naissances et enregistrer les taux ainsi que les croissances des animaux jusqu’à l’âge adulte issus d’œufs incubés suite à la fécondation in vitro avec un milieu de culture.

Bénéfices attendus

L'impact à long terme des techniques d'assistance médicale à la procréation (AMP) demeure un sujet de préoccupation de santé publique important car les mécanismes inducteurs, issus des manipulations in vitro, sont encore mal compris. L'unique contrôle qualité des milieux destinés à l'AMP dénommé MEA (Mouse Embryo Assay) consiste à vérifier qu'au moins 80% des embryons de souris cultivés durant 72-96 h dans ces milieux atteignent le stade blastocyste. Nous allons compléter ce contrôle chez la souris en utilisant l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes et en analysant dans ces conditions l’impact sur l’activité de l’œuf au moment de la fécondation et à long terme chez l’animal adulte. Mieux comprendre l’impact de certains composants des milieux de culture afin d’optimiser leur formulation permettra d’augmenter le taux de développement de l’embryon jusqu’au terme et d’obtenir des animaux en bonne santé.

Procédures

Les souris donneuses d’ovocytes (420) auront 2 injections à 48h d’intervalle, durée quelques secondes. Les souris receveuses (180) auront 2 injections, durée quelques secondes. Chaque souris receveuse aura une chirurgie, durée 1 heure.

Impact sur les animaux

Stress léger relatif aux différentes manipulations des souris. Douleur modérée relative au transfert chirurgical d’embryons et douleur légère liée à la piqure lors des injections.

Devenir

La mise à mort des femelles donneuses est nécessaire pour collecter les ovocytes. En fin de procédure, après le sevrage des souriceaux, les souris receveuses ayant mis bas pour la première fois, ne pourront pas avoir un second transfert d’embryons. Elles seront euthanasiées.

Remplacement

Seul des animaux peuvent être utilisés pour fournir des gamètes et donc permettre le formation d’œufs et le développement d’un nouvel individu complet.

Réduction

Dans cette étude nous avons calculé le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des données suffisanteset avoir une bonne estimation statistique de la variabilité des réponses. Afin de réduire au maximum le nombre de receveuses utilisées, les receveuses accouplées qui ne seront pas utilisées seront gardées au repos et réutilisées 10 jours après.

Raffinement

Les méthodes expérimentales ont été choisies pour limiter tout stress et éviter toute souffrance lors des interventions sur les animaux. Avant chaque transfert chirurgical d’embryons, un traitement analgésique sera donné pour éviter toute douleur avant l’intervention. Puis un mélange anesthésique/analgésique sera administré afin de prévenir la douleur durant toute l’intervention chirurgicale. Le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe dans un environnement enrichi (cabane en cellulose et papier de ouate) et l’application de critères d’arrêts de l'expérience permettent de garantir le bien-être des animaux. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance et de mettre en œuvre des traitements appropriés ou de décider d’une euthanasie, en accord avec la cellule bien-être animal de l’installation expérimentale.

Choix des espèces

La souris est l’espèce modèle idéale pour ce projet car la durée de gestation est très courte (19-20 jours) et la croissance des animaux rapide (sevrage à 4 semaines). Cette rapidité permet de mettre en évidence des relations entre des changements qui ont lieu pendant la fécondation et leurs conséquences à l'âge adulte. Les lignées de souris utilisées dans ce projet sont des lignées de référence par rapport à nos précédentes études Les souris seront utilisées dès l’âge de 6 semaines, maturité sexuelle pour les femelles.

2 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris knockout subissent des modèles de douleur avec tests d'immersion et de pression de la queue, test de Von Frey, plaque froide et chirurgies, pour étudier le rôle de récepteurs dans la nociception. Le porteur indique que la douleur infligée interdit toute réutilisation, chaque animal étant tué à l'issue de sa procédure, les effets attendus incluant un abaissement du seuil douloureux et des inflammations aux points d'injection. Il décrit le modèle murin comme "incontournable" en neurosciences et le travail sur "l'animal entier" comme "indispensable".

Objectifs

La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur. Il y a donc des points communs entre l’hypersensibilité induite par les opiacés et le développement de l’hypersensibilité induite par les douleurs chroniques. Nos résultats récents indiquent que des récepteurs spécifiques sont impliqués dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment généré des lignées de souris modifiées génétiquement afin de présenter une déficience pour chacun de ces récepteurs spécifiques. L’étude de ces lignées nous permettra de mieux comprendre l’implication de chaque récepteur dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ainsi nous pourrons envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Le même projet est déposé dans deux établissements utilisateurs pour des raisons de disponibilités d’équipements scientifiques dont le planning des utilisations n’est pas connu à ce jour. Toutefois, le nombre d’animaux annoncé : 2900, sera utilisé sur l’ensemble des deux établissements.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, les résultats de ce projet, combinés aux résultats obtenus par l’approche pharmacologique, permettront d’affiner le rôle de chacun de ces 6 récepteurs ainsi que des ligands endogènes (molécules naturellement synthétisées par les neurones et pouvant s’y fixer), dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.

Procédures

Gestes techniques subit par animal selon la procédure et le groupe auquel il appartient : PE1 : Injection composé x4 (10 secondes) / 10 tests Tail Immersion Test (TIT) d’une durée de 30 secondes / 10 tests Tail Pressure Test (TPT) d’une durée de 30 secondes PE2 : Injection composé x 10 (10 secondes) / 15 tests TIT (30 secondes) / 15 tests TPT (30 secondes) PE3 : Injection composé x1 (10 secondes) / 10 tests TIT (30 secondes) / 10 tests TPT (30 secondes) PE4 : Injection composé x1 (10 secondes) / 16 tests TIT (30 secondes) / 16 tests TPT (30 secondes PE5 : Chirurgie (20 minutes) / Injection composé x2 (10 secondes) / 15 tests du Von Frey (20 minutes) / 15 tests de la plaque froide (5 minutes) PE6 : Chirurgie (5 minutes) / Injection composé x2 (10 secondes) / 10 tests du Von Frey (20 minutes) / 10 tests du plantar (15 minutes) PE7 : Groupe 1 : Injection x1 (10 minutes ) / 11 tests TIT (30 secondes) / 11 tests TPT (30 secondes) Groupe 2 : Injection (10 minutes ) / 11 tests TIT (30 secondes) / 11 tests TPT (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.

Remplacement

L’étude du rôle des récepteurs à peptide RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur n’est réalisable que sur l’animal entier car il n’existe pas, à ce jour, de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. De plus, cette étude a pour but de compléter l’évaluation de différentes molécules ciblant les récepteurs à peptide RFamide sur la modulation de la nociception chez la souris. La combinaison des résultats obtenus par les approches génétiques et pharmacologiques permettra ainsi de conclure de manière plus convaincante quant à l’implication des différents récepteurs RF-amide dans la modulation de la douleur.

Réduction

En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les tests effectués sont compatibles avec le bien-être de l'animal ce qui permet de réduire l’effectif. Les expériences seront menées sur les mâles et étendues aux femelles dans les modèles de douleur les plus pertinents.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Dès que cela est possible, les gestes douloureux sont réalisés sous anesthésie générale, accompagnées d’une analgésie locale et sur tapis chauffant afin d’améliorer le confort de l’animal. Le réveil se fait individuellement en cage propre sous lampe chauffante.

Choix des espèces

Les objectifs du projet consistent à étudier le rôle des récepteurs RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 6 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 8 semaines ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et d'un développement complet du système nociceptif.