Procédures légères

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ce modèle déficient pour l'interleukine 10 développe une inflammation intestinale spontanée et subit des gavages quotidiens pendant sept jours pour tester un régime enrichi en oméga 6 et en bactéries propioniques contre la colite. Le porteur indique une surveillance de la consistance des selles et du comportement, avec euthanasie lorsque le score de point limite atteint 4. Toutes les souris sont euthanasiées pour prélever les organes, le porteur affirmant qu'il est impossible de modéliser cette complexité par des cultures in vitro ou des organoïdes.

Objectifs

L’intégrité de la barrière épithéliale intestinale est un paramètre physiologique crucial. Elle est compromise dans de nombreuses pathologies à composante inflammatoire, du diabète de type I à l’autisme en passant par les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Malgré les progrès des biothérapies, les patients atteints de MICI ont une qualité de vie très altérée, ne disposent pas de thérapies efficaces et 70% d’entre eux vont devoir avoir recours à la chirurgie au moins une fois au cours de leur vie. Il est nécessaire d’augmenter nos connaissances sur la physiopathologie des MICI et de définir de nouveaux moyens pour renforcer le tube digestif. Un intérêt croissant est donc porté aux composés alimentaires capables de renforcer la barrière épithéliale intestinale. L’objectif de ce projet est de tester si un régime riche en dérivés en acides gras polyinsaturés oméga 6 (AGPI), combiné ou pas à un enrichissement en bactéries propioniques laitières, peut réduire une colite développée chez la souris déficiente pour l’Interleukine 10. Nous souhaitons déterminer si des souches de bactéries propioniques peuvent renforcer la barrière épithéliale intestinale, diminuer l’inflammation et diminuer la colite par des dérivés AGPI oméga 6, ou s’il faut combiner les 2 agents pour optimiser une nouvelle stratégie thérapeutique pour les MICI

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de déterminer: - si un régime enrichi en Acides Gras Polyinsaturés oméga 6 peut réduire le développement d’une inflammation intestinale - si une supplémentation en bactéries laitières peut réduire le développement d’une inflammation intestinale - quelle souche peut être utilisée pour protéger de ce développement - si les 2 régimes sont complémentaires ou synergiques

Procédures

Les animaux en élevage auront une anesthésie locale avec de la lidocaïne pour l’identification au moment de la pose de la bague (geste très rapide avec une contention de 20 secondes max). Pour les animaux en expérimentation, un gavage sera réalisé quotidiennement pendant 7 jours et la contention durera moins de 20 sec par animal. Un autre gavage sera effectué 3 fois au total. Ce gavage, et donc la contention le permettant durera moins de 20 sec par animal. A l’issue de ce gavage les animaux sont à nouveaux manipulés avec anesthésie locale et le geste durera 30 secondes max. Les animaux seront positionnés en cage individuelle pendant 5h pour une exploration et ceci sera effectué au total 3 jours.

Impact sur les animaux

Il est possible d’observer des cas d'agressivité des parents sur leur petits ou agressivité dans le couple. Dans ce cas, les animaux sont isolés avec un enrichissement adapté et peuvent être exclus de l’aspect reproduction. L’identification (pose de bague) au moment du sevrage peut entraîner une gêne et du stress. Le modèle de souris déficiente pour l’interleukine 10 est bien caractérisé néanmoins, une inflammation intestinale est présente à partir de 8 semaines avec un régime standard, et nous ne savons pas les conséquences d’un régime riche en oméga 3 ou 6 ou de la supplémentation en souches bactériennes sur ce modèle: La consistance des selles peut changer et sera surveillée ainsi que le comportement global des animaux. Leur poids sera mesuré 2 fois par semaine. Les gavages réalisés peuvent entrainer une gêne et/ou une inflammation même si ceux-ci seront réalisés par du personnel expérimenté.

Devenir

Les animaux obtenus suite à la procédure élevage seront intégrés par la suite dans la procédure expérimentation. Les géniteurs de la procédure élevage seront euthanasiés à l’issue des 6 mois en reproduction. Concernant les animaux en expérimentation, ils seront mis à mort à la fin de l’expérimentation pour permettre la collecte de différents organes afin de réaliser la suite des expérimentations mais cette fois-ci ex vivo.

Remplacement

La maladie de Crohn met en jeux différents systèmes cellulaires (bactéries, épithélium, système nerveux entérique, cellules immunitaires, muscles lisses). Il est, au jour J, impossible de modéliser cette complexité par des modèles in vitro de co-culture ou même d’organoïdes.

Réduction

Nous avons déjà travaillé sur les supplémentations en acides gras polyinsaturés n-6 ou en bactéries propioniques laitières et avec le modèle de colite induite chimiquement, ce qui nous a permis de faire des calculs de puissance, et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité.

Raffinement

Une table de points limites est bien sûr établie. Une surveillance quotidienne tout au long du protocole nous permettra de vérifier que le score de point limite reste inférieur à 1, d’augmenter notre surveillance (matin et soir) si le score est de 1 ou de 2, de réhydrater les animaux et de leurs donner des analgésiques s’il est de 3, et de les euthanasier s’il est de 4.

Choix des espèces

Au sein du laboratoire, et plus généralement, le modèle de souris IL10-/- est le plus utilisé pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et surtout mimer la maladie de Crohn. Il présente rapidement une inflammation intestinale, des défauts de barrière et un remodelage tissulaire semblables aux pathologies humaines. La supplémentation en acides gras poylinsaturés n-6 doit se faire pendant au minimum 8 semaines chez des animaux jeunes. Nous la ferons sur des souris de 4 semaines de vie et pendant 8 semaines.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ce modèle transgénique de l'ataxie spinocérébelleuse de type 3 est suivi par IRM sous anesthésie gazeuse jusqu'à deux heures et par prélèvements sanguins mensuels sur animaux vigiles pendant treize mois. Le porteur indique que la pathologie provoque des troubles moteurs progressifs, une perte de poids et une mortalité précoce, et qu'aucun animal ne sera maintenu au-delà de quinze mois. Toutes les souris sont euthanasiées pour prélever le cerveau, le porteur décrivant le recours à l'animal comme "obligatoire et nécessaire" pour suivre la pathologie dans un "organisme entier".

Objectifs

Les ataxies spinocérébelleuses font partie des maladies génétiques neurodégénératives du cervelet et du tronc cérébral qui entraînent de nombreux troubles moteurs. La forme la plus connue est la SCA-3 aussi appelée maladie de Machado-Joseph. CDans cette maladie, qui touche 1 à 2 personnes sur 100 000, c’est est due à une mutation de la protéine ataxine-3 qui est mutée et qui s’aggrège alors dans les neurones, provoquant ainsi leur mort et l’apparition de troubles moteurs. A ce jour, il n’existe pas de traitement capable de ralentir ou stopper l’évolution de la maladie et les médicaments actuels permettent seulement de soulager certains symptômes, Aujourd’hui nous disposons d’un modèle murin transgénique exprimant la forme humaine de la mutation ataxine-3. Dans ce projet, nous souhaitons proposons de suivre en par imagerie IRM les changements morphologiques et biochimiques associés à l’expression de la pathologie au niveau du cervelet dans ce un modèle expérimentalmurin transgénique exprimant la forme humaine de la mutation ataxine-3. L’objectif de Ccette étude est ainsi permettra d’identifier la cinétique d’apparition des biomarqueurs d’imagerie pertinents pour étudier la cinétique de la pathologie ; ce qui permettra alors de savoir si nous disposons d’un modèle expérimental pertinent pour l’évaluation thérapeutique de stratégies thérapeutiques qui seront proposées pour le traitement de la maladie de Machadi-Joseph.et proposer une nouvelle l’approche thérapeutique dans cette indicationdans la prise en charge de la maladie de Machado-Joseph.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider la pertinence de l’utilisation de notre modèle expérimental pour étudier la mise en place et l’évolution de l’ataxie cérébelleuse de type 3 par imagerie IRM dans un contexte préclinique, puis pour évaluer l’efficacité thérapeutique de composés qui seront proposés pour le traitement de la maladie de Machado-Joseph. La recherche sans a priori de marqueurs d’imagerie pertinents pour suivre l’évolution de la pathologie dans notre modèle expérimental pourraient également permettre l’identification de nouveaux biomarqueurs qui pourraient par la suite être utilisés dans des essais cliniques chez l’humain.

Procédures

Prélèvements sanguins: Fréquence : 1 fois/mois pendant la durée de l’étude (soit 13 mois) Animaux vigiles/contention manuelle Durée acte : 1min maximum Acquisition imagerie IRM: Anesthésie gazeuse Durée maximale de l’examen : 2h/animal 5 sessions maximum sur la durée de l’étude

Impact sur les animaux

Le développement de la pathologie chez les animaux transgéniques est associé à une à l’apparition progressive de troubles moteurs. Dans ce contexte, aucun animal ne sera maintenu en vie au-delà de 15 mois d’âge, âge auquel une mortalité commence à être observée chez les animaux transgéniques. Les effets indésirables potentiellement attendus sont : • Apparition progressive de troubles de la motricité associée au développement de la pathologie • Perte de poids • Mortalité précoce • Douleurs associées aux microprélèvèments sanguins réguliers effectués sur animaux vigiles et anesthésie longue durée (max 1h) lors des examens imagerie IRM

Devenir

Afin de corréler les données acquises in vivo par imagerie aux analyses biochimiques et protéomiques ainsi qu’aux données histologiques, il est nécessaire de prélever des tissus et organes, notamment le cerveau, ce qui implique que tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet.

Remplacement

La caractérisation de modèles expérimentaux exprimant les mutations responsables des pathologies humaines permet une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant l’expression de la pathologie. Le recours un modèle animal reste obligatoire et nécessaire afin de suivre le décours temporel de l’expression de la pathologie dans un organisme entier et pour étudier dans quelle mesure un traitement pourrait venir corriger les atteintes observées, ce qui ne peut être reproduit dans un modèle in vitro.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour garder une puissance statistique permettant de s’assurer que les résultats puissent être correctement exploités malgré une variabilité inter-individuelle. Un minimum de n=15 animaux/groupe est nécessaire pour mesurer et analyser de nouveaux paramètres par imagerie. La comparaison des données d’imagerie intra-groupe et inter-groupe sera réalisée au moyen de tests paramétriques robustes. Le suivi longitudinal au cours du temps par imagerie permettra de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

-Surveillance et maintien des composantes physiologiques durant les examens d’imagerie : respiration, température corporelle. Réveil de l’animal en chambre thermostatée avant réintroduction dans sa cage -Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt tout signe d’inconfort ou de douleur qui pourraient survenir, et administrer le soin correspondant -Surveillance du poids corporel des animaux : pesée mensuelle des animaux. Réajustement de la fréquence de pesée et des rations alimentaires si nécessité et/ou animal montrant des signes de faiblesse Aucun animal présentant des signes de souffrance au-delà de 24h ne sera maintenu en vie, et une euthanasie sera envisagée.

Choix des espèces

Dans ce projet nous avons choisi d’utiliser un modèle murin transgénique porteur de la mutation responsable de l’ataxie cérébelleuse chez l’humain. Nous disposons déjà de données comportementales dans ce modèle, générées par des collaborateurs extérieurs. Il est nécessaire de caractériser notre modèle à l’aide de données d’imagerie pour pouvoir ensuite envisager de tester des stratégies thérapeutiques pour traiter cette pathologie. Il s’agit d’une approche à fort potentiel translationnel car nous souhaitons ici utiliser la même modalité d’imagerie que celle envisagée pour le suivi de patients atteints de cette maladie dans les futurs essais cliniques. Dans ce projet, nous souhaitons suivre les animaux sur le long terme (suivi longitudinal) en imagerie IRM de façon à suivre le décours temporel de l’évolution de la pathologie au niveau cérébral. Nous utiliserons des souris âgées de 2 mois. Le suivi longitudinal des animaux est envisagé jusqu’à l’âge de 15 mois.

1 330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent après la naissance des injections répétées pour induire une mutation, subissent un test de nage sur cinq jours pour évaluer la mémoire, puis une injection de traceur avant leur mise à mort par exsanguination et le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que les nouveau-nés peuvent être exclus du nid par la mère et que les adultes peuvent développer des accidents vasculaires cérébraux se traduisant par des déplacements en cercle. Il affirme que les interactions vasculaires du cerveau ne peuvent être reproduites in vitro et que les géniteurs sont euthanasiés une fois produits les effectifs voulus.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives avec atteintes des petits vaisseaux cérébraux et symptômes de démence sont de plus en plus courantes de nos jours. Il est devenu crucial pour la santé publique de préserver l'intégrité du réseau vasculaire du cerveau. Ce réseau est protégé par une barrière spéciale appelée barrière hémato-encéphalique, qui contrôle les échanges sanguins avec le tissu cérébral. Récemment, des scientifiques ont découvert une nouvelle population de cellules qui entourent les vaisseaux sanguins de cette barrière. On les appelle les cellules périvasculaires. Il est suggéré que ces cellules jouent un rôle important dans le maintien de la stabilité du réseau vasculaire et de l'équilibre des cellules nerveuses. Dans ce projet de recherche, nous avons plusieurs objectifs : tout d'abord, comprendre comment ces cellules périvasculaires se développent et se répartissent dans le cerveau pendant la période de maturation après la naissance. Ensuite, nous voulons étudier la capacité de ces cellules à produire une matrice extracellulaire. Enfin, nous souhaitons comprendre comment des facteurs génétiques peuvent influencer le recrutement de ces cellules périvasculaires.

Bénéfices attendus

Impact sur la santé et implications cliniques : Nos études vont permettre d'examiner en détail la fonction de la barrière vasculaire du cerveau, connue sous le nom de barrière hémato-encéphalique, dans les maladies vasculaires cérébrales. Nous allons évaluer l'importance biologique des marqueurs identifiés dans le maintien de cette barrière protectrice. Ces résultats pourront accélérer le développement de nouvelles thérapies visant à améliorer la fonction de la barrière vasculaire et à traiter les troubles cognitifs chez les patients souffrant de maladies affectant les petits vaisseaux cérébraux. Nous espérons également contribuer à l'identification de nouveaux biomarqueurs permettant de prédire le risque d'accidents vasculaires cérébraux, de déclin cognitif et de démence.

Procédures

Les animaux transgéniques seront tatoués à 7 jours d’âge (en 10 secondes). La mutation génétique chez tous les mutants sera induite après la naissance par 4 injections d'un agent inducteur pendant 4 ou 5 jours consécutifs (chaque injection incluant la contention ne dure que quelques secondes). Les animaux adultes seront testés pour leur capacité de mémorisation des taches en utilisant un test de nage réparti sur 5 jours (8 min par jour). La perméabilité vasculaire sera suivie après injection d’un traceur sous anesthésie (injection unique incluant la contention de 10 secondes avant le sacrifice). L'animal aura au préalable reçu une injection d'un antalgique 30 min avant l'acte afin de diminuer la douleur liée à cette injection. A l’euthanasie, sous anesthésie profonde, un prélèvement sanguin de 200 microlitres sera réalisé pour doser le traceur dans la circulation sanguine.

Impact sur les animaux

Le modèle post natal : les altérations du comportement des nouveaux-nés pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience tels que immobilité, arrêt de l’allaitement, exclusion du nid par la mère. Chez l'adulte, les complications aigues pourront être des accidents cérébro vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent déplacement en cercle).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés, afin de pouvoir prélever les organes et réaliser l’étude histologique. Les géniteurs seront euthanasiés lorsque le nombre d'animaux nécessaires aux expérimentations aura été produit.

Remplacement

Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neuropathologiques avec atteintes des petits vaisseaux du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que les signes cliniques associés à ces maladies, comme les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'intégrité vasculaire dépend d'interactions multiples entre différents types cellulaires. Il est encore très difficile d'appréhender in vitro les interactions entre le tissu environnant et les réseaux tridimentionnels des vaisseaux et les altérations du phénotype vasculaire sur la fonction d'un organe (notamment le cerveau). L'expérimentation in vivo en association avec l'utilisation de souris transgéniques délétées spécifiquement dans certain tissu (endothélium...) permet de différencier l'action spécifique de chaque type cellulaire dans le tissu et fournit des informations de mécanismes physiopathologiques impossible à obtenir in vitro. Pour réduire le nombre des animaux euthanasiés, aucune expérience déjà publiée n'est reproduite et lorsque cela est possible les études conceptuelles sont réalisées in vitro sur des cellules en culture avant d'être testé in vivo. Cependant la physiologie des vaisseaux est complexe, met en jeu des interactions multiples entre les composants de la paroi vasculaire et le sang qui ne peuvent pas être reproduites in vitro de façon satisfaisante

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des expériences préliminaires qui ont permis d’identifier le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour permettre une analyse des résultats statistiquement significative. Pour réduire le nombre d'animaux, les animaux seront inclus dans plusieurs protocoles expérimentaux (tests de comportement, analyse des tissus).

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions limitant au maximum le stress et la douleur. Ils sont élevés en groupe dans des cages ventilées maintenant une atmosphère saine. Des jouets/ tubes en carton sont mis à disposition des animaux dans leur cage pour enrichir leur environnement, leur permettre de ronger et de se cacher. Les litières sont dépoussiérées et additionnés de cubes de coton leur permettant de construire des nids. Les opérations chirurgicales sont réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d’un antalgique. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien.

Choix des espèces

Choix de l'espèce: La souris a été choisie en raison de l'existence de souris transgéniques dont les gènes d'intérêt ont été mutés. C 'est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire à de forte ressemblance avec celui décrit chez l'homme. Choix des stades de développement: les souris seront analysées dans les premiers jours après la naissance (stade dit post natal) et à l'age adulte. La maturation du réseau vasculaire dans le cerveau chez la souris se fait pendant les 3 premières semaines de vie . Il est donc important d'analyser la mise place du système vasculaire en post natal. L'étude à l'age adulte correspond à une étude du maintien des structures vasculaires, maintien qui serait altéré dans les pathologies neurodégénératives chez l'homme.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont soumises à un régime riche en graisses pendant un à quatre mois, à des antibiotiques dans l'eau de boisson et, pour certaines, à une ablation chirurgicale des organes génitaux, afin d'étudier le vieillissement du système immunitaire lié à l'obésité. Le porteur indique que les souris grossissent et deviennent moins actives, et que la chirurgie provoque des douleurs à l'incision. Il affirme que les interactions du système immunitaire ne peuvent être reproduites in vitro, ce qui l'oblige selon lui à recourir à l'animal.

Objectifs

L’obésité, maladie de plus en plus présente dans le monde, est devenue un enjeu majeur de santé publique. Elle est à l’origine de nombreuses complications telles que des maladies inflammatoires chroniques. L’obésité est également associée à des anomalies de la flore intestinale et à une diminution de la fonction du système immunitaire. Ces mêmes phénomènes ont également pu être observés au cours du vieillissement chez la souris. En effet, une inflammation chronique et une modification de la flore intestinale conduisent à une altération de la fonction d’une population de cellules composant le système immunitaire (les lymphocytes T) et donc à son vieillissement. Nous posons donc l’hypothèse que l’inflammation chronique et les modifications de la flore intestinale observées dans l’obésité pourraient induire un vieillissement accéléré du système immunitaire. Notre objectif est, dans un premier temps, d’étudier l’impact d’une obésité induite par un régime riche en graisses sur le vieillissement du système immunitaire. Dans un second temps, nous évaluerons le rôle de l’inflammation, de la flore intestinale mais aussi des hormones sexuelles sur le vieillissement du système immunitaire dans le contexte d’une obésité induite par un régime riche en graisses.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’immunodéficience observée dans l’obésité. Ces travaux pourraient ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les personnes obèses. Nous porterons également notre attention sur l’impact du sexe qui n’a pas été étudié jusqu’ici.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d’aliments (régime contrôle ou régime riche en graisses) sur une durée de 1 à 4 mois. Certains animaux seront également soumis à un traitement antibiotique dans l’eau de boisson sur une durée de 2 mois maximum. Enfin, d’autres animaux subiront une ablation des organes génitaux par chirurgie avant d’être mis sous régime contrôle ou riche en graisses.

Impact sur les animaux

Les animaux placés sous régime riche en graisses vont prendre du poids tout au long des semaines et vont devenir moins actifs. Le traitement aux antibiotiques peut donner un goût à l’eau de boisson. Les souris sont susceptibles de moins boire en début de traitement. La chirurgie d’ablation des organes génitaux pourra entrainer des douleurs au niveau de l’incision.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires à l’étude du vieillissement du système immunitaire.

Remplacement

Le système immunitaire est composé de nombreuses cellules qui interagissent entre elles. L’effet d’un régime riche en graisses sur les cellules qui le composent est le résultat d’interactions complexes qui ne peuvent pas être reproduites in vitro nous obligeant ainsi à utiliser l’expérimentation animale.

Réduction

Des lots d’un nombre réduit d’animaux seront utilisés pour anticiper la validité statistique des données obtenues. De plus, des expériences préliminaires nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés en déterminant le temps de mise sous régime le mieux adapté.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoirs ventilés et auront un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Ils seront au maximum 5 par cage. Le milieu sera enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en cartons. Le régime riche en graisses n’induit pas de souffrance chez les animaux. Les souris vont prendre du poids et devenir un peu moins actives. Elles seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et un suivi hebdomadaire de la part de l’équipe scientifique sera mis en place en prenant en compte les critères établis dans la grille de score. Si, au vu des critères, un animal est en mal-être, il sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence dans l’étude du système immunitaire. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris utilisées auront entre 8 et 12 semaines au début de la mise sous régime gras car à cet âge le système immunitaire est mature.