Procédures légères
Recherche préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
2880 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures classees legeres. Chaque animal recoit une ou deux injections d'agents stimulant les lymphocytes B et T, puis des composes par gavage et par voie intraveineuse, intraperitoneale ou sous-cutanee, avec des prelevements sanguins, avant d'etre tue. Le porteur affirme que les animaux ne developperont ni signe clinique visible ni effet indesirable notoire, la gravite tenant aux manipulations et a la mise a mort. Il qualifie le recours aux modeles animaux d'"indispensable" et s'appuie sur des modeles routiniers, sans detailler les composes testes.
Objectifs
On dénombre environ 80 maladies immuno-inflammatoires tels que le psoriasis, le sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. On estime que 5 à 8% de la population mondiale est touchée par une maladie auto-immune, caractérisée par une réponse inadaptée du système immunitaire qui se retourne contre les propres tissus du patient. La physiopathologie des maladies immuno-inflammatoires est complexe car elles impliquent de nombreux facteurs et cellules, dont les lymphocytes (B et T), globules blancs dont le rôle est la défense immunitaire de l’organisme. La synthèse des anticorps par les lymphocytes B répond à la stimulation par 2 types d’antigènes (Ag) : les Ag thymo-dépendants ou les Ag thymo-indépendants (en fonction de l’interaction ou non avec les lymphocytes T). Les anticorps sont également impliqués dans la physiopathologie des maladies auto-immunes. Des traitements permettent de contrôler les symptômes de la maladie, de contrôler ou d’inhiber l’auto-immunité. Ces derniers doivent généralement être pris de façon chronique car ils ne permettent pas de guérir la maladie. De plus, ils ne sont pas spécifiques des cellules effectrices de l’auto-immunité et interfèrent avec certaines fonctions générales du système immunitaire. Récemment développées, les biothérapies offrent une meilleure maîtrise des symptômes et des risques de lésions car elles sont plus spécifiques des acteurs clés impliqués dans le processus pathologique concerné. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients.
Bénéfices attendus
L’objectif ultime est de pouvoir supprimer spécifiquement le mécanisme à l’origine d’une maladie auto-immune, sans impacter le bon fonctionnement du système immunitaire. Ces nouvelles molécules fourniront aux patients des thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices ciblées qui pourront grandement améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Dans ce projet les animaux recevront 1 ou 2 injections par voie i.p. d’agents biologiques stimulant les lymphocytes B et T. Les composés seront administrés par gavage, i.v., i.p. et s.c.. Des prélèvements sanguins seront également effectués pour suivre l’apparition des anticorps/types cellulaires et la pharmacocinétique des composés testés.
Impact sur les animaux
Les animaux ne développeront pas de signes cliniques visibles n'y d'effet indésirable notoire..
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal avant l’élimination du cadavre
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro.
Réduction
Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. Les paramètres mesurés seront gardés ou exclus selon qu'ils suivent une distribution normale et présentent une variabilité acceptable. L’analyse statistique concerne des séries indépendantes, supérieures à 2 groupes. L'analyse de variance (ANOVA) sera suivie d'un test paramétrique ou non paramétrique en fonction de la configuration de l'étude, permettant des comparaisons multiples (e.g. Dunnett). Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie sera envisagé par inhalation d’isoflurane. De la buprénorphine à 0,01-0,2 mg/kg/8h en sous cutanée sera utilisée en cas de signes de douleur. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal
Choix des espèces
Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur de la bibliographie solide et des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. L’expertise du fournisseur sera le cas échéant prise en compte lors de la mise au point des modèles. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature
Caractérisation des effets de la mutation dup24 du gène ARX sur le développement du cerveau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
210 souris femelles gestantes vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures classees legeres. Chacune recoit une injection de BrdU a un stade de gestation defini, puis est tuee par dislocation cervicale entre deux et quarante-huit heures plus tard, ses embryons etant extraits et decapites pour etudier le developpement des neurones. Le porteur qualifie le phenotype de ces souris de non dommageable et presente la seule injection comme indolore, la gravite tenant a la mise a mort des meres et des embryons. Il affirme qu'aucune etude in vitro n'est possible, le gene etudie n'etant exprime que dans le cerveau.
Objectifs
L’objectif de cette étude est la caractérisation de l’effet de la mutation dup24 du gène ARX dans le développement des neurones GABA afin de mieux comprendre le lien entre ce type de neurones et la déficience intellectuelle et les troubles de motricité fine observés chez les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet vise non seulement à améliorer les connaissances au niveau fondamental sur le développement des neurones GABAergiques, mais également à mieux comprendre quel est le lien entre ces neurones et la motricité fine, dont l’altération conduit chez les patients ARX dup24 à des troubles du langage et de l’utilisation de la pince formée par le pouce et l’index. Quand et comment sont apparues ces compétences qui sont propres à l’homme, sont encore le sujet de débats mais ces questions devraient bénéficier de ce modèle d’étude unique qu’est la duplication de 24 pb d’ARX.
Procédures
Des femelles gestantes hétéozygotes (XmX) pour la mutation ARX dup24 seront soumises à une injection au BrdU à un stade particulier de la gestation (entre E13.5 et E16.5, c’est-à-dire 13.5 à 16.5 jours après accouplement). Ces souris seront ensuite euthanasiées de 2 à 48 heures plus tard pour récupérer les embryons qui seront également euthanasiés. Un maximum de 210 femelles gestantes (30 femelles/stade de gestation, voir en annexe) devrait être utilisé pendant la durée du projet.
Impact sur les animaux
Il n'y en a pas car le phénotype de ces souris est non dommageable. La seule expérimentation qui sera réalisée sur les animaux vivants est une procédure de classe légère, à savoir l’injection de BrdU en péritonéal qui, bien réalisée, n’est pas connue pour provoquer de stress ou de la souffrance chez l’animal.
Devenir
Toutes les femelles gestantes ayant reçu une injection au BrdU seront sacrifiées 2 à 48 heures après l'injection par dislocation cervicale et tous les embryons seront rapidement extraits du placenta et décapités
Remplacement
L’objectif de cette étude est la caractérisation de l’effet de la mutation dup24 du gène ARX dans le développement des interneurones GABA afin de mieux comprendre le lien entre ce type de neurones et la déficience intellectuelle et les troubles de motricité fine observés chez les patients. Ce type de projet ne peut pas être mené in vitro car il n’existe pas de type cellulaire neuronal exprimant ARX de manière endogène et ce gène n’est exprimé que dans le cerveau, ne permettant pas de prélèvements chez les patients.
Réduction
Concernant la réduction du nombre d'animaux utilisés dans cette étude, il sera adapté au plus juste afin de pouvoir garantir une interprétation scientifique et statistique des résultats tout en prenant en compte la variabilité individuelle. Pour les injections de BrdU, nous prévoyons d’utiliser maximum 30 portées pour chacun des stades (en fonction du nombre de coupes nécessaires à tester en histologie et en fonction du nombre d’embryons par portée). Ces chiffres peuvent paraitre élevés mais nous n’avons pas toujours la certitude de pouvoir avoir les 4 génotypes au sein d’une même portée et pour ce type d’expérience, il est très difficile de comparer des individus issus de portées différentes. Pour l’instant, nous prévoyons de tester différents stades embryonnaires (voir document en annexe) car nous ne savons pas exactement à quel stade nous pouvons nous attendre à voir des différences de nombre de progéniteurs neuronaux. Cependant, le nombre d’animaux utilisés dans cette étude sera adapté au plus juste en fonction des résultats obtenus au cours des 5 ans afin de pouvoir garantir une interprétation scientifique et statistique des résultats tout en prenant en compte la variabilité individuelle. Le test de Student sera réalisé pour tester la significativité des résultats obtenus. Au total, nous prévoyons donc d'utiliser un maximum de 210 animaux sur la durée totale du projet (5 ans).
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages 1284L réglementaires, souvent avec leurs frères ou sœurs, avec de la cellulose et équipées d'igloos pour l'enrichissement au milieu. Ces souris portant la mutation c.429_452dup24 dans le gène ARX ont été générées à l'Institut Clinique de la Souris (Illkirch) qui leur a fait passer un grand nombre de tests de comportement. Les résultats obtenus (et publiés : Dubos et al., Human Molecular genetics, 2018) montrent que ces souris sont en bonne santé et que la mutation ARXdup24 n'entraîne pas de phénotype dommageable. La seule procédure qui sera réalisée sur les animaux vivants est une procédure de classe légère, à savoir l’injection de BrdU en péritonéal qui, bien réalisée, n’est pas connue pour provoquer de stress ou de la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Nous travaillons ici sur un modèle de souris transgénique (knock-in) pour lequel un fragment de l'exon 2 du gène de souris a été remplacé par un fragment du gène ARX humain contenant la mutation c.429_452dup24. La souris est un modèle approprié à l’étude des mécanismes moléculaires contrôlant le développement du cerveau car le développement de ce dernier est proche de celui de l'humain, en particulier aux stades embryonnaires étudiés. De plus, dans le cas de l'étude de maladies génétiques rares comme c’est le cas des pathologies associées aux mutations du gène ARX, ce modèle permet d'étudier plus en détail les mécanismes physiopathologiques liés à des mutations particulières grâce à l’étude des phénotypes observés chez l'animal. La majorité des animaux utilisés sera au stade embryonnaire car c'est la période à laquelle est surtout exprimé le gène ARX. Cela nécessitera de sacrifier des femelles gestantes afin de pouvoir récupérer les embryons.
Etude de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’AVC hémorragique intracérébrale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1848 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'a modere. Chaque animal subit une chirurgie de la tete qui provoque une hemorragie cerebrale par injection de collagenase, puis une IRM et deux semaines de tests moteurs, avant une thoracotomie terminale pour fixer et prelever le cerveau. Le porteur indique surveiller des signes de detresse post-chirurgicale comme l'inactivite ou la perte de poids, qui servent de points limites. Sur le remplacement, il se borne a affirmer que les procedures ne peuvent pas etre remplacees, et rattache le projet a des financements industriels.
Objectifs
L’effet de nos quatre stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC hémorragique chez la souris par administration intraveineuse (i.v) ou en infusion sur 72h à l’aide de pompes osmotique placées en sous cutanée (Alzet-2001) pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 2 doses afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit sensorimoteur ainsi que du volume hémorragique. Ces doses seront fournies par l’industriel.
Bénéfices attendus
Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant la réduction du déficit sensorimoteur ainsi que du volume hémorragique en cas d'AVC hémorragique.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la collagénase, provoquant ainsi une hémorragie dans le striatum. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale et suiveront une série de test comportementale s'étalant de J+1 à J+14 post ischémie. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. Les procédures douloureuse (chirurgie, persfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.
Impact sur les animaux
Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse post-chirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés.
Devenir
A la suite de la procédure 1, les animaux seront gardés en vie afin de réaliser le suivi de la récupération fonctionelle. A la suite de la procédure 2, les animaux seront gardés en vie afin de réaliser l'évaluation des hémorragies par IRM. A la suite de la procédure 3, les animaux seront gardés en vie afin de procéder au prélèvement du coeur post fixation. Enfin, les animaux seront mis à mort pour la procédure 4 permettant ainsi de prélever le cerveau préalablement fixé pour analyses immunohistochimies.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques.
Raffinement
Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’hémorragie intra crânienne. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS et d’environ 25g pour les C57BL6J. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’hémorragie.
Effets d’une supplémentation orale en glutamine durant l’obésité : focus sur le contrôle glycémique et les troubles fonctionnels digestifs associés
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1344 souris femelles vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures dont la gravite declaree va de legere a severe. Le resume decrit surtout un test de glycemie par prelevement d'une goutte de sang a la queue, sans detailler l'induction de l'obesite ni du syndrome de l'intestin irritable qui justifient pourtant la severite annoncee. Le porteur prevoit une grille de score clinique, une injection de buprenorphine entre cinq et sept points et une mise a mort au-dela de sept points. Il affirme que ce projet de "physiologie integree" rend le recours aux modeles animaux "necessaire" pour tester l'effet d'une supplementation en glutamine.
Objectifs
Ce projet permettra à terme d'ouvrir des portes d'intervention nutritionnelle chez des patients obèses dotés du syndrome SII.
Bénéfices attendus
Les données récentes chez l'homme, comme chez l'animal, montre qu'une supplémentation orale en glutamine, pourrait limiter la résistane à l'insuline. Le but de cette étude est de mettre en évidence cette thèse.
Procédures
Les animaux aurant un test de glucémie, la mesure étant réalisée en effetuant un prélèvement d'une seule goutte de sang. examen pratiqué sur la queue de l'animal.
Impact sur les animaux
La mise en place, de point limite cruciaux, de surveillance quotidienne. notation de 0 à 2 des caratéristiques de l'animal dêpot nasal: évaluation de 0 à 2 dêpot orbital: évaluation de 0 à 3 oreille en arrière: évaluation de 0 à 2 joue enflée: évalauation de 0 à 2 mouvement des vibrisses : évaluation de 0 à 2: le score de chaque animal, étant l'addition de chaque caratéristique Il y aura deux cas de figures : (i)Lorsque la somme des scores de chaque critère sera compris entre 5 et 7, l’animal recevra une injection de buprénorphine à la dose de 0,05 mg/kg (Kalliokoski O et al. The Veterinary Journal 2011). L’animal sera retiré de la procédure, surveillé et remis dans sa cage avec ses congénères. (ii)Lorsque la somme des scores de chaque critère sera supérieure à 7, l’animal sera euthanasié au moyen d’une injection léthale d'Euthoxin.
Devenir
Tous les animaux seront mise à mort, après les différents mesures des procédures, selon une méthode, clairement défine.
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée mettant en jeu des relations inter-organes importantes, l'obésité et le syndrome de l'intestin irritable étant des pathologies multifactorielles. Ainsi des facteurs environnementaux d'origine alimentaire influençant le microbiote intestinal ou des évènements de stress influençant le système nerveux central et l'intestin co-existent. Le recours à des modèles animaux est donc nécessaire pour mieux comprendre (i) l'interaction entre ces pathologies, et (ii) l’influence bénéfique que pourrait avoir une supplémentation orale en glutamine sur ces pathologies.
Réduction
Nous avons réduit au maximun, le nombre d'animaux par groupe; afin que les tests statisitques soient correctset puissent se dérouler sans problèmes.
Raffinement
Pour raffiner ; les animaux sont hébergés aux normes requises et un enrichissement des cages est mis en place. Des points limites adaptés, une stratégie d’anesthésie et d'analgésie seront mise en place avec un suivi quotidien du bien- être animal. Nous allons dans ce projet utiliser que des souris femelles, ce qui diminuera les variations dans les réponses
Choix des espèces
La souris C57Bl/6 est communément utilisée dans les modèles soumis à un régime riche en lipides et dans les modèles SII-like. De plus, la souris C57Bl/6 a un taux de réponse élevé au régime riche en lipides par rapport à d'autres espèces animales voire d'autres souches. Le choix de la souris par rapport au rat se justifie par une meilleure réponse au régime riche en lipides et par le coût de l'alimentation riche en lipides. Pour comparer nos différents groupes et en particulier aux données obtenues chez les souris ob/ob, l'utilisation de cette souche apparait nécessaire, les souris ob/ob ayant le fond génétique C57Bl/6. Les souris seront livrées à l'animalerie centrale à leur sixième semaine. A ce stade, nos études antérieures montrent une bonne réponse des animaux au régime riche en lipides.
Etude de molécules bioactives promouvant l’oligodendrogenese dans des modèles murins de lésion cérébrale néonataux et adultes
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
7983 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance leger a modere. Des adultes recoivent un gavage quotidien puis une chirurgie qui injecte une molecule demyelinisante dans le corps calleux ou la moelle epiniere, tandis que des souriceaux subissent une electroporation cerebrale sous anesthesie, avant que tous soient tues pour prelever le cerveau ou la moelle. Le porteur indique que le gavage peut irriter et que la chirurgie provoque des douleurs post-operatoires, et affirme qu'une approche in vivo chez le mammifere est "indispensable" avant tout essai clinique. Les retombees annoncees contre la sclerose en plaques et les lesions du grand premature restent renvoyees a de futurs essais.
Objectifs
Les oligodendrocytes sont des cellules essentielles du système nerveux central, puisque ce sont elles qui forment les gaines de myéline, permettant la propagation rapide de l’influx nerveux, ainsi qu’un support pour les neurones. Certaines maladies dites dysmyélinisantes ou démyélinisantes comme la pathologie du cerveau des grands prématurés ou la Sclérose en Plaques, respectivement, entrainent une perte de ces cellules. Une remyélinisation spontanée a lieu à partir des précurseurs d’oligodendrocyte présents dans l’ensemble du cerveau. Néanmoins, la remyélinisation reste incomplète, et les thérapies menant à une remyélinisation efficace sont inexistantes. En nous basant sur des approches de traitement des données (big data) par différents outils bioinformatiques (in silico), nous avons mis en évidence des molécules bioactives ayant la capacité d’activer des gènes clés impliqués dans la biologie des oligodendrocytes. Ces molécules, ayant donc un fort potentiel de régénération des oligodendrocytes et de (re)myélinisation, ont été testées et validées sur des modèles in vitro de culture cellulaire. Cette nouvelle étude a pour objectif de valider l’efficacité de ces molécules sur des modèles précliniques, de démyelinisation suivie de remyelinisation, in vivo chez la souris, et de comprendre leur mode d’action.
Bénéfices attendus
La Sclérose en plaques est une maladie inflammatoire auto-immune qui touche plus de 100 000 personnes en France. Des avancées ont été faites pour proposer des traitements visant à stopper les attaques immunitaires contre les oligodendrocytes. Cependant, il n’existe pas encore de traitements permettant une remyélinisation efficace. L’Organisation Mondial de la Santé (OMS) estime qu’au moins 15 millions d’enfants naissent prématurément par an dans le monde, représentant 1 naissance sur 10, avec un taux qui augmente de manière inexpliquée dans les pays développés. Presque 1 million de ces enfants ne survivent pas et une proportion importante des survivants développent des déficits neurologiques comme des paralysies cérébrales, des défauts sévères des fonctions cognitives et des maladies psychiatriques comme le trouble de déficit de l'attention / hyperactivité (TDAH) ou le trouble du spectre autistique (TSA). Deux processus clés interviennent pendant les phases précoces de lésions cérébrales chez le prématuré : l’altération de la concentration en oxygène et la neuro-inflammation qui affectent dramatiquement la génération des oligodendrocytes et qui mènent à une hypomyélinisation. Dans ces deux pathologies, il est essentiel de développer des traitements favorisant la génération des oligodendrocytes. Nos études antérieures ont permis de mieux comprendre les mécanismes intervenant dans ce processus et nous ont permis d’acquérir des données sur les gènes impliqués. Grâce à l’analyse de ces données, nous avons établi une liste de molécules bioactives prometteuse. Des études in vitro sur cellules en culture nous ont permis de sélectionner 3 de ces molécules, comme ayant le plus grand potentiel à promouvoir la genèse des oligodendrocytes. Ces études précliniques permettront de valider l’efficacité de molécules bioactives sur la production des oligodendrocytes, dans des modèles de lésion cérébrales du grands-prématurés et de remyélinisation chez l’adulte. Elles seront la base pour commencer des essais cliniques pour promouvoir la réparation cérébrale chez des patients atteints de maladies démyélinisantes, comme la Sclérose en Plaques ou dysmyélinisante comme dans la pathologie du cerveau des grands prématurés.
Procédures
Pour ce projet, il est prévu de soumettre des souris adultes à 1 gavage de quelques secondes par jour pendant 5 jours, puis après quelques jours, une chirurgie sous anesthésie et analgésie sera pratiquée afin d’injecter une molécule démyélinisante dans le corps calleux ou la moelle épinière (geste rapide : 10min). Les molécules bioactives d’intérêt leur seront administrées dans l’eau de boisson tous les jours jusqu’au jour de l’euthanasie et une injection unique intrapéritonéale (durant quelques secondes) sur animal vigile d’un agent marquant l’ADN leur sera faite, 2 heures avant l’euthanasie pour prélèvement. Concernant les modèles chez les souriceaux, nous avons prévu réaliser une électroporation (injection dans un des ventricules du cerveau et application d’un courant électrique), sous anesthésie (geste rapide – 2min). Les molécules bioactives d’intérêt leur seront administrées par injection sous-cutanée (20 maximum - durant quelques secondes) sur animal vigile, chaque jour jusqu’au jour d’euthanasie puis une injection unique (durant quelques secondes) d’un agent marquant l’ADN leur sera faites, 2 heures avant l’euthanasie pour prélèvement. Nous avons par ailleurs prévu de réaliser une (ou 2 – à quelques jours d’intervalle) injection(s) (durant quelques secondes) sur souriceaux vigiles. Les molécules bioactives d’intérêt leur seront administrées par injection sous-cutanée (20 maximum - durant quelques secondes) sur animal vigile, chaque jour jusqu’au jour d’euthanasie puis une injection unique (durant quelques secondes) d’un agent marquant l’ADN leur sera faites, 2 heures avant l’euthanasie pour prélèvement.
Impact sur les animaux
Concernant l’étude sur la remyélinisation chez l’adulte, les animaux seront contraints à un gavage qui peut provoquer des irritations. Lors de l’injection, les animaux seront anesthésiés, ce qui entraine un potentiel risque pour l’animal et un risque hémorragique au niveau du site d’injection. Des douleurs post-opératoires sont aussi attendues. Concernant l’étude chez les souriceaux, l’électroporation doit se faire sous anesthésie ce qui entraine un potentiel risque pour l’animal. Les différentes injections réalisées peuvent entrainer une douleur passagère.
Devenir
Les analyses de ces expériences nécessiteront le prélèvement des tissus d’intérêt (cerveau ou moelle épinière) et donc l’euthanasie des animaux. Pour respecter le principe de raffinement, nous nous assurerons que les expériences seront réalisées dans des conditions optimales (bon timing, dose optimale) et contrôlées, afin d’obtenir des résultats interprétables et diminuer ainsi la variabilité donc le nombre d’animaux à analyser.
Remplacement
Notre projet vise à valider l’efficacité de molécules bioactives dans la production des oligodendrocytes, des cellules du cerveau, très importantes pour son fonctionnement. Suivant le principe de remplacement, des études in vitro sur cultures cellulaires ont été réalisées afin de sélectionner 3 molécules parmi les 12 que nous avions mises en évidence par des analyses in silico (analyses bioinformatiques) comme ayant le plus grand potentiel à promouvoir la production des oligodendrocytes. Avant d’envisager de faire passer ces molécules en essai clinique, il est indispensable, de passer par une approche in vivo chez le Mammifère afin de reproduire la complexité du cerveau. Nous utiliserons des modèles mimant les effets de pathologies comme la Sclérose en plaques chez l’adulte ou bien des défauts de production d’oligodendrocytes retrouvés lors du développement en cas naissance prématurée. Il nous sera ainsi possible de prendre en compte le contexte inflammatoire dû à l’attaque du système immunitaire sur le cerveau, par exemple. De plus, les outils génétiques disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision à quel moment ces défauts interviennent.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés (7923) sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables et sera calculé pour chaque type d’analyse. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillons en étroite collaboration avec des statisticiens présents dans notre unité pour définir toutes les tailles d'échantillons et les tests statistiques appropriés. Nous comptons observer de nombreux paramètres (stade différentiation des cellules selon le stade développement, morphologie des cellules, …) qui pourront être analysés sur les mêmes échantillons.
Raffinement
L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement et les conditions d’enrichissement de l’environnement (maison, papier craft, batonnet), d’alimentation et de soins quand nécessaires seront contrôlées. Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Tout au long de la vie des animaux, un suivi rigoureux sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et du vétérinaire (vérification quotidienne par l’équipe zootechnique et un suivi post-opératoire 1 fois par jour par les responsables de projets. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et dans le cas où cette douleur persiste, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile. De la nourriture liquide sera mise à disposition des souris pendant la période de gavage afin de faciliter la prise alimentaire. Des soins seront apportés avant, pendant et après la chirurgie : injection d’analgésique avant l’anesthésie, ainsi qu’en post-opératoire. Un biberon d’analgésique sera aussi mis à disposition des animaux. Du gel ophtalmique sera appliqué pour assurer une bonne hydratation des yeux de l’animal. L’application de quelques gouttes d’analgésique local sur le site d’incision permettra de diminuer la douleur. Durant toute la période d’anesthésie, l’animal sera placé sur tapis chauffant afin de maintenir sa température. Un analgésique en crème sera appliquée sur les points d’appui des barres d’oreille afin de réduire l’inconfort. La peau de l’animal sera tondue et nettoyée. Les animaux seront placés dans une cage chauffée jusqu’au réveil. Les concentrations des produits injectés seront optimisées pour réduire le volume injecté. Des points limite sont mis en place : Si une perte de poids importante est constatée par rapport au poids avant procédure, l’animal sera euthanasié. Après la chirurgie, si une infection ou des signes de souffrances étaient constatés, nous procéderions à un nettoyage de la plaie (si infection) et injection d’analgésique, après consultation avec la structure chargée du bien-être animal et du vétérinaire. Si aucun signe d’amélioration n’est visible après 48h, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Après validation des molécules d’intérêt in vitro sur cellules en culture, et avant de les faire passer en essai clinique, il nous est indispensable de les valider sur modèle in vivo de cerveau de Mammifère. Nous avons fait le choix de la souris car les outils génétiques et moléculaires développés dans notre domaine de recherche ont été réalisés pour des travaux chez la souris. Les animaux génétiquement modifiés qui sont nécessaires à cette étude sont uniquement disponibles chez la souris. Notamment, les lignées Cre et Lox disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision l’inactivation de nos gènes d’intérêt. Les modèles de lésions focales de démyélinisation suivi de remyélinisation ont été parfaitement caractérisés et nous les maîtrisons. Les animaux utilisés pour le modèle de démyélinisation suivi de remyélinisation seront des adultes d’au moins 3 mois (myélinisation totale). L’électroporation se fera sur des souriceaux de 1 à 2 jours, permettant de cibler les cellules souches neurales dans leur période de différenciation. Les injections de tamoxifène se feront sur des souriceaux ayant entre 1 et 5 jours pour cibler la période avant la différentiation des cellules progénitrices en oligodendrocytes.
Analyse histologique de cerveau de souris porteuses de mutations humaines associées à des déficiences intellectuelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris porteuses de mutations humaines liées a des deficiences intellectuelles vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance leger, une partie etant tuee sans reveil pour prelever le cerveau. Elles sont genotypees par ablation d'une phalange ou prelevement d'oreille, recoivent une injection intraperitoneale, puis sont tuees a trois semaines ou a quatre mois pour analyser leurs structures cerebrales. Le porteur affirme que le modele murin reste "indispensable" pour evaluer le cerveau adulte des mammiferes, que les organoides ne reproduisent pas. Les retombees therapeutiques evoquees, une restauration de la proteine normale, sont renvoyees au conditionnel et au long terme.
Objectifs
Nous nous intéressons aux protéines qui sont associées avec l'expression des gènes. Une étape importante est la reconnaissance des gènes par des protéines particulières qui sont présentes dans toutes les cellules. De manière surprenante, des mutations dans les gènes codant pour ces protéines ont été identifiées chez des patients humains présentant un retard de croissance et du développement moteur, une microcéphalie, des difficultés d'alimentation, et une déficience intellectuelle sévère. Nous avons développé des modèles de souris qui reproduisent deux de ces mutations humaines. Nous souhaitons voir si les structures cérébrales sont affectées chez les souris mutantes.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettera de valider nos deux modèles murins en tant que modèles de pathologie humaine afin de pouvoir étudier les mécanismes moléculaires qui sont perturbées de manière spécifique dans le cerveau. A plus long terme si ces modèles sont validés, ils pourront servir de modèle expérimental pour explorer la restauration de l'expression de la prtotéine sauvage comme hypothèse thérapeutique.
Procédures
Les souris seront génotypées et identifiées par phalagectomie (1 prélèvement, 1 seconde) ou par prélèvement auriculaire (1 prélèvement, 1 seconde). Les souris seront soumises à une anesthésie par une injection intrapéritonéale qui dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une injection intrapéritonéale et les animaux dont les cerveaux seront prélevés à 21 jours (PE1) subiront un prélèvement de la dernière phalange. Ces deux nuisances sont associées à une douleur légère.
Devenir
Il s'agit d'une procédure terminale pour analyser les cerveaux des animaux.
Remplacement
Le modèle animal murin reste indispensable afin d’évaluer la structure complexe du cerveau des mammifères, en particulier du cerveau adulte qui n'est pas modélisable par les alternatives organoïdes (mini-cerveau) qui ne sont pas des structures adultes.
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé selon une étude publiée permettant une mesure fiable de différents paramètres structuraux du cerveau et une comparaison entre contrôles et mutants selon un pipeline statistique standardisé développé à cet effet.
Raffinement
Cette procédure ne débutera qu'après l'évaluation préalable d'un phénotype dommageable potentiel de chaque mutation. Les patients humains ont des troubles moteurs, des difficultés d'alimentation et la possibilité de développer des crises d'épilepsie pendant l'enfance. Si ces phénotypes sont observés chez nos modèles murins, nous renforcerons le suivi réglementaire des animaux en suivant leur poids 3 fois par semaine et en mettant de la nourriture gélifiée.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier l'effet d'une mutation en générant des lignées proteuses de mutations ciblées. De plus, nous nous intéressons à des mutations identifiées chez l'homme associées à des déficiences intellectuelles donc le recours à un modèle mammifère est nécessaire. Nous souhaitons étudier l'évolution potentielle du phénotype qui est détecté après la naissance chez les patients humains pour les deux mutations. Nous avons sélectionné un âge jeune à 3 semaines (P21) et un âge adulte à 4 mois (P120) pour des mâles et de femelles.
Etude de l’effet de différentes formulations de la copie synthétique de la phéromone maternelle de la poule sur le stress et le développement du microbiote intestinal en élevage avicole.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
750 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevés dans des conditions d'élevage intensif reproduites pour l'étude, ils reçoivent une phéromone de synthèse censée réduire leur stress, puis sont tués par lots à intervalles réguliers pour prélever duvet, plumes et organes. Le porteur indique que la souche Ross 308, sélectionnée pour atteindre le poids d'abattage en quarante-deux jours, ne peut être gardée vivante car ses pattes ne soutiennent plus son poids. Il présente ce produit commercial comme un moyen d'améliorer le bien-être des animaux non-humains, dont les conditions de détention restent la source première du stress étudié.
Objectifs
L’élevage avicole et notamment du poulet de chair peut comprendre des pratiques susceptibles de causer un stress et d’altérer le bien-être animal. Le stress réduit la qualité de vie des poulets et entraîne une diminution de la croissance, une baisse de l’immunité, une diminution de la fonction gastro-intestinale. Un stress prolongé contribue à l’augmentation des maladies, mortalité, une diminution de la qualité des productions. L’optimisation de l’élevage avicole est donc souhaitable d’un point de vue éthique et sociétal. Un traitement capable d’apaiser les animaux, les aider à s’adapter à l’environnement et à soutenir leur défense immunitaire est de grand intérêt. La copie de la phéromone maternelle de la poule dite MHUSA protège les individus contre les effets négatifs du stress. La sécrétion naturelle est produite par la poule pour apaiser et protéger les poussins dans l’environnement. Le produit est commercialisé sous forme de bloc diffuseur. Une étude précédente a testé le MHUSA en formulation spray appliqué sur les animaux en montrant des effets bénéfiques du produit sur l’adaptation des poussins au nouvel environnement et leur défenses immunitaires. Une application sur les animaux permet aux individus d’être eux-mêmes les diffuseurs de la phéromone, qui étant diffusée en permanence et à hauteur des poulets, améliorerait sa captation et donc ses effets. Le laboratoire en charge de la fabrication des produits développe une formulation qui puisse durer longtemps sur les animaux afin de limiter les renouvellements par l’éleveur. Pour cela, le MHUSA est dilué dans une solution contenant une substance retard. Deux types de substances retard sont possibles et seront testées. L’objectif est de tester ces deux nouvelles formulations sur des poussins de chair maintenus dans des conditions d’élevage similaires au milieu agricole. Ces nouvelles formulations seront comparées à la formulation précédente (sans la substance retard) et une solution témoin (eau). Nous proposons une étude composée de deux expériences réalisées l’une après l’autre : un test de rémanence pour les deux nouvelles formulations ; un essai d’efficacité pour étudier les effets des 3 traitements sur le stress et le développement de la flore intestinal vu sa possible altération en cas de stress. L’essai d’efficacité vise à identifier la formulation qui, en prolongeant la diffusion de MHUSA, améliorerait aussi les paramètres sélectionnés.
Bénéfices attendus
Les pratiques d’élevage du poulet de chair sont souvent source de stress et peur; cela peut compromettre le bien-être animal ainsi que la qualité de la production. Du fait des conditions de détention basée sur le confinement en bâtiment et sur un grand nombre d’animaux pour une surface limitée, les oiseaux ont du mal à s’adapter à leur environnement; aussi, leurs besoins naturels sont peu respectés, avec des conséquences négatives sur l’état de santé et la croissance. En parallèle, les consommateurs sont de plus en plus sensibles aux questions de bien-être animal et demandeurs d’un produit de meilleure qualité sous un point de vue aussi éthique. L’utilisation d’un produit capable de réduire les effets négatifs du stress en élevage est de grand intérêt, donc, pour les animaux, pour les producteurs et pour les consommateurs. Pour ces propriétés, le produit à base de phéromone maternelle de la poule, ou MHUSA, est un outil visant à réduire le stress en élevage et améliorer le bien-être animal et la production des animaux. Cette expérience a pour objectif d’étudier les effets d’une nouvelle formulation vaporisée sur une bande de poussins de chair. Nous attendons que les animaux traités aient un meilleur développement et fonctionnement des organes députés à la défence immunitaire, un meilleur développement de la flore intestinale et ainsi un meilleur état général de santé, qui donnera finalement de meilleures performances en termes de production. On s’intéresse aussi à l’étude du comportement. L’utilise de MHUSA en élevage a été associé, par retours des éleveurs, à des animaux plus calmes et moins peureux lors du passage du personnel à travers le bâtiment. Il est attendu que MHUSA soit associé à une réduction de l’agressivité et de la peur. Le développement d’une nouvelle technologie étant sensée améliorer la formulation et prolonger la persistance du produit, on s’attend aussi à ce que l’une des deux formulations contenant la substance retard soit associée à de meilleurs résultats.
Procédures
Pour l’application du traitement qui se réalisera lors du test de rémanence ainsi que durant l’essai, l’opérateur utilisera un flacon vaporisateur. La durée d’application du traitement sera d’environ 5 minutes/groupe. Lors du test de rémanence il y aura 3 applications aux jours J0 - J15 - J21. Concernant l’essai, la première application du traitement sera réalisée chez le couvoir avant le transport. Chaque groupe des poussins sera ensuite traité de nouveau durant l’expérience selon une fréquence qui sera connue après le test de rémanence. Pour le test de rémanence, 5 animaux/groupe seront retirés de leur enclos aux jours J0 (2 points) – J5 – J10 – J15 – J18 – J21 – J26 – J31 – J33 – J36 – J39 – J42 ; les animaux seront mis à mort pour récupérer les duvets ou plumes pour les analyses. Pour l’essai, 10 animaux/groupe seront retirés de leur enclos aux jours J0 – J2 – J6 – J12 – J18 – J24 – J30 – J42 ; les animaux seront anesthésiés pour la réalisation d’une prise de sang, pesés, et mis à mort pour le prélèvement d’organes devant être analysés. Aussi, des observations comportementales seront réalisées à travers l’enregistrement de vidéos réalisés à J1 – J14 – J27 – J40. Chaque vidéo durera environ 30 minutes; durant la vidéo, une personne marchera dans l’enclos pendant 30 secondes pour évaluer la peur des animaux à l’homme (test d’évitement).
Impact sur les animaux
Les conditions de détention tendant à simuler celles de l’élevage commercial peuvent être une source de nuisance, en particulier le nombre élevé d’animaux confinés dans des enclos. Le traitement lui-même n’est pas sensé créer d’effet indésirable sur les poussins, bien que cela soit surveillé tout au long de l'étude. La rentrée du personnel dans l’enclos pour l’enlèvement des animaux et leur transfert en salle de test pourrait engendrer une peur chez les animaux prélevés et restants. L’anesthésie pourraient être source de peur et représenter une nuisance. Concernant les observations comportementales, l’entrée de l’opérateur pour poser les cameras ou pour réaliser le test d’évitement pourrait engendrer de la peur et du stress chez les animaux.
Devenir
Pour le test de rémanence, 5 individus/groupe sont mis à mort à 13 moments pour la récupération et l’analyse des duvets et plumes. Pour l’essai d’efficacité, 10 animaux/groupe seront mis à mort à 8 moments pour réaliser les prélèvements d’organes à étudier. Le surplus de poulets restants à la fin des expériences sera mis à mort par le vétérinaire en charge des animaux. Les animaux ne pourront pas être gardés en vie, ni réutilisés dans d’autres projets car la souche Ross 308 n’est pas compatible avec une vie plus longue. En fait, ces poulets ont été sélectionnés pour atteindre le poids d’abattage en un laps de temps très court, les filets deviennent très gros et les pattes ne pourraient plus soutenir leur poids. Les animaux n’arriveraient plus à se tenir debout et à rejoindre leur mangeoire.
Remplacement
Il s’agit d’une étude qui nécessite l’implication d’êtres vivants, dans ce cas des poulets, pour étudier les effets du traitement appliqué sur les paramètres de stress et de bien-être, y compris le comportement. Il n’est pas envisageable donc de remplacer les animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux impliqué dans le projet a été déterminé par une approche statistique et il a été réduit en veillant toutefois à travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les différents groupes pour les comparaisons. Pour le test de rémanence, 5 individus/groupe mis à mort à chaque point de prélèvement sont considérés suffisant pour juger chimiquement de la présence d’une substance, cela aussi sur la base s’une variabilité interindividuelle considérée très faible. 13 moments de prélèvements seront nécessaires pour réaliser la courbe de rémanence. Pour l’essai d’efficacité, 10 individus/groupe/temps est jugé suffisant pour montrer une différence significative pour chaque paramètre à l’étude. Un surplus d’animaux est prévu pour les deux procédures pour maintenir une densité d’animaux souhaitée et balancer une éventuelle mortalité. Compte tenu que la haute densité d’animaux est parmi les facteurs stressants pour les poulets de chair, il est important de la respecter pour pouvoir observer les effets du traitement sur le stress.
Raffinement
L’hébergement suivra les recommandations législatives concernant les poulets destinés à la production de viande. La densité animale ne dépassera pas les 33kg/m². Le calcul tiendra compte du poids final des poulets et la réduction des effectifs. Les enclos seront aménagés pour répondre aux besoins de l’espèce. Une litière fournira un lieu de couchage confortable, une protection des pattes et permettra aux comportements naturels (gratter, picorer le sol) de s’exprimer. Des éléments d’enrichissement seront utilisés, par exemple : ballots de paille, des blocs à piquer, balles de fourrage. La nourriture et l’eau seront en libre accès. Les paramètres d’ambiance tels que la température, luminosité, ventilation et humidité seront adaptés et monitorés. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement : à chaque fois que l’opérateur rentrera dans l’enclos il devra observer des animaux qui mangent, qui boivent, qui se reposent, qui jouent, qui vocalisent ; les animaux ne devraient jamais être amassés. Le vétérinaire réfèrent sera contacté en cas de problème. L’application du traitement sera réalisée dans le calme. Les mises à mort et les prélèvements seront réalisés par le même vétérinaire et par le même personnel expérimenté. Une attention toute particulière est portée à la diminution des contraintes exercées aux animaux, les procédures seront en fait réalisées entièrement sous anesthésie pour une partie, et après la mise à mort pour une autre partie.
Choix des espèces
Le projet vise à étudier l'effet de différentes formulations de la phéromone maternelle de la poule. Cette étude sera réalisée sur des poulets de chair de la souche ROSS 308. Ce poulet est la variété la plus répandue de poulet de chair et caractérisée par une croissance très rapide. Il est en effet sélectionné pour atteindre son poids d'abattage en 42 jours. Les conditions d’élevage utilisées pour atteindre cet objectif exposent les animaux à divers facteurs de stress qui peuvent impacter négativement leur bien-être ainsi que la qualité de la production. Pour cela, l’étude sur les effets de la phéromone est de grand intérêt dans l’optique de fournir aux éleveurs un outil pour limiter les effets négatifs du stress chez les animaux, améliorer leur bien-être ainsi que la production. Les animaux impliqués dans le test de rémanence et dans l’essai seront des poussins Ross 308 de l’âge de 1 jour. Le but scientifique est en effet d’étudier les effets du traitement sur une bande de poussins Ross durant un cycle entier d’élevage, c’est-à-dire 42 jours.
Evaluation du risque chimique d’éléments métalliques libérés dans l’eau par des protections anti-corrosion chez un poisson.
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
2 844 médakas marins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère. Les poissons sont exposés pendant six mois à l'aluminium et aux métaux relâchés par des protections anti-corrosion, par l'eau et par la nourriture, avec des anesthésies répétées pour biométrie et des tests comportementaux, avant d'être tués pour analyse. Le porteur indique tester volontairement de fortes concentrations pour établir une dose-réponse, ce qui peut provoquer désorientation, noircissement de la peau et mortalité. Il affirme qu'aucune alternative non-animale ne permet d'étudier croissance, reproduction et comportement chez ces poissons.
Objectifs
Les protections anti-corrosion telles que les anodes sacrificielles sont utilisées pour réduire la dégradation des structures métalliques immergées dans l’eau de mer. Leur mise en place est amenée à augmenter avec le développement de parcs éoliens offshore. Cependant, ces méthodes conduisent à la libération d’une grande quantité d’éléments chimiques dans l’environnement marin dont l’effet nocif potentiel encore mal évalué préoccupe les autorités environnementales et la société civile. En effet, l’accumulation de métaux peut s’avérer toxique pour les organismes aquatiques et leur toxicité à long-terme est encore mal connue chez les poissons marins, notamment en mélange (« effet cocktail »). L’objectif de ce projet est donc d’étudier la toxicité de ces éléments chez le médaka marin (Oryzias melastigma) en considérant survie, croissance, effort reproducteur et comportement (neurotoxicité). Le projet sera divisé en deux procédures qui permettront d'évaluer la toxicité des éléments étudiés par balnéation (procédure 1) et par transfert trophique c’est-à-dire à travers la nourriture (procédure 2), représentant les deux voies de contamination subies par les poissons dans leur environnement.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de raffiner l’analyse du risque chimique causé par l’aluminium ainsi que de celui causé par les protections cathodiques telles que les anodes galvaniques en milieu marin. Ainsi, ils permettront de calculer des valeurs de toxicité prenant en compte plusieurs aspects de la physiologie animale (survie, croissance, reproduction, comportement) non disponibles à ce jour. Ces résultats chiffrés permettront de fournir des valeurs seuil de concentrations en aluminium à ne pas dépasser dans l’environnement et serviront 1) d’indicateurs de santé de l’environnement étudié et 2) de valeurs de référence sur lesquelles s’appuyer pour le déploiement raisonné et sécuritaire de protections cathodiques en milieu marin. Les résultats seront également communiqués aux parties prenantes (public, industriels, professionnels à activité maritime) afin d’informer sur la toxicité ou l’absence de toxicité liée à la présence de ces protections dans l’environnement, et donc renseigner sur la pertinence de leur utilisation pour la protection des systèmes de production d'énergie renouvelable offshores.
Procédures
Durant le projet, les individus seront chacun soumis à un maximum de cinq anesthésies pour biométrie (mesures taille et poids). L’ensemble de l’intervention ne dure pas plus que 5 min par poisson (transfert en quelques secondes dans le bac d’anesthésie, biométrie ~1 min) puis transfert en bac de réveil où le poisson est laissé pendant quelques min pour récupérer. Chaque individu est également soumis à 4 tests comportementaux non-invasifs (comme décrits en section 4.2 – procédure 1), à raison d’un test quotidien sauf en jour 1 où un test en groupe puis un test en individuel s’enchaînent pour une durée totale de 14 min de test) avec une période de repos total de 24 h pendant laquelle le poisson est nourri et placé dans un bac individuel en contact visuel proche avec ses congénères. Ci-dessous est présenté le détail des durées des différents tests : - Test 1 (en groupe) (jour 1): 5 minutes - Test 1 (individuel) (jour 1) : 9 minutes - Test 2 (individuel) (jour 2) : 7 minutes - Test 3 (individuel) (jour 3) : 42 minutes - Test 4 (individuel) (jour 4, 5) : divisé en 3 “sessions”, chacune d’une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Des études précédentes ont montré l’absence de toxicité aiguë, i.e. effectuées sur des stades embryo-larvaires et de courte durée, de l’aluminium chez les poissons marins. Dans le cadre de ce projet, les poissons seront exposés sur une durée plus longue impliquant les stades juvéniles et adultes afin de pouvoir étudier les effets des métaux sur des fonctions physiologiques intégratives telles que la reproduction et la croissance des poissons marins. Des expositions chroniques sur poissons à ces composés n’ayant jamais été réalisées, l'apparition d'effets léthaux au cours des 6 mois d'exposition est donc pour l’heure inconnue. Il est cependant possible d’observer des effets subléthaux et léthaux (e.g. baisse de croissance, désorientation, noircissement de la peau) durant la période d’exposition, résultats qui viendront nourrir les données du projet. En effet, dans la mesure où les résultats de ce projet servent à une analyse de risque chimique, celui-ci doit inclure des concentrations fortes (conditions très défavorables) afin de pouvoir en tirer une dose-réponse valide (càd. avoir une gamme comprenant au moins une forte concentration où un effet toxique est observé, et au moins une faible concentration où aucun effet toxique n’est visible).
Devenir
En fin de projet, les animaux seront prélevés après euthanasie pour l’analyse moléculaire et histologique des organes.
Remplacement
Le projet dans lequel s’inscrit ce travail a été financé afin d’étudier les effets à long-terme de l’aluminium et des éléments relargués par les protections anti-corrosion sur la croissance et les aptitudes de reproduction et comportementales des poissons. Il n’existe à ce jour aucune alternative non-animale valide pour l’étude des fonctions physiologiques intégratives que sont la croissance, la reproduction, et le comportement chez les téléostéens spécifiquement. Cependant, nous avons mené des expériences préliminaires sur des stades hors-champ expérimentation animale (eleuthéroembryons) afin de faire une première évaluation de la toxicité des produits chimiques étudiés sur notre modèle, le médaka marin (ligne directrice OCDE 212). Il s’est avéré que les résultats étaient concordants avec ceux obtenus dans la littérature, soit aucun effet léthal ou subléthal (malformations, taux d’éclosion) observé même aux concentrations les plus fortes testées.
Réduction
Les effectifs ont été estimés à partir d’une analyse de puissance statistique afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé dans le projet tout en conservant un effectif suffisant pour avoir des résultats fiables. Cela nous a permis d'arriver à un nombre de poissons de 50 individus / sexe / condition testée pour la procédure 1, et 81 individus / sexe / condition testée pour la procédure 2. A ces valeurs s'ajoute un coefficient de 20% de risque de perte (mortalité naturelle), ce qui nous amène à utiliser 60 individus / sexe / condition pour la procédure 1 et 97 individus / sexe / condition testée pour la procédure 2. D’une façon générale, un soin a été apporté afin d’utiliser les mêmes individus pour les différentes analyses.
Raffinement
Les individus, élevés en groupe dans des structures adaptées à l’espèce, sont observés trois fois par jour lors du nourrissage, ainsi l’atteinte d’un des points limites fixés (mélanisation, infection, nage altérée) est identifié de manière précoce. Le poisson est ensuite immédiatement isolé en bac individuel. Si son état ne s’améliore pas dans un délai de 24 h, l’individu est euthanasié à l’aide d’une surdose d’anesthésiant par balnéation. Pendant les expériences menées pour l’étude des aptitudes comportementales, les individus sont gardés en bacs individuels pendant 5 jours afin de pouvoir conserver leur identité. L'individualisation des poissons lors des expériences de comportement est maîtrisée et a déjà été mis en place au laboratoire dans le cadre d’un autre projet. Le stress qui pourrait être provoqué par l’isolement est réduit par la mise en place d’un contact visuel de proximité entre les poissons. Enfin, lors des mesures de taille et poids, les poissons sont maintenus en groupe jusqu’à l’anesthésie et manipulés seulement sous anesthésie. Le poisson ne reste pas plus de 1 min hors de l’eau avant d’être transféré en bac de réveil.
Choix des espèces
Le médaka est caractérisé par une reproduction non-saisonnière en laboratoire, une bonne fécondité et par des cycles de vie courts (3-4 mois) qui permettent d’aborder aisément les questions des effets à long-terme impliquant des expositions à l’ensemble des stades de vie. Dans ce projet, il est utilisé comme un poisson modèle pour les poissons vivant en eau de mer.
Etude du rôle du toucher affectif dans les troubles autistiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
674 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une mutation liée à l'autisme, elles reçoivent des injections quotidiennes, une partie subissant en plus l'implantation d'une puce, puis sont suivies dans des tests comportementaux nommés, suivi automatisé en cage, test de sociabilité à trois chambres et caresses au pinceau sous enregistrement cardiaque. Le porteur indique que la chirurgie d'implant peut provoquer stress et gêne durant une semaine. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou mathématique ne reproduit la dimension émotionnelle du toucher, et que la souris ne peut être remplacée, les retombées pour les personnes autistes restant lointaines.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en évidence l’importance du toucher affectif et social dans les troubles du spectre autistique et son rôle potentiel en tant que thérapie dans ce genre de trouble neurodéveloppementaux
Bénéfices attendus
Ce projet permettre de mettre en évidence l’effet du toucher dans le neurodéveloppement et son rôle dans les troubles neurodéveloppement tel que les troubles du syndrome autistique (TSA). Si l’hypothèse de vase est validée, cela permettra à court terme de réduire les déficits des animaux atteint de ce syndrome par nos différentes approches. A long terme ce projet permettra de proposer des interventions sur les patients autistiques basé sur le toucher affectif ou une approche pharmacologique afin de réduire les déficits liés au TSA.
Procédures
544 animaux recevront des injections intrapéritonéales quotidienne pendant 7à 10 jours sous anesthésie gazeuse (5 minutes) pour limiter la souffrance et le stress des animaux. 302 animaux subirons en plus une petite chirurgie unique (5 minutes) sous anesthésie gazeuse pour implanter des puces d'identification radio (puce RFID) en sous-cutanés à l'aide d'un trocart. Ces animaux seront ensuite testé dans le système du live mouse tracker (ou LMT) et dans le test d'interaction social sans aucune intervention autre que le déplacement de l'animal dans la cage du LMT (enregistrements uniques de 120h) et du test de sociabilité à trois chambres de (enregistrement uniques de 30 minutes). Le système du Live mouse tracker (LMT) a été spécialement conçu pour permettre le suivi, l'identification et la caractérisation automatiques en direct par étiquetage comportemental d'un maximum de quatre souris dans un environnement enrichi standardisé, sans limite de temps avec de la nourriture et de l’eau ad libidum. Le système est constitué d'une cage de 50x50cm reposant sur un plancher contenant 16 antennes radios RFID et une camera infrarouge sur le dessus. La cage contient de la litière, deux biberons d'eau, une mangeoire contenant des croquettes à volonté, divers enrichissements (coton, papier, carton) et une maison en plexiglas rouge. Le LMT permet d’accumuler de grandes bases de données de façon non biaisé sur le comportement social des animaux avec une granulométrie beaucoup plus grande que les tests classique sans avoir à manipuler les animaux. Le test de sociabilité quand à lui est constitué deux trois arènes de 40cm² connectées par des portes que l'animal test peut explorer librement. dans deux de ces compartiments se situe soit une autre souris, soit un objet. Le déplacement de la souris et suivie grâce à une camera et le temps d'interaction avec la souris ou avec l'objet est calculé. Les animaux sont vigil durant ces tests. 268 animaux, tous vigiles, seront placés dans le système ECgenie deux fois au cours de leur vie (p15 et p80) pendant que l'expérimentateur appliquera sur le dos à l’aide d’un pinceau en poil de martre souple une caresse à une vitesse de 3 cm/s pendant 10 minutes. Le système ECG génie est un système d'enregistrement du rythme cardiaque non-invasif. l'enregistrement est réalisé lorsque l'animal pose ses pattes sur deux électrodes posées au sol. Il ne nécessite aucune contention et les animaux sont donc libres de leur mouvement dans le système.
Impact sur les animaux
Ce projet se base sur l’utilisation d’un modèle murin génétique de trouble du spectre autistique couramment utilisé en recherche sur l'autisme. La souris posedant une mutation humaine relié au TSA (Shank3ΔC) présente une anxiété accrue, des troubles de reconnaissance sociales ainsi que des comportements compulsifs. Les chirurgies nécessaires à ce projet pour poser les implants nous permettant de suivre les animaux dans le live mouse tracker est une petite chirurgie similaire à celle utilisée pour identifier des animaux avec des puces radio. Dans ce cas, nous prévoyons que des effets indésirables liés à cette chirurgie (stress et gêne) peuvent durer 1 semaine.
Devenir
La plupart des animaux utilisés étants génétiquement modifiés et/ou infectés par des virus génétiquement modifiés eux aussi, il nous est impossible de replacer ou de faire adopter ces animaux. Ils seront donc mit à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
La perception du toucher est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul, en particulier sa dimension émotionnelle. Il n’existe pas de modèles in-vitro ou de modèles mathématiques permettant de modéliser la représentation du toucher pouvant mimer une émotion, en dehors des animaux de laboratoire. De plus, la variété des techniques de modifications génétiques chez la souris permet d'identifier et de cibler spécifiquement des mécanismes moléculaires ou cellulaires à un niveau où l’expérimentation humaine n’atteint pas ce niveau de résolution. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Chez l’homme, la dimension émotionnelle du toucher est un paramètre confondant, qui rend difficile la constitution de petites cohortes homogènes. À l’inverse, les modèles animaux sont homogènes et fournissent des résultats reproductibles. Ceci permet d'établir avec précision le nombre d'animaux nécessaire à la validation des hypothèses de travail par des tests de puissance statistique. Nous exploitons au mieux nos enlevages, puisque nous étudions mâles et femelles, et que nous étudions la majorité des génotypes produits. De plus, le test de LMT (qui est un des tests comportementaux principalement utiliser dans ce projet) est un test où aucune intervention extérieure n’est nécessaire et permet de grandement enrichir la cage des animaux, réduisant leur niveau de stress tout en garantissant l’enregistrement d’une grande quantité de donnée. Cela permet aussi de faire des tests comportementaux conventionnels sur ces animaux, réduisant le nombre d’animaux total utilisés. Ce projet propose d’utiliser plusieurs approches afin d’achever le même objectif, mais dès les premiers résultats prémilitaires obtenus, il sera possible de juger laquelle de ces approches est la plus efficace et donc de réduire le nombre de procédures qu’au modèle le plus efficace (viral contre génétique par exemple).
Raffinement
Nos procédures requièrent que tous nos animaux soient suivis dès leur naissance. Ceci permettra de s’assurer du bien-être des animaux tout au long de leur vie en suivant certains paramètre définis par une fiche et grille de suivi clinique au minimum trois fois par semaine (en annexe). L'aspect extérieur (ex: piloérection, signes d’infection ou de plaie, paralysies, forme et orientation des yeux, oreilles et moustaches), le comportement (ex: activité, vocalisation spontanée, prostration) et le poids (perte de plus de 20 % du poids) sont particulièrement suivis. Ce suivi tout a long de la vie par les expérimentateurs permettra aussi de réduire le stress des animaux qui y seront habitué. Cela augmentera aussi la qualité et la reproductibilité des résultats, et donc in fine le nombre d’animaux nécessaire. Tous les tests comportementaux présents dans cette saisine ne sont pas stressants ou anxiogènes et laissent une liberté d’action maximale aux animaux. Toutes les manipulations, pharmacologiques ou génétiques, ont pour but d’améliorer les symptômes du trouble autistique et donc d’améliorer les conditions de vie des animaux, et cela, très tôt après leurs naissances. De plus, le test de LMT (qui est un des tests comportementaux principalement utiliser dans ce projet) est un test où aucune intervention extérieure n’est nécessaire et permet de grandement enrichir la cage des animaux, réduisant leur niveau de stress tout en garantissant l’enregistrement d’une grande quantité de donnée. Toutes les douleurs opératoires et postopératoires seront prises en compte avec une prise en charge pharmacologique adaptée.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris, car c’est le modèle mammifère de référence pour la technique de modification génique. Le projet scientifique vise à utiliser la puissance de la génétique chez la souris pour étudier le rôle des gènes essentielles dans la perception et l’intégration sensorielle normale et pathologique dans un modèle d'autisme. Notre projet vise à moduler différentes voies neuronales durant les étapes précoces du développement neuronal qui ont lieu entre la naissance et l'adolescence pour en observer les conséquences à l'état adulte. Par conséquent nous manipulerons les animaux dès la naissance et jusqu'à l'âge adulte.
Comprendre l’origine génétique de la mortinatalité associée à des modèles de trisomie 21.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à léger, certaines menées sans réveil. Des femelles gestantes porteuses de modèles de trisomie 21 sont tuées pour extraire leurs foetus, ceux prélevés à un stade précoce étant rendus inconscients par le froid puis immergés dans un fixateur, les autres euthanasiés chimiquement, afin d'analyser à quel stade survient la mortalité de ces lignées. Le porteur reconnaît que la sortie et l'isolement des foetus entraînent stress et angoisse, qu'il dit limiter à moins d'une heure. Il affirme que l'étude de ces gènes du développement ne peut se faire que sur un modèle animal.
Objectifs
Un des objectifs de notre laboratoire consiste à créer et à étudier de nouveaux modèles murins de trisomie 21 (T21)obtenus par ingénierie chromosomique, afin de mieux connaître les mécanismes de cette pathologie. C’est une maladie congénitale complexe, neuro-dégénérative, qui affecte le développement embryonnaire. Ce syndrome résulte de la présence en trois copies de tout ou partie (trisomie complète ou partielle) du chromosome 21 humain (HSA21). L’homologie entre le HSA21 et les chromosomes murins est maintenant bien définie et approximativement 99% des gènes murins possèdent un orthologue chez l’homme. Afin de mettre en évidence des gènes ayant un impact majeur dans le phénotype, et ainsi proposer de nouvelles voies thérapeutiques, nous avons créés différentes lignées de souris porteuses de trisomies partielles. En étudiant la transmission de la trisomie de ces différentes lignées, nous nous sommes rendus compte que le taux de transmission n’était pas celui attendu (uniquement 36% de trisomiques en moyenne dans la descendance) notamment pour une lignée porteuse d’une petite trisomie partielle correspondant à une région bien déterminée (alors qu’il devrait être de 50%). Il semblerait donc que cette région dites "critique" soit responsable d’une léthalité in utéro ou post naissances. Afin de mieux caractériser ce phénomène de mortinatalité, nous voulons étudier la viabilité des souris de 4 lignées différentes : 1modèle correspondant à la plus petite région où apparait la léthalité et 3 autres modèles plus complets pour identifier d'éventuelles interactions génétiques.
Bénéfices attendus
Nous espérons pouvoir déterminer le stade de la léthalité observée dans différents modèles de souris de trisomies partielles ou complètes et faire une relation entre les phénotypes et les gènes de ces régions.
Procédures
Après mise à mort de la femelle gestante, les fœtus à E18.5 seront sortis des cornes utérines en incisant longitudinalement le muscle utérin. Après une observation macroscopique, ils seront ensuite euthanasiés par administration d’un euthanasiant chimique (contention de 10 secondes pour administrer l’euthanasiant). Les fœtus à E14.5 seront sortis des cornes utérines après mises à mort de la femelle gestante. Après une observation macroscopique sous loupe binoculaire, ils seront rendus inconscients par le froid (15 minutes). L'engourdissement par le froid entraine une perte de conscience car une stimulation de la pointe de la patte avec une pince n’entraine aucune réaction du foetus. Ensuite, les foetus seront euthanasiés par immersion dans le fixateur histologique.
Impact sur les animaux
La souffrance fœtale est difficile à évaluer si la mort a lieu en fin de gestation ou au moment de la naissance. On peut estimer qu’il peut y avoir souffrance ou inconfort dans le cas d’une mutation où le nouveau-né meurt peu de temps après la naissance voire quelques jours après. Mais, dans le cadre de ce projet, pour éviter que la femelle gestante souffre de complications et pour minimiser la souffrance ou l’inconfort, les embryons ou les fœtus seront prélevés un jour avant leur mort anticipée ou un jour avant la naissance.
Devenir
Les fœtus à E14.5 et à E18.5 sont euthanasiés pour les analyses histologiques ou biologie moléculaire.
Remplacement
Le modèle animal est le seul qui nous permet d’étudier dans son ensemble les effets des gènes d’intérêts sur les fonctions vitales ainsi que le développement. Le développement de maladies congénitales, dont on ne connait à priori pas la nature avant de les avoir observées ne peut pas être remplacée par une autre approche que l’expérimentation animale.
Réduction
Cette stratégie permet de réduire le nombre d’animaux utilisés car les stades sont choisis à des moments clés pour la survie et permettent d’éviter la dissection au hasard afin de déterminer le stade de létalité. Nous suivons aussi la gestation des femelles grâce à un examen échographique, et cela permet d’euthanasier uniquement les femelles dont nous avons besoin c’est-à-dire gestantes et pas des non gestantes (car à des stades embryonnaires précoces, la détermination de la gestation par palpation est sans garantie). Les nombres d’animaux sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique.
Raffinement
Tout est mis en œuvre pour le bien-être des animaux, la surveillance de l’état de santé et des actions appropriées sont réalisées à l’animalerie si nécessaires (soins, analgésie, …). Une attention particulière sera aussi appliquée lors du test de viabilité sur les fœtus qui ne dépassera jamais une heure. Ce test nécessite la sortie de fœtus de la mère et leur isolement, ce qui entraîne nécessairement un stress et une angoisse. Nous nous appliquerons à réduire ce stress au minimum en gardant les fœtus proches les uns des autres sur une plaque chauffante afin d’éviter une hypothermie et en limitant leur manipulation au stricte nécessaire.
Choix des espèces
De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal de la souris est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Le stade 18.5 jpc est choisi comme point de départ car c’est le stade qui précède la mise bas et les foetus normaux sont déjà viables pour le test d’adaptation à la vie extra-utérine. Le stade 14.5 jpc correspond à l’achèvement de l’organogenèse.
Rôle des hormones sexuelles femelles sur la régénération musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit des lavages vaginaux, une lésion musculaire provoquée par électrostimulation sous anesthésie, des mesures de force et des injections, avant d'être tué pour prélever l'utérus et le muscle. Le porteur indique que le cumul de ces actes induit un stress. Il reconnaît que la régénération musculaire peut être étudiée en partie in vitro, mais affirme que l'interaction entre cellules ne s'observe qu'in vivo.
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Il a été montré que ce processus est plus efficace chez les souris femelles par rapport aux souris mâles. Cette différence pourrait être liée, au moins en partie, aux variations d’un type d’hormones sexuelles femelles au cours du cycle ovarien. L’objectif de cette étude est d’évaluer le rôle des hormones sexuelles femelles dans un modèle standardisé de dommage musculaire induit par électrostimulation
Bénéfices attendus
Le projet vise à comprendre le rôle des hormones sexuelles femelles dans la réparation du tissu musculaire. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques affectant la production/disponibilité des hormones sexuelles femelles (ménopause, cancer…).
Procédures
Les souris sont soumises à des lavages vaginaux (2 au maximum, durée 1 minute maximum), un protocole d’électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 10-15 minutes), une mesure de force musculaire (5 au maximum, anesthésie générale de 5-10 minutes) et des injections intrapéritonéales (2 au maximum)
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables légers sont attendus du fait d’un cumul d’actes (lavages vaginaux, injections, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer l’utérus et le tissu musculaire pour des analyses histologiques
Remplacement
Des travaux ont déjà démontré in vitro le rôle des hormones sexuelles femelles sur la prolifération des cellules souches musculaires. Aussi, bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. La réalisation complète du projet est conditionnée à la mise en évidence des effets des hormones sexuelles femelles lors d’une première phase expérimentale.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle de dommage musculaire et de lavages vaginaux montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques. Un lavage vaginal est effectué ce qui permet d’éviter la réalisation d’un prélèvement intravaginal (frottis)
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Le projet porte sur le rôle des hormones sexuelles dans la régénération musculaire. Des souris adultes, âgées de 8-12 semaines, sont donc utilisées afin que la production de ces hormones soit fonctionnelle.
Etudes de toxicologie, tolérance locale, pharmacocinétique et pharmacologie chez le miniporc
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 110 miniporcs vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à modéré, la plupart tués à l'issue, 160 réutilisés et 40 adoptés. Chaque animal reçoit un produit à tester par administration unique ou répétée, avec pose de cathéters ou d'implants et prélèvements sanguins, avant l'analyse de ses organes, pour des études de toxicologie exigées par la réglementation avant les essais cliniques. Le porteur indique que ces actes peuvent provoquer douleur post-opératoire, perte de poids, léthargie et inflammation locale. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative pour déterminer la toxicité d'une substance après exposition systémique et qu'il faut accéder à l'animal "dans son entièreté".
Objectifs
La réalisation d’études de toxicologie générale, toxicologie de la reproduction, toxicologie juvenile, tolérance locale, de pharmacologie de sécurité est une obligation réglementaire avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (dispositif médical, médicament vétérinaire, produit chimique). Ces études sont réalisées selon les guidelines ICH, EMA, OCDE, US FDA ou toute autre guideline applicable. Préalablement aux études réglementaires, la réalisation d’études de pharmacocinétique / pharmacodynamique, pharmacologie d’efficacité, dose maximale tolérée et étude de recherche de doses est un prérequis nécessaire afin de collecter des données d’exposition, de toxicité et de pharmacologie sur le produit et de choisir ou ajuster de manière raisonnée les doses et le design des études réglementaires.
Bénéfices attendus
Les études de toxicologie par administration unique ou répétée sont réglementairement requises par les lignes directrices Européennes et Internationales et représentent une etape essentielle avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain (sur des volontaires sains en court terme et sur les patients dans le moyen et long terme), ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (dispositifs médicaux, médicament vétérinaire, produit chimique ). Pour les médicaments humains et vétérinaires et dispositifs médicaux, ces études sont des pré-requis indispensables aux essais cliniques. Ils visent à définir le profil de toxicité ou de tolerabilité des produits à tester et donc rendre les essais cliniques plus sures pour les patients ou volontaires participant à l'essai. Ils permettent aussi de définir le niveau de dose (marge de sécurité) pour la première administration à l’homme ou l’animal. Ces études incluent des évaluations toxicocinétiques pour déterminer les taux d’exposition entrainant une toxicité. En ce qui concerne les produits chimiques ce projet permettra d’evaluer la sécurité des molecules chimiques dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal comme demandé par la loi et par les lignes directrices européennes. Ce projet permettra donc d’avancer dans le développement des solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques innovantes pour le traitement de certaines maladies chez l’homme, les animaux ou les plantes et de contribuer à l’evaluation de la sécurité des produits chimiques.
Procédures
Ces études consistent en administration unique ou répétée du produit à tester. La fréquence de ces administrations varie en fonction du produit (par exemple 1 fois par jour, 1 fois par semaine). La durée des administrations est généralement rapide quelques secondes à quelques minutes, pour les administrations orales, souscutanée ou intraveneuse en bolus. Elles peuvent parfois être plus longue pour les perfusions (de plusieurs minutes à continue). Les administrations sont suivies d’observations régulières des animaux (plusieurs fois par jours), pesées corporelles (généralement de 1 fois par jour à 1 fois par semaine), évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires (généralement 1 à 4 fois par étude), sur le développement neurocomportemental, squelettique et des fonctions reproductives, évaluation des fonctions respiratoires et cardiovasculaires et analyse macroscopique ou histopathologique. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les autres techniques ou procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec le cas échéant un protocole d’analgésie adapté. Le nombre et la durée des interventions sont adaptés en fonction de l'utilisation clinique, de la durée d'étude, de la cinétique d'exposition, des effets attendus et sont définis dans le plan d'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration, de prélèvement de sang ou de pose de cathéter - Douleur légère à modérée en post-opératoire (quelques jours) pour la pose des cathéters ou d’implants de capteurs collectant des données physiologiques (par exemple pression artérielle, ventriculaire, pleurale, ECG, EMG ou autres) - Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration des médicaments ou produits chimiques à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Des points limites précoces adaptés sont mis en place selon la typologie d’etude et la classe du produit à tester afin d’eviter une prolongation inutile des effets observés. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures sont rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie)
Devenir
En accord avec le plan d’étude utilisé les animaux pourrons être 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques, microscopiques et/ou squelettiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles ; 2) gardés en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies ; 3) replacés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude, conditionnée par un examen vétérinaire favorable.
Remplacement
Pour ce qui est du remplacement, il n’existe pas actuellement d’alternatives à l’expérimentation animale qui permettent de déterminer la toxicité de substances suite à une exposition systémique. L'utilisation du mini-porc répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Dans ces études, un relevé des signes cliniques et des paramètres sanguins des animaux est requis, il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, il est impossible de le remplacer par des méthodes alternatives pour évaluer les effets du produit.
Réduction
Le nombre d’animaux pour les études réglementaires est défini dans les guidelines internationaux applicables (Guidelines ICH, …) et adapté en fonction du nombre de doses testées, du nombre de produit testés et de la présence ou non d’une période de réversibilité. Pour les études préliminaires, le nombre d’animaux par lot est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des objectifs de l’étude, du nombre de doses testées et du nombre de produits et est précisé dans le plan d’étude.
Raffinement
Pour améliorer leur bien-être, les miniporcs males et femelles seront hébergés en groupes sociaux sauf incompatibilité avec la procédure expérimentale ou incompatibilité comportementale. Les miniporcs seront hébergés sur litière (copeaux de bois) dans un box avec un panier et un jouet (chaine métallique,…). Un enrichissement alimentaire est distribué quotidiennement aux miniporcs et réparti dans la litière permettant aux animaux de fourrager. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les actes pouvant engendrer du stress ou de l’inconfort seront réduits au minimum nécessaire (nombre et durée) et seront réalisés sous anesthésie avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption des administrations, réduction de la dose testée par exemple). Les autres techniques ou procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec le cas échéant un protocole d’analgésie adapté.
Choix des espèces
Il s’agit d’une justification réglementaire. En effet, le mini-porc est une espèce non-rongeur acceptée par les agences réglementaires. Le choix de cette espèce répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Il est fait en fonction de critères scientifiques précis, des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques disponibles et en fonction des analogies entre l’homme et l’animal. De la naissance à adulte mature. En fonction du type d’étude et de la population ou des animaux cibles du produit, nous choisirons l’âge le plus adéquat. Ce choix et la justification sont détaillés dans le plan d’étude.