Procédures légères

12 macaques rhésus vont être utilisé·es, gardés en vie et réintroduits dans leur groupe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une puce radiofréquence, est capturé la veille puis transporté et placé sous anesthésie environ trois heures pour un examen en IRM du cerveau. Le projet, de recherche fondamentale, compare la perception de la voix entre macaques, ouistitis et humains. Le porteur indique qu'aucun individu ne sera tué et affirme que cette comparaison entre espèces ne peut se faire sans recourir à des animaux.

Objectifs

Ce projet vise à étudier les mécanismes cérébraux et comportementaux de la perception de la voix chez les ouistitis (callithrix jacchus), le macaque (rhesus) et l’humain. La description du projet concerne les macaques. Les macaques sont hébergés dans des volières extérieures et intérieures en groupe sociaux dans l’EU2/2. Les performances comportementales à des tâches de cognition auditive sont mesurées via des modules de tests automatiques accessibles à volonté. Nous utilisons également l’IRMf pour mesurer l’activité cérébrale dans des conditions d’écoute passive et la comparer entre les groupes de sujets de taille comparable entre ouistitis, macaques et humains. Les macaques sont scannés en IRM 3T sous anesthésie. Deux expériences seront réalisées : la localisation d’un patch vocal (neurones sensibles et spécifiques au traitement des vocalisations des macaques) et comparaison inter-espèce.

Bénéfices attendus

Nous espérons que cette recherche fournira de nouvelles informations cruciales sur les bases cérébrales du traitement de l'information vocale chez les macaques. En particulier, nous mesurerons la localisation anatomique et la variabilité interindividuelle des patchs vocaux des macaques avec une taille d'échantillon et une puissance statistique comparables à celles des études humaines, pour une comparaison optimale entre espèces.

Procédures

Pose d’une puce RFID en position sous-cutanée dans chaque avant bras : celle-ci se réalise dans l’EU2/2 lors du contrôle sanitaire des animaux qui dure en moyenne 40 minutes, la pose de puces en elle-même ne dure pas plus de 10 minutes. La capture des animaux se réalise la veille de l’IRM et dure en moyenne une heure (avec ou sans anesthésie). Le transport des animaux jusqu’au centre IRM de l’EU1/2 se décompose en deux trajets (aller et retour) d’une heure et demie chacun. La session de scanning dure environ 3 heures incluant la sédation et l’anesthésie de l’animal, son positionnement dans le scanner, l’acquisition des séquences anatomiques et fonctionneles, puis sa sortie et son réveil.

Impact sur les animaux

Mise à jeun 12 heures avant les anesthésies (pose puce RFID, transport IRM). Anesthésie lors du transport au centre d'imagerie et pendant la session de scanning. Isolement du groupe pour les animaux participants à l'IRM anesthésié.

Devenir

Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu, ils seront tous réintroduits dans leur groupe sociaux.

Remplacement

Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes, afin d’inférer des mécanismes potentiellement présents chez un ancêtre commun, ici les mécanismes comportementaux et neuronaux de la perception de l’information vocale. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera minimal pour réduire autant que possible le nombre de singes impliqués, mais sera suffisant pour permettre une puissance statistique importante pouvant rendre les données interprétables. Le nombre d'animaux doit pouvoir permettre de comparer un groupe de macaques à un groupe humain.

Raffinement

Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par notre responsable du bien-être animal et validé par la la structure en charge du bien-être animal. Les animaux seront seulement anesthésié une fois pendant la durée de l'étude pour la pose des puces RFID. Pour certains animaux, comme les males adultes, une deuxième anesthésie par technique de téléanesthésie pourra etre réalisé pour le transpor des animaux au centre d'imagerie.

Choix des espèces

Cette étude comparera les données observées chez l’humain à celles mesurées chez deux espèces de primates nonhumains: macaques et marmousets. Les raisons justifiant le choix des macaques comme espèce de comparaison sont les suivantes : -Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; -Ils utilisent des vocalisations complexes et variées, bien caractérisées acoustiquement ; -Il s'agit d’un modèle neuroscientifique largement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires ; -Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf sur le même scanner que les humains, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. Nous constituerons un groupe formé de sub-adultes afin de faciliter la gestion et l’entraînement dans les premières phases du projet, et afin qu’ils soient à un âge de jeune adulte pendant le durée du projet, pour comparaison optimale avec les groupes d’humains aussi constitués de jeunes adultes.

676 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Certaines subissent un tatouage, une amputation de la queue et l'implantation d'une puce radiofréquence, et un groupe de femelles reproductrices est soumis à un régime riche en graisses, avant enregistrement des comportements sociaux dans un dispositif de suivi vidéo. Le projet, de recherche fondamentale, modélise des comportements de type autistique et l'effet de l'obésité gestationnelle. Le porteur classe l'amputation de la queue parmi les gestes légers tout en reconnaissant qu'elle provoque stress et douleur, et affirme que le comportement ne peut s'étudier qu'in vivo.

Objectifs

Le trouble du spectre de l’autisme (TSA) désigne un ensemble de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par : 1) des déficits de la communication sociale et 2) la présence de comportements répétitifs et des intérêts restreints. L'étiologie des TSA serait déterminée par la combinaison de plusieurs facteurs : génétiques et environnementaux. Parmi ces facteurs environnementaux, l’obésité maternelle représente un facteur de risque important. Le diagnostic des TSA repose essentiellement sur l’observation d’un comportement « anormal » durant les deux premières années de vie et notamment le comportement social. Ce dernier est un comportement très complexe dont l’étude requiert un niveau de détails élevé et l’accès à l’observation de plus de 2 animaux interagissant de manière libre pendant une longue période de temps. Pour étudier ce comportement et répondre à ces critères, nous proposons d’utiliser un système qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de 4 souris pendant plusieurs jours. Dans ce projet, nous souhaiterions modéliser des comportements complexes de type autistique sur 5 modèles de souris portant chacun l’inactivation d’un gène impliqué dans des pathologies avec TSA. Ce projet s’articule autour de 4 objectifs : Objectif 1 : Modélisation de comportements complexes de type autistique chez 2 modèles murins de TSA à différents stades du développement. Objectif 2 : Etudier l’effet de l’inactivation du gène associé au TSA dans certains types de neurones sur les interactions sociales et les comportements répétitifs respectivement. Objectif 3 : Etudier l’effet de la réexpression du gène cité précédemment sur les comportements complexes de type autistique. Objectif 4 : Etudier l’impact d’un surpoids gestationnel sur des comportements complexes de type autistique chez la descendance du modèle murin de TSA. En effet, la variabilité des symptômes autistiques pour une même mutation peut être expliquée par la contribution de facteurs environnementaux. Dans ce projet, nous proposons de tester l'hypothèse que le surpoids gestationnel pourrait être un facteur aggravant.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront, d'une part, l'identification de nouveaux comportements complexes associés aux troubles du spectre de l'autisme observés chez des souris en « semi-liberté » sur des modèles génétiques de l’autisme, sur un modèle avec obésité gestationnelle (connue pour être un facteur de risque), et sur des modèles combinant les facteurs génétiques et obésité gestationnelle. L'obésité représente un enjeu majeur de santé publique dont l'incidence est en nette augmentation en France depuis 1997 avec des conséquences graves sur la santé cardiovasculaire, métabolique et neurologique. Plus précisément, le taux de surpoids et d'obésité atteint 32% chez les femmes en âge de procréer ou enceintes. Par conséquent, la mesure de l'impact d'un surpoids/obésité gestationnel, est importante car elle peut démasquer ou aggraver l’effet des mutations génétiques. Il est nécessaire de mettre en évidence ces conséquences sur les symptômes de type autistique qui sont de plus en plus fréquents chez les enfants.

Procédures

Dans ce projet, certains animaux subiront différentes interventions légère unique pour les identifier (tatouage, caudectomie, implantation d'une puce radiofréquence en sous-cutanée) permettant de les identifier et un lot de femelles reproductrices sera soumis à un régime riche en graisses sur une période 6 semaines. Dans tous les cas, des mesures adaptées ont été prévues pour pallier aux nuisances éventuelles occasionnées par ces procédures.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certaines expérimentations sont susceptibles d'induire du stress (tatouage, anesthésie, implantation de la puce radio fréquence) ou du stress et de la douleur (caudectomie). Les enregistrements vidéo dans le système Live Mouse Tracker (LMT) qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de plusieurs souris pourrait induire un stress lié au changement d’environnement. Le régime riche en graisses pourrait produire de l'anxiété mais ce n'est pas évident sur une période courte de 6 semaines.

Devenir

Les animaux enregistrés dans le système Live Mouse Tracker (LMT) et les animaux soumis au régime riche en graisses seront sacrifiés pour réaliser des prélèvements pour des analyses immunohistochimiques et histologiques.

Remplacement

Dans ce projet, nous nous intéresserons essentiellement à l'étude du comportement social. Le comportement est un ensemble d'actions réalisés par un être vivant, les modèles in vitro (culture cellulaire par exemple) ne permettant pas d'étudier le comportement, le modèle animal reste donc notre seule alternative. De plus, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite une validation sur des modèles précliniques (modèles animaux). Par conséquent, l'utilisation d'un modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs de notre étude. Il est à noter que l'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisé.

Réduction

Ce projet sera réalisé sur plusieurs étapes successives. Le nombre de souris générées pour cette étude (20 souris par groupe, par sexe et par génotype) a été établi à partir d'études comportementales réalisées précédemment se basant sur des tests de puissance statistiques (http://powerandsamplesize.com/Calculators/) ainsi que sur les données de la littérature utilisant ce système. Etant donné que l’utilisation du Live Mouse Tracker (LMT) est une procédure non-invasive, les mêmes souris seront utilisées aux différents âges pour l’étude comportementale. Ces mêmes animaux seront utilisés pour les études immunohistochimiques. De plus, l'utilisation d'animaux dans certaines expérimentations sera conditionnée par les résultats obtenus dans d'autres expérimentations. En effet, si les résultats de cette dernière sont positifs (altérations comportementales), alors nous réaliserons les expérimentations suivantes et le nombre de souris utilisé sera alors établi grâce à l'utilisation de tests de puissance statistiques.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification, un accès illimité à l'eau et la nourriture, la présence d'objets (tunnel) et un nombre limité de souris par cage (4 souris par cage). Pour notre étude, il est nécessaire de constituer des groupes de 4 souris de même sexe et de même âge par cage pour l'étude comportementale. Les animaux seront habitués à la manipulation par l'expérimentateur. Les expérimentations induisant une douleur seront toutes réalisées sous anesthésie (locale et générale). Les animaux seront surveillés quotidiennement (poils, posture, activité dans la cage ...) et le poids pris régulièrement. Une grille de score (jointe en annexe) sera mise en place pour la surveillance des animaux. Si un animal montre un score classé comme bénin à modéré, il sera surveillé plusieurs fois par jour et l'administration d’un AINS (anti-inflammatoire non stéroidien) en sous-cutanée et/ou d’un morphinique en sous-cutanée sera envisagée. L'arrêt de la nourriture riche en graisse sera également considéré pour les animaux avec surpoids gestationnel. Si aucune amélioration n'est observée et que l'état de l'animal se détériore, une mise à mort sera alors réalisée.

Choix des espèces

Les souris représentent des modèles robustes pour étudier différentes pathologies dont les TSA. Tout d'abord, les souris sont des animaux très prolifiques avec des temps de génération courts et des portées assez conséquentes facilitant l'étude de cohortes de plusieurs animaux. De plus, l'espérance de vie des souris est courte permettant d'étudier différents stades de développement en moins d'un an. Et enfin, les outils génétiques utilisés chez la souris permettent de générer les mêmes mutations génétiques retrouvées chez l'Homme mimant ainsi un certain nombre de symptômes et motivant la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, les animaux seront utilisés à 3 stades de développement différents : 1) Stade juvénile (entre le 35ème jour de vie postnatale (P35) et le 40ème jour de vie postnatale (P40)) : Pour identifier des altérations précoces du comportement (de type autistique). En effet, les TSA apparaissent durant les 2 premières années de vie chez l'Homme. 2) Stade adulte (3 à 4 mois) : Pour évaluer la progression des altérations comportementales présentes au stade juvénile et/ou l'apparition de nouvelles altérations comportementales. 3) Stade de vieillissement (>18 mois) : Pour identifier des altérations comportementales similaires à celles observées dans certaines maladies neurodégénératives telle que la maladie d'Alzheimer. En effet, les patients atteints de certains syndromes autistiques (syndrome de Down ou le syndrome de Prader-Willi) développent une démence ou un déclin cognitif après 40 ans.

6 macaques à longue queue vont être utilisé·es, gardés en vie pour une réutilisation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit cinq sessions de mesure de la conduction nerveuse sous anesthésie générale, avec insertion d'électrodes et stimulation des nerfs périphériques, espacées d'au moins trois jours. Le projet vise à valider cette mesure chez le primate non-humain pour l'intégrer aux études réglementaires de toxicologie. Le porteur indique que l'évaluation de la toxicité chez une à deux espèces animales reste une exigence réglementaire et retient le primate pour son homologie avec l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer et valider la mesure de la conduction nerveuse chez le primate non humain. Cette méthode permettra l’obtention d’enregistrement fonctionnels de l’activité du système nerveux périphériques dans les études réglementaires d’évaluation de la sécurité des produits pharmaceutiques. La validation permettra de s’assurer que l’appareil d’enregistrement et le test mis en place permettent de mesurer la conduction nerveuse de façon fiable et reproductible chez le primate non-humain avant l’intégration dans les études de toxicologie réglementaire.

Bénéfices attendus

La validation de cette technique permettra d’effectuer la mesure de la conduction nerveuse et ainsi d’évaluer une possible atteinte du système nerveux périphérique lors de la réalisation d’études de toxicologie règlementaire (notamment pour des candidats médicaments appartenant à des classes pour lesquelles des neuropathies ont déjà été mise en évidence chez l’homme ou ayant une indication en lien avec le système nerveux). Cette technique sera aussi utilisé pour l’évaluation du fonctionnement du système nerveux pendant les études réglementaire pour les thérapies innovantes telle que la thérapie génique (pour lesquels les vecteurs employés présentent un tropisme pour le système nerveux) . La surveillance de l’état du système nerveux périphérique par la mesure de la conduction nerveuse lors des études réglementaires permettra une meilleure anticipation des effets adverses pouvant survenir chez l’homme notamment lors des essais cliniques. Cette méthode étant translationnelle, elle pourra aussi être utilisée chez l’homme lors des essais cliniques en se basant sur les résultats obtenus chez l’animal afin de monitorer le développement potentiel de neuropathies. A terme, ce projet contribuera aussi à la réduction du nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques en permettant l’enregistrement de paramètres additionnels (mesure de la conduction nerveuse) chez des animaux déjà inclus dans les études de toxicologie réglementaire au lieu de réaliser des études spécifiquement pour évaluer ce point (étude standalone).

Procédures

Chaque session de mesure de conduction nerveuse sera réalisée sous anesthésie générale. 5 sessions d’enregistrement par animal seront réalisées. Une mise à jeun sera prévu avant chaque anesthésie. Les sessions d’enregistrement seront espacées d’au moins 3 jours.

Impact sur les animaux

La procédure étant réalisée sous anesthésie générale, il n’y pas d’effets négatifs attendus liés à l’insertion d’électrodes et à la stimulation des nerfs périphériques chez l’animal (celle-ci étant réalisée en routine sans anesthésie ou analgésie chez l’homme vigile dans le cadre des examens cliniques d’enregistrement de vitesse de conduction nerveuse). Chez l’animal, les procédures d’enregistrement (durant environ 15 minutes et jusqu’à 45 minutes maximum) se font sur des animaux anesthésiés (afin que ceux-ci soient immobiles et ne ressentent pas l‘introduction des électrodes ni le spasme ou le pincement potentiellement induit par le courant électrique) mis à jeun au minimum 6 heures avant la procédure . La fréquence respiratoire sera monitorée au cours de l’anesthésie. Lors du réveil anesthésique, des pertes d’équilibres et une hypothermie légère peuvent être observée temporairement. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante et par air chaud pulsé si nécessaire sera mise en place.

Devenir

Le degré de sévérité de la procédure étant classé à priori comme léger les animaux seront gardés en vie pour une éventuelle réutilisation après une période de repos.

Remplacement

Bien que des alternatives in vitro et in silico à l’usage d’animaux afin d’évaluer la sécurité et la toxicité des candidats médicaments soient en développement, l’évaluation non-clinique de la toxicité des médicaments chez une à deux espèces animales reste une exigence réglementaire en Europe à ce jour car il n’existe pas actuellement d’alternatives qui permettent de déterminer la toxicité de substances suite à une exposition systémique sans le tester dans l’animal. La technique de mesure de la conduction nerveuse doit donc être validée dans les espèces chez lesquelles elle sera par la suite utilisée dans le cadre des études réglementaires.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique. La sensibilité du test de conduction nerveuse a également été prise en compte pour déterminer le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin de détecter rapidement tout signe clinique. La procédure d’enregistrement sera réalisée sous anesthésie avec un agent ayant des propriétés analgésique avec une surveillance anesthésique (au minimum fréquence respiratoire et température corporelle de l’animal). Si la température corporelle centrale est en dessous de 36°C, des mesures pour réchauffer l’animal seront prises (mise sous lampe chauffante ; utilisation de cage de réveil avec air chaud pulsé, couverture de l’animal, air chaud compulsé...). Si l’animal ne répond pas aux mesures de réchauffement, l’euthanasie sera considérée. L’anesthésie sera réversée par l’utilisation d’un antagoniste médicamenteux pour faciliter le réveil.

Choix des espèces

De nombreux traitements innovants nécessitent une homologie importante avec l’homme afin d’évaluer les potentiels effets toxiques. Dans ce cas, les études de toxicologie réglementaire doivent être conduites chez le primate non-humain. Or, ces thérapies sont à risque de causer des neuropathies chez l’homme. L’intégration de la mesure de la conduction nerveuse dans les études de toxicologie règlementaire sera donc essentielle pour évaluer ces risques. La technique de mesure de la conduction nerveuse, ayant vocation à être incorporée à des études de toxicologie règlementaire, doit être conduite chez les espèces qui seront utilisées dans ces études. Cette intégration nécessite donc la validation préalable du test de mesure de la conduction nerveuse chez le primate non humain. La validation du test de conduction nerveuse se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire.

360 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un prélèvement de l'extrémité de la queue et un tatouage des phalanges pour génotypage, les animaux sans le bon phénotype étant euthanasiés après cette étape et les autres à l'âge adulte pour prélever leur moelle épinière. Le projet vise à caractériser des interneurones spinaux, avec l'objectif à long terme de développer des stratégies pour les patients traumatisés médullaires. Le porteur décrit ce modèle translationnel comme "crucial" et affirme que l'absence de données transcriptomiques publiées rend l'utilisation de nouveaux animaux "indispensable".

Objectifs

L'objectif principal du projet est la caractérisation moléculaire des neurones impliqués dans l'intégration sensorimotrice au sein de la moelle épinière chez l'homme. A plus long terme, l'objectif de cette caractérisation est de permettre la mise en œuvre de stratégies de neuromodulation ciblée afin d'améliorer le pronostic neurologique des patients traumatisés médullaires.

Bénéfices attendus

Chaque année et en France seulement, ce sont 1500 à 2000 nouveaux patients, d'un âge moyen est de 28 ans, qui viennent s'ajouter aux 40 000 para ou tétraplégiques recensés. Dans ce contexte, le développement d'un nouveau modèle translationnel est crucial afin de tester chez l'animal de nouvelles stratégies ciblées dont la transposition potentielle chez l'homme sera le préalable et non plus l'aléa.

Procédures

Prélèvement de l'extrêmité caudale de la queue de l'animal et tatouage de phalanges (prélèvement au niveau de l'oreille en cas de nécessité d'un nouveau prélèvement). Les animaux sont tatoués et prélevés entre le 7 et 10e jour. Cette procédure unique dure moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Seul le prélèvement de la queue (ou des phalanges en seconde intention) sera réalisé à des fins de génotypage.

Devenir

Les animaux n'ayant pas le bon phénotype seront euthanasiés à l'issue du génotypage. Les autres animaux seront euthanasiés une fois adulte (entre 2 et 4 mois) en vue du prélèvement post-mortem de la moelle épinière.

Remplacement

Afin de diminuer le nombre d'animaux utilisés, les données souris wild type seront issus de publications antérieures ayant mis en ligne les données de séquençage (snRNA-seq). Il n'y a toutefois aucune donnée transcriptomique publiée issues de souris En1-Cre permettant d'obtenir un profil spécifique pour les interneurones V1, ce qui rend indispensable l'utilisation de nouveaux animaux de la même espèce pour comparer les profils transcriptomiques.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au minimum nécessaire à l'obtention d'un nombre statistiquement suffisant pour l'analyse transcriptomique robuste, soit 40 000 neurones analysés. D'après nos résultats préliminaires, chaque moelle épinière souris extraite permet l'analyse d'environ 2000 neurones. Nous prévoyons donc d'analyser les moelles épinières issues d'environ 20 souris En1-Cre;Sun1-sfGFP ce qui est le nombre minimal d'animaux permettant un profiling transcriptomique statistiquement robuste.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans une animalerie agrée, en groupe sociaux, dans des conditions de températures et hygrométrie controlées. Elles ont accès ad libitum à la nourriture et l'eau: au sevrage, des croquettes humides sont placées au fond de la cage pendant le 1e semaine et leur consommation effective vérifiée. Les cages présentent un enrichissement du milieu donc la présence d'un "nid" sera le signe de souris calmes, regroupées et sociables. Les animaux sont quotidiennement surveillés, en tenant compte leur comportement (pas de prostration, de difficulté de déplacement, pas de stéréotypie) et de l'absence de lésions. Une surveillance quotidienne sera mise en place pour surveiller l'allaitement des souriceaux par la femelle ayant mise bas. Des points limites pour les souriceaux de moins de 10 jours et conduisant à une euthanasie immédiate du nouveau-né ont été établis. Pour les animaux adultes vivants (dont ceux utilisés en accouplement), la surveillance quotidienne permettra d'euthanasier tout animal présentant des lésions graves ou des signes de souffrance, ayant atteint un point limite ou présentant un comportement stéréotypique.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris du fait de l'existence de lignées transgéniques permettant de cibler l'expression de protéines fluorescentes spécifiquement dans les neurones spinaux V1. L'objectif du présent projet étant la caractérisation des neurones adultes, les souris utilisées seront euthanasiés à l'âge adulte, soit entre 2 et 4 mois.

1 440 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce projet se limite à produire et entretenir des lignées génétiquement modifiées, avec biopsie de la queue sous anesthésie pour génotypage et pose d'une puce sous-cutanée. Les souris de génotype "inadéquat" sont tuées après génotypage, et les couples reproducteurs le sont quand ils cessent de donner des portées. Le porteur relie cet élevage à l'étude d'une protéine liée à l'obésité et au diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity".

Objectifs

L'obésité et le diabète de type II connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans qui fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que des neuropeptides connus pour jouer un rôle crucial dans le contrôle hypothalamique du comportement alimentaire sont aussi exprimés dans les îlots pancréatiques, suggérant que les neuropeptides hypothalamiques pourraient servir de lien entre l’homéostasie énergétique et glucidique. C’est le cas du 26RFa, neuropeptide hypothalamique identifié au sein de l'Unité comme le ligand endogène d’un récepteur humain orphelin, le GPR103. Des études récentes menées au sein du laboratoire révèlent que le 26RFa est un nouvel acteur de la régulation de la glycémie. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel d'une protéine de la famille des chromogranines, la chromogranine A (CgA), dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Or la CgA est exprimée par de nombreuses populations de cellules nerveuses, et de récentes études préliminaires nous ont permis d'observer que les neurones 26RFa expriment également la CgA. Ainsi, la compréhension du rôle de cette chromogranine dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neuropeptides tels que le 26RFa pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du diabète de type II. Dans ce contexte, nous souhaitons héberger et reproduire des souris CgA-loxP obtenues de "GemPharmatech". L'entretien de cette lignée nous permettra d'invalider de manière ciblée le gène exprimant la CgA en la croisant avec la lignée 26RFa-iCRE/+ pour invalider la CgA dans les cellules exprimant le 26RFa. Ce croisement devrait nous permettre de caractériser l'impact de l'altération de la sécrétion de neuropeptides sur la régulation de l'homéostasie du glucose dans l'organisme.

Bénéfices attendus

L'expression de la CgA étant ubiquiste, l'invalidation globale du gène exprimant la CgA ne nous permet pas de discriminer le rôle central des rôles périphériques de la CgA quant au contrôle de l'homéostasie glucidique. Par ailleurs, la caractérisation du phénotype des souris issues des croisements (prise alimentaire, poids, glycémie, morphologie et capacité sécrétoire des neurones hypothalamiques) concourra à la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion du 26RFa et son rôle dans l’homéostasie glucidique.

Procédures

Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm destiné au génotypage des animaux) sous anesthésie : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie. L’induction de l'anesthésie profonde se fait par voie aérienne dans une cage dite "à induction". Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide de puces stériles dédiées. La puce est placée en sous-cutané entre les omoplates de façon tangentielle à la courbe du dos et à l'aide de l'injecteur stérile à usage unique fourni avec la puce.

Impact sur les animaux

Les modèles de souris dont le gène ChgA a été invalidé de manière globale sont viables, mais présentent une hypertension et une obésité. L'invalidation ciblée du gène ChgA ne devrait pas induire de nuisance ou d’effet indésirable accentués chez les animaux. Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale sous anesthésie par voie aérienne dans une cage dite "à induction" (isoflurane). Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide d'une puce placée en sous-cutané. L’élevage et la reproduction devraient induire peu de stress et de souffrance.

Devenir

Une partie des animaux générés dans ce projet sera destinée à la reproduction et à l'entretien de la lignée CgA-loxP, et une autre partie des animaux sera destinée à la génération et à l'entretien d'une lignée dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26RFa. Les animaux de génotype adéquat seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissance à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précedemment décrites. Les animaux de génotype inadéquat donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.

Remplacement

L’étude de l'impact de l'invalidation ciblée du gène ChgA sur l'homéostasie glucidique n’est possible que dans un système intégré et nécessite donc l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à réduire le nombre d'animaux générés en choisissant de travailler sur les animaux homozygotes pour la construction CgA-loxP, plutôt qu'hétérozygotes. En effet, les règles de la génétique mendélienne indiquent que la probabilité d'obtenir des animaux de génotype adéquat est de 1/4 dans le cas de croisements d'animaux double hétérozygotes CgA-loxP. Le nombre d'animaux de génotype non adéquat, générés dans la descendance des croisements est ainsi divisé par deux.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à cinq par cage (deux femelles et un mâle par cage pour les accouplements) pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de boules de coton pour construire un nid + dôme en plastique rouge sous lequel se réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux. Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Pour réduire une éventuelle souffrance liée à la mise bas, les femelles seront suivies quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. La mise-bas en elle-même sera étroitement surveillée afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal (le processus de mise-bas dure en moyenne 2 heures chez la souris) et l’aide nécessaire sera apportée aux femelles en cas de difficultés au cours de la mise bas (temps de mise bas allongé au-delà de 4h, mise-bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…).

Choix des espèces

La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes, ce qui n'est pas le cas d’autres modèles mammifères. Ainsi, des souris de la lignée C57Bl/6J ont été utilisées afin de générer les animaux portant la construction transgénique CgA-floxP provenant de GemPharmatech (B6/JGpt-Chgaem1Cflox/Gpt). Cette dernière lignée (utilisation de souris à partir de 8 semaines de vie, âge de maturité sexuelle) sera alors croisée avec une lignée transgénique 26RFa-iCRE (même stade de développement et également obtenue à partir de souris de la lignée C57Bl/6J), détenue au sein de l'animalerie, soumise à un « Material Transfert Agreement » convenu entre le laboratoire d’origine et l’Inserm U1239.

20 chiens vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dix-neuf étant ensuite réutilisés dans d'autres études et un seul proposé à l'adoption. Pendant six semaines, ils reçoivent un aliment additionné d'un probiotique, subissent quatre prises de sang et deux "défis comportementaux" consistant en un trajet en voiture en caisse de transport. L'objectif est commercial, faire autoriser ce probiotique comme additif alimentaire pour chiens sur le marché européen, une troisième étude étant exigée par les autorités. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'effet d'un aliment sur l'anxiété du chien.

Objectifs

Le projet a pour but d'évaluer le bénéfice d'un probiotique inclus dans un aliment complet sur l'anxiété chez le chien.

Bénéfices attendus

Il est attendu du projet que le probiotique évalué puisse faire l'objet d'une autorisation en tant qu'additif entrant dans la composition d'aliment pour chien sur le marché Européen. Le probiotique utilisé dans l’étude a un effet calmant pour les animaux anxieux et ainsi améliorer la qualité de vie des chiens.

Procédures

Pendant l'étude, les chiens recevront un aliment complet avec ajout d'un probiotique sous forme de poudre chaque jour pendant 6 semaines, soit 42 jours. Chaque chien subira 4 prises de sang (volume de 1mL / prise) par voie veineuse et 2 défis comportementaux réalisés à J43 et J106 de l'étude. Le défi comportemental prendra la forme d'un court trajet en voiture d'une durée de 10 minutes, en caisse de transport.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles seraient: défécation ou miction incontrôlée, comportements d’échappement intenses et persistants pouvant nuire à l’animal, et vomissements durant le trajet en voiture. Les nuisances possibles au moment des prélèvements sanguins sont: hématome, infection.

Devenir

Parmi les 20 chiens, 19 seront ré-utilisés dans d'autres études, et 1 chien ayant atteint l'âge requis sera proposé pour un placement via le programme d'adoption de l'animalerie.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative prouvée permettant d'évaluer l'impact de la consommation d'un aliment sur l'anxiété chez le chien. Par conséquent, il n'est pas possible de remplacer le recours à l'espèce animale étudiée dans ce projet.

Réduction

Sur la base de la variation constatée sur des études similaires réalisées précédemment, il a été déterminé qu'avec 20 chiens, nous serons en mesure de détecter une différence statistiquement significative de 10% dans les paramètres physiologiques étudiés.

Raffinement

Les chiens suivent un programme de socialisation individuelle régulière se composant d'activités d'éducation canine, de promenade en laisse et de sortie en parc. Ceci pour favoriser des interactions positives avec le personnel soignant et ceux appliquant les procédures expérimentales. Les animaux bénéficient quotidiennement d'accès à de larges enclos gazonnés où ils peuvent s'ébattre plusieurs heures par jour sous la supervision d'animaliers. Ils sont logés en box individuel par couple dont les dimensions sont très supérieures aux minima réglementaires. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel soignant composé de vétérinaires, assistants vétérinaires et soigneurs animaliers, ainsi que de comportementalistes.

Choix des espèces

Le probiotique étudiée est destiné à l'espèce Canine, qui a déjà été évalué dans deux études précédentes. Les autorités sanitaires Européennes requierent qu'une troisièmé étude soit réalisée sur l'espèce animale concernée pour valider l'effet du probiotique étudié en tant qu'additif alimentaire. Les animaux seront au stade adulte considérant que l'ingrédient actif sera intégré en premier lieu dans des aliments pour chien adulte.