Procédures légères

208 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent pendant douze semaines un régime gras et sucré combiné à des phtalates, perturbateurs endocriniens présents dans les emballages, puis des injections avant d'être tuées pour analyser leur cerveau. L'objet est d'évaluer l'effet combiné de l'alimentation occidentale et de la contamination chimique sur la microvascularisation cérébrale, avec un appui annoncé aux recommandations de santé publique. Le porteur décrit des nuisances "très limitées voire inexistantes" et affirme qu'aucun modèle in vitro ou sur invertébrés ne permet cette étude intégrée.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’étudier les effets d’une co-exposition à un régime alimentaire mimant une alimentation déséquilibrée à l’origine de désordres métaboliques (régime obésogène et diabétogène), associée à l’exposition chronique à des doses environnementales de phtalates, composés chimiques exogènes plastifiants reconnus comme perturbateurs endocriniens à action anti-androgénique, sur la fonction cérébrovasculaire chez la souris mâle adulte. Ce travail permettra d’évaluer les effets des inter-relations possibles entre alimentation obésogène-diabétogène, et contamination chimique environnementale par les perturbateurs endocriniens de type phtalates, sur la microvasculature cérébrale et qui pourraient être une des causes d’une altération de la santé reproductive chez le mâle.

Bénéfices attendus

Le projet se place dans le contexte de la transition alimentaire, des changements des comportements de consommation et de l'exposition environnementale aux perturbateurs endocriniens. Le projet analyse les altérations générées sur la fonction cérébrovasculaire et les positionne dans une perspective intégrative, permettant de progresser sur la notion d'exposome qui représente l'ensemble des facteurs auxquels est exposé un organisme tout au long de sa vie et qui influence sa santé, et de vulnérabilité des populations sensibles. A terme, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental pourront participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ce projet servira de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs.

Procédures

Les 6 cohortes d’animaux (total 208 souris mâles adultes) seront soumises pendant 12 semaines à un régime alimentaire riche en graisses et en sucre ou contôle, associé ou non à un mélange de phtalates mimant l’exposition environementale à des phtalates, composés chimiques perturbateurs endocriniens largement utilisés comme plastifiants, entre autres, dans les contenants alimentaires. Les études publiées précédemment indiquent que les souris supportent assez bien ces troubles métaboliques lorsqu’elles sont nourries et abreuvées ad libitum, ce qui sera le cas tout au long des expérimentations. A l’issue de ces 12 semaines : 24 animaux à l’état vigile reçoivent une injection unique par voie intrapéritonéale (durée 1 min) puis sont euthanasiés 3h après par une méthode réglementaire; 24 animaux anesthésiés reçoivent une injection unique par voie intraveineuse (veine de la queue, durée 3 min) puis sont euthanasiés 10 min plus tard par une méthode réglementaire; 160 animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables liés au régime alimentaire sont, à priori, très limités voire inexistants. Les études publiées précédemment indiquent que les souris supportent assez bien ces troubles métaboliques lorsqu’elles sont nourries et abreuvées ad libitum, ce qui sera le cas tout au long des expérimentations. Les nuisances qui pourraient survenir sont celles liées aux injections intra-péritonéale et intra-veineuse: inconfort passager dû à la manipulation et à la contention (injection ip) et douleur légère et passagère au point d'injection.

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire pour effectuer les analyses post-morten à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire dans les régions cérébrales concernées par l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène associé à une exposition à des doses environementales de phtalates.

Remplacement

La modélisation ou les études in vitro (lignées cellulaires, co-cultures, organoïdes, …) ou sur les invertébrés ne permettent pas l’étude de l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène (mimant le régime alimentaire occidental actuel) associé à l’exposition aux perturbateurs endocriniens environementaux, sur l’unité neurovasculaire. Les modèles in vitro de barrière hématoencéphalique existant actuellement ne permettent pas encore ce type d’étude intégrée demandant de s’intéresser non seuleument aux capillaires cérébraux mais également à leur environnement (unité neurovasculaire), en lien avec l’axe hypothalamus-hypophyse-gonades. Les invertébrés ne présentent pas de capillaires cérébraux non fénétrés de structure et de fonction semblables à ceux des mammifères. La modélisation nécessite des données cellulaires pour permettre d’apporter des informations sur le fonctionnement du cerveau et de la microvasculture cérébrale en particulier. De plus, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental doivent pouvoir participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ils serviront de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs. La souris est le modèle animal le plus approprié pour ce type d’étude physio-physiopathologique.

Réduction

Le dimensionnement des groupes expérimentaux pour chaque cohorte est déterminé au plus juste pour obtenir des données quantitatives permettant une analyse statistique robuste, recevable pour publication scientifique dans des journaux internationaux à comité de lecture, et en prenant en compte les variations entre les individus, et les besoins et nécessités des protocoles expérimentaux, selon la règle des 3R. Ce projet est un projet de recherche original et ne bénéficie pas de résultats déjà existants sur lesquels s’appuyer. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été confirmé par un calcul de puissance et des tests statistiques pertinents seront faits pour une interprétation fiable des résultats. Les protocoles utilisés sont adaptés pour limiter le nombre d'animaux.

Raffinement

Les souris proviennent d’un fournisseur extérieur agréé, sont réparties par 4 dans chaque cage pour éviter l’isolement et hébergées dans une pièce dédiée de notre animalerie dans des conditions contrôlées. Les cages sont en portoirs ventilés et contiennent de la sciure avec du nid végétal. Les animaux ont libre accès à la nourriture et à la boisson. Aucune procédure expérimentale ne nécessite l’isolement d’animaux. Les souris font l’objet d’une surveillance quotidienne par au moins une personne formée et compétente. Les données relatives à ces contrôles sont enregistrées et validées par la structure du bien-être animale (SBEA) locale et des points limites définis pour permettre de repérer rapidement tout animal malade, blessé ou en souffrance (inconfort, stress, angoisse) et de prendre les mesures appropriées en interagissant avec la SBEA locale et le vétérinaire référent. L'euthanasie des animaux est réalisée sous anesthésie générale et les tissus sont prélevés pour analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les mieux caractérisés pour les études métaboliques et il existe de nombreux outils biotechniques disponibles pour ce modèle animal (anticorps, lignées transgéniques...). Cela permet également de comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature et avec nos résultats précédents pour affiner nos hypothèses de travail. le projet concerne l’adulte. Les animaux sont commandés chez le fournisseur à l’âge de 6 à 8 semaines pour éviter les effets du transport sur les derniers stades de maturation du système nerveux central. Les animaux sont acclimatés pendant 1 semaine dans notre animalerie (nouvel environnement). Les animaux sont stabulés à raison de 4 souris par cage, les cages sont placées sur des portaoirs ventilés.

114 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces jeunes mâles castrés sont isolés puis exposés pendant sept jours à des poussières contaminées par des phtalates et d'autres perturbateurs endocriniens, avant le prélèvement de leurs organes. Le projet vise à valider un test in vitro censé, à terme, remplacer ce type d'expérience, étape que le porteur qualifie lui-même d'"indispensable". Le choix du porcelet est justifié par une physiologie digestive proche de celle de l'enfant, cible réelle de l'évaluation du risque.

Objectifs

Le but de ce projet est de valider in vivo l’intérêt d’une méthode alternative à l’utilisation d’animaux : utiliser un test in vitro pour prédire la biodisponibilité relative de plastifiants, insecticides et retardateurs de flamme contaminants les poussières intérieures. Cette étape de validation in vivo est indispensable pour intégrer le test in vitro dans les futures démarches d’évaluations d'exposition sur environnement intérieurs pollués par ces perturbateurs endocriniens (poussières représentatives d’environnements intérieurs contaminés en France)

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra de vérifier la corrélation d’un test in vitro susceptible de remplacer ce type d’expérimentation pour les polluants étudiés. Il permettra ainsi à terme de rendre plus éthique les l’évaluation quantitative de risque sanitaire, et de réduire manière significative le coût de ces dernières, tout en aidant les gestionnaires à hiérarchiser les environnements les plus à risques concernant l’exposition de l’enfant.

Procédures

Les animaux subiront une claustration individuelle temporaire (quotidienne, même en acclimatation

Impact sur les animaux

Le comportement social des animaux sera affecté légèrement par cette procédure. Peu de douleur, de stress et d'angoisse devraient survenir durant cette expérimentation. Les animaux seront toutefois surveillés quotidiennement et un point limite basé sur la perte de poids entre deux pesée a été fixé.

Devenir

Du fait des prélèvements envisagés (prélèvement d'organes comme des muscles, le foie en plus du sang et des urines) et de leur importance pour l'animal la mise à mort est rendue nécessaire

Remplacement

La stratégie de l'expérience consiste à comparer et à corréler les données prédites par un test in vitro avec les données de biodisponibilité in vivo afin de remplacer à terme les essais sur animaux sur cette problématique. Il ne peut y avoir de remplacement à l'heure actuelle pour ces perturbateurs endocriniens objet de la présente étude.

Réduction

Un calcul de puissance a été réalisé en vue de définir le nombre nécessaire et suffisant d'animaux en amont de l'étude. Une étude de la linéarité entre la dose d'exposition et les concentrations retrouvées dans les organes des porcelets sera réalisée en 1° étape ce qui permettra de limiter le nombre d'animaux de la 2° étape. Au total, 114 porcelets seront utilisés dans ce projet.

Raffinement

L'hébergement sera réalisé en groupes sociaux de 3 porcelets par box pourvu d'enrichissement avec cordes de chanvre. Lors de l'application de la procédure de mise en cage individuelle, l’isolement limité à 4 h maximum excepté de 12h pour la collecte d’urine dans les cages et des enrichissements supplémentaires (cordes de chanvre, ballons ) seront rajoutés pour chaque individu. Un respect strict des points limites sera réalisé afin de limiter toute nuisance et assurer le bien-être des animaux durant la durée du projet.

Choix des espèces

Les porcelets ont une physiologie digestive proche de celle des humains, en particulier de l’enfant (6 mois à 3 ans), ce qui permettra d'étudier la biodisponibilité relative de ces perturbateurs endocriniens en adéquation avec le sujet de l’évaluation de risque (l’enfant). En outre, les porcs consomment régulièrement de grandes quantités de sol dans leur environnement naturel, ce qui facilite l'ingestion de poussières par voie alimentaire. Nous avons choisi des porcelets mâles castrés pour permettre de mieux comparer cette étude à celle précédemment réalisée. Les porcelets auront 30 à 40 jours d’âge et seront sevrés. Ces conditions sont en adéquations avec la précédente étude menée sur d'autres polluants organiques. Les porcelets ont une physiologie digestive proche de celle des humains, en particulier de l’enfant (6 mois à 3 ans), ce qui permettra d'étudier la biodisponibilité des contaminants.

1 050 lézards vivipares, espèce sauvage de la faune française, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchés dans des enclos semi-naturels sans être tués. Cent cinquante femelles gestantes capturées subissent une restriction alimentaire et des températures nocturnes élevées, trois prises de sang et une mesure de réponse inflammatoire, et leurs 900 petits sont marqués un à un. L'objet est de mesurer comment le réchauffement nocturne et le manque de nourriture pèsent sur la reproduction de cette espèce. Le porteur affirme qu'aucun équivalent cellulaire ou in silico ne peut remplacer l'animal pour une étude écophysiologique en conditions contrôlées.

Objectifs

Les changements climatiques récents ont modifié la date des évènements de reproduction, la distribution géographique et l'abondance de nombreuses espèces à travers le monde. Ces changements sont très variables en direction et en ampleur selon les espèces, et les animaux ectothermes terrestres sont particulièrement affectés par la modification des conditions thermiques. Chez ces espèces, le réchauffement climatique a des effets létaux via les températures élevées durant le jour mais aussi via des actions chroniques en provoquant une accélération du vieillissement ou des déséquilibres énergétiques. Les études climatiques indiquent une augmentation plus rapide des températures nocturnes que des températures diurnes dans la plupart des régions du globe, mais très peu d’études ont quantifié les effets écophysiologiques des températures nocturnes. Chez les ectothermes terrestres, des températures nocturnes plus élevées pourraient ouvrir de nouvelles niches temporelles en prolongeant le temps d’activité potentiel ou en permettant l’activité nocturne dans les environnements trop chauds pendant la journée, ce qui serait bénéfique. À l’inverse, elles pourraient accentuer les effets délétères déjà constatés avec l’augmentation des températures diurnes en provoquant des taux de vieillissement et des déséquilibres énergétiques accrus car les compensations comportementales durant les phases d’inactivités sont très restreintes. Au-delà des conséquences physiologiques directes de la modification des cycles thermiques diurnes et nocturnes, les changements climatiques peuvent affecter les ectothermes via des effets indirects sur l’abondance de leurs proies. Conjointement, l’augmentation des températures nocturnes et une plus faible disponibilité des ressources nutritives pourraient ainsi avoir des effets délétères sensibles, en particulier pendant la gestation chez les ectothermes vivipares, car cette modalité de reproduction impose à la mère des dépenses métaboliques et énergétiques importantes. Les effets combinés de ces deux facteurs sont rarement explorés. Dans ce contexte, il est nécessaire d’étudier les effets combinés des températures nocturnes et de la disponibilité alimentaire sur la physiologie et les comportements des femelles pendant la gestation ainsi leurs conséquences sur l’aptitude des femelles et de leur progéniture.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de faire progresser notre compréhension de la flexibilité de la phénologie de la reproduction et des effets combinés des températures nocturnes et des ressources nutritives sur la qualité de la reproduction à l’aide d’une approche expérimentale. Nos travaux antérieurs suggèrent que les femelles lézards qui mettent bas plus tôt font face à des coûts énergétiques mais augmentent la croissance, la survie et la probabilité de reproduction à l’âge d’un an de leurs jeunes. Ces effets devraient être exacerbés s’il existait des déséquilibres énergétiques forts induits par des températures importantes lors des phases d’inactivité et exacerbés par une disette alimentaire. Mettre en évidence les conséquences d’une gestation accélérée la nuit et d’une restriction alimentaire sur la condition physiologique et physique des femelles nous permettra de progresser dans la bonne direction pour quantifier ces effets. De plus, nous avons démontré que les trois dernières décennies avaient été marquées par une accélération de la croissance et de l’effort de reproduction dans les populations naturelles, mais que le réchauffement climatique pouvait aussi précipiter certaines populations vers l’extinction en accélérant de manière trop importante le rythme de vie des lézards. Dans ce contexte, l’expérience permettra aussi de mieux anticiper les effets du réchauffement climatique sur la reproduction en conditions naturelles et de mesurer si ces effets sont seulement directs ou indirectement induits par les effets du climat sur les ressources. Ces effets indirects sont difficiles à quantifier en conditions naturelles ce qui justifie cette approche expérimentale.

Procédures

Des femelles gestantes seront capturées dans un élevage en extérieur au sein d'enclos semi-naturels au printemps (n=150) et maintenues en captivité dans différentes conditions thermiques nocturnes et de disponibilité de la nourriture en fonction de leur lot expérimental (6 lots, 25 femelles par lot) pendant 1 à 2 mois. Des prélèvements sanguins (durée de manipulation de 3-4 minutes) seront effectués sur animaux vigiles au début de la gestation, au premier tiers de la gestation et en fin de gestation (n=150, 3 prélèvements par animal). Des mesures de la réponse inflammatoire (durée de manipulation de 4-5 minutes) seront effectuées sur animaux vigiles au début de la gestation, au premier tiers de la gestation et en fin de gestation (n=150, 3 mesures par animal). A la fin de la gestation, les nouveaux nés seront marqués individuellement (n=900; durée de manipulation de 2 minutes). Tous les animaux seront relâchés dans des enclos semi-naturels en extérieur pendant l'été puis recapturés au printemps pour des mesures non invasives afin de suivre leur survie, leur croissance et leur reproduction future.

Impact sur les animaux

Comme nos projets passés l’indiquent, les protocoles du projet induiront une variabilité naturelle de la vitesse de la gestation sans effets létaux pour la mère ou la descendance ainsi qu’une restriction nutritive modérée pour les femelles. Les effets attendus sont ceux d’une accélération thermique de la gestation dans la gamme de variation naturelle et une sous-nutrition modérée induisant éventuellement un stress modéré se traduisant par une moins bonne condition physique et immunitaire, un plus haut niveau de mobilisation des réserves ou de dommages oxydatifs chez les femelles ainsi qu’un nombre plus faible de juvéniles produits. Les procédures expérimentales seront pour l’essentiel non invasives en dehors de trois prises de sang et de l’évaluation de la réponse immunitaire qui nécessitera une piqure. Ces manipulations sont très bien tolérées par les animaux adultes de cette espèce et induisent principalement un stress ponctuel au moment de la manipulation. Les lézards vivipares sont par ailleurs très tolérants à la mise en élevage dans les conditions de captivité de ce projet et à la manipulation par un expérimentateur. Pendant l’expérience, les animaux sont maintenus en conditions d'élevage enrichies dans leur cage individuelle et une phase d'acclimatation sera proposée avant le début de l'expérience.

Devenir

Les animaux sont tous relâchés dans les enclos semi-naturels donc replacés en captivité dans des conditions extérieures proches du milieu naturel sans réutilisation dans de futurs projets.

Remplacement

Il est impossible de remplacer le modèle biologique par un équivalent cellulaire ou in silico car l'étude écophysiologique de la plasticité de la reproduction nécessite l'utilisation d'animaux dans des conditions contrôlées au laboratoire et aussi en conditions naturelles comme dans notre projet.

Réduction

Un échantillon important d’animaux sera utilisé pour quantifier les conséquences écophysiologiques et les effets intergénérationnels des températures nocturnes et du manque de nourriture (150 femelles adultes et 900 descendants soit 1050 individus maximum) dans la mesure où ces animaux sauvages présentent une forte variabilité inter-individuelle, parce que les animaux seront divisés en 6 groupes expérimentaux et du fait que nous effectuerons un suivi pendant une année en conditions semi-naturelles où la mortalité annuelle est identique à celle dans les populations sauvages. Ces effectifs ont été réduits au minimum par rapport aux 6 groupes expérimentaux du projet et aux besoins du suivi longitudinal sur une année. On utilisera une méthode non-invasive échographique pour valider le statut de reproduction des femelles adultes et ainsi éviter de manipuler des femelles non gestantes. Les analyses statistiques consisteront à comparer les traits des six groupes expérimentaux à l'aide d'analyse de variance (modèles linéaires classiques) ou de modèles mixtes pour les données répétées (données mesurées plusieurs fois pendant la gestation ou après la gestation).

Raffinement

Afin de raffiner les protocoles, les animaux seront manipulés dans des conditions semi-naturelles proches de leur environnement sauvage pendant la quasi-totalité de l’expérience. En dehors des périodes d'élevage, les animaux seront maintenus dans de grands enclos extérieurs de 100 m2 chacun dans une prairie naturelle avec la végétation, les proies naturelles et les interactions sociales typiques d'une population sauvage. L'habitat de chaque enclos est enrichi de zones d'abri, de thermorégulation et de boisson pour optimiser la diversité des microhabitats offerts aux individus. En élevage, on raffinera aussi les conditions d'élevage grâce à un enrichissement des cages et à l'utilisation de conditions climatiques avec des cycles jour. Les cages individuelles sont enrichies à l'aide d'un abri, d'une pierre artificielle pour la thermorégulation et d'un éclairage blanc naturel enrichi en ultraviolet. Des points limites associés à la perte de masse seront appliqués avec arrêt des procédures expérimentales en cas de dépassement du point limite et basculement des conditions d'élevage des animaux vers des conditions optimales ad libitum, si nécessaire avec soins demandés par le vétérinaire référent, avec fin des mesures et des protocoles expérimentaux si les points limites sont dépassés.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le lézard vivipare, Zootoca vivipara (Lichenstein 1823). Il s’agit d’un lézard de la faune française étudié depuis 30 ans dans notre laboratoire et dont les populations naturelles en France ont été bien décrites. Le modèle biologique est intéressant pour comprendre l’écologie de vertébrés « ectothermes » comme les reptiles ou les amphibiens terrestres. Ce groupe comprend de nombreuses espèces menacées d’extinction en Europe et à valeur symbolique et écologique forte. Une thèse a permis d'analyser la plasticité thermique de la phénologie de la reproduction dans des populations naturelles. Ce projet visera à quantifier les conséquences d’une gestation accélérée la nuit et d’une restriction alimentaire pendant la gestation sur les femelles et les juvéniles à l'aide d'une approche expérimentale. Les animaux utilisés seront tout d’abord des femelles adultes gestantes (de 2 ans ou plus). Afin de limiter les variations inter-individuelles, nous ne prendrons pas de femelle sub-adulte (1 an) qui serait gestante car cette première reproduction à 1an est plus rare en conditions naturelles et leur morphologie (taille, masse) serait trop différente de celles des femelles adultes. Le statut de reproduction sera confirmé par une échographie. Dans un second temps, les nouveau-nés issus de la reproduction de ces femelles seront étudiés. Les populations semi-naturelles seront composées par ailleurs de tous les stades de développement (juvéniles, sub-adultes et adultes) pour générer une structure d’âge et de sexe « naturelle » comparable à celle des populations sauvages. Les animaux sont tous identifiés individuellement par un marquage à la naissance et les individus adultes et subadultes sont par ailleurs photographiés en phase ventrale chaque année pour confirmer le marquage individuel à la naissance en cas de doute.

12 vaches laitières vont être utilisées dans une procédure classée en gravité légère, puis conservées pour le renouvellement du troupeau et réutilisables dans d'autres essais. Elles sont soumises à un test de motivation par conditionnement opérant dans une aire en U, avec isolement social partiel et privation d'accès à la nourriture jusqu'à six heures, pour valider un outil censé mesurer leur intérêt pour une alimentation variée. Le porteur indique que l'environnement nouveau et l'isolement peuvent générer un stress transitoire et que la privation d'aliment provoque une sensation de faim. Il présente l'étude comme visant à déterminer si la diversité alimentaire est un besoin participant au bien-être des vaches laitières.

Objectifs

Dans les systèmes d’élevage de bovins laitiers actuels, l’alimentation des vaches laitières peut être qualifiée de monotone car les rations qui leur sont offertes sont généralement peu complexes en termes de composition et ne varient pas ou peu dans le temps. Pourtant lorsqu’elles en ont la possibilité, les vaches laitières composent un régime alimentaire diversifié en sélectionnant, pour constituer leur ration, un large éventail de plantes dont la disponibilité et la composition varient dans l’espace et dans le temps. Cependant, la question de l’importance de la diversité alimentaire dans les systèmes d’alimentation des ruminants d’élevage n’a émergé que récemment. L’objectif de ce projet est de valider un test comportemental (appelé conditionnement opérant) permettant d'évaluer la motivation des vaches laitières pour un régime diversifié comparativement à un régime monotone. Après validation dans le cadre du présent projet, le test de la motivation des vaches laitières pour la diversité alimentaire sera mis en place lors de futurs projets dédiés à l’étude de l’importance de la diversité alimentaire pour les vaches laitières. A plus long terme, cela permettra de déterminer si la diversité alimentaire est un besoin pour les vaches laitières et participe à leur bien-être.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer et de valider un test d'évaluation de la motivation pour la diversité alimentaire chez la vache laitière. Une fois validé, ce test sera mis en place dans le cadre de futurs projets qui permettront d’apporter des connaissances sur l’importance de la diversité alimentaire pour les vaches laitières en prenant en compte le point de vue de l’animal grâce à l’étude de la motivation de ces dernières pour la diversification de leur régime alimentaire. A plus long terme, les nouvelles connaissances apportées par ce projet participeront à déterminer si la diversité alimentaire est un prérequis indispensable pour le bien-être des vaches laitières et s’il est donc nécessaire ou non de développer des systèmes d’élevage permettant aux vaches de diversifier leur régime alimentaire pour garantir leur bien-être. Les résultats de ce projet ont vocation à permettre de faire évoluer les pratiques d’élevage en faveur du bien-être des vaches laitières. Au-delà de la question de la diversité, ce projet permettra de valider le test de motivation alimentaire chez la vache laitière, qui pourra être réutilisé pour répondre à d’autres questions en lien avec le comportement alimentaire.

Procédures

Le comportement des vaches laitières sera étudié grâce à des tests comportementaux réalisés en trois phases (une phase d’habituation, une phase d’apprentissage et une phase de réalisation des tests) dans une aire de test en forme de "U", en présence d'aliments habituels et d’aliments nouveaux, avec des congénères dans un parc d'attente à proximité (maximum 20 sessions par animal sur 1 mois toutes phases confondues).

Impact sur les animaux

Le test de motivation mis en place dans le cadre de ce projet sont des tests de comportement individuel de courte durée (10 min). Ces tests seront réalisés dans une aire de test spécifique (aire en « U ») qui est localisée dans un bâtiment non connu des vaches au début du projet. La découverte d’un environnement nouveau et l’isolement social peuvent générer du stress chez la vache laitière. Néanmoins, ce stress est transitoire puisque la concentration sanguine en cortisol (hormone du stress) retrouve le niveau observé avant le début de l’isolement dans un environnement nouveau en 45 minutes. Dans notre projet, afin de limiter le stress engendré par la découverte d’un environnement nouveau et par l’isolement social, une phase d’habituation progressive à l’aire de test sera réalisée avant la réalisation des tests de motivation. Lors de cette phase d’habituation, les vaches laitières seront dans un premier temps amenées en groupe de 12 vaches dans une aire d’attente adjacente à l’aire de test dans le bâtiment nouveau, puis seront introduites deux par deux et enfin seules dans l’aire de test avant de passer à la phase d’apprentissage et à la phase de réalisation des tests. Afin de maximiser l’intérêt des vaches pour les aliments lors des différentes phases, l’accès à l’alimentation sera bloqué 3h avant d’être amenées dans le bâtiment de test (en fin de matinée vers 11h) et pendant toute la durée de réalisation des tests (durée maximale sans accès à l’alimentation = 6h). Le fait de bloquer l’accès à l’alimentation pourra générer une sensation de faim. Cependant, cette restriction d’accès à l’alimentation ne devrait pas entrainer de restriction alimentaire. En effet, les vaches laitières ingèrent la majorité de leur ration au moment de la distribution de leur ration qui a lieu 2 fois par jour (à 8h et à 16h). De plus, lorsque le temps d’accès à l’alimentation est réduit, elles sont aussi capables d’adapter leur comportement alimentaire afin d’ingérer la totalité de leur ration journalière.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, seule une procédure légère qui n’est pas susceptible d’avoir d‘effets importants sur le bien-être et aucun effet sur la santé des animaux sera réalisée. Les animaux seront donc conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable de l’installation expérimentale. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci est effectivement possible.

Remplacement

Ce projet vise à développer et valider un test de motivation des vaches laitières pour la diversité alimentaire. Une fois validé, ce test de motivation sera mis en place dans le cadre de futurs projets qui permettront de déterminer l’importance de cette diversité alimentaire du point de vue de l’animal. A long terme, les nouvelles connaissances apportées par ce projet participeront à déterminer si la diversité alimentaire est un besoin pour les vaches laitières et si elle participe à leur bien-être. La considération du point de vue de l’animal implique d’analyser les réponses comportementales des vaches laitières vis-à-vis de la diversité et de la monotonie alimentaire. Il est donc impossible de se passer de l’utilisation de vaches laitières pour atteindre l’objectif de ce projet.

Réduction

Le nombre de vaches laitières impliquées dans ce projet a été défini sur la base des connaissances bibliographiques sur le comportement alimentaire et les capacités d’apprentissage des vaches laitières afin de pouvoir étudier la variabilité interindividuelle de la vitesse d’apprentissage du principe du test de motivation et de la motivation des vaches laitières pour la diversité alimentaire. Cela permettra de définir plus précisément le nombre d’animaux nécessaires pour les projets futurs mettant en œuvre ce test ainsi que la durée de la phase d’apprentissage nécessaire pour que les vaches comprennent le principe du test.

Raffinement

Les animaux de ce projet sont des vaches laitières habituées à être manipulées par les personnes qui réaliseront le projet. De plus, l’expérimentation mise en place est basée sur un test de comportement permettant d’étudier la motivation des vaches pour la diversité alimentaire. Ce test n’induit aucune douleur mais peut générer un stress de courte durée. Pour limiter le stress potentiellement induit par un isolement social (partiel car présence de congénères à côté de l’aire de test) et un environnement inconnu au début du projet, une phase d’habituation progressive est mise en place et une récompense alimentaire est présente dans le test. Des points limites sont définis afin de sortir une vache du protocole en cas de non habituation à la procédure. En dehors des périodes de test, les vaches sont maintenues dans leur environnement d’élevage habituel qui est adapté à leurs besoins comportementaux, environnementaux et sanitaires.

Choix des espèces

La question de l’intérêt de la diversité alimentaire a été abordée chez les petits ruminants. Cependant, il existe très peu d’études traitant de cette question chez la vache laitière, alors que ces dernières sont les ruminants dont les systèmes d’alimentation sont généralement parmi les plus monotones. La problématique de l’étude est donc spécifique aux vaches laitières et nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches laitières utilisées dans ce projet seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la principale race de vache laitière fournissant du lait pour l’alimentation humaine et de la race la plus répandue en France et dans le monde. Les vaches laitières seront des vaches adultes car le projet vise à valider un test de motivation pour la diversité alimentaire dédié aux vaches laitières et donc à ce stade.

16 430 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Élevés au stade larvaire dans un milieu antibiotique pour supprimer leur microbiote, ils sont collectés à différents jours, anesthésiés et enrobés dans une matrice de cellulose pour observation au microscope, puis mis à mort pour prélèvement de l'intestin ou séquençage. Le porteur indique que la privation de microbiote entraîne un sous-développement de l'intestin et que la collecte peut être une source de stress. Il justifie le choix de l'espèce par la transparence des larves et leur développement hors de l'utérus, et affirme que la culture in vitro d'un intestin colonisé est impossible à l'heure actuelle.

Objectifs

Les cytokines sont des agents essentiels du système immunitaire et constituent une partie des molécules indispensables à la communication intercellulaire. L'activité d'une cytokine est assurée par la présence à la surface de la cellule cible, de récepteurs spécifiques : ceux-ci permettront de transmettre le message. Elles sont donc des médiateurs, et leur production a lieu en réponse, principalement, à la présence d'un agent infectieux tels qu'un virus ou une bactérie, ou de l'un de leurs constituants. La colonisation de l'intestin par les micro-organismes commensaux (hôte habituel d'un organisme sans lui causer de dommage) commence avec l'ingestion de nourriture, et augmente massivement en nombre et en complexité avec les changements alimentaires tels que l'inclusion d'aliments secs dans le repas des poissons. La génération d'animaux sans germes par l'élimination de la flore commensale en début de vie entraîne un sous-développement des cellules épithéliales et immunitaires intestinales, ce qui conduit à un dysfonctionnement durable de l'organe. Les poissons zèbres dépourvus de microbiote intestinal (ensembles des micro-organismes présents dans l’intestin) présentent une prolifération épithéliale intestinale et une différenciation cellulaire défectueuses au cours du développement. Par exemple, les maladies inflammatoires intestinales peuvent résulter d’un problème d’échange entre la lumière intestinale (espace intérieur de l’intestin) et les cellules épithéliales qui la composent. En fait, la perturbation du dialogue entre le microbiote, le système immunitaire et les cellules épithéliales via les cytokines peut avoir des effets délétères sur l’état d’équilibre de l'intestin, compromettre l'absorption des nutriments et avoir un impact au-delà de l'intestin. Plusieurs études ont révélé des mécanismes par lesquels le microbiote contrôle la maturation du système immunitaire intestinal. Cependant, la manière dont le microbiote régule le développement de l'épithélium intestinal reste largement inconnue. Nous voulons donc comprendre comment les bactéries présentes dans notre intestin et l’interaction qu’elles ont avec les cytokines d’intérêt, peuvent réguler le développement de l’épithélium intestinal.

Bénéfices attendus

Le système immunitaire est bien connu pour son rôle important lors d'infections par des bactéries, des virus et d'autres agents pathogènes. Cependant, au-delà de l'immunité et de la défense, le rôle des signaux du système immunitaire, tels que les cytokines, dans le développement et la maturation des organes n'est pas bien compris. En outre, on ne sait pas comment les cytokines interagissent avec l’ensemble des micro-organismes colonisateurs, qui favorise la maturation des organes. Ces questions peuvent être facilement étudiées dans le modèle du poisson zèbre puisqu'il se développe en pleine eau et qu'il est transparent, ce qui permet d'observer directement les organes en développement dans le contexte de l'organisme complet. En outre, la manipulation de l'environnement est également très facile avec ce modèle animal. Ces avantages expérimentaux nous permettent de comprendre en détail comment les cytokines et leur interaction avec le microbiote modulent le développement et la maturation des organes intestinaux. En outre, ce projet nous permettra de révéler comment le dysfonctionnement du système immunitaire, au-delà de l'altération de la défense et de l'immunité, peut entraîner une altération de la maturation correcte de l'intestin. Ces résultats peuvent potentiellement ouvrir la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies intestinales, y compris celles liées à l'inflammation intestinale, ainsi que pour les pathologies dans lesquelles le bon fonctionnement physiologique de l'intestin est compromis.

Procédures

Les différentes interventions sur les larves dépourvues de toute flore seront les suivantes : - Observation rapide sans ouverture de boite tous les jours ou presque - Changement du milieu antibiotique, tous les jours ou tous les 2 jours - Aux temps J5, J8, J12, J15, 25 larves seront collectées, anesthésiées et incluent délicatement dans une matrice de cellulose le temps de l’observation au microscope. L’observation avec prise de photo de chaque larve pourrait prendre jusqu’à deux heures. Les larves seront mises à mort pour analyse post-mortem. - Aux temps à J12 et J15, 30 larves seront collectées et mises à mort avant de prélever l’intestin pour analyse. - Collecte de 225 larves pour séquençage. Les larves seront mises à mort pour analyses. - 15 larves seront collectées, anesthésiées et incluent délicatement dans une matrice de cellulose le temps de l’observation au microscope et seront mises à mort pour analyse post-mortem.

Impact sur les animaux

Nous allons étudier des larves de 5 jours post-fertilisation (dpf) jusqu’à 15dpf, avec prise alimentaire sans germe à partir de 7 dpf. La formule de cette nourriture contient tous les nutriments nécessaires à leur croissance en dehors des germes. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement. L’effet indésirable qui pourrait apparaitre serait une mortalité des larves au cours du processus. Un risque de stress lors de la collecte des larves pour analyse au microscope est possible.

Devenir

Toutes les larves seront mises à mort pour analyse post-mortem

Remplacement

L'étude de cellules souches en culture extraite de l'organisme vivant n'est pas suffisante pour comprendre les processus de l'embryogénèse (processus de formation d'un organisme pluricellulaire, de la cellule initiale issue de la rencontre des cellules reproductrices parentales à un être vivant autonome). La culture in vitro d’intestin et sa colonisation avec un microbiote est impossible à l’heure actuelle. Il n’existe aucune donnée sur d’autre modèle de Vertébré. Néanmoins, il existe des données de séquençage de l’ARN (technique pour identifier et quantifier le matériel génétique à un moment donné) issues du modèle poisson sur lesquelles nous nous sommes basés.

Réduction

Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Les tailles des lots ont été déterminés en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet

Raffinement

Les espacements des observations ont été déterminés en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. D’une façon générale, les expériences sont de courte durée. Les larves seront lors de la manipulation pilote surveillées quotidiennement puis la fréquence du suivi sera ajustée. Les larves mortes seront enlevées et le milieu avec antibiotique sera changé pour garder les larves dans un environnement optimal. Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l'angoisse de l'animal, ce dernier sera anesthésié durant toute la procédure expérimentale d’analyse au micrsocope par le biais de la tricaïne diluée dans l’eau.

Choix des espèces

Notre compréhension de la manière dont cellules, gènes de l'hôte et microbiote contrôlent le développement des organes des vertébrés est limitée dans les modèles mammifères. Il n'est pas pratique d’y réaliser des manipulations précises dans l'environnement, dans l’animal, et en même temps, de suivre en image l'intestin en développement. Pour surmonter ces limites, notre nouvelle approche consiste à combiner les avantages du modèle du poisson zèbre avec les nouvelles technologies. Le poisson zèbre est un modèle animal idéal pour étudier le développement des vertébrés en raison de sa facilité de manipulation génétique, de sa grande descendance, de sa transparence et de son développement ex utero rapide. Il est également un système modèle puissant pour étudier le microbiome (environnement spécifique d’un microbiote) des vertébrés. Enfin, la plupart des lignées et des voies immunitaires sont conservées entre poissons et mammifères. Cette étude s’effectuera sur des larves de 5dpf jusqu’à 15 dpf. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoces sous deux conditions environnementales différentes (présence de germes conventionnels et sans germe).

325 animaux non-humains, 200 moutons, 100 cochons, 15 chiens et 10 bovins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures que le porteur classe en gravité légère. Chaque animal subit sous anesthésie générale l'implantation chirurgicale d'un dispositif médical et des examens d'imagerie pouvant durer plusieurs heures, avant une euthanasie destinée à parachever la formation par l'examen de l'organe et du dispositif implanté. L'objet déclaré est de former des professionnels de santé à l'usage de dispositifs implantables, pas de produire des connaissances. Le porteur affirme que ces gestes ne s'apprennent que sur un animal vivant aux organes de taille humaine, tout en mentionnant l'existence de simulateurs et d'organes explantés.

Objectifs

Chaque année de nouveaux dispositifs implantables issus de la recherche sont disponibles pour les professionnels de santé (en cardiologie, en gastro-entérologie, en neurologie et urologie par exemple) et permettent de compenser, compléter/remplacer les fonctions vitales d’un organe défaillant pour prolonger la survie des patients et leur confort de vie. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Les professionnels de santé ont l’obligation de se former à l’utilisation de ces nouveaux dispositifs. L’utilisation d’un dispositif médical par un professionnel de santé ou un patient ne peut se faire sans une information de l’utilisateur, voire une formation préalable, elle requiert un apprentissage permettant d’utiliser le matériel, afin d’optimiser ses performances et de s’approprier les gestes permettant d’assurer à l’utilisateur une sécurité maximale d’utilisation. Un même produit, s’il est utilisé ou non conformément aux recommandations du fabricant, aura ou non la performance validée lors de son évaluation. Les dispositifs médicaux sont définis comme des produits «utilisateur-dépendant». La directive 93/42/CE modifiée relative à l’évaluation de ces dispositifs en vue de leur accès au marché européen, soumet les industriels à des obligations en matière de gestion des risques pour le produit mais également son environnement, prend en compte ce caractère «utilisateur-dépendant». Les industriels sont, à ce titre, responsables du recueil, de l’évaluation, de la mesure et du développement de tout élément susceptible de permettre une utilisation optimale des produits qu’ils commercialisent et d’assurer leur sécurité. Performances et sécurité des dispositifs médicaux sont corrélées à la formation et à l’expérience de l’utilisateur. De plus, les conditions d’utilisation des dispositifs ne peuvent se réduire à des questions d’observance. Sur tous ces points, le dispositif médical doit être différencié du médicament, y compris pour son utilisation par un professionnel de santé ou un patient. Ce projet vise à former les professionnels de santé à l’utilisation des dispositifs médicaux innovants en situation réelle sur un animal anesthésié.

Bénéfices attendus

Répondre à l’obligation de formation des professionnels de santé à la technique d’implantation d’un nouveau dispositif médical, à sa bonne utilisation et à son évaluation fonctionnelle pour la sécurité pour les futurs patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie. Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - La douleur durant l'intervention en fonction de l’invasivité de la technique, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour la réduire au maximum comme par exemple la mise en oeuvre systématique d'un protocole d'anesthésie générale et d'un protocole d'analgésie avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur morphiniques.

Devenir

Pour répondre à l’obligation de formation des professionnels de santé à la technique d’implantation d’un nouveau dispositif médical, à sa bonne utilisation et à son évaluation fonctionnelle pour la sécurité des futurs patients, il est nécessaire de procéder à l'euthanasie de tous les animaux du projet en fin de procédure pour parachever la formation en réalisant les prélèvements et analyses ex-vivo et permettre aux professionnels d’évaluer macroscopiquement l’organe et le dispositif juste implantés.

Remplacement

La formation des professionnels de santé aux méthodes d’implantation des dispositifs médicaux regroupe les notions de maîtrise du geste chirurgical mais aussi d’évaluation fonctionnelle en temps réel au moment de l’implantation grâce à l’imagerie. La réponse de l’organisme lors des différentes phases de l’implantation du dispositif et son suivi simultané par des méthodes d’imagerie pour en permettre l’évaluation fonctionnelle nécessite une formation sur un animal vivant. Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l’homme dans des conditions fonctionnelles qui reproduisent la fonction de l’organe vivant dans l’organisme afin de mimer au mieux la réalité d’une intervention.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet et aux besoins de formation. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie peu invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les professionnels de santé en formation reçoivent généralement une formation théorique en amont de cette formation pratique. Pour répondre à ce même objectif de réduction, les partenaires qui développent les dispositifs médicaux ont également développés des outils d’apprentissage avec simulateurs ainsi que des procédures permettant de travailler sur des organes explantés. La précision croissante des outils d’imagerie fonctionnelle permet également de gagner en précision dans les techniques d’implantation et d’évaluation des dispositifs, ce qui augmente le raffinement des procédure et limite le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble de la procédure est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant la procédure, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Pendant les phases d’acclimatation, les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation).

Choix des espèces

Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l’homme dans les conditions fonctionnelles de l’organe vivant dans l’organisme pour mimer au mieux la réalité d’une intervention. Pour répondre à l’obligation de formation, le modèle animal utilisé sera fonction du dispositif et de son indication. Les différences interspécifiques de nature tissulaire, de forme, de taille anatomique et de fonction requièrent l’emploi de différentes espèces de grande taille. Pour chaque formation le modèle animal retenu sera identifié préalablement en fonction de ces spécificités et similitudes avec l’Homme et sera la brebis pour les formations intéressant les domaines de la cardiologie, de la chirurgie vasculaire et de la neurologie principalement, le porc pour les formations intéressant les domaines de la gastro-entérologie, de l'ophtalmologie et de la cardiologie principalement, plus spécifiquement le chien pour la chirurgie des auricules cardiaques et les veaux pour les dispositifs d'assistance cardiaque. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.