Procédures légères
Etude de la plasticité fonctionelle de fibres motrices descendantes suite à une lésion médullaire et d’une stimulation magnétique trans-spinale régénérative chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 069 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et une vingtaine réutilisées dans d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement sévère, 785 souris étant classées à ce niveau. Elles subissent une lésion chirurgicale de la moelle épinière par hémisection ou contusion, des injections de traceurs neuronaux et des tests moteurs sur une échelle horizontale et en libre déplacement, certaines recevant en plus une stimulation magnétique répétée sous anesthésie. Le porteur indique que la lésion provoque une paralysie et une perte d'appui des membres postérieurs du côté lésé, effet qu'il qualifie d'inhérent au modèle. Les retombées annoncées pour les personnes paralysées, des thérapies ciblées, restent formulées comme un espoir à terme.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de comprendre comment la moelle épinière peut se réparer après une blessure grave à la colonne vertébrale. Une blessure à la moelle épinière peut entrainer une perte totale ou partielle des fonctions motrices et sensorielles en-dessous de la blessure, ce qui peut inclure la perte de capacité de marcher. Malheureusement, il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour cette condition. La raison de ces pertes est que les voies de communication entre le cerveau et la moelle épinière, appelées voies descendantes, sont endommagées ou affaiblies. Cependant, les circuits de la moelle épinière situés en dessous de la blessure conservent souvent une grande partie de leur fonctionnalité, même après la blessure. Une piste prometteuse consiste donc à encourager la repousse des voies neurales descendantes pour rétablir le contrôle moteur de la moelle épinière. Cependant, il existe de nombreuses voies neurales descendantes, et elles ne sont pas toutes équivalentes en termes de fonctionnalité. De plus, certaines voies pourraient être plus aptes que d'autres à se régénérer. Il est donc important d'étudier la capacité de repousse de chaque voie neurale descendante et d'évaluer comment cela peut améliorer les capacités motrices. Récemment, des chercheurs ont identifié différentes voies neurales descendantes qui jouent un rôle crucial dans le contrôle des mouvements des membres supérieurs chez la souris. Ces voies ont leur origine dans le tronc cérébral et se distinguent par leur fonction et leur composition moléculaire. D'autre part, des études ont montré les bienfaits d'une stimulation magnétique trans-spinale répétée (rTSMS). Cette méthode non invasive, qui peut être appliquée chez l'homme, améliore la motricité après une blessure expérimentale de la moelle épinière et pourrait favoriser la repousse des axones (les prolongements des cellules nerveuses). Sur la base de ces découvertes, ce projet a les objectifs suivants : 1. Etudier anatomiquement la capacité des voies neuronales descendantes du tronc cérébral à survivre et à se régénérer spontanément après une blessure expérimentale de la moelle épinière. 2. Examiner la possibilité que la rTSMS puisse favoriser la repousse et la survie des voies neurales descendantes, ou certaines d'entre elles. 3. Evaluer la contribution fonctionnelle de chaque voie neurale descendante à l'amélioration des capacités motrices induites par la rTSMS.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé publique majeur, avec plus de 180 000 nouveaux cas chaque année, et malheureusement, il n'existe actuellement aucun remède. C'est pourquoi il est essentiel de mener des expérimentations animales afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués et d'évaluer l'efficacité de différentes méthodes thérapeutiques. Ce projet a pour objectif d'identifier les populations de neurones pour lesquelles favoriser la connectivité avec les zones situées sous la lésion permet une certaine récupération de la motricité. Nous nous concentrons sur une voie nerveuse spécifique, qui est la plus ancienne du point de vue de l'évolution et donc la plus conservée entre les espèces. Nos résultats obtenus chez la souris nous permettront ensuite de rechercher des cellules similaires chez l'homme et d'étudier leur altération chez les patients atteints de lésions médullaires. À terme, nous espérons pouvoir adapter des thérapies ciblées aux neurones dont nous aurons démontré la fonctionnalité et la capacité de plasticité. Par ailleurs, la méthode de stimulation magnétique que nous utilisons pour favoriser la récupération est non invasive et indolore, ce qui la rend applicable à l'homme. La stimulation magnétique transcrânienne est déjà utilisée dans le traitement de certaines maladies neurodégénératives, et des essais de stimulation trans-spinale sont en cours. Cependant, les mécanismes directement impactés par ce type de stimulation ne sont pas encore entièrement connus. C'est pourquoi il est essentiel de caractériser, chez la souris, les changements dans l'organisation des circuits nerveux induits par la stimulation magnétique trans-spinale, afin de mieux adapter cette technique à une utilisation chez l'homme. En résumé, ce projet vise à améliorer notre compréhension des mécanismes de récupération après une lésion de la moelle épinière en identifiant les neurones clés et en évaluant l'efficacité d'une stimulation magnétique non invasive. Les résultats de cette recherche pourraient permettre de développer des thérapies ciblées pour les patients atteints de lésions médullaires, améliorant ainsi leur qualité de vie.
Procédures
Des tests de comportements moteurs seront réalisés chez tous les animaux. Ils recevront au préalable une injection d’un ligand pharmacologique ou d’une solution contrôle. Puis, ils seront placés dans une enceinte dans laquelle ils pourront se déplacer librement ou sur une échelle horizontale. Ces animaux referont ces tests une deuxième fois environ 15 jours après les premiers tests. Selon les groupes d’animaux, certains le referont une troisième fois 20 ou 65 jours après les premiers tests. La quasi-totalité des animaux recevront une injection de traceur de neurones au niveau de la moelle épinière et/ou dans le tronc cérébral lors d’une procédure chirurgicale. La plupart d’entre eux auront la moelle épinière lésée par hémi-section ou par contusion lors de cette même procédure chirurgicale. Certains groupes d’animaux recevront une stimulation magnétique trans-spinale répétée, ce qui est une procédure sans douleur pour l’animal, réalisée sous anesthésie pour que l’animal reste immobile, pendant une durée maximale de 15 minutes. Cette stimulation sera répétée pendant 14 jours successifs.
Impact sur les animaux
Les tests de comportement moteur décrits dans ce projet sont des tests réalisés en routine dans notre laboratoire, nous savons qu’ils n’auront pas d’effets indésirable. Il en est de même pour les injections de traceurs neuronaux. Le modèle de lésion par hémi-section est connu chez différentes espèces dont la souris pour engendrer des déficits moteurs – c’est inhérent au modèle, puisque le but de ces recherches est de tenter de compenser ces déficits. En particulier, les animaux présenteront, de manière transitoire, une mobilité réduite causée par une paralysie complète et une perte de capacité portante des membres postérieurs du côté lésé. Nous optimiserons la méthode de lésion pour que les déficits moteurs soient parfaitement latéralisés.
Devenir
Les animaux qui n'auront pas reçu d'injections de traceurs neuronaux ni de lésions médullaires seront utilisés dans d'autres projets. Les autres animaux seront mis à mort en vue du prélèvement du cerveau et de la moelle épinières pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet.
Remplacement
Le but de cette étude est de caractériser finement la repousse axonale à la suite d’une lésion de la moelle épinière, étudier les changements d’organisation des voies axonales au sein de l’ensemble de la moelle épinière et de corréler cette plasticité à la récupération fonctionnelle. A ce jour, aucune alternative non animale n'est disponible pour ces questions. En effet, même si les bases neurales de l'activité locomotrices ont beaucoup progressé, et sont encore étudiées, sur des préparations in vitro (tronc cérébral et moelle épinière attachées), ces préparations ne sont pas adaptées à l'étude d'une lésion et de la plasticité neuronale qui en découle. En effet, ces préparations ne peuvent être maintenues actives que quelques heures au mieux, ce qui ne permet pas l'étude des changements d'activité neuronale et de connectivité qui s'installent dès les premiers jours après la lésion et qui continuent à s'opérer plusieurs semaines après. L'enjeu de ce projet est en d'étudier la corrélation entre plasticité anatomique et autonomie motrice, qui est le critère à restaurer chez les sujets humains. La motricité, donc l'exécution d'un mouvement bien donné, et dont l'efficacité est quantifiable et mesurable, ne peut être étudié que sur l'animal adulte et intègre. Enfin, des modèles computationnels existent et sont utilisés par certains laboratoires. Nous avons nous-même un projet sur la modélisation des réseaux locomoteurs, mais dans un contexte sain. Ces modèles sont intégralement construits sur des moelles épinières intactes, et les conséquences anatomiques et fonctionnelles des lésions médullaires ne peuvent pas être simulées.
Réduction
Nous ferons une double utilisation de la plupart des animaux (étude fonctionnelle et anatomique). L’étude anatomique reposera sur des observations de neurones et leurs quantifications par animal, puis moyennées entre animaux. L’étude fonctionnelle reposera sur des comparaisons de mobilité et d’intégrité des mouvements entre animaux lésés et non lésés, et entre animaux lésés ayant ou non subi un traitement par stimulation trans-spinale. Par expérience, nous estimons que 10 animaux par groupe seront nécessaires par type de comparaison afin des résultats significatifs.
Raffinement
Toutes les expériences invasives seront réalisées sous anesthésie générale, combinées à un traitement analgésique. Après une chirurgie, les animaux seront transférés dans une chambre chauffante ventilée, conçue spécialement pour le réveil post-opératoire, et ce jusqu’au réveil complet. Ils retourneront ensuite dans leur cage d’origine afin d’éviter un stress lié à l’isolement. Ils seront soumis à un suivi post-opératoire quotidien pendant 7 jours pendant l’expérimentateur suivants la chirurgie. Nous contrôlerons le poids, l’aspect général (respiration, pelage, propreté de la zone anogénitale, déplacement, sutures), le comportement dans la cage et pendant les manipulations. Si les animaux montrent des signes de douleur, ils recevront un traitement adapté. Hors suivi post-opératoire, les animaux seront suivis quotidiennement par les personnels de l’animalerie.
Choix des espèces
La compréhension des bases neurales de la locomotion, de son contrôle par le tronc cérébral en condition sain ou lésé chez l’humain nécessite le recours à un modèle animal mammifère. La petite taille, la facilité d’élevage et la vitesse de reproduction de la souris a fait de cette espèce un modèle de choix pour les expériences de génétique depuis plus d’un siècle. Surtout, c’est actuellement le seul mammifère permettant un accès facile à la modification des gènes par la technologie du génie génétique sur cellules souches. De nombreuses lignées génétiquement modifiées sont donc disponibles chez cette espèce. Dans le cadre de ce projet, ces lignées génétiquement modifiées, qui ne présentent pas en elles-mêmes de phénotype dommageable, permettent de marquer par un traceur une seule population de neurones descendants. C’est la seule manière d’étudier une population neuronale de manière isolée. De plus, l’anatomie du cerveau et de la moelle épinière de la souris est très bien cartographiée. L’étude ne comporte pas d’aspects liés au développement. Les animaux utilisés seront adultes, âgés de 1mois et demi à 6 mois.
Génotypage par coupe de bout de queue chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
20 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 5 000 tuées et 15 000 gardées vivantes pour l'élevage ou d'autres projets. À une dizaine de jours, chaque souriceau subit sous anesthésie l'ablation d'un millimètre de queue destinée au génotypage, les animaux surnuméraires ou ne portant pas la modification génétique recherchée étant ensuite tués au CO2. Le porteur affirme qu'aucun saignement ni effet indésirable n'est attendu et que le prélèvement de poils, moins invasif, a été écarté parce qu'il faussait les résultats. Il présente le génotypage comme "indispensable" à la gestion des lignées génétiquement modifiées, sans lequel le modèle vivant ne peut être remplacé.
Objectifs
Les études faites au sein de notre animalerie nécessitent l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Ces souris présentes les trois génotypes possibles, homozygote mutant, hétérozygotes et homozygotes sauvages. Afin de pouvoir définir le génotype des souris, un génotypage est nécessaire. Après avoir testé différents types de prélèvements sur les animaux, il s’avère que le prélèvement le moins invasif (prélèvement de poils) entraine des contaminations et donc des erreurs de génotypage. Nous devons donc effectuer ce génotypage par prélèvement de bout de queue. Ce mode de prélèvement a démontré une meilleure fiabilité que d’autres prélèvements. Afin de s’assurer du bien-être des animaux, ces prélèvements sont effectués sous anesthésie générale au vetflurane et les animaux sont tout de suite remis dans leurs cages d’hébergement pour réveil avec leurs parents.
Bénéfices attendus
Le génotypage permet de connaitre le génotype des animaux et donc de sélectionner les bons animaux pour le projet ou le maintien de lignée
Procédures
les animaux subiront un prélèvement de 1 mm de bout de queue vers 10 jours d'age sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les animaux étant prélevé à un jeune âge et sous anesthésie, la coagulation se fera rapidement, il n’y aura pas de saignement. Les animaux se réveilleront avec leurs parents, il n’y aura pas de nuisances ni d’effets indésirables.
Devenir
Les animaux surnuméraires ou ne possédant par le génotype nécessaire seront mis à mort par inhalation progressive de CO2. Les animaux possédant le bon génotype seront gardés en vie pour le maintien de la lignée ou pour la réalisation de projet ne nécessitant pas de demande d’autorisation de projet. Environ 25 % partiront dans le cadre d'une utlisation continue dans des projets necessitant une demande d'autiorisation de projet
Remplacement
Le génotypage des animaux est indispensable au bon déroulé des études et à la bonne gestion de lignées OGM. Le modèle vivant ne peut donc pas être remplacé.
Réduction
Le génotypage des animaux permet de ne garder que le minimum d’animaux. En effet si la lignée suit la loi de Mendel, nous pouvons supposer du nombre d’animaux possédant le bon génotype issu d’un accouplement. Cela permet donc de ne garder qu’un nombre minimum de parents géniteurs et donc un nombre minimum de petits à génotyper
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permet l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et prélèvements seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation.Afin de diminuer le stress des animaux, le puçage et la coupure du bout de la queue se font en même temps sous la même anesthésie générale par inhalation de vetflurane. Ainsi les animaux ne sont anesthésiés qu’une fois.
Choix des espèces
Au sein de notre animalerie, nous n’effectuons de prélèvements que sur les souris car seules les souris génétiquement modifiés sont mises en accouplement et nécessite un génotypage. Les animaux seront prélevés à l’âges de 10 jours, cet âge permet de pouvoir génotyper les animaux avant la date de sevrage et donc de pouvoir répartir les animaux dans les cages d’hébergement par génotype au moment du sevrage.
Etudes moléculaires chez un nouveau modèle rat du Syndrome de Down et de la Maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent un jeûne de six heures, une pose de bague d'identification et une biopsie de l'oreille, puis un prélèvement de sang sous anesthésie avant d'être tués pour des analyses moléculaires post-mortem. Le projet vise à caractériser une nouvelle lignée de rats reproduisant la trisomie 21 et la maladie d'Alzheimer, le porteur avançant que ce modèle pourrait éclairer les mécanismes des deux pathologies. Sur le remplacement, il affirme qu'"aucune alternative" n'existe et que l'étude du cerveau exige un organisme vivant étudié dans sa globalité.
Objectifs
Le Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 touche 1 naissance sur 800 et représente la forme la plus fréquente de retard mental. Par ailleurs, les personnes atteintes du SD développent de nombreuses comorbidités parmi lesquelles la maladie d’Alzheimer (MA). Nous venons ainsi de créer un tout nouveau modèle de rats du SD pouvant également être utilisé pour étudier le développement de la MA. Ce dernier pourrait notamment contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique du SD, ainsi qu’à l’identification de mécanismes impliqués dans le développement de la MA dans ce contexte du SD. L’objectif de ce projet est donc de réaliser une première caractérisation de ce modèle grâce à des analyses moléculaires effectuées sur des échantillons de sang/plasma ainsi que sur le cerveau. Les résultats de ces analyses sont sensibles à la prise alimentaire des animaux. De ce fait, il est nécessaire de réaliser une mise à jeun des animaux afin de contrecarrer les effets de la prise alimentaire, cette dernière étant très aléatoire d’un individu à l’autre. Les animaux seront donc soumis à une privation alimentaire avant d’effectuer un prélèvement sanguin qui sera réalisé sous anesthésie générale.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau modèle de rats du SD. Les bénéfices potentiels de ce projet sont multiples (i) une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques du SD, (ii) une meilleure compréhension du rôle de l’interaction 2 gènes dans le développement de la MA dans le SD, l’un de ces gènes étant connu pour son implication dans le SD et l’autre dans la MA et (iii) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de la MA dans le SD. Par ailleurs, les mécanismes identifiés pour le développement de la MA dans le SD pourraient également s’appliquer aux personnes de la population générale affectées par la MA. Par la suite, cela pourrait potentiellement permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le SD et la MA.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, les animaux seront soumis à une privation alimentaire en vu d’une mise à jeun. Cette privation alimentaire sera d’une durée de 6h. Elle sera réalisée une seule fois par rat et sur la totalité des animaux du projet, soit 24 rats. Ces animaux seront ensuite anesthésiés pour pouvoir réaliser un prélèvement sanguin. Pour cela, un mélange anesthésique sera administré par voie intrapéritonéale, cette injection est réalisée en 1 à 2 mins par rat. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé, il se fait en 1-2 mins. A noter que l’injection d’anesthésique et le prélèvement de sang sont réalisés qu’une seule fois par rat. Par ailleurs, les animaux seront soumis à la pose d’une bague à numéro unique permettant de les identifier, ainsi qu’au prélèvement d’une biopsie d’oreille afin de déterminer quels animaux sont porteurs de la modification génétique. Ces deux actes sont réalisés une seule fois par animal et de façon successive en 2-3 mins.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à une privation alimentaire afin de réaliser une mise à jeun. Cette privation alimentaire peut induire un stress léger chez l’animal. Par ailleurs, le prélèvement sanguin nécessite d’anesthésier l’animal au préalable via une injection d’anesthésique par voie intrapéritonéale. Cette injection n’induit qu’une douleur minime et très brève au site d’injection liée à l’introduction de l’aiguille. Elle peut également induire un stress de courte durée chez l’animal du fait de la contention nécessaire pour pouvoir effectuer l’injection. Concernant la pose d’une bague à numéro unique et du prélèvement d’une biopsie d’oreille, ces deux actes, réalisés de façon successive, ne génèrent qu’une douleur minime et un stress léger chez l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux prévu dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir réaliser des analyses moléculaires en post-mortem.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo.
Réduction
Cette demande concerne la réalisation de prélèvements sanguins et du cerveau sur des animaux mis à jeun en vu de réaliser des analyses moléculaires. Le recul et les connaissances que nous avons sur la mise en œuvre de ces analyses nous permettent d’estimer que le nombre d’animaux nécessaire est de 6 animaux/génotype/sexe. Cet effectif a été déterminé afin d’avoir un nombre minimal d’animaux tout en ayant des résultats scientifiquement interprétables et ce en prenant en compte une variabilité inter-individu attendue. Par ailleurs, cette étude sera réalisée sur des mâles et des femelles afin d’utiliser l’ensemble des animaux produits et de vérifier qu’il n’y a pas de différence en fonction du sexe.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à une mise à jeun qui n’est en rien délétère pour l’animal. En effet, elle est réalisée sur une période très courte (6h) et pendant la phase de jour, période pendant laquelle les rats dorment principalement et mangent peu, ils ne seront donc que peu perturbés. Il n’y a donc pas de point limite concernant la mise à jeun. Par ailleurs, un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie/analgésie générale profonde. Ainsi, aucune douleur n’est attendue. Le prélèvement de sang ne commencera qu’après la perte totale des réflexes de retrait lors du pincement de la patte et des réflexes de fermeture palpébrale témoignant d’une anesthésie profonde. Les points limites seront donc déterminés en fonction des observations faites pendant l’anesthésie/analgésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l’animal). La procédure d’anesthésie sera arrêtée si ces points limites sont atteints. Par ailleurs, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien permettant de s’assurer de leur bien-être et de leur santé. Si les animaux présentent des signes de mal être ou de douleur (plaies, hérissement du poil, attitude voûtée, perte de poids, altération de la respiration, comportement anormal (perte de réactivité, animal prostré)), ils seront placés sous surveillance accrue et présentés au vétérinaire. Si un traitement est envisageable, il sera mis en place (antiseptiques, antibiotiques, analgésiques). A noter que le traitement utilisé devra être adapté au cas pas cas en fonction des symptômes rencontrés. Si aucun traitement n’est envisageable et que l’état de l’animal persiste ou se dégrade au cours de la journée, il sera mis à mort. Ainsi, l’atteinte de points limites concernant le bien-être et la santé des animaux sera déterminée sur la base des observations quotidiennes de nos animaux. Par ailleurs, tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par deux, le rat étant une espèce très sociable, et disposeront d’un bâton à ronger en guise d’enrichissement.
Choix des espèces
La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme que ne l’est la souris. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez le rat. L’étude sera réalisée chez des rats âgés de 3-5 mois, car c’est l’âge auquel ont été faites les analyses moléculaires sur les précédents modèles rat du SD. Le but étant de pouvoir comparer les résultats obtenus.
Rôle du récepteur nucléaire PPARy dans la fibrose médullaire et dans le soutien du tissu hématopoïétique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
536 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de cellules hématopoïétiques sous anesthésie et jusqu'à six prélèvements de sang, pour étudier le rôle du récepteur PPARγ dans la fibrose de la moelle osseuse au cours de la myélofibrose, un cancer du sang. Le porteur indique que la maladie peut réduire la prise de poids et augmenter la taille de la rate, et que les souris sont tuées en fin d'expérience pour l'examen des fémurs, seuls les reproducteurs de la lignée étant gardés vivants. Sur le remplacement, il affirme qu'il reste impossible de reproduire in vitro la complexité du microenvironnement médullaire et conclut que la validation passe par le modèle murin.
Objectifs
La production des cellules sanguines (hématopoïèse) est réalisée au niveau de la moelle osseuse et résulte d’une interaction fine entre les cellules progénitrices (qui peuvent se diviser et donner les cellules du sang) et les cellules stromales qui sont une composante du microenvironnement de la moelle osseuse. La myélofibrose (MF) est un cancer du sang rare caractérisé par une fibrose de ces cellules stromales entrainant une altération de la production des cellules sanguines. C’est une pathologie grave, avec une médiane de survie de 5 à 6 ans. Il a été rapporté que l’activation du récepteur nucléaire (PPARγ) par des molécules pharmacologiques entraîne une réduction de la fibrose dans des modèles murins de MF. Ces résultats en font une une cible thérapeutique intéressante dans une pathologie où les traitements agissent principalement sur les symptômes de la maladie. Dans l’objectif d’utiliser des médicaments ciblant PPARy dans le traitement de la MF, il est impératif de caractériser le rôle physiologique de PPARy dans le stroma de la moelle osseuse. Pour répondre à cette question, un stroma médullaire murin qui, par l’utilisation d’une technique de génie génétique, n’exprime pas PPARy a été développé. Il récapitule des caractéristiques de la fibrose médullaire avec notamment une altération des capacités à soutenir l’hématopoïèse. Les premiers résultats obtenus in vitro ne permettent pas l’étude du rôle de PPARy dans toutes les composantes de l’hématopoïèse. Pour cela nous prévoyons de développer des systèmes d’étude plus complexes faisant appel au modèle murin. Nous mettrons en place une co-culture de cellules progénitrices hématopoiétiques murines et humaines sur stroma normal (WT) ou invalidé (KO) qui sera transplanté dans des modèles murins pour l’étude de leur hématopoïèse. La même approche sera utilisée avec des cellules progénitrices provenant d’hémopathies afin d’étudier l’effet sur une hématopoïèse pathologique En parallèle de cette étude un modèle murin d’invalidation (KO) de PPARy spécifiquement dans les cellules du stroma de la moelle osseuse sera développé. Il permettra après traitement par une molécule stimulant la MF de déterminer si la sensibilité à la fibrose est corrélée à l’expression de PPARy dans les cellules du stroma de la moelle osseuse. Enfin, on étudiera dans ce modèle la manière dont se développent différents cancers du sang afin de déterminer si la fibrose médullaire impacte l’histoire naturelle de ces maladies.
Bénéfices attendus
La myélofibrose (MF) est la plus grave des néoplasies myéloprolifératives (NMP) (famille de cancer du sang comprenant également la polyglobulie de Vaquez (PV) et thrombocytémie essentielle (TE) avec une médiane de survie de cinq à six ans. Les traitements actuellement disponibles ciblent principalement les symptômes et n’ont que peu d’influence sur l’histoire naturelle de la maladie. Seule la greffe de moelle osseuse est curative mais elle ne concerne qu’une faible minorité de patients qui sont éligibles au traitement. Récemment, il a été démontré que l’activation du récepteur nucléaire PPARy par ses ligands pharmacologiques permettait de réduire le développement anormal de la densité osseuse (ostéosclérose) et de la fibrose médullaire dans trois modèles précliniques murins de la MF. Au cours de ce projet, nous souhaitons caractériser la fonction physiologique de PPARy au sein des cellules du microenvironement de la moelle osseuse (stroma médullaire) qui supportent la production des cellules sanguines et sont les cibles de la fibrose. Nous souhaitons ainsi démontrer que PPARy est un acteur clé de la prévention du développement de la fibrose médullaire, de l’ostéosclérose et de la capacité des cellules mésenchymateuses à soutenir l’hématopoïèse. L’ensemble de ces travaux a pour objectif de mieux caractériser en quoi PPARy peut être une cible thérapeutique ouvrant de nouvelles stratégies de prise en charge (en monothérapies ou associées au traitement conventionnels) des NMP et particulièrement de la myélofibrose. Ces résultats pourront également être étendus à d’autres organes dont les pathologies impliquent le développement d’une fibrose. Dans un contexte plus général ce travail permettra également de mieux comprendre et appréhender la part relative au stroma médullaire dans le développement des hémopathies et le potentiel intérêt d’un ciblage thérapeutique du stroma en plus de celui des cellules hématopoïétiques. Des molécules pharmacologiques ciblant PPARy étant déjà sur le marché, ce travail permettra également d’envisager leur repositionnement thérapeutique dans la prise en charge de la MF.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à : - Une irradiation : procédure indolore, réalisée en maintenant les groupes sociaux définis, et durant une dizaine de minutes. - Une unique injection pour chaque animal (animal sous anesthésie générale et analgésie) de cellules hématopoïétiques normales ou pathologiques. Cette intervention ne dure que quelques minutes et se déroule sous un contrôle permanent pour veiller à la bonne anesthésie, l’absence de douleur et gérer le réveil. - Des prélèvements de sang : pour le suivi de l’hématopoïèse, réalisés sur animaux vigiles sur une durée ≤ à une minute, avec un délai minimum de 3 semaines entre chaque prélèvement et un nombre maximum de 6 prélèvements - un traitement par injection impliquant un geste d’une durée inférieur ou égale à une minute sur une période maximale de 3 semaines.
Impact sur les animaux
L’irradiation, l’anesthésie, la transplantation de cellules hématopoïétiques, les injections sous-cutanées et les prélèvements de sang au niveau de la veine faciale peuvent engendrer du stress chez la souris. Le développement d’une hématopoïèse pathologique peut également engendrer des modifications des constantes hématologiques avec notamment une augmentation de plaquettes et/ou de l’hématocrite, qui peuvent à terme générer de la fibrose et une diminution de production des cellules sanguines, ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. Durant le développement des hémopathies PV, TE, MF la prise de poids des animaux est réduite.
Devenir
Les analyses de la fibrose de la moelle osseuse ce font par examen histopathologiques des fémurs ce qui nécessite l’euthanasie des animaux à la fin de chaque expérimentation. Seuls les animaux reproducteurs seront maintenus en vie. En effet, si le modèle murin d’invalidation de PPARy dans les cellules stromales médullaires apporte les résultats escomptés, il pourra être utilisé pour d’autres hémopathies ou pour des questions plus fondamentales d’étude de la communication entre le microenvironnement et les cellules hématopoïétiques. Il constituera donc un intérêt pour la communauté scientifique et pourra être pérennisé.
Remplacement
Au cours de ce projet, une grande partie des expériences seront menées in vitro, cependant en raison de la complexité et du nombre d’intervenants cellulaires et matriciels composant le micro-environnement médullaire et régulant l’hématopoïèse, il est actuellement impossible de mimer la physiologie médullaire par des modèles exclusivement in vitro. Nos modèles in vitro seront donc utilisés autant que faire se peut afin de mettre au point les protocoles et de générer les résultats préliminaires, mais ils nécessitent néanmoins d’être validés dans des modèles in vivo murins dans un second temps. D’autre part, ce projet a pour objectif de caractériser la pertinence du ciblage thérapeutique de PPARy dans la myélofibrose. Il est donc important de valider sa fonction dans des modèles murins précliniques, validés et reconnus, de cette pathologie.
Réduction
Dans l’ensemble des expérimentations associées à cette demande les animaux sont hébergés en groupe (n=5 individus par cage). Nos expériences précédentes nous ont montré que pour une condition expérimentale en analyse non-paramétrique un minimum de deux boites (dix individus) était nécessaire. Le nombre d’expérimentations indépendantes pour chaque condition est réduite à 2 (pour vérifier la reproductibilité entre expérience). Lorsque cela était possible, nous avons choisi de réaliser des greffes compétitives. Cette stratégie présente deux avantages, 1) elle augmente la sensibilité en permettant de comparer les conditions au sein d’un même individu ce qui réduit dans les analyses de groupe la variation inter-individu et permet de réduire les effectifs, 2) chaque individu étant son propre contrôle cela permet de supprimer le groupe contrôle et de limiter encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les souris seront hébergées en groupe, avec des éléments d’enrichissement. Elles seront surveillées régulièrement pour limiter tout mal-être éventuel en accord avec les critères d’évaluation de l’état général des animaux. Certains critères biologiques spécifiques comme le taux l’hémoglobine seront également monitorés et pris en compte comme point limite. Les interventions de transplantation seront pratiquées sous anesthésie générale et analgésie en limitant la durée de l’anesthésie et en assurant un maintien de la température corporelle grâce à un tapis chauffant et de l’hydratation des yeux grâce à un gel oculaire. Les animaux sont traités par antibiotiques durant les 3 semaines post-transplantation pour limiter le risque d’infection. Les prélèvements de sang seront faits par voie sub-mandibulaire afin d’être le moins douloureux possible et seront espacés d’au moins 3 semaines.
Choix des espèces
Le modèle rongeur nous semble le plus adapté car c’est historiquement un modèle de prédilection pour l’étude de l’hématopoïèse. C’est un modèle bien établi, validé par la communauté scientifique, et qui fait l’objet de nombreuses publications scientifiques. Les modèles précliniques des différentes hémopathies étudiées, la leucémie myéloïde chronique (LMC), la thrombocytémie essentielle (TE), la polyglobulie de Vaquez (PV) et la myélofibrose (MF) sont établis dans le modèle rongeur. Travailler sur la même souche murine apporte une pertinence à la comparaison entre nos données. Que cela soit pour obtenir une meilleure prise de greffe, ou pour avoir la possibilité de suivre le développement de la pathologie au cours du temps, nous devons utiliser des animaux jeunes (8 semaines).
Mise en place d’expériences de perception de signaux acoustiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, réutilisées à l'issue pour d'autres mises au point, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un marquage par perçage des oreilles au sevrage, puis des isolements de deux à vingt-quatre heures et jusqu'à trois tests de réaction à des cris ultrasonores de congénères. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu et que les animaux n'auront pas subi de "stress significatif". Le protocole prépare des études ultérieures sur des souris modèles de déficiences intellectuelles et d'autisme.
Objectifs
Les souris communiquent entre elles en utilisant principalement l’odorat, mais aussi le toucher, la vue et l’ouïe. En effet, les souriceaux isolés de la mère et du nid ainsi que les juvéniles ou adultes au cours des interactions sociales émettent des cris dans le domaine de l’ultrason, non perceptibles par l’Homme. Des études ont montré que ces cris de petits non sevrés déclenchaient de manière robuste le comportement de recherche de la mère et que les cris ultrasonores du juvénile ou de l’adulte pouvaient refléter la motivation pour l’interaction sociale. Les fonctions plus précises de ces signaux sont cependant encore peu détaillées. Dans ce projet, nous mettrons en place un protocole expérimental qui nous permettra d’évaluer les réactions comportementales des souris à la perception de cris ultrasonores de leurs congénères. Nous établirons donc un protocole permettant de tester la réaction de la mère lorsqu’elle perçoit les cris de ses souriceaux et un protocole permettant de tester la réaction des juvéniles et des adultes lorsqu’ils sont soumis à des enregistrements de cris ultrasonores de congénères.
Bénéfices attendus
La mise en place de ce protocole nous permettra de tester ultérieurement la perception des cris ultrasonores ainsi que d’identifier les régions du cerveau impliquées dans le traitement de ces signaux chez des souris modèles de déficiences intellectuelles et de troubles du spectre autistique.
Procédures
Les animaux subissent une identification par perçage des oreilles au moment du sevrage. Ce geste ponctuel réalisé en contention légère sur animal vigile ne dure que quelques secondes. Les souris juvéniles et adultes seront soumises à un isolement de 2h ou de 24h, respectivement. Ces durées sont maintenues au minimum pour augmenter leur motivation pour faire le test. Ces isolements ne seront pas répétés plus de trois fois chez chaque animal car ils s'habituent très rapidement aux manipulations de playback. Les animaux subissent aussi ensuite un test comportementa de playback (réaction à l'écoute de vocalisations ultrasonores) au maximum trois fois par animal; ce test dure au maximum 10 min.
Impact sur les animaux
Les souris juvéniles et adultes seront soumises à un isolement de 2h ou de 24h, respectivement. Ces durées sont maintenues au minimum pour augmenter leur motivation pour faire le test. Aucun effet indésirable lors du test n’est attendu. Aucun phénotype dommageable n’a été rapporté chez les lignées utilisées. Uniquement une partie des souris subira une légère douleur très ponctuelle lors du marquage à l’oreille au moment du sevrage. Les animaux seront soumis à un stress léger lors des tests comportementaux (isolement ponctuel et exploration d’un nouvel environnement).
Devenir
Les animaux utilisés seront donc conservés pour une réutilisation dans les mises au point de tests comportementaux non invasifs. Ils n’auront pas subi de stress significatif.
Remplacement
Pour évaluer la perception de signaux de communication, il est nécessaire d’étudier un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire, et en particulier de la souris dans ce cas. En effet, cette espèce sera ensuite étudiée dans le cadre de modèle de maladies neuropsychiatriques d’origine génétique. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser ces pathologies humaines.
Réduction
Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes. Les échantillons proposés permettront de vérifier si le test de mise au point donne les résultats attendus.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables. Les temps d’isolement seront limités au minimum. Dans la procédure impliquant les mères allaitantes, le contact avec les petits sera maximisé, les séparations mère-souriceaux minimisées. Les animaux sont manipulés au moyen d'un tube pour réduire tout stress au minimum. Dans la procédure impliquant des juvéniles, les animaux rejoignent leur groupes sociaux dès la fin du test. Les animaux seront inspectés visuellement pour vérifier leur bon état corporel et leur vivacité; l'animal sera sorti de la procédure si besoin.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. Comme le laboratoire utilise ces modèles, nous mettons au point les tests comportementaux pour les explorer. Les souris seront testées une fois au stade juvénile (22-35 jours) et au stade jeune adulte (8-12 semaines). Nous avons choisi ces âges car ils correspondent à des périodes critiques pour le test réalisé, suivant les publications existantes.
Mise au point de souris humanisées par du microbiote- EU2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée s'étale du "sans réveil" au sévère, alors que le porteur qualifie l'ensemble des actes de "sévérité légère". Des reproductrices axéniques reçoivent un gavage de microbiote de patients obèses, puis les animaux passent une imagerie sous anesthésie sans réveil, un isolement de vingt-quatre heures sans enrichissement et des injections irritantes. Les reproducteurs devenus trop vieux et les descendants au mauvais microbiote sont tués par dislocation cervicale, les autres après imagerie ou tests comportementaux pour analyse du cerveau. Le modèle est présenté comme "unique" pour relier microbiote et déclin cognitif.
Objectifs
Créer des colonnies de souris "humanisées" avec du microbiote issus de patients obèses avec des fonctions cognitives faibles ou fortes afin de démontrer la causalité et d'identifier pour isoler les bactéries d'intérêt. Etudier le rôle du microbiote sur les performances cognitives et émotionnelles des souris et ainsi développer des nouvelles stratégies thérapeutiques visant à ralentir le déclin neurocognitif associé à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir un modèle unique et original de souris humanisées et stables, colonisées avec le microbiote de patients présentant un score faible ou élevé de fonction cognitive, qui peut être étudié sur plusieurs générations (F1, F2, F3) sans transplantation fécale sur les descendants. Ce modèle de souris axénique humanisé peut être utilisé pour identifier le rôle du microbiote dans la variation des fonctions physiologiques et physiopathologiques, et nous permettront l'étude de l'apparition des composantes cognitives similaires à l'être humain.
Procédures
Pour la procédure expérimentales 1, les souris reproductrices de deux lignées de souris axéniques, C57Bl/6J et Tg2576, recevront un gavage unique d'une solution de 200 ul. Pour la procédure 2, les souris seront, par une unique séance, mises dans l’imagerie non invasive qui est faite sous anesthésie pendant 2 heures. Pour la procédure 3, les souris doivent être isolées, sans aucun enrichissement pendant 24 heures. Dans la procédure 4, marquage des cellules progénitrices par injection intrapéritonéale peut être irritante.
Impact sur les animaux
Notre projet comporte des actes expérimentaux de sévérité légère. En effet la procédure1 consiste en 1/ un gavage unique avec du microbiote de patients obèses qui va coloniser le tube digestif des animaux, qui seront vigiles durant cet acte. Le geste est rapide, sans douleur, générant un stress léger du à la contention, 2/la collecte de fèces pour vérifier la colonisation de leur tubes digestifs, elle est sans douleur. La colonisation du tube digestif par un microbiote humain n’a pas à priori d’impact sur la santé des animaux dans la durée. Pour la procédure 2, des mesures de tissus adipeux seront fait par une technique d’imagerie non invasive (l’IRM) pour lesquels les animaux seront anesthésiés pour les immobiliser, ils ne seront pas réveillés avant leur mise à mort, évitant ainsi toute souffrance/stress. Pour la procédure 3, l'isolement durant 24h pour le phénotypage métabolique en temps réel. Le manque d'un enrichissement au quel les souris sont habituées (sopalin, donc elles ne peuvent pas faire un nid) et il n' y a pas de litière au fond des cages non plus, ce qui peut stresser la souris. Dans la procédure 4, marquage des cellules progénitrices par injection intrapéritonéale peut être irritante.
Devenir
Les reproducteurs devenus trop vieux (à l'âge de 6-8 mois), ainsi que les animaux de la descendance ne présentant pas le microbiote approprié seront mis à mort par dislocation cervicale. Il en va de même pour tout animal qui présenterait le moindre signe de souffrance. Les souris utilisées, pour la procédure 2, seront également euthanasiées à la fin de la séance d’IRM afin de prélever des tissus adipeux qui seront utilisés pour des analyses ex vivo (résonance magnétique nucléaire et lipidomique). Après tous les tests de comportement, les souris seront euthanasiées afin d'étudier l'anatomie du cerveau. Les associations entre les résultats anatomie des tissus et les fonctions cognitives ainsi que les états émotionnels seront évaluées pour comprendre comment l'anatomie du cerveau détermine leur fonction.
Remplacement
Notre étude vise à évaluer les effets de la transplantation de microbiote fécal humain sur les performances cognitives et émotionnelles de souris. Cela ne peut être fait que sur un modèle animal. Comme les animaux présentent un microbiote local, notre étude nécessite un modèle animal dans lequel ce microbiote résident est supprimé (c’est-à-dire, des souris axéniques). Celles-ci offrent la garantie de pouvoir étudier spécifiquement l’impact comportemental du microbiote transplanté. De tels modèles axéniques sont actuellement disponibles dans les espèces de souris. Nous proposons une approche unique et originale pour transplanter le microbiote fécal de patients obèses dans ce modèle de souris axéniques. Dans les études que nous réaliserons au laboratoire, nous serons amenés à tester ces souris axéniques transplantées et leur descendance pour lequel il a été montré une stabilisation du microbiote.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est réduit pour atteindre une valeur minimale sans nuire à la qualité statistique des données. En outre, les souris seront réutilisées pour plusieurs expériences. Par exemple, après l'isolement dans les cages métaboliques, les souris seront mis à mort et prélever les tissus adipeux et le foie pour le profilage du microbiote tissulaire, afin d'obtenir un maximum de données en utilisant un nombre minimum d'animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans une structure et des conditions parfaitement adaptées (élevage en isolateur, litière changée régulièrement, eau et nourriture à volonté, température et hygrométrie régulée,...) avec une surveillance quotidienne, week-end et jours fériés inclus. Les animaux bénéficient également d’un enrichissement de leur milieux (type feuille de cellulose, permettant une diminution du stress potentiel et la réalisation de petits nids par les animaux). Enfin, la souffrance éventuelle des animaux sera minimisée autant que possible et nous interviendrons immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance.tout animal présentant un aspect inhabituel : prostration, pelage terne et hirsute, traces de blessures infligées par les autres animaux sera isolé. Il fera l'objet d'une attention accrue et benéficiera de soins appropriés (désinfection des plaies ou accès facilté à la nourriture si nécessaire).Si aucune amélioration de son état n'est constaté, il sera mis à mort le plus rapidement possible pour eviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Afin d'étudier l'effet du microbiote, un modèle axénique sera nécessaire pour éviter les effets de la flore locale de l'animal hôte. Les espèces de souris axéniques sont actuellement disponibles. En plus, les modèles de souris sont des modèles bien adaptés à la recherche en neurosciences comportementales, car ils présentent une variété de comportements pertinents pour les maladies humaines. - Pour les souris de production, afin de générer la ligne de la souris, les animaux seront utilisés à l'âge adulte (2-8 mois) car il faut qu'ils aient atteints la maturité sexuelle pour permettre la reproduction. - Pour les souris en experimentation des souris adultes (6-18 mois) seront utilisées pour caractériser les phénotypes des souris dans ce projet et étudier leur évolution au cours du vieillissement.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies d’origine auto-immune et diabétique chez le rongeur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 365
2 043 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Une partie subit une chirurgie d'induction de neuropathie, une électrophysiologie du nerf sciatique sous anesthésie et des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, avec trois tests comportementaux répétés, pour évaluer des candidats médicaments contre des neuropathies auto-immunes et diabétiques. Le porteur décrit des douleurs neuropathiques, une baisse sévère de la mobilité au pic de la maladie et les effets du diabète induit, obésité, hyperglycémie et retard de cicatrisation. Parmi les bénéfices avancés figurent une banque de tissus, des publications et une mise sur le marché "prévue d'ici 2035".
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé au niveau des pattes arrière permettant à la fois leur motricité mais aussi de ressentir des sensations perçues à leur niveau (toucher, douleur, température…). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une enveloppe autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP ont pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. Contrairement à la perte axonale, la démyélinisation est un phénomène réversible. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire) ou bien acquises, comme la neuropathie (maladie des nerfs) diabétique (causée par le diabète) et la neuropathie d’origine auto-immune lors de laquelle le système immunitaire s’attaque à la myéline. Dans ce projet nous nous intéresserons aux neuropathies périphériques acquises qui touchent 4% de la population mondiale et pour lesquelles les traitements actuels ne ciblent pas spécifiquement la démyélinisation pathologique dans ces maladies. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de plusieurs traitements agissant directement sur la démyélinisation pathologique dans les modèles rongeurs transgéniques de ces maladies. Ils seront donc complémentaires de ceux déjà employés en clinique. Les résultats seront publiés auprès de la communauté scientifique.
Bénéfices attendus
Avantages à court-terme : - Démontrer l’efficacité de notre stratégie thérapeutique. - Sélectionner les produits efficaces pour un futur passage en clinique. - Créer une banque de tissus. - Publier des résultats. Avantages à long terme : -Thérapies complémentaires de celles sur le marché pour les patients. -Une autorisation de mise sur le marché prévue d’ici 2035.
Procédures
- La chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 30 minutes. - L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. - Les trois tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum. - Le modèle de rat Guillain Barré sera induit par une réaction immunitaire. -Les prélèvements de sang via le sinus rétro-orbital et celui du liquide dans lequel baigne le cerveau (liquide céphalo-rachidien) seront effectués au maximum sur 914 animaux, une fois par animal et sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nuisances -Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. -Douleurs post-opératoires (4 jours) -Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (durée 5 semaines) entre-coupée d’une diminution sévère de la mobilité lors du pic de la pathologie (durée de 5 jours entre le 15ème et 19ème jour) puis réversibilité progressive des symptômes. -Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) -Nuisances associées au diabète : obésité, hyperglycémie, myocardie et retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédures car des prélèvements terminaux sont nécessaires à l'étude des effets des traitements.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent rend difficile la modélisation in silico et la reproduction in vitro du système. Des méthodes existent pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il est clair que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénérescence et régénérescence du nerf périphérique ne sont pas reproduits in vitro. L'expérimentation animale reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
Un calcul de taille d’échantillon a été réalisé, basé sur la variabilité attendue, la différence biologiquement significative à mettre en évidence avec une puissance suffisante et un risque alpha déterminé. Ces calculs ont été réalisés sur les données d’électrophysiologie et de comportement moteur afin de connaitre le nombre minimum d’animaux à avoir par lot pour chaque test. Dans tous les modèles sauf ceux des souris développant une démyélinisation d’origine auto-immune, les deux sexes seront utilisés car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Pour les modèles de souris de neuropathies d’origine auto-immune uniquement les femelles seront utilisées car 100% présenteront la pathologie, contre 16 à 30% des mâles. Une autre manière de réduire le nombre d’animaux nécessaire sera de les commander chez les fournisseurs ou de les générer par FIV (fécondation in vitro).
Raffinement
- Les rongeurs auront une période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie lors de laquelle une habituation aux expérimentateurs sera effectuée ; - Pour éviter les douleurs neuropathiques, nous utiliserons de la litière de cellulose. Cette litière présente également l’avantage d’avoir une bonne capacité d’absorption et sera donc particulièrement adaptée à la polyurie des souris diabétiques. De plus, le personnel formé et compétent augmentera la fréquence du change des cages et des biberons en fonction de l’évolution du diabète. - Des fiches individuelles de suivi pré- et post-opératoire seront utilisées ; - Deux fois par semaine, l’évaluation de l’état clinique des animaux sera faite, avec des scores corrélés à l’intensité de la souffrance, à l’aide de plusieurs fiches dont chacune est adaptée aux besoins spécifiques des lignées et au suivi post-opératoire. Selon la souffrance évaluée, il y aura une discussion avec le vétérinaire pour décider des soins à apporter ou de la nécessité d’une euthanasie. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, par exemple, en cas de déshydratation, apport d’eau gélifiée ou injections sous-cutanées d’une solution isotonique d’électrolytes. En cas de perte de poids ou d’état affaibli, mise à disposition de nourriture humide et d’eau gélifiée sur le sol de la cage. -Nous sédaterons les rats avant leur euthanasie par dislocation cervicale ; -Une fois par semaine (modèles de souris de neuropathie auto-immune) ou une fois par jour (rat SGB) nous évaluerons l’évolution de la paralysie par une fiche de scoring. -Pour éviter la perte d’identification des animaux et le stress de contention : les animaux seront marqués de manière permanente soit par des poinçons d’oreille, soit par des micro-puces sous-cutanées, soit à la queue par un stylo marqueur non toxique.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez des souris C57Bl6 sauvages ou db/db et sur des rats, ceci nécessitant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Rat/souris : juvéniles et adultes Les animaux seront reçus entre 3 et 6 semaines d’âge. Une partie d’entre eux commenceront à être traités entre 4 et 8 semaines d’âge (procédure 1, 2, 3, 4 et 5). L’autre partie des animaux sera traitée à partir de 20 à 30 semaines d’âge (une partie de la procédure 4). Il s’agit de souris modèles de neuropathie périphérique d’origine auto-immune chez qui les symptômes moteurs s’expriment tardivement. Ces femelles seront générées par FIV, aucun mâle ne sera commandé pour ces modèles.
Evaluation de la biodisponibilité de sources d’astaxanthine d’origine naturelle par cinétique plasmatique chez la truite arc en ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
48 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson reçoit sous anesthésie un transpondeur dans le muscle du dos, puis une gélule d'astaxanthine et six prélèvements sanguins sur sept jours, avant d'être tué pour prélèvement du tissu intestinal. Le porteur reconnaît des régurgitations, des dommages à l'œsophage et aux branchies et des saignements à la queue. L'objectif est commercial, comparer une source naturelle d'astaxanthine à la version de synthèse pour la pigmentation des filets d'élevage, la couleur étant présentée comme un critère de qualité pour le consommateur.
Objectifs
L’astaxanthine est un caroténoïde qui joue un rôle prédominant dans la pigmentation des espèces aquacoles comme les salmonidés. Cependant, comme les poissons ne peuvent pas en produire il doit être apporté dans la ration alimentaire. Ainsi, en élevage aquacole, l’astaxanthine constitue un ingrédient essentiel de la composition des aliments car il est indispensable pour la santé des poissons et permet également de satisfaire les préférences des consommateurs pour des filets de salmonidés bien colorés, la couleur du filet étant un critère de qualité important. Enfin, la demande sociétale de produits animaux élevés avec des aliments exempts de produits synthétiques étant croissante, il est nécessaire d’identifier des sources d’astaxanthine d’origine naturelle. Actuellement, la source d'astaxanthine la plus commune utilisée en alimentation des poissons pour pigmenter les filets est l’astaxanthine chimiquement synthétisée à partir du carotène. Un nombre limité de produits d'astaxanthine d'origine naturelle sont disponibles commercialement pour une utilisation en aquaculture. Cependant, ils présentent des performances de pigmentation sous-optimales, des capacités d'application limitées et des coûts de production très élevés. Aussi, quel que soit la source d’astaxanthine utilisée et rajoutée dans l’aliment, elle doit être biodisponible, présenter une efficacité de pigmentation optimale pour les espèces aquacoles cibles et être commercialement accessible à tous. Ce projet a pour but d’évaluer des nouveaux produits d’astaxanthine issus d’une source naturelle : une algue non génétiquement modifiée cultivée dans des bioréacteurs. Pour évaluer la biodisponibilité de la source alternative d’astaxanthine extraite de trois différentes façons, sa concentration sera déterminée dans le plasma sanguin lors d’un essai court permettant de déterminer l'efficacité d''absorption de l'astaxanthine qui une fois dans le sang sera transporté par les lipoprotéines pour être ensuite déposer dans le muscle. Si les résultats obtenus (efficacité d'absorption dans le sang) sont comparables à ceux de l’astaxanthine de synthèse, un deuxième projet portera sur la pigmentation effective de la chair de poisson par évaluation de la déposition de l'astaxanthine dans le muscle après conditionnement alimentaire nécessitant un temps d’élevage plus long et un nombre d’animaux plus important qui mimera les conditions d’élevage.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront à court terme de déterminer si la source naturelle d’astaxanthine testée est aussi biodisponible chez les salmonidés que la source synthétique d’astaxanthine actuellement sur le marché et de déterminer quel est le processus d'extraction le plus adapté afin d'obtenir une molécule d'astaxanthine aussi biodisponible que l'astaxanthine de synthèse. Si la biodisponibilité est comparable, il sera nécessaire au cours d’un autre projet d’évaluer chez le poisson en croissance, ayant reçu dans sa ration alimentaire le caroténoïde d’intérêt, la pigmentation de la chair, produit final pour les consommateurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 7 jours. Chaque poisson anesthesié sera identifé au début de la procédure par un transpondeur placé dans le muscle du dos. Tous les poissons seront soumis à un prélèvement sanguin 0, 24 , 48 , 72, 96 et 168 heures après administration orale d'une gélule contenant la dose d'astaxanthine à évaluer. A chaque temps, un volume sanguin nécessaire et suffisant sera prélevé sur chaque poisson anesthésié pour l'analyse de la concentration plasmatique en astaxanthine. Pour chaque prise de sang, le temps ne dépassera pas 1 minute.
Impact sur les animaux
Régurgitation après gavage, dommages au niveau de l'œsophage et des branchies, dommages au niveau de la queue (saignement mineur au site de prélèvement sanguin, ecchymose à l'extrémité, circulation périphérique restreinte dans la nageoire caudale).
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort après le dernier prélèvement sanguin pour échantillonnées du tissu intestinal, les animaux de plus de 1000g ne peuvent plus être utilisés.
Remplacement
La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico capable de mettre en évidence la biodisponibilité des caroténoïdes spécifiquement destinés aux poissons. L’efficacité des caroténoïdes ne peut être évaluée qu’en utilisant l’animal auquel il est destiné. L'évaluation de la concentration plasmatique constitue la première étape d'évaluation de l'efficacité d'absorption des nouvelles molécules d'astaxanthine.
Réduction
Sur la base de résultats antérieures sur la concentration plasmatique d’astaxanthine chez la truite arc en ciel, une analyse statistique a montré que le nombre minimal d’animaux (l’animal étant considéré comme l’unité expérimentale) nécessaire est de 12 animaux pour chaque produit testé (4) afin de détecter une différence de 1,0 ug/ml d'astaxanthine plasmatique entre les produits testés et le produit commerciale.
Raffinement
Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours de l' étude, les truites arc en ciel sont sédatées puis anesthésiées. Utilisation d'un analgésique afin de réduire la douleur après le marquage. Pour l'administration de la gelule, une pipette graduée de laboratoire en plastique sera introduite superficiellement dans l'oesophage. La capture et le stress dus à la sortie des bassins pour la pesée par groupe des animaux et pour le marquage au-dessus de la ligne media et les prises de sang (approche ventrale) sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’un mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Les prises de sang seront faites en alternance d’un côté et de l’autre de la veine caudale avec application d'un pansement hydrorésistant antiseptique et antifongique pour faciliter la cicatrisation. L’analgésique n’est pas utilisé pour réduire la douleur lors des prises de sang car cela implique une injection supplémentaire ( double traumatisme). Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux (température…) ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les produits d’astaxanthine évalués chez la truite arc en ciel sont destinés à être incorporés dans les aliments comme pigment pour les salmonidés. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car elle est taxonomiquement proche du saumon et les résultats pourront être transposés chez le saumon. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, aux maladies, avec un taux de croissance plus élevée. Truites adultes pesant entre 1 200 et 1 300 grammes. Cette taille est nécessaire pour pouvoir effectuer des prélèvements sanguins répétées et rapprochés (approche ventrale) avec une période de récupération minimale de 1 jour.
Impact des milieux portuaires pollués sur la santé des poissons juvéniles
- Protection de l’environnement
3 600 poissons juvéniles, sars et saupes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont maintenus en cage un mois dans des zones portuaires, une partie déplacée d'un milieu peu pollué vers un milieu pollué, avant des prélèvements post-mortem d'otolithes, de foie, de muscle et de branchies. Le porteur reconnaît que l'encagement et l'exposition chimique peuvent induire un stress additionnel, qu'il estime non létal. L'objectif déclaré est de mieux cadrer les opérations de restauration écologique des ports.
Objectifs
L’urbanisation des zones côtières a entrainé des changements extrêmes et irréversibles sur les écosystèmes marins. La destruction des habitats naturels subtidaux est considérée comme une des plus grandes menaces pour la diversité des populations et des écosystèmes marins. C’est pourquoi de plus en plus d’opérations de restauration écologique visant à limiter l’impact des infrastructures «grises» sur les écosystèmes marins voient le jours dans les zones marines urbaines. A ce jour, les projets de restauration menés dans les ports visent à accroitre la complexité tridimensionnelle des ouvrages pour en augmenter la qualité en tant que nourriceries pour les juvéniles de poissons, contribuant ainsi au maintien des populations tout en assurant leurs fonctions. Si ces opérations montrent effectivement une recolonisation des ports par des juvéniles, elles ne prennent généralement pas en compte l’influence des processus denso-indépendants, comme la qualité du milieu environnant. Or, les activités anthropiques font des ports le réceptacle de contaminations microbiologiques et chimiques pouvant impacter les sédiments et la colonne d’eau et affectant négativement la physiologie, la santé, le comportement et la survie des organismes marins, en particulier des jeunes stades de poissons. Afin d’estimer si des opérations de restauration de nourriceries en zones marines urbaines peuvent atteindre leurs objectifs de maintien de la biomasse et de connectivité des populations, il est donc nécessaire d’évaluer au préalable l’impact de ce milieu particulier sur les juvéniles de poissons. L’objectif du projet est de qualifier l’état physiologique des poissons marins côtiers en zones marines urbaines restaurées par comparaison à des zones non urbaines, et de tester l’existence d’une acclimatation et/ou d’une adaptation à la pollution de la population générée par une phase juvénile en zone marine urbaine, au travers de la question : une exposition juvénile à des niveaux de pollution contrastés dans les nourriceries se traduit-elle par une réponse physiologique et écotoxicologique différente des individus?
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’effet d’un séjour en nourriceries dans des zones fortements polluées, et permettra de mieux contrôler les conditions de succès des opérations de restauration écologique dans ces milieux.
Procédures
Pas d'interventions et de gestes techniques sur les poissons autres que l'encagement pour une durée d'un mois. Tous les prélèvements seront effectués post-mortem. Les tissus prélevés sont les otolithes, le foie, le muscle, la nageoire caudale et les branchies.
Impact sur les animaux
L’encagement pourrait être une source de stress pour les animaux. Les sars et saupes encagés pourront continuer à exprimer leurs comportements sociaux et alimentaires mais dans un rayon d’action limité par rapport au milieu naturel. Deux populations sur les trois utilisées lors de l’encagement dans les deux zones portuaires (soit au total 80 individus sur 120 par zone portuaire) seront introduites dans un milieu pollué alors qu’elles provenaient d’un milieu moins pollué. Cela pourrait induire un stress additionnel (chimique) sur ces individus, mais ce stress ne devrait pas être létal.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Il est impossible de substituer l’utilisation des animaux pour ce projet, car il a pour but d’étudier l’impact d’un milieu environnant sur la physiologie du poisson.
Réduction
En physiologie/écotoxicologie, étant donné la forte variabilité inter-individuelle attendue dans l’analyse des biomarqueurs, 25 (+ 5) individus correspond au nombre minimum d’animaux nécessaire. Ce nombre est comparable à ce qui est fait en routine dans le cadre des programmes de biomonitoring actif.
Raffinement
Lors de l’encagement, une surveillance accrue sera effectuée (1 plongée par jour) afin d'observer le comportement et le bien-être des poissons. Afin d’enrichir les cages par la colonisation d’algues épiphytes sur les grilles, celles-ci seront immergées 8 semaines avant l’hébergement des poissons. Outre le fait d’offrir un habitat le plus proche possible du milieu naturel, cet enrichissement naturel apportera une source additionnelle de nourriture pour les juvéniles de poissons. De plus, des roches seront ajoutées dans chaque cage afin de reproduire l’habitat naturel.
Choix des espèces
Le sar et la saupe sont des espèces côtières dont la phase juvénile se déroule dans des nourriceries. Les opérations de restauration écologique avec immersion de structures tridimentionnelles dans les ports ont montrés que les juvéniles de ces deux espèces étaient abondantes sur ces sites restorés. De plus, certaines ressources génétiques existent déjà pour ces espèces, ce qui facilitera l’analyse des résultats génétiques obtenus dans ce projet. Les espèces du genre Diplodus sp. et Sarpa salpa sont numériquement bien représentées dans le milieu naturel et l’échantillonnage réalisé ne mettra pas en péril la ressource.
Influence de variétés de colza et de procédés de fabrication de tourteaux sur le stress oxydant de vaches laitières multipares en péripartum et de leurs veaux
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
92 bovins, vaches et veaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les vaches replacées dans l'élevage et les veaux vendus pour la croissance selon la pratique commerciale. L'essai teste des variétés de colza et des procédés de fabrication de tourteaux censés réduire le "stress oxydant" autour de la mise bas, avec sept prises de sang sur les vaches et cinq sur les veaux. Le porteur affirme qu'aucun impact négatif de l'alimentation n'est attendu et que la traite reste conforme à la pratique standard. La finalité affichée est de fournir à la filière laitière un tourteau valorisable et un lait enrichi en antioxydants, un objectif commercial autant que sanitaire.
Objectifs
Nous étudions les effets de régimes à base de colza sur le concept d'une seule Santé pour l'animal et pour l'homme. Certaines variétés de colza apporteraient des composés spécifiques permettant de diminuer le stress oxydant des vaches ingérant des tourteaux de ces colzas. Le stress oxydant de souris modèle de l'homme et de veaux ingérant le lait de ces vaches pourrait également être diminué. Cette demande d'autorisation à expérimenter porte spécifiquement sur un essai sur vaches autour de la période de mise bas et sur des veaux recevant le colostrum et le lait de ces vaches. La période autour de la mise bas pour la vache et de la naissance pour son veau sont des périodes où le stress oxydant est important. Les vaches (4 groupes) recevront donc avant la mise bas et en début de lactation 4 régimes alimentaires. Deux régimes contiennent ces variétés de colza spécifiques et un régime n'en contient pas. Un quatrième régime permettra de tester sur une des 2 variétés de colza si le processus de fabrication du tourteau a dégradé l'apport de ces composés spécifiques par une intensité de chauffage du tourteau trop importante à la fabrication. Le lait des mères sera distribué aux 4 groupes de veaux pendant 5 semaines à partir de la naissance.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier l’effectivité de variétés de colza et de traitements technologiques protecteurs lors de la fabrication de tourteaux pour préserver la vache et son veau du stress oxydant autour de la mise bas. Il pourrait donc fournir des pistes pour la filière bovine laitière pour développer des tourteaux de colza qui seraient bénéfiques à la santé des vaches et des veaux, avec le potentiel de réduire l’usage des traitements médicamenteux en élevage. Ces tourteaux pourraient apporter un atout nutritionnel supplémentaire au lait de consommation, enrichi ainsi en antioxydants. D’un point de vue des connaissances scientifiques, il permettra d'étudier si les molécules d'intérêt contenues dans ces colzas sont métabolisées et présentes dans le sang des vaches alimentées avec ce type de régime, puis dans leur colostrum et le lait, et enfin, s’ils sont transmis au veau in utero puis lorsqu’ils sont nourris avec le colostrum puis le lait. L’objectif est de déterminer le statut oxydant des vaches et de leurs veaux et les relations avec leur statut immunitaire.
Procédures
Des prises de sang, réalisées sur vaches (7 prélèvements répartis sur 9 semaines) et veaux (5 prélèvements répartis sur 5 semaines), permettront un suivi précis des hormones et métabolites d’intérêt. Ces prises de sang dureront chacune au maximum 5 min.
Impact sur les animaux
Dans cet essai, les apports alimentaires sont conformes aux recommandations préconisées en alimentation pour l’élevage de vaches en fin de gestation et début de lactation ainsi que pour celui des veaux dans les 5 premières semaines de vie. Il ne devrait donc y avoir aucun impact négatif de l’alimentation sur la santé ou le bien-être des animaux. La traite est pratiquée selon la pratique standard en élevage et n’engendre pas de contrainte aux vaches. Les prises de sang, réalisées sur vaches et veaux, peuvent générer un léger stress pour les animaux, mais leurs réalisations rapides (au plus 5 min), par le personnel formé de l’établissement utilisateur, permettront de limiter ce stress.
Devenir
Les 2 procédures expérimentales, l'une sur vaches, l'autre sur veaux, sont légères. Les vaches seront replacées dans l'établissement utilisateur après l'essai, les veaux seront vendus pour continuer leur croissance selon la pratique commerciale standard.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative in vitro pour tester l’effet des composés bioactifs présents dans la ration pour réduire à la fois le stress oxydant qui survient chez la vache laitière au moment de la mise bas et celui de son veau recevant son colostrum (première sécrétion lactée, riche en immunoglobulines) puis son lait.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de vaches et de veaux à utiliser dans ces 2 procédures en nous référant à des essais similaires publiés sur l’effet d’autres types de composés (comme les vitamines) sur le stress oxydant des vaches à la mise bas et sur celui des veaux à la naissance et dans les premières semaines de vie. Le nombre de vaches (52) a été raisonné pour avoir 4 lots de 12 vaches en début d’essai (48 vaches) qui recevront 4 traitements alimentaires. De plus, 4 vaches nourrices recevant chacune un des 4 régimes alimentaires fourniront du lait en début de lactation aux premiers veaux à naitre. Le nombre de veaux retenu pour réaliser l’essai est de 40 veaux mâles (4 lots de 10 veaux qui recevront 4 traitements alimentaires). Dans les 2 essais, le schéma expérimental sera continu. Les analyses statistiques pratiquées seront des analyses de variance.
Raffinement
Hormis les prises de sang, le protocole ne modifie pas les conditions d’élevage des vaches et des veaux nouveaux nés. En effet, les apports énergétiques et protéiques des rations seront ajustés dans la gamme des apports recommandés pour les vaches et leurs veaux, visant à ne pas engendrer de perturbation par rapport à une conduite d’élevage classique non expérimentale. La traite des vaches est pratiquée selon la pratique standard en élevage et n’engendre pas de contrainte aux vaches. Pour réaliser les prises de sang, les vaches seront placées devant leur auge et bloquées au cornadis comme au moment de l'alimentation. Elles ne subiront donc aucun stress lié à ce blocage car elles y sont habituées (pratique quotidienne). La durée maximale pour le prélèvement de sang est limitée à 5 min chez la vache comme chez le veau afin de limiter le stress induit. Lors de la réalisation des prises de sang, le temps de contention manuel pratiqué sur les jeunes veaux sera minimisé à 5 min afin de limiter le stress induit. De plus, le personnel des installations est formé à la réalisation de ce geste ce qui contribue à minimiser le stress induit. Ce personnel est de plus formé en expérimentation animale et est sensibilisé à la douleur animale.
Choix des espèces
La problématique de l’étude, assez spécifique aux vaches laitières et à leurs veaux, nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les veaux sont des veaux mâles croisés Prim’Holstein et Blanc Bleu Belge qui est une race à viande. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Il nous faut des vaches laitières adultes pour étudier l’effet des molécules d’intérêt présentes dans le lait apporté aux veaux. Dans cet essai, nous utiliserons des vaches multipares ayant déjà mis bas au moins une fois et ayant réalisé au moins une lactation. Le stress oxydant chez les vaches laitières se produit au moment de la mise bas ; c’est pourquoi nous étudierons la phase autour de la mise bas (4 semaines avant la mise bas et 5 semaines après). Le stress oxydant chez les veaux est maximum au cours des premières semaines de vie et l’immunité propre s’acquiert lors de cette période. Le veau dispose d’abord d’une immunité transmise via le colostrum de sa mère, qui diminue pour être minimale à l’âge de 3 semaines de vie, avant de développer sa propre immunité. C’est pourquoi, nous avons choisi d’étudier l’effet de ces apports de molécules par le lait, de la naissance à l’âge de 5 semaines chez le veau.
Identifier les déterminants physiologiques de maladie (obésité, diabète…) par l’analyse non-invasive des paramètres métaboliques chez le petit animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 48
252 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré du "sans réveil" au léger, une partie réutilisée pour d'autres études et le reste tué pour prélèvement d'organes. Les animaux passent par une plateforme de mesure métabolique non invasive, avec un isolement individuel d'environ deux semaines présenté comme la seule contrainte. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et estime qu'un quart environ des animaux est tué dans son établissement. Le dispositif sert des collaborations extérieures, le devenir de chaque animal dépendant de l'équipe qui le récupère.
Objectifs
Le but est d'étudier au niveau préclinique le métabolisme énergétique des souris ou rats par un outil non-invasif et complètement automatisé. Pour cela, la plateforme d’Exploration Physiologique Fonctionnelle (EPF) est composée de 12 cages et permet la mesure en temps réel et pour chaque souris ou rats : - la prise alimentaire et hydrique - la mesure de la consommation d’oxygène - la production de dioxyde de carbone - la mesure du quotient respiratoire (indicatif de la nature du métabolisme glycolytique ou oxydatif) - la dépense énergétique globale de l’animal - l’activité spontanée et la mesure fine des déplacements dans les 3 dimensions spatiales (X, Y, Z). La plateforme EPF permet aussi l’analyse non-invasive de la composition corporelle des souris et rats par un scanner à résonance magnétique. Ce système ne requiert pas d’anesthésie et permet de déterminer la masse maigre, la masse grasse, les fluides corporels et la composition totale en eau sur des souris et rats.
Bénéfices attendus
Cette étude s'inscrit dans le cadre de collaborations qui auront été préalablement validées par des comités éthique locaux aux équipes voulant collaborer avec nous pour connaitre les comportements métaboliques et cela sans douleur et en limitant le stress des animaux.
Procédures
Aucune intervention n'est effectuée, il s'agit d'une procédure non invasive de mesure de calorimétrie indirecte.
Impact sur les animaux
Cette lecture métabolique est non-invasive et nécessite un isolement de 2 semaines au total avant d'être regroupé. Nous n'attendons aucun effet indésirable sur les animaux, ceux-ci ont de la nourriture et de l'eau à disposition comme dans une cage d'hébergement classique, la seule contrainte étant l'isolement de l'animal obligatoire pour les prises de mesure. Chaques études collaboratives (21 par an) sont réalisées sur 12 souris ou rats.
Devenir
En fonction des collaborations, les animaux seront récupérés dans le cadre des collaborations et mis directement à mort pour prélèvements d'organes. Nous pouvons estimer que 25% des animaux sont mis à mort dans notre EU.
Remplacement
Dans le cadre des projets de collaborations nous devrons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour nos études nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux (activité, prise alimentaire et hydrique) et de métabolique . De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus.
Raffinement
Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs / le stress dans la procédure. Cette procédure est non invasive et ne provoquent normalement aucun effet indésirable sur les animaux.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur. Les animaux doivent être âgées au minimum de 10 semaines lorsque toutes les structures cérébrales et le métabolisme soient stabilisés.
Etude de pharmacologie (biodistribution, élimination) de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques chez le rat en vue d’une application en oncologie humaine – Étude 3
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par voie intraveineuse, sous anesthésie, des molécules radiomarquées destinées au diagnostic ou au traitement du cancer, passent deux imageries, puis sont tués pour prélèvement d'organes et comptage de la radioactivité. Le porteur affirme que l'animal est la "seule alternative", un système in vitro ne reproduisant ni circulation sanguine ni excrétion, et justifie le choix du rat par un métabolisme différent de celui de la souris. Le projet sert un industriel qui cherche à écarter les composés à risque avant la suite de son développement.
Objectifs
Lors du développement de nouveaux médicaments et/ou sondes d’imagerie, il est nécessaire d’étudier la façon dont la molécule d’intérêt se distribue et est éliminée de l’organisme. Cette étape permettra de valider qu’un agent diagnostic sera éliminé rapidement de l’organisme sans causer de toxicité ou qu’un composé thérapeutique restera suffisamment longtemps dans l’organisme pour exercer son action. Pour cela, nous avons d’abord vérifié sur culture cellulaire que les composés à étudier n’exercent pas de toxicité. Les composés à étudier ont, d’autre part, déjà été injectés à la souris sans causer d’effets secondaires. Nous allons ensuite procéder au radiomarquage de la molécule (ajout d’un isotope radioactif pour pouvoir la détecter : Indium111 ou lutétium 177) puis au contrôle in vitro sur culture cellulaire de la préservation de l’activité biologique de la molécule suite à ce marquage. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés pharmacocinétiques d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative est l’utilisation d’animaux. L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. L’industriel développant les composés à évaluer dans ce projet a pu remarquer lors de ses développements précédents que certains de ses composés pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris (notamment au niveau des organes excréteurs que sont le foie et les reins). Les métabolismes du rat et de la souris sont très différents, et cette différence de métabolisme induit des différences sur le comportement pharmacocinétique des médicaments. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat (d’autres travaux menés conjointement seront réalisés chez la souris porteuse de tumeur pour identifier des différences de comportement selon les espèces et permettre ainsi une meilleure prédiction du comportement des composés chez l’homme). L’objectif de notre projet vise donc à suivre jusque 5 composés par expérience, chez des rats sains, après administration par voie intraveineuse grâce à l’utilisation de l’imagerie et du comptage de la radioactivité.
Bénéfices attendus
Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de caractériser précisément et simultanément le comportement de 5 composés dans l’organisme afin d’orienter les développements ultérieurs vers le diagnostic ou la thérapie, et d’écarter des composés à risque pour la suite des développements (rétention trop importante dans un organe non ciblé).
Procédures
- Préhension et mise sous anesthésie (3 fois maximum : injection et 2 imageries – quelques secondes) - Injection intrraveineuse d'un agent d’imagerie sous anesthésie (1 fois, quelques minutes) - Imagerie (2 fois, 45 minutes maximum par imagerie)
Impact sur les animaux
La préhension pour induction de l’anesthésie pourrait causer un certain stress aux animaux. Les injections, imageries et euthanasies seront réalisées sous anesthésie par du personnel expérimenté et ne devraient pas provoquer de nuisances supplémentaires. Les composés à tester ont déjà été injectés à l’animal (à une dose supérieure à celle que nous utiliserons) et n’ont pas provoqué d’effet secondaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Le prélèvement des organes étant nécessaire pour réaliser des analyses complémentaires et affiner les résultats d’imagerie par comptage précis de la radioactivité, l’euthanasie des animaux est inévitable.
Remplacement
Les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, les composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum (n=3 par groupe et par temps). Le nombre d'animaux a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide d'une analyse statistique.
Raffinement
Les gestes de ce projet (injection, imagerie, euthanasie) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les animaux seront observés quotidiennement et le suivi pondéral sera réalisé 2 fois par semaine. Aucun effet indésirable n’est attendu mais des points limites adaptés ont été définis. Toute observation d’un signe de souffrance sera suivie de l’arrêt immédiat du protocole et de l’euthanasie.
Choix des espèces
L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. L’industriel développant les composés à évaluer dans ce projet a pu remarquer lors de ses développements précédents que certains de ses composés pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris. De plus le métabolisme du rat est différent de celui de la souris et plus proche de l'homme pour les molécules étudiées. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 8 semaines d’âge), puisque les études prévues par la suite seront réalisées sur des animaux adultes présentant un cancer.