Procédures légères
Les Effets Longitudinaux de la Psilocybine sur le Sommeil Chez La Souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
336 souris reçoivent une injection unique de psilocybine, dont 56 après l'implantation chirurgicale d'un dispositif d'enregistrement cérébral de deux heures, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à sévère. Toutes sont tuées à l'issue pour analyse histologique du cerveau. Certaines subissent des privations de sommeil répétées et deux tests comportementaux de locomotion et d'anxiété, pour décrire comment la substance modifie le sommeil sur un mois. Les améliorations du sommeil rapportées chez l'humain, que le porteur invoque, restent au conditionnel face à ces atteintes.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre comment les champignons hallucinogènes, une substance psychoactive, modifient temporairement l’activité cérébrale, et peuvent influencer le sommeil à court terme et/ou sur plusieurs semaines. Le sommeil joue un rôle essentiel dans la santé mentale et physique, mais les mécanismes biologiques expliquant pourquoi cette substance peut modifier durablement la qualité du sommeil restent mal compris. L’objectif est donc de décrire précisément les changements de sommeil induits par cette substance et d’identifier quels circuits cérébraux et quelles cellules pourraient être impliqués dans ces effets. Pour répondre à ces questions, l’étude utilisera des souris adultes. Le sommeil sera enregistré de manière répétée au cours du temps afin de comparer, chez un même animal, une période de référence (avant administration) et plusieurs périodes de suivi (immédiatement après, puis une semaine, deux semaines et un mois plus tard). En complément, des tests comportementaux simples et non invasifs permettront d’évaluer l’exploration et des indicateurs liés à l’anxiété, car ces dimensions peuvent interagir avec le sommeil.
Bénéfices attendus
La psilocybine fait l’objet d’un intérêt clinique croissant en psychiatrie, avec des essais contrôlés rapportant des améliorations rapides et parfois durables des symptômes dans la dépression (notamment épisodes dépressifs majeurs et formes résistantes), et un champ de recherche en expansion pour d’autres troubles liés au stress et au trauma dans des cadres thérapeutiques encadrés. Parallèlement, de nombreux travaux et retours cliniques chez l’humain rapportent, après une prise, une amélioration subjective de la qualité du sommeil (sommeil perçu comme plus réparateur), même si la physiologie du sommeil reste encore insuffisamment caractérisée. Le projet vise donc à mieux caractériser les effets aigus et long terme de la psilocybine sur l’architecture du sommeil et son homéostasie et identifier les effets cellulaires. Ces résultats pourraient améliorer l’interprétation des effets thérapeutiques rapportés en clinique et contribuer à l’optimisation de stratégies de prise en charge où le sommeil est un déterminant majeur du pronostic et de la résilience psychique.
Procédures
Les contraintes pour les animaux proviennent principalement de : (i) l’implantation d’un dispositif d’enregistrement chez 56 souris, correspondant à une chirurgie unique, qui dure environ 2H , suivie d’une récupération de 4 jours ; (ii) une injection expérimental unique (15s) du psychoactive sur 336 souris au total; (iii) des sessions d’enregistrement du sommeil de 24 h réalisées chez 56 souris réalisé 4 fois à 7 jours d’intervalle ainsi que, pour certains de ces animaux, des privations douces de sommeil limitées à 4 h suivies d’un enregistrement de 2 h post-privation pour étudier comment l’organisme essaye de récupérer 4h de sommeil en moins. Deux tests comportementaux non invasifs seront réalisés chez 56 souris à raison de 3 sessions espacées de 24H minimum pour chacun des tests. Le premier test consiste à mesurer la locomotion et l’anxiété (une durée de 10 minutes et qui sera réalisé deux fois pour étudier les effets de la substance psychoactive avant et après son injection). Le deuxième test étudie seulement l’anxiété, et dure aussi 10 minutes, et sera répété qu’une fois 30 jours après l’administration de la substance psychoactive.
Impact sur les animaux
Les nuisances principales sont liées à la chirurgie d'implantation (douleur post-opératoire, inconfort lié aux implants, risques d'infection). La psilocybine peut induire des modifications transitoires du comportement (hyperlocomotion, réactivité accrue); la surveillance post-injection est donc renforcée.
Devenir
Le sort prévu pour tous les animaux sont une mise à mort adaptée pour chaque procédure. Les objectifs poursuivis dans cette étude nécessitent des analyses histologiques des tissus cérébraux ainsi que certains enregistrements ex vivo, ce qui oblige à mettre les animaux à mort en fin de procédure.
Remplacement
L’étude cherche à comprendre comment une substance pouvant modifier l’activité cérébrale influence le sommeil dans un organisme entier, et comment ces effets s’accompagnent de changements durables dans certaines régions du cerveau. Ces questions nécessitent d’observer simultanément le sommeil, l’activité, la température et des réponses biologiques intégrées (réseaux cérébraux, interactions entre différents types de cellules), ce qui ne peut pas être reproduit de façon fiable par des méthodes entièrement alternatives. Des approches non animales (cultures cellulaires, organoïdes, modélisation) peuvent aider à explorer certains mécanismes isolés, mais elles ne permettent pas de mesurer l’architecture du sommeil ni ses régulations physiologiques sur plusieurs semaines. L’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le projet est conçu pour utiliser le moins d’animaux possible tout en assurant des résultats robustes. La stratégie repose sur des suivis dans le temps d’un même animal et sur plusieurs types d’expériences quand celles-ci ne sont pas invasives ou que c’est possible en respectant le bien-être des animaux, diminuant ainsi la variabilité statistique.
Raffinement
Toutes les procédures sont organisées pour limiter la douleur, le stress et la durée de contrainte. Une habituation progressive est mise en place (manipulation douce, acclimatation aux conditions d’enregistrement) afin de réduire l’anxiété liée aux manipulations. Pour les animaux nécessitant une chirurgie, l’intervention est réalisée sous anesthésie avec des mesures de prévention de la douleur en utilisant des analgiques avant et après l’opération, et une surveillance post-opératoire renforcée ; une période de récupération est respectée avant les enregistrements. Les périodes de privation de sommeil sont limitées dans le temps et réalisées par des stimulations douces, sans recours à des méthodes aversives, avec un retour rapide à des conditions calmes. Les tests comportementaux sont non invasifs, effectués sur des durées minimales, dans une salle dédiée, avec nettoyage systématique et retour rapide au logement. Des critères d’arrêt anticipé (points limites) et une mise à mort précoce sont prévus en cas de signe de souffrance non contrôlée, afin de garantir le niveau de bien-être maximal compatible avec les objectifs scientifiques.
Choix des espèces
La souris est utilisée car elle constitue un modèle de référence pour l’étude du sommeil : elle présente des états de vigilance bien caractérisés et permet des suivis répétés à l’échelle de plusieurs semaines nécessaires à l’analyse des effets persistants. Enfin, l’espèce murine permet le recours à des outils génétiques et histologiques indispensables aux objectifs du projet. De plus, nous étudierons ces effets sur des souris âgées de 80 jours, là où la maturation du cerveau est finie, et donc le sommeil stabilisé, assurant que les effets que nous allons voir ne peuvent pas être attribués à l’âge.
Séances de travaux pratiques de formation règlementaire
- Enseignement supérieur
Rats : 605
Lapins : 75
Réutilisés d'une séance à l'autre avant, pour certains, d'être proposés à l'adoption, 1 605 souris, rats et lapins vont être utilisés dans des travaux pratiques de formation réglementaire. Les rongeurs et lapins vigiles subissent jusqu'à trois gestes techniques par séance, injections, gavages ou prélèvements sanguins, et une partie des rats une chirurgie sous anesthésie sans réveil. Le niveau de souffrance déclaré va de léger à modéré, les souris étant tuées à la fin de la séance. La finalité n'est pas de produire des connaissances mais de faire pratiquer les gestes de base sur animal vivant à des stagiaires en formation.
Objectifs
Les formations règlementaires nécessaires à l’application de procédures, à leur réalisation ou à leur conception prévoient des parties pratiques. La conception de ces programmes pédagogiques suit la trame imposée par l’Arrêté du 1er Février 2013, qui inclut le module 8b intitulé « Procédures expérimentales faiblement invasives : éléments pratiques par groupe d’espèces ». D’autre part, la règlementation française prévoit une formation spécifique pour les personnes qui réalisent et conçoivent des projets incluant de la chirurgie. Le module de formation 8b et la formation à la chirurgie expérimentale sont susceptibles d’inclure des travaux pratiques sur animaux vivants. L’objectif pédagogique : - pour le module 8b de la formation « concepteur » : est de montrer aux futurs chercheurs les enjeux de l’inclusion d’animaux dans des procédures faiblement invasives, pour que par la suite, ils connaissent les bonnes pratiques en matière de contention, administration et prélèvement et qu’ils les utilisent pour concevoir les projets. - Pour le module 8b de la formation « applicateur » : de montrer, et faire pratique avec un encadrement très attentif, les bonnes pratiques dans les mêmes domaines. - Pour la formation à la chirurgie expérimentale : de mettre en pratique avec un encadrement poussé et attentif, pour la première fois, les gestes de base en chirurgie, après qu’ils auront été travaillés sur des modèles inertes et des cadavres. Dans tous les cas, le tutorat, qui doit être mis en place à la prise de poste, est la véritable formation pratique, adaptée aux tâches de chacun. Il peut commencer quand la personne a validé la formation règlementaire. Ce projet présente les séances de travaux pratiques sur animaux vivants prévues dans les programmes de formation de notre établissement, destinées à des étudiants en formation initiale, inclus dans des programmes de licence pro, master ou en formation continue.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est pédagogique. Il permet de montrer aux étudiants les bonnes pratiques, passer des messages généraux en matière d’éthique et permet aux stagiaires d’essayer, avec un encadrement attentif, de pratiquer des gestes pour la première fois sur un animal vivant, selon les meilleurs standards actuels. A la différence du tutorat, le stagiaire est ici très encadré et n’est pas sur son lieu de travail, il se consacre totalement à sa formation et se prépare au futur tutorat.
Procédures
. Les animaux subissent un nombre limité et encadré de prélèvements sanguins et d'administrations au cours d'une séance de travaux pratiques. Les souris vigiles subissent un maximum de trois gestes techniques (injections, administration par voie orale ou prélèvements sanguins). Un prélèvement sanguin et des injections supplémentaires sont susceptibles d'être réalisés après anesthésie, avec une analgésie adaptée. Les rats vigiles subissent au plus 3 gestes techniques. Les lapins subissent au maximum deux piqures (injection ou prélèvement sanguin). Une procédure prévoit aussi une intervention chirurgicale sans réveil, pour laquelle les animaux reçoivent deux injections pour l'analgésie et l'anesthésie de niveau chirurgical avant la réalisation des gestes. Sur les animaux vigiles, le temps de contention est de l’ordre de 1 à 2 minutes pour les injections et de 5 minutes maximum pour les prélèvements sanguins.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent un nombre limité et encadré de prélèvements sanguins et d'administrations au cours d'une séance de travaux pratiques. Les souris vigiles subissent un maximum de trois gestes techniques (injections, administration par voie orale ou prélèvements sanguins). Un prélèvement sanguin et des injections supplémentaires sont susceptibles d'être réalisés après anesthésie, avec une analgésie adaptée. Les rats vigiles subissent au plus 3 gestes techniques. Les lapins subissent au maximum deux piqures (injection ou prélèvement sanguin). Une procédure prévoit aussi une intervention chirurgicale sans réveil, pour laquelle les animaux reçoivent deux injections pour l'analgésie et l'anesthésie de niveau chirurgical avant la réalisation des gestes. Sur les animaux vigiles, le temps de contention est de l’ordre de 1 à 2 minutes pour les injections et de 5 minutes maximum pour les prélèvements sanguins.
Devenir
A l'issue des séances de TP qui ne sont pas sans réveil, l'état de santé des animaux est évalué. S'ils sont en bonne santé, sans lésion dûes aux erreurs des stagiaires, ils sont gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres séances de formation. Au terme de plusieurs utilisations pédagogiques, ils peuvent être proposés à l'adoption.
Remplacement
Pour le module de formation règlementaire, de formation pratique aux procédures peu invasives, les cours qui précèdent les activités sur animaux montrent des images et des vidéos qui réduisent le nombre d’animaux au minimum nécessaire. La formation à la chirurgie expérimentale est un programme de 28h dans lequel les premières séances de travaux pratiques sont réalisées sur modèles inertes puis sur cadavre. La séance de TP sur animaux arrive en fin de formation quand la gestuelle a déjà été travaillée avec ces outils sans animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est déterminé en fonction du nombre de stagiaires inscrits à la séance. Il est limité au nombre nécessaire pour que chaque stagiaire puisse apprendre suffisamment en manipulant l’animal et en essayant les gestes sans que le même animal ne serve trop. Le nombre ne peut donc pas être trop bas pour limiter l’impact sur l’animal, cependant, nous préférons, en particulier pour les souris, qui sont euthanasiées à la fin de la séance, et chez qui les gestes sont réalisés sous anesthésie avec analgésie adaptée, réaliser plus de gestes faiblement invasifs par animal pour réduire le nombre d’animaux. Le calcul est, au maximum, de 1 lapin pour 3 stagiaires, 1 rat pour 2 stagiaires, 1 souris par stagiaire
Raffinement
Des règles internes on été définies pour limiter le nombre de gestes par animal : pas plus de 3 gestes faiblement invasifs comme une injection ou prélèvement sanguin par animal vigile et par séance pour les lapins, les rats et les souris dans le module pratique de formation aux procédures peu invasives. - recours à l’anesthésie générale avec analgésie adaptée des souris pour les TP du module 8b où l’on pratique plus de gestes. - anesthésie et analgésie de niveau chirurgical pour le TP de cathétérisme chirurgical chez le Rat. - application de points limites précoces pour retirer des séances des animaux trop stressés ou en cas d’échec d’un geste. Dans l’ensemble, comme l’objectif est de faire la démonstration des bonnes pratiques, les séances se passent dans le calme, étape par étape, avec un nombre important d’encadrants, ce qui laisse le temps de bien prendre en compte le stress potentiel induit.
Choix des espèces
Les modules de formation règlementaire pratique aux procédures peu invasives s’inscrivent dans des modules spécifiques d’espèces rongeurs, ou rongeurs et lagomorphes. La formation à la chirurgie expérimentale utilise des rongeurs parce que ce sont les espèces les plus couramment utilisées en recherche et qu’il est trop complexe d’organiser des TP d’initiation à la chirurgie avec d’autres espèces. Les animaux sont commandés en fonction de leur poids, ce sont des animaux jeunes adultes, tels qu’ils sont utilisés en recherche : Souris de 30g, Rats entre 250 et 300 g, Lapin de 2,5 à 2,8 kg.
Rôle du métabolisme des phosphoinositides dans la physiopathologie de la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 217 souris porteuses d'une myopathie qui les tue en moyenne vers treize semaines vont être utilisées, dans des procédures classées légères à sévères. Elles subissent des injections quotidiennes pendant 28 jours, des tests de force et de course, une stimulation électrique de la jonction neuromusculaire et l'injection d'un virus. Le RNT répète que cette maladie "ne provoque pas de douleur", tout en classant 418 de ces souris en souffrance sévère et en décrivant une dégradation musculaire jusqu'à la mort. Toutes sont tuées pour disséquer leurs muscles et tester trois traitements censés prolonger leur survie.
Objectifs
La myopathie centronucléaire liée au chromosome X est une maladie grave, touchant les garçons dès la naissance, qui rend les muscles très faibles et pour laquelle il n’existe malheureusement pas encore de traitement. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine qui contrôle le métabolisme de certains types de lipides. Lorsque la protéine ne fonctionne pas bien, les muscles perdent leur force et deviennent plus petits. Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans le fonctionnement du muscle et dans le développement de la myopathie centronucléaire, nous avons créé une nouvelle lignée de souris dans laquelle cette protéine a perdu sa fonction. Ces souris commencent à montrer des signes de myopathie vers 6 semaines et vivent moins longtemps que les souris normales. Dans leurs cellules musculaires, deux fonctions semblent particulièrement perturbées : la fonction mitochondriale et la fonction lysosomale. L’objectif du projet est de mieux caractériser l’évolution de la fonction musculaire chez ces souris au cours du développement de la myopathie centronucléaire et de comprendre comment les fonctions mitochondriale et lysosomale sont contrôlées par cette protéine. Nous testerons également plusieurs traitements pour restaurer les fonctions mitochondriale et lysosomale lorsque la protéine ne fonctionne plus afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques contre cette maladie. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs : les tests auront lieu dans l’EU 1 et la mise à mort sera effectuée dans l’EU 2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la perte de fonction de la protéine perturbe le fonctionnement normal du muscle et provoque la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (XLCNM). Plus précisément, il permettra d’étudier le rôle des fonctions mitochondriale (production d'énergie pour la cellule) et lysosomale (recyclage des déchets cellulaires) dans le développement de la maladie. De plus, il permettra de tester de nouveaux traitements potentiels en vérifiant qu’ils ne sont pas toxiques et qu’ils sont efficaces pour empêcher ou ralentir le développement de la XLCNM. Si les résultats sont positifs, ils pourront être proposés pour de futurs essais chez les patients atteints de myopathie centronucléaire.
Procédures
Sur le 1er groupe d’animaux, 4 fois (semaines 4-7-10-13), sur animal vigile sauf si mention contraire : -mesure de composition corporelle : contention dans l’appareil de mesure de la composition corporelle, 2 minutes -test de force (force d'agrippement des 4 membres à une grille reliée à un dynamomètre): 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais -test de course sur tapis roulant : 10-45 minutes selon la capacité des animaux -test de motricité (temps mis pour franchir un obstacle de type "échelle horizontale" en marchant): 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux -test de la fonction de la jonction neuromusculaire (animal anesthésié) : stimulation électrique 8 x 0,2 millisecondes Sur le 2ème groupe d’animaux, 1 fois : 1 injection sur animal anesthésié, 10 secondes Sur le 3ème groupe d’animaux : -injection intrapéritonéale : 1 / jour pendant 28 jours consécutifs, 28 x 10 secondes -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Sur le 4ème groupe d’animaux : -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Toutes ces interventions seront réalisées dans l’établissement EU 1.
Impact sur les animaux
La myopathie centronucléaire chez l’Homme se caractérise par une faiblesse musculaire dès la naissance, sans douleur, due à l’absence d’une protéine. La faiblesse musculaire s’aggrave progressivement jusqu’ à ce qu’ils ne puissent plus respirer et meurent vers l’âge de 2,5 ans. La souris que nous avons créée, dont la protéine n’est plus fonctionnelle, développe les premiers symptômes autour de 6 semaines. D’après nos premiers résultats, ces symptômes deviennent sévères rapidement pour aboutir à une perte de mobilité des membres inférieurs et à la mort des animaux autour de 13 semaines en moyenne. Ponctuellement, les souris seront soumises à des stress et de l’inconfort pour des durées très courtes (contention nécessaire aux injections et injections elles-mêmes, mesures de composition corporelle et de force) ou courtes avec fin immédiate du stress et de l’inconfort à l’arrêt de la manipulation (tests d’endurance). Les traitements viseront tous à améliorer le phénotype musculaire et à prolonger la durée de vie. Deux d’entre eux ont déjà été largement utilisés dans des modèles animaux et testés lors d’études cliniques. Concernant le troisième, son absence de toxicité à haute dose à court et moyen termes (4 mois) a déjà été testée et validée sur des souris. Afin de déterminer les conditions de traitement optimales, la présente demande inclut une expérience préliminaire au cours de laquelle des petits groupes de souris seront traités selon différentes modalités, mais à des doses inférieures ou égales à celle déjà testée. Enfin, l’injection par voie intraveineuse d’un virus spécial (utilisé chez l’Homme en thérapie génique), qui permettra de faire briller une protéine dans certaines parties de la cellule, bien que réalisée sous anesthésie, pourrait entraîner un inconfort léger au réveil. Pour éviter cela, nous utiliserons un gel analgésique localement.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort et leurs muscles disséqués pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires ou pour préparer des cultures de cellules musculaires in vitro.
Remplacement
Le but principal de ce projet est d’étudier un nouveau modèle de la myopathie centronucléaire pour mieux comprendre comment les muscles sont touchés. Ensuite, ce modèle servira à tester plusieurs traitements qui pourraient aider les muscles à mieux fonctionner. Pour cela, nous devons mesurer des paramètres importants du fonctionnement du muscle comme la force, l’endurance, la façon dont les souris bougent mais aussi combien de temps elles vivent. Ces paramètres ne peuvent pas être mesurés avec d’autres méthodes. Les autres méthodes disponibles sont des cellules musculaires qui poussent dans une boîte en plastique au laboratoire, mais ces cellules ne deviennent jamais aussi développées, ni aussi fortes, que de vrais muscles dans un corps vivant. Elles ne peuvent même pas vraiment se contracter comme un vrai muscle. Elles ont quand même été utiles pour comprendre ce qui ne marche plus quand la protéine d’intérêt est absente, et pour trouver quelles parties de la cellule sont perturbées (par exemple, les mitochondries et les lysosomes). Ces cellules seront d’ailleurs à nouveau utilisées plus tard pour comprendre comment elles réagissent aux traitements, mais pour bien étudier l’effet des médicaments sur les muscles, il faut utiliser les souris du modèle de myopathie centronucléaire.
Réduction
Nous avons utilisé des méthodes statistiques pour calculer combien de souris utiliser pour chaque expérience afin d’être sûrs d’obtenir des résultats fiables, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Tout d’abord, nous comparerons la force des muscles entre les souris saines et les souris malades au cours de l’évolution de la maladie. D’après nos tests précédents, il faut environ 21 souris par groupe pour voir une vraie différence. Nous incluerons 2 souris de plus dans le groupe malade au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Des souris seront également nécessaires pour étudier ce qui se passe à l’intérieur des muscles aux différentes étapes du développement de la maladie, c’est-à-dire aux âges de 4, 7, 10 et 13 semaines. Pour ces analyses, nous aurons besoin de 9 souris par groupe. Ensuite, nous ferons un essai pour vérifier une nouvelle technique qui permet de « marquer » certaines parties des cellules musculaires (mitochondries et lysosomes) avec un virus spécial. Pour ça, nous utiliserons seulement 3 souris saines par groupe. Pour comparer les protéines et les petites molécules dans ces mitochondries et ces lysosomes chez les souris saines et les souris malades, nous utiliserons 6 à 12 souris par groupe selon la variabilité des mesures. Les groupes de souris malades auront une souris de plus au cas où l’une meure plus tôt à cause de la myopathie. Puis nous testerons différents traitements (3 médicaments, donnés à différents moments au cours du développement de la maladie) pour essayer d’améliorer la force des muscles et augmenter la durée de vie des souris. Pour cela, nous aurons besoin de plusieurs groupes de souris pour comparer les effets de ces traitements à des souris saines et à des souris malades non traitées. Nous aurons besoin de 19 souris par groupe pour détecter une différence intéressante, et nous ajouterons 2 souris de plus dans les groupes de souris malades au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Enfin, des souris serviront à préparer des cellules musculaires en laboratoire pour comprendre ce qui se passe à l’intérieur des cellules et comment elles réagissent aux traitements.
Raffinement
La myopathie centronucléaire, chez les souris comme chez les patients, ne provoque pas de douleur au niveau des muscles, ni ailleurs. Nous serons quand-même attentifs à ce que les souris ne souffrent pas durant nos expériences. Pour cela, nous leur permettrons d’avoir un comportement aussi naturel que possible dans leurs cages en leur donnant du matériel leur permettant de ronger et de faire un nid, et elles seront plusieurs par cage afin de ne pas souffrir d’isolement. Lorsque leurs muscles deviendront faibles et qu’elles auront du mal à se déplacer, nous leur fournirons la nourriture et l’eau directement au fond de la cage pour qu’elles n’aient aucun effort à faire pour s’alimenter. Avant de réaliser les tests de la fonction musculaire, nous les habituerons aux systèmes utilisés pour qu’elles ne soient pas stressées au moment de faire les tests. Lorsque des anesthésies seront nécessaires, nous les placerons sur un tapis chauffant pour ne pas qu’elles aient froid durant l’expérience. Suite aux injections intraveineuses de virus, nous utiliserons un analgésique local.
Choix des espèces
La myopathie centronucléaire est une maladie musculaire due à l’absence d’une protéine dans le muscle. Nous avons donc créé une nouvelle lignée de souris chez laquelle cette protéine ne fonctionne pas dans le muscle afin d’étudier comment la protéine provoque la maladie. Ces souris ne présentent initialement pas de symptômes ; à partir de 6 semaines, leur fonction musculaire commence à se dégrader et elles meurent en moyenne vers 13 semaines. Dans les expériences sans traitement, nous utiliserons des souris âgées entre 4 et 13 semaines, c’est-à-dire avant le moment où elles risquent de mourir de la maladie. Dans les expériences avec traitements, ceux-ci auront pour objectif d’améliorer la fonction musculaire, mais également d’augmenter la durée de vie. Si ces traitements fonctionnent, nous serons donc amenés à étudier les souris au-delà de 13 semaines, plus ou moins longtemps en fonction de l’efficacité des traitements pour maintenir la fonction musculaire.
Maintien de 2 lignées de souris pour le modèle de la maladie de surcharge
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Gardées vivantes jusqu'à 30 mois pour être suivies au fil du vieillissement, 3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Elles portent une mutation reproduisant la maladie de Pompe et développent avec l'âge une surdité partielle puis une faiblesse musculaire, quelques prélèvements sanguins étant réalisés sous anesthésie locale. Le porteur qualifie ce modèle murin d'"indispensable" pour comprendre la maladie et tester des traitements. Le projet ne produit toutefois aucune donnée par lui-même, son seul objet étant d'entretenir ces lignées et de fournir des animaux à d'autres protocoles, reproducteurs et surnuméraires étant mis à mort.
Objectifs
Produire le nombre d’animaux nécessaires au maintien des lignées, aux projets autorisés (projet autorisé en cours), aux projets avec prélèvements terminaux hors procédures et aux projets à venir répondant au modèle pathologique de la maladie de Pompe.
Bénéfices attendus
La maladie de Pompe est une maladie rare dans laquelle l’organisme manque totalement d’une enzyme indispensable. En l’absence de cette enzyme, certaines substances ne sont plus correctement dégradées et s’accumulent dans les cellules, ce qui perturbe leur fonctionnement. Chez la souris, il existe un modèle expérimental de la maladie de Pompe qui reproduit bien ce qui se passe chez les patients. Ces souris présentent notamment des anomalies d’un mécanisme naturel de la cellule, comparable à un système de nettoyage et de recyclage interne. Ce système permet normalement d’éliminer les éléments usés ou inutiles afin de maintenir les cellules en bonne santé. Dans ce modèle, les atteintes sont relativement modérées mais ressemblent à celles observées chez les patients atteints des formes tardives de la maladie. On observe ainsi, avec le temps, une faiblesse musculaire progressive, et une atteinte du cœur qui apparaît plus tardivement et n’est pas mortelle, contrairement aux formes infantiles sévères. Certaines souris ont été génétiquement modifiées pour rendre ce système de nettoyage cellulaire visible grâce à un marqueur fluorescent. Cela permet aux chercheurs de suivre directement, au microscope, l’activité de ce mécanisme à l’intérieur des cellules. Ce modèle est unique et très précieux pour mieux comprendre comment la maladie évolue et pour tester de nouveaux traitements capables d’en ralentir la progression. Enfin, le vieillissement joue un rôle important : avec l’âge, le fonctionnement des cellules, leur capacité de nettoyage, de production d’énergie et de régénération musculaire diminue. Étudier des souris âgées atteintes de la maladie permet donc de mieux représenter la situation des patients adultes et de comprendre l’évolution complète et naturelle de la maladie de Pompe au fil du temps.
Procédures
Un prélèvement sanguin, sous anesthésie locale, sera réalisé 4 fois maximum (18, 24, 27 et 30 mois) par prélèvement à la veine de la queue afin de récupérer 1 à 2 gouttes de sang. Estimation durée < 1 min/prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
Il est possible d’observer des cas de cannibalisme des parents sur les souriceaux ou de parents ne s’occupant pas des souriceaux. Effets indésirables liés au phénotype dommageable : - Surcharge en glycogène et atteinte de l’autophagie dans les cellules des souris suite à l’absence génétique de l’enzyme ; - A un âge tardif (>12 mois) une surdité partielle est attendue, ce qui a été confirmée par les études fonctionnelles précédemment réalisées par notre unité (enregistrement des potentiels évoqués auditifs) ; - A un âge très tardif (>16 mois) une faiblesse musculaire est attendue, ce qui a été confirmée par les études précédemment réalisées par notre unité.
Devenir
L’ensemble des animaux reproducteurs seront mis à mort en fin de protocole. Les animaux atteignant 30 mois ou les animaux surnuméraires seront mis à mort si non intégrés à un projet.
Remplacement
Les modèles cellulaires de la maladie de Pompe ne reflètent que partiellement la pathologie et ne permettent pas d’atteindre l’ensemble des objectifs scientifiques. Dans l’objectif d'une compréhension mécanistique et physiopathologique de la maladie de Pompe avec possiblement le développement de stratégies thérapeutiques, seul un modèle complexe comme le modèle murin est pertinent et surtout indispensable.
Réduction
Le nombre de souris est optimisé et adapté afin d’assurer le maintien des différentes lignées murines et de répondre aux seules demandes des utilisateurs des protocoles de recherche. L’optimisation s’appuie sur une évaluation prospective la plus fine possible des besoins pour les projets concernés.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages à couvercle filtrant. Ils seront manipulés sous hotte sans rupture de confinement. Lors de la mise en accouplement, les reproducteurs sont dans un environnement enrichi : nourriture spéciale, maison, hamac et nid de coton. Si 2 portées consécutives ne vont pas jusqu’au sevrage, le reproducteur est mis à mort puis 21 jours après, en absence de gestation, la femelle est mise à mort. Pour préserver les relations parents-souriceaux, le change est décalé de 3 jours au moins après la mise bas et indiqué sur la cage. De plus, pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Des bouchons humidifiés sont mis directement dans la cage et une pipette adaptée est proposée pour faciliter l’hydratation des souriceaux. Des nids de cotons favoriseront la thermorégulation. Les animaux d’âge supérieur à 6 mois auront un bilan de santé aux âges de 18, 24, 27 et 30 mois. Le bilan sera composé d’un examen clinique avec une palpation rigoureuse pour rechercher toute grosseur puisque les cancers sont la première cause de mortalité chez de nombreuses souches de souris âgées. Plus spécifiquement le lymphosarcome est rapporté chez les souris C57BL/6 et B6/129 comme étant le plus fréquent. Les animaux présentant une masse ulcérée et adhérente au plan profond seront euthanasiés par surdosage de CO₂. Des modifications du métabolisme du glucose étant décrites chez l’animal âgé, une mesure de glycémie par prélèvement caudal sera réalisée. Elle sera complétée par des tests de tolérance au glucose ou à l’insuline si le diabète est supérieur à 2 g/l. En plus d’une glycémie > 2g/l, la présence de 2 autres signes notables affectant l’aspect général, le comportement ou la reproduction conduira à la mise à mort de l’animal. Pour les animaux manipulés, de plus de 12 mois, susceptibles d'être atteints de surdité partielle, donc moins sensibles aux bruits extérieurs, les opérateurs devront se signaler davantage aux animaux avant toute intervention. Pour les animaux avec une faiblesse musculaire, généralement d’âge supérieur à 16 mois, les croquettes seront mises en accès facilité directement dans la cage. Basé sur une expérience de 15 ans, nous n’attendons pas davantage de mort spontanée chez nos lignées transgéniques. L'analyse statistique des courbes de survie des souris GAA KO comparées à celles des WT entre 2016 et 2023 ne montre pas de différence significative de survie.
Choix des espèces
Le projet s'inscrit dans un contexte de maladie de Pompe (glycogénose de type 2) et la souris GAA-KO 6neo/6neo de fond génétique C57Bl6J/129Sv est le modèle murin de la maladie internationalement utilisé. L'âge à la reproduction étant entre 2 et 6 mois et la durée maximale de mise en reproduction étant de 7 portées, les reproducteurs pourraient être mis à mort au plus tard à l'âge de 12 mois. Les animaux nés et n’entrant pas au maintien des lignées, aux projets autorisés et aux projets à venir pourront être intégrés aux projets avec prélèvements terminaux hors procédures ou mis à mort si surnuméraires. Les animaux en vieillissement pourront être conservés jusqu’à 30 mois en ayant un suivi quotidien de leurs évolutions et en réalisant un bilan de santé aux âges de 18, 24, 27 et 30 mois.
Élevage, génotypage de lignées murines transgéniques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
- Système urogénital
Environ 3 000 de ces souris sont maintenues en vie pour la reproduction des lignées, les surnuméraires et celles au mauvais génotype étant tuées. 5 000 souris au total vont être utilisées, dans des procédures classées légères à modérées, pour l'élevage et le génotypage de lignées transgéniques. Chaque animal subit au sevrage une biopsie de la queue et la pose d'une bague auriculaire, certaines lignées développant un prolapsus anal ou des troubles respiratoires à l'âge adulte. Le porteur décrit ces lignées comme "indispensables" et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les défenses des muqueuses à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Les souris sont utilisées pour le maintien et l’amplification de lignées transgéniques, y compris des lignées présentant ou susceptibles de présenter un phénotype dommageable. Elles sont identifiées au sevrage par pose de bague auriculaire et, lorsque nécessaire, par génotypage à partir d’une biopsie de queue.
Bénéfices attendus
Les lignées transgéniques sont indispensables pour des projets visant à démontrer le rôle d’une famille de gènes fortement conservée entre l’Homme et la souris dans la protection des muqueuses. Elles permettent également de mieux comprendre les relations entre la variabilité de ces gènes et les altérations des mécanismes de défense des muqueuses sécrétrices. Ces modèles contribuent au développement de stratégies thérapeutiques et, à terme, à la mise en place de méthodes alternatives à l’expérimentation animale pour des études mécanistiques. Le projet permet également de maintenir un noyau de lignées transgéniques et de fournir des animaux à des laboratoires partenaires dans le cadre de collaborations scientifiques.
Procédures
La biopsie de queue (< 1 mm) est réalisée au sevrage sur des animaux vigiles, sous contention, pour le génotypage, concomitamment à la pose d’une bague auriculaire pour l’identification. Dans de rares cas, un génotypage complémentaire peut être réalisé à l’âge adulte par prélèvement au poinçon auriculaire sur animal vigile, sous contention.
Impact sur les animaux
Certaines lignées présentent un phénotype dommageable avéré ou potentiel. Des souris d’une lignée peuvent développer un prolapsus anal associé à une inflammation colorectale, tandis que des troubles respiratoires peuvent apparaître dans une autre lignée. Ces phénotypes sont observés uniquement chez des souris homozygotes âgées de plus de 5 mois. Sur la base de l’expérience acquise sur ces deux lignées, suivies depuis plusieurs années chez des souris âgées de moins de 6 mois, le phénotype dommageable reste peu fréquent (
Devenir
Les souris avec des génotypes requis sont maintenues en vie pour l’établissement et l’entretien des lignées ainsi que pour leur utilisation dans les protocoles expérimentaux du présent projet ou de projets associés. Les souris ne présentant pas de génotype requis (souris surnuméraires ou non nécessaires) sont mises à mort, soit dans le cadre de la gestion des colonies, soit en fin d’utilisation expérimentale. Les souris présentant un phénotype dommageable sont également mises à mort en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses sécrétrices, en particulier les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuels ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions au niveau de l’organisme entier. Les investigations chez l’Homme restent limitées et reposent principalement sur des observations cliniques et des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans ces pathologies nécessite une compréhension approfondie des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent, permettant le contrôle de l’environnement expérimental et de la variabilité génétique. Son système immunitaire est bien caractérisé, son génome entièrement séquencé, et de nombreuses lignées transgéniques sont disponibles pour étudier des gènes impliqués dans la défense des épithéliums. Certaines lignées utilisées dans ce projet contribueront également au développement d’approches complémentaires visant à réduire à terme le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
La production de souris est planifiée en fonction des besoins expérimentaux, estimés à partir d’approches statistiques et de l’expérience acquise. Les schémas d’accouplement sont optimisés afin de produire le nombre nécessaire de souris présentant les génotypes requis. Le maintien de certaines lignées par accouplement d’animaux homozygotes permet de limiter le recours aux prélèvements invasifs pour le génotypage. Les lignées qui ne seront plus utilisées sont conservées par cryoconservation.
Raffinement
Les souris sont élevées et utilisées dans des locaux agréés disposant d’un statut sanitaire « exempt de pathogènes spécifiques » (EOPS). Elles sont hébergées en cages enrichies, par groupes de 2 à 5 individus, avec accès ad libitum à une alimentation standardisée stérile et à de l’eau de boisson stérile. Le personnel en charge de l’élevage et des manipulations est formé et habilité conformément à la réglementation en vigueur. Les souris font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Les procédures réalisées dans le cadre du projet sont peu invasives et associées à une douleur de faible intensité. L’identification par bague auriculaire et le prélèvement d’une biopsie de queue (< 1 mm) pour le génotypage sont réalisés par du personnel formé, selon des gestes rapides et standardisés. Le poinçon auriculaire réalisé à l’âge adulte est effectué par du personnel formé, sur animal correctement maintenu, avec une contention brève et un geste rapide limitant le stress et permettant une lésion de petite taille à cicatrisation rapide. Les conditions d’hygiène sont adaptées afin de limiter tout risque de complication locale. Une anesthésie locale peut être envisagée en cas de sensibilité accrue ou d’évolution des pratiques. Les animaux susceptibles de développer un phénotype dommageable sont identifiés afin de permettre un suivi adapté. En cas d’apparition de signes cliniques évocateurs d’un phénotype dommageable, ils sont soumis aux points limites définis dans le protocole et retirés de l’étude si nécessaire.
Choix des espèces
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses, en particulier les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuels ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions à l’échelle de l’organisme entier. Les investigations chez l’Homme sont limitées et reposent principalement sur des observations cliniques et des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans ces pathologies nécessite une compréhension détaillée des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent de recherche, permettant le contrôle de l’environnement expérimental et de la variabilité génétique. Son système immunitaire est bien caractérisé, son génome entièrement séquencé, et de nombreuses lignées transgéniques sont disponibles pour l’étude de gènes impliqués dans la défense des épithéliums. Tous les stades de développement postnataux peuvent être concernés, dans le cadre du maintien et de l’amplification des lignées utilisées pour les besoins de projets de recherche faisant l’objet d’autorisations spécifiques.
Rôle de la qualité des lipides alimentaires sur la perméabilité intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Soumises à un jeûne puis à un gavage, 72 souris vont être utilisées, toutes tuées sous anesthésie pour prélever leurs organes. Les procédures sont classées en souffrance légère, la principale contrainte décrite étant le stress de la contention lors du gavage. Le porteur juge le recours à l'animal "indispensable", un tissu vivant en condition postprandiale ne pouvant selon lui être remplacé. La perméabilité de l'intestin, au cœur de l'étude, est mesurée sur l'organe prélevé, pour établir si la quantité et le type de lipides alimentaires la modifient après un repas.
Objectifs
La barrière intestinale constitue un élément clé dans la physiopathologie des maladies métaboliques, notamment l’obésité. Son altération favorise le passage, à des degrés divers, de composés pro-inflammatoires, induisant ainsi une inflammation d’intensité variable. Les facteurs à l’origine de cette altération, conduisant à une augmentation de la perméabilité intestinale, sont multiples : stress, alimentation, pathologies, etc. Parmi ces facteurs, un excès chronique de lipides alimentaires, en particulier d’acides gras saturés (AGS), est fréquemment associé à une augmentation de la perméabilité intestinale et à une élévation de l’inflammation, l’ensemble souvent corrélé au développement de l’obésité. L’objectif de ce projet, mené chez la souris, est de déterminer le rôle des lipides alimentaires, et plus spécifiquement de leur qualité, sur la perméabilité intestinale en condition postprandiale. Nos travaux précédents, réalisés sur un modèle de souris déficientes en CD36 intestinal (récepteur impliqué dans l’absorption des lipides) soumises à un régime riche en lipides saturés, ont mis en évidence un effet marqué du régime riche en lipides saturés sur la perméabilité intestinale. Nous cherchons désormais à déterminer si l’excès de lipides, à lui seul, peut influencer la perméabilité intestinale, ou si le type de lipides joue également un rôle modulateur après ingestion. Pour cela, la perméabilité intestinale sera évaluée à l’aide d’un dispositif spécifique de mesure sur les organes prélevés. Cette expérimentation permettra de répondre à notre objectif principal et d’apporter de nouvelles connaissances sur l’impact de la qualité des lipides alimentaires sur la perméabilité intestinale postprandiale. Les résultats obtenus permettront également de valider ce protocole en vue de son application à d’autres modèles.
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. La perméabilité intestinale est-elle modifiée suite à un repas riche en lipide (condition postprandiale) ? 2. La qualité des lipides alimentaires (Acides gras saturés AGS ou acides gras insaturés AGI) influence-t-elle la perméabilité intestinale ? En fonction des résultats obtenus dans ce projet, nous pourrons apporter une première preuve de concept sur l’impact des lipides alimentaires sur la fonction barrière de l’intestin, de même que de tester notre protocole pour application sur nos autres modèles
Procédures
L’ensemble de l’effectif sera soumis à une mise à jeun de 4h. Cette mise à jeun se fera sur la matinée, en dehors de la phase principale de nourriture, qui est nocturne, et n’aura donc que peu d’impact sur l’animal. Le gavage sera réalisé par un expérimentateur formé
Impact sur les animaux
Le gavage nécessitera une préhension des animaux ce qui peut être stressant pour les souris, mais ce geste sera réalisé par un expérimentateur formé
Devenir
A l’issue de la procédure, l’ensemble de l’effectif (72 souris) sera mis à mort dans l’établissement utilisateur sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier un phénomène physiologique précis sur un tissu vivant en condition postprandiale. Il est donc indispensable de recourir au modèle animal.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides
Raffinement
Afin de diminuer le stress, nos animaux seront acclimatés une semaine minimum après réception et avant application de la procédure. Lors des procédures expérimentales, la préhension des souris et le gavage seront réalisés par des personnes expérimentées. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet et mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la barrière intestinale qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus
Identification de virus adéno-associé pour édition du génome des cellules satellites du muscle squelettique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Une partie des 224 rats utilisés porte une mutation du gène Dmd qui reproduit la dystrophie musculaire de Duchenne. Tous sont tués, dans des procédures classées en souffrance légère, après une injection unique de virus adéno-associé sous anesthésie et, pour 48 d'entre eux, des tests de force répétés. Les rats malades sont mis à mort entre 1 et 3 mois, avant l'apparition des atteintes les plus lourdes du phénotype. La mise à mort sert à prélever les muscles pour repérer quelles capsides virales atteignent le mieux les cellules souches, en vue d'une future thérapie génique.
Objectifs
Les cellules satellites du muscle squelettique sont essentielles pour la régénération, et peut-être la population cellulaire clé pour les thérapies géniques pour lutter contre des myopathies, comme la dystrophie de Duchenne (DMD). Les cellules satellites sont entourées par plusieurs types de cellules. Les thérapies pour certaines maladies musculaires pourraient être améliorées en ciblant ces cellules souches, et en évitant l’expression du transgène (gène thérapeutique qui remplace le gène défectueux causant la maladie) dans d’autres cellules, qui pourraient déclencher des réponses immunitaires. Aujourd’hui la thérapie génique repose fortement sur l’utilisation de virus adéno-associé (AAV). Les différents variants du virus ont des capacités différentes d’infecter des organes et populations cellulaires spécifiques. En modifiant les protéines de surface des virus, les capsides, des équipes autour du monde cherchent à trouver des variants d’AAV encore plus spécifiques que ceux trouvés dans la nature. Nous allons utiliser des AAV avec des capsides variées pour identifier les meilleurs variants qui peuvent cibler les cellules satellites du muscle squelettique. Des rats d'une souche type sauvage ou avec une dystrophie provoquée par mutation du gène Dmd recevront une injection du virus par traitement qui circule dans tout le corps. On vérifiera que les cellules satellites sont bien ciblées en les isolants du tissu, en les examinant individuellement et en analysant leur ADN et ARN. Quelques virus seront également testés pour leur capacité de guérir la dystrophie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier des capsides qui permettent une expression de transgène spécifique pour les cellules souches du muscle squelettique. Une telle capside n’est pas connue à ce jour, donc l’identification sera une avancée importante pour la thérapie génique du muscle. Du point de vue clinique, ces capsides seraient essentielles pour des thérapies géniques ciblées pour les cellules souches, pour éviter des effets hors-cible et des réponses immunitaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule injection qui dure environ 30 minutes avec anesthésie. 48 animaux seront soumis à des tests de force, qui durent également environ 30 minutes. Cinq mesures successives seront effectuées, avec un temps de repos minimum de cinq minutes entre chaque essai.
Impact sur les animaux
Nous attendons une douleur légère liée avec les injections systémiques et intramusculaires, qui ne nécessite pas de traitement analgésique. Les rats DMD ne présentent pas des effets délétères majeurs du phénotype avant l’âge de 10 mois, et dans ce projet, ils seront mis à mort entre 1 et 3 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Les variants d’AAV ont déjà été testés dans d’autres modèles, dont la souris. Plusieurs expériences seront avec des bibliothèques de variants, ce qui permet de tester des millions de variants dans un seul animal. La complexité de la niche des cellules souches du muscle ne peut pas être reconstitué in vitro, et c'est donc essentiel que ces expériences soient faites dans des rats, pour examiner la spécificité des capsides.
Réduction
Le nombre d’animaux soumis aux expérimentations avec AAV est nécessaire pour la cytométrie en flux, l’extraction d’ADN, et les coupes histologiques. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Le calcul de puissance statistique nous recommande d’utiliser 8 rats par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés. Les données seront analysées avec des tests ANOVA.
Raffinement
Les animaux sont élevés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la règlementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès à volonté à la nourriture et à l’eau. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, avec un nombre par cages adapté à leur taille. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel par ailleurs compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Une grille d’évaluation critériée de la douleur et des points limites pour cette lignée a été établie. Les rats seront constamment évalués en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Toute atteinte des points limites sera suivi d’une action correctrice précisée sur la grille. En cas d’absence de bénéfice (trouble irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat pour des raisons multiples. Le rat est un mammifère et la conservation des fonctions et protéines entre mammifères suggère qu'un AAV qui peut infecter les cellules satellites du muscle de rat aura une capacité similaire d'infecter les cellules satellites du muscle humain. Les AAVs seront injectés à 4 semaines d’âge, quand le muscle se forme toujours, parce que les cellules satellites sont plus accessibles au virus à ce stade.
Analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans la transmission à la descendance du risque de maladie par l’obésité paternelle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
691 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Rendues obèses par un régime hypercalorique donné dès le sevrage, elles sont accouplées, et leurs embryons comme leurs descendants adultes sont mis à mort pour l'analyse des tissus. L'objectif est d'identifier les composants du liquide séminal qui transmettraient à la descendance un risque métabolique lié à l'obésité du père. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal, l'étude sur "organisme entier" restant selon lui indispensable.
Objectifs
Tout comme la nutrition maternelle, l'état nutritionnel du père au moment de la conception détermine la santé à long terme de la progéniture. En effet, les enfants de pères obèses ont un risque beaucoup plus élevé de développer une obésité et des troubles métaboliques et cognitifs que les enfants de pères ayant un poids corporel normal. Ce risque accru de maladie résulte d'un processus de « programmation métabolique » sous-tendu par des modifications épigénétiques au niveau des spermatozoïdes. Cependant, le dépôt des spermatozoïdes dans le système reproducteur féminin s'accompagne de la libération d'un cocktail complexe de substances fonctionnellement diverses qui constituent collectivement le liquide séminal. Ces substances sont produites par les organes sexuels accessoires masculins, à savoir la prostate, l'épididyme, les vésicules séminales et les testicules, et agissent pour maximiser les chances de réussite de la conception en favorisant la survie des spermatozoïdes et le développement de l'embryon préimplantatoire. Bien que plusieurs rapports ont montré que les composants du liquide séminal sont également impliqués dans la « programmation » de la santé postnatale de la progéniture, à ce jour, ces composants et leurs mécanismes d'action n'ont pas été identifiés. Ce projet vise à identifier les métabolites et les microARN du liquide séminal agissant comme vecteurs de "programmation métabolique" par l'obésité paternelle et à caractériser les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation par lesquels ils modifient l'activité métabolique et le profil épigénétique de la progéniture.
Bénéfices attendus
Outre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la susceptibilité pathologique induite par l'obésité via la lignée paternelle, les résultats acquis à la fin du projet pourraient contribuer à l'établissement d'un nouveau paradigme pour prévenir le risque de maladie pour l'enfant à naître. Celui-ci serait basé non seulement sur les recommandations pour les femmes enceintes, mais aussi sur des conseils nutritionnels et des recommandations adressés aux futurs pères pour qu’ils adoptent une alimentation équilibrée et non hypercalorique de même que des habitudes de vie sains avant la procréation.
Procédures
Aucune intervention chirurgicale sera effectuée sur les animaux vivants. Tous les prélèvements d’échantillons biologiques seront effectués chez des animaux décédés.
Impact sur les animaux
Les expériences qui seront réalisées pour atteindre les objectifs du projet, ne provoqueront aucune souffrance ni nuisance particulière aux animaux. Toutefois, une vigilance constante leur sera apportée pour détecter des signes cliniques sévères ou notables afin de prendre une décision d’euthanasie en cas d’atteinte des points limites comme décrit dans le tableau en annexe.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour l’obtention des échantillons biologiques sur lesquels des analyses moléculaires seront effectuées.
Remplacement
Nous cherchons à obtenir des informations fondamentales sur les mécanismes de transmission de risque de maladies métaboliques et des désordres cognitifs chez la descendance de mères et de pères obèses. Cela implique la réalisation d’analyses moléculaires dans des tissus et d’études comportementales chez l’organisme entier. Il n’y a pas d’alternative à l’utilisation d’animaux pour atteindre les objectifs scientifiques visés par ce projet.
Réduction
Le projet est basé sur l’accouplement d’animaux mâles obèses et non-obèses avec de femelles non-obèses ou obèses (animaux géniteurs F0), pour l’obtention d’embryons à trois stades distincts de développement et des animaux adultes (génération F1). Sur ces derniers, des analyses moléculaires et des études comportementales seront réalisées. Afin de minimiser au maximum le nombre d’animaux, un même animal mâle sera accouplé à deux femelles distinctes. Par ailleurs, le nombre d’animaux à utiliser est le minimum nécessaire pour pouvoir observer des différences statistiquement significatives entre les divers groupes expérimentaux. Ce nombre a été déterminé sur la base des résultats de nos expériences précédentes et en considérant comme paramètre une puissance de 90% et un pourcentage d’erreur de 5%.
Raffinement
Toutes les manipulations chez les animaux (accouplements, constitution des portées, pesées…), seront faites dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale par du personnel avec plusieurs années d’expériences dans la manipulation et le soin des animaux de laboratoire. Afin de minimiser au maximum le stress pouvant être subi par les animaux, leur environnement sera enrichi par l’introduction à l’intérieur des cages de dômes en plastique, de bâtons en bois et de frisottis pour le nid. Lors de la constitution des portées, les personnels frotteront leurs gants avec la litière souillée par la mère avant de manipuler les animaux de la portée afin de réduire les perturbations olfactives. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement, y compris les week-ends et les jours fériés. L’évaluation de l’état des animaux sera alors effectuée en référence au tableau fourni précédemment (point 3.3.2.4). Cette évaluation conditionnera les éventuelles décisions d’euthanasie dans le cas d’observation de signes attestant d’une souffrance (dos vouté, ventre rétracté, facies contracté, agressivité, vocalisation).
Choix des espèces
La souris C57BL/6 est le modèle de choix pour l’étude de l‘obésité et ses complications car elle présente une très grande susceptibilité au développement d’une obésité, du diabète et de l'athérosclérose. De plus, sa variabilité génétique est très réduite et sa petite taille rend son hébergement, entretien et alimentation bien plus économique que celui du rat. La Souris BALB/c présente les mêmes avantages en termes d’homogénéité génétique et de facilité et d’économie d’hébergement que la souris C57BL/6. Mais, contrairement à la souris C57BL/6, elle ne développe pas de signes d’obésité lorsqu’elle est exposée à une alimentation hypercalorique. L’utilisation combinée de ces deux souches, nous permettra donc de délimiter la contribution du fond génétique, par rapport aux modifications épigénétiques, dans le risque de maladie transmis par l’obésité parentale. Des souris mâles et femelles âgées de 21 jours (géniteurs, génération F0), seront utilisées pour obtenir des embryons de 13 et 17 jours d’âge gestationnel et des animaux adultes de première génération (F1). L’utilisation de souris de 21 jours d’âge se justifie par le fait que l’exposition à une alimentation hypercalorique dès le sevrage est nécessaire pour l’acquisition d’un phénotype clair d’obésité. Concernant les embryons, leur utilisation se justifie par les raisons suivantes. L’objectif de ce projet, est d’établir le lien de cause à effet entre les modifications épigénétiques et métabolomiques induites par l’obésité sur les spermatozoïdes et les altérations cognitives et métaboliques observés chez les descendants de pères ou de mères obèses. Nous nous intéresserons en particulier à l’analyse de la synthèse de la sérotonine et de la kyunurenine à partir du tryptophane, car nos études précédentes indiquent que cette voie métabolique est affectée dans le cerveau des animaux de pères obèses. L’étude des embryons au 13ème jour du développement nous permettra de déterminer si l’obésité parentale entraîne une déficience de la synthèse de sérotonine dans le placenta qui se traduirait par une diminution de la concentration de ce neuromédiateur dans le cerveau embryonnaire, tandis que les analyses dans les embryons de 17 jours de gestation, nous permettront de déterminer si les altérations dans la concentration cérébrale de sérotonine résultent d’une modification de la synthèse de ce neurotransmetteur dans les neurones sérotoninergiques eux-mêmes. Les expériences qui seront effectuées chez les animaux adult
Étude de faisabilité d’une stratégie de thérapie génique pour la maladie de Willebrand
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
737 souris vont être utilisées pour tester une thérapie génique contre la maladie de Willebrand, une maladie hémorragique, dont 50 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Après une injection, elles subissent des prélèvements sanguins sous anesthésie puis un test d'hémostase terminal, incision ou section des vaisseaux de la queue, pouvant durer jusqu'à quarante minutes. Ce test mesure la capacité du sang à cesser de couler, avant un éventuel passage à l'humain. Le RNT affirme que la coagulation exige "absolument un organisme vivant entier" et qu'aucun test ne peut aujourd'hui éviter le recours à l'animal.
Objectifs
Les maladies hémorragiques familiales, telles que la maladie de Willebrand, restent assez méconnues. Ces maladies empêchent l’arrêt des saignements. Les traitements disponibles sont lourds (injections intraveineuses répétées) et pas toujours efficaces. Une approche par thérapie génique, avec une seule administration, pourrait donc représenter une avancée majeure dans la prise en charge de ces patients et améliorer beaucoup leur qualité de vie. Notre projet va consister à tester, chez un modèle de souris mimant la maladie de Willebrand humaine, l’efficacité de cette nouvelle approche thérapeutique à l’aide de tests bien standardisés.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de cette étude doivent permettre d'établir la preuve de concept de l'efficacité de cette thérapie dans la maladie de Willebrand. A terme, ce projet devrait pouvoir servir de base pour la mise en place d'essais cliniques visant à déployer cette thérapie, moins lourde que les thérapies actuelles, chez les patients.
Procédures
Toutes les souris reçoivent une injection rapide (5-10 secondes) sur animal vigile. 1) Un groupe reçoit seul un prélèvement (20-30 secondes) sous anesthésie 3/5 jours après injection et est euthanasié. 2) Un groupe reçoit un prélèvement (10-20 secondes) sous anesthésie 3 jours après injection et, 2/5 jours après, un test d’hémostase terminal (incision ou section des vaisseaux de la queue) sous anesthésie (maximum 40 minutes). 3) Un groupe reçoit trois prélèvements (10-20 secondes) sous anesthésie toutes les quatre semaines, puis, un test d’hémostase terminal sous anesthésie (maximum 40 minutes) a 12 semaines. Toutes les souris sont euthanasiées par les méthodes règlementaire en fin d’expérience encore sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Stress léger lors de la préhension des animaux. Douleur légère et transitoire après les injections et après les prélèvements du sang.
Devenir
Les actes expérimentaux finaux sont sans réveil du fait de la collecte de quantités importantes de sang, indispensables pour nos recherches scientifiques.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Afin de déterminer le plus petit nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse mathématique de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience en utilisant ces modèles en prenant en compte les variabilités de chaque test.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. Les animaux ne sont jamais seuls dans les cages d’hébergement et ils ont un accès libre à la nourriture et à l'eau. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et l'acte expérimental aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les souris sont sous observation quotidienne et la quantification des points limites, susceptibles d'entraîner une procédure d’euthanasie immédiate de l'animal, sont strictement appliquée.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à un modèles murin des maladie hémorragique familiale permettant de tester un thérapie déjà utilisé chez les patients. Ces modèle ne manifestent pas des saignements spontanées. Les souris adultes, entre 8 et 30 semaines d’âge, des deux sexes seront utilisées.
Modèle préclinique de vaccination avec biopuces
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées une fois avec des salmonelles vivantes, 696 souris sont utilisées pour tester un vaccin à base de biopuces, 120 d'entre elles dans des procédures classées en souffrance sévère. L'infection provoque perte de poids, pelage hérissé, prostration et anorexie, et le RNT signale qu'une mortalité aiguë peut survenir sans aucun signe clinique préalable. Le même document affirme par ailleurs que l'injection des biopuces n'induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus, l'écart restant net entre les procédures dites indolores et une infection qui peut tuer sans prévenir.
Objectifs
Les salmonelles sont des bactéries qui peuvent infecter les cellules de l’organisme et représentent un problème important de santé publique. Certaines formes provoquent des infections digestives généralement bénignes, mais dans certains cas, notamment chez les personnes fragiles (personnes âgées ou immunodéprimées), elles peuvent entraîner des infections graves pouvant être mortelles. La transmission se fait principalement par contact avec des animaux ou par la consommation d’aliments contaminés (viandes, œufs, produits laitiers). Il est donc important de développer de nouvelles stratégies pour mieux protéger les populations à risque, notamment par la vaccination. Dans ce projet, nous développons une approche vaccinale innovante basée sur des « biopuces ». Il s’agit de petits dispositifs en silicium capables de transporter des bactéries inactivées dans l’organisme. Ces biopuces, appelées ICARO (Intracellular Carriers Against Resistant microOrganisms), peuvent être internalisées par certaines cellules du système immunitaire. Elles permettraient ainsi de déclencher une réponse immunitaire efficace contre la bactérie, en particulier une réponse dite « cytotoxique », essentielle pour éliminer les cellules infectées. L’objectif est de démontrer que cette stratégie peut protéger les souris contre une infection par les salmonelles, constituant ainsi une première preuve de concept pour le développement de nouveaux vaccins.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une preuve de concept de l'utilisation de biopuces en silicium chargées en agents pathogènes inactivés comme méthode de protection contre ces agents in vivo et potentiellement une solution vaccinale innovante. En effet, s’il existe une solution vaccinale disponible dans un cadre vétérinaire pour les poulets, aucun vaccin contre les salmonelles n’est disponible chez les mammifères. Or, comme indiqué plus haut, les souches de salmonelles non typhiques comme Salmonella enterica Typhimurium peuvent entrainer des infections systémiques chez les enfants, personnes âgées et patients immunodéprimés avec des taux de létalité élevés, rendant la recherche de nouvelles approches vaccinales telles que celle proposée dans ce projet indispensable.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. 1- Le gavage des souris Salmonella enterica Typhimurium sauvage sera effectué une seule fois sur des souris vigiles, pendant environ 1 minute. 2- L’injection des biopuces par différentes voies (10 secondes par injection) sera réalisée une à trois fois, à une semaine d’intervalle, sur des souris vigiles (injections intrapéritonéales), ou anesthésiées (injections intraveineuses par voie rétro-orbitale et injections intraplantaires). 3- Dans certaines expériences, nous préleverons du sang chez les souris immunisées ou infectées. Cela sera réalisé une fois par semaine dans le cadre du schéma d’immunisation, et une seule fois chez les souris infectées.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de courte durée attendus (incluent le stress, un inconfort léger et la douleur modérée) sont les anesthésies à l'isoflurane nécessaires à l'injection des biopuces, aux prélèvements rétroorbitaux ainsi qu’aux injections intrapéritonéales et gavages sur des souris vigiles. Dans des études précédentes, nous avons démontré que l’injection de ces bioparticules n’induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Pour la procédure impliquant une infection par les salmonelles, les symptômes classiques de la maladie chez la souris, seront observés chaque jour dès le début de l’infection (signes extérieurs : perte de poids, pelage hirsute, yeux tirés larmoyants, posture voûtée, dos rond, prostration, anorexie). Une mortalité aiguë peut survenir sans signes cliniques dans les infections fulminantes chez les individus très sensibles.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure et les tissus d'intérêt prélevés en vue d'analyses.
Remplacement
Les analyses préalables effectuées in vitro sur des cellules primaires pertinentes permettent d’évaluer la cytotoxicité et la dose optimale de biopuces par cellule cible. Ces approches in vitro et ex vivo permettront de réduire de manière substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. En revanche, la protection conférée par cette stratégie vaccinale innovante ne peut être évaluée que dans un modèle murin entier dont l’infection par Salmonella Typhimurium est connue pour reproduire les conditions d’infection systémique chez l’homme (recherche préclinique).
Réduction
Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de tests et donc de souris utilisées. Le nombre estimé de souris nécessaires à ce projet (696) a été calculé à l'aide de méthodes statistiques validées () afin d’obtenir une puissance statistique. Ce calcul inclut la réalisation de mesures multiples par animal afin de réduire le nombre total de souris utilisées.
Raffinement
Afin de limiter leur stress, les souris seront acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant toute expérimentation. Les souris seront anesthésiées à l'isoflurane pour réaliser les injections des biopuces et les prélévements sanguins rétroorbitaux. Les injections intraplantaires seront réalisées sur le dessus de la patte pour éviter toute gêne lors de la marche. Lors des expériences d’injection des biopuces et d'infection par les salmonelles sur les animaux vaccinés ou non avec les biopuces, le poids et l’apparition des symptômes de la salmonellose seront suivis quotidiennement en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Lors des procédures de biodistribution des biopuces, d’optimisation de la cross-présentation antigénique et d’évaluation de l’immunogénicité (procédures de gravité légère), les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et le suivi sera réalisé selon une grille d’évaluation du bien-être adaptée, incluant notamment l’apparence générale, le comportement et la prise alimentaire. Une surveillance accrue et, si nécessaire, une prise en charge analgésique seront mises en place en cas d’altération de l’état général. Lors de la procédure d’infection par Salmonella (procédure de gravité sévère), les animaux seront suivis quotidiennement afin d’évaluer l’apparition de signes cliniques et l’évolution de la pathologie. Un score de souffrance sera utilisé pour le suivi du bien-être animal. Les critères d’arrêt immédiat incluent notamment une perte de poids supérieure à 20 %, l’apparition de signes cliniques sévères ou une altération marquée de l’état général, entraînant une euthanasie immédiate. Pour l’ensemble des procédures, en cas de dégradation de l’état des animaux, une surveillance renforcée sera mise en place (trois fois par jour) avec administration d’un analgésique (buprénorphine, voie sous-cutanée, 0,1 mg/kg en dose initiale, renouvelée à 0,05-0,1 mg/kg toutes les 6-8 h si nécessaire) et, si nécessaire, apport de nourriture adaptée et réhydratation sous-cutanée. La buprénorphine est utilisée à visée préventive ou curative selon les procédures. En cas de persistance de la souffrance malgré les mesures mises en place pendant plus de deux jours, une euthanasie sera réalisée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Des critères d’arrêt indépendants du score, tels que définis dans la grille d’évaluation, s’appliquent à tout moment.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle idéal pour effectuer les expérimentations prévues dans ce projet. Son infection orale par Salmonella enterica Typhimurium est en effet connue pour mimer une infection systémique par les salmonelles chez l’homme et est donc idéale pour tester l’efficacité vaccinale dans un modèle préclinique. Le modèle murin permet aussi d'étudier les réponses immunitaires spécifiques d'antigènes modèles utilisés dans le cadre de ce projet et d'analyser précisément les populations immunitaires et leur état d'activation grâce au grand nombre d'anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce.
Évaluation des effets radio-protecteurs et pro-régénératifs de traitements sur le syndrome d’irradiation aiguë survenant après une exposition à doses fortes et modérées de rayonnements ionisants_MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Jusqu'à vingt-neuf gestes techniques en trente jours par animal : 1 413 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever les organes les plus atteints, dont 765 dans des procédures classées en souffrance sévère. Elles reçoivent une irradiation du corps entier, des gavages, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des injections, avec pour effets attendus perte de poids, anémie, prostration, déshydratation ou septicémie. Le scénario invoqué est celui d'un accident ou d'une attaque nucléaire exposant des populations humaines. L'effet radioprotecteur recherché reste à démontrer, quand l'irradiation et ses suites sont, elles, provoquées à coup sûr.
Objectifs
MODIFICATION – Le protocole 1 du projet a été modifié en supprimant l’étude de l’effet protecteur des molécules après une forte dose d’irradiation, remplacée par l’étude de leur effet curatif après une dose modérée. En effet, la majorité des individus irradiés se trouvera autour du point d’impact de l’accident, recevant ainsi une dose modérée, non létale, qu’il est donc important d’étudier. Le protocole 2 du projet intègre désormais l’étude d’un traitement du syndrome gastro-intestinal radio-induit (forte dose d’irradiation localisée) via l’administration de produits acellulaires (EV). Les individus exposés brièvement (quelques minutes) à une dose d’irradiation forte ou modérée (accident ou attaque nucléaire), vont souffrir d’un syndrome d’irradiation aiguë (SIA) engageant le pronostic vital. Les traitements curatifs actuels sont très invasifs (greffes de moelle osseuse) ou inexistants. Certains médicaments soulagent les symptômes (diarrhées et vomissements) ou préviennent les infections, sans améliorer significativement la survie. Nous proposons donc un projet pré-clinique chez la souris pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements contre le syndrome d’irradiation aiguë. Le SIA combine trois syndromes : hématopoïétique, gastro-intestinal et neurovasculaire. Ce projet se concentre sur les deux premiers. L’effet curatif sera mesuré par la capacité de deux tissus très radiosensibles, la moelle osseuse et l’intestin grêle, à se reconstituer plus ou moins rapidement après irradiation. Ces tissus se renouvellent constamment tout au long de la vie d’un individu et l’impact d’une irradiation sur leur fonctionnement est donc majeur pour la survie. En effet, la moelle osseuse contient les cellules souches hématopoïétiques responsables de la production et du renouvellement des cellules sanguines tout au long de la vie. De même, l’intestin grêle contient des cellules souches permettant le renouvellement tous les 4 à 5 jours des cellules intestinales maintenant une barrière imperméable empêchant le passage des bactéries du microbiote dans le sang. Préserver ces tissus est essentiel à la survie. Nous nous attendons à ce que l’administration de ces traitements après une irradiation ait un effet curatif en améliorant l’état général, mais également la survie des animaux. Le modèle rongeur est pertinent car il a été utilisé et validé dans de nombreuses études précliniques dans le cadre d’une irradiation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de révéler si le traitement des animaux avec les molécules d’intérêt (composés chimiques ou produits acellulaires), administrées après irradiation, (1) améliore leur survie, (2) diminue les effets indésirables associés à l’irradiation, (3) permet une récupération plus rapide de l’état général des souris grâce à une accélération de la régénération des tissus lésés (moelle osseuse et intestin grêle). Des bénéfices sur la population humaine sont susceptibles de découler de ce projet, comme une prise en charge immédiate des personnes ayant été exposées à des doses d’irradiation ionisante fortes et modérées avec l’administration rapide d’un traitement permettant un meilleur pronostic vital et une meilleure récupération hématopoïétique et intestinale (exemple : après un accident ou une attaque nucléaire). Ce projet a donc un intérêt clinique majeur car les traitements curatifs actuels sont inexistants et/ou inapplicables à grande échelle. En effet, actuellement, - la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte sévère du tissu hématopoïétique nécessite des traitements invasifs et coûteux, non généralisables à grande échelle (greffe de moelle osseuse) et présentant de nombreux inconvénients (recherche d’un donneur compatible, traitement immunosuppresseur à vie, risque de rejet). - la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte gastro-intestinale sévère repose uniquement sur des traitements symptomatiques (antibiotiques, anti-diarrhéiques et antiémétiques). Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif.
Procédures
Dans l’étude du syndrome hématopoïétique induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : - 1 irradiation corps entier (durée < 10 minutes) - gavages (4 maximum d’une durée de 2 minutes) - des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (30 secondes) - prélèvements de sang 1 fois/semaine sur animal vigile sur une durée de 30 jours (4 maximum de 3 minutes), puis un prélèvement de sang, sous anesthésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). 1 à 2 injections (1 minute) en vigile pour tous les animaux Les souris subiront au maximum 29 gestes techniques sur 30 jours. Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : - 1 irradiation locale au niveau abdominal, sous anesthésie (durée < 10 minutes) - 1 gavage avec de l’eau ou avec la molécule à tester (2 minutes) ou 1 injection i sous anesthésie de produits acellulaires ou cellules Muse (durée < 10 minutes) - des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) - 1 gavage post-irradiation abdominale localisée (2 minutes) - 1 prélèvement de sang juste avant la mise à mort, sous anesthésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). - 2 injections sur animal vigile (2 x 1 minute). Les souris subiront au maximum 22 gestes techniques sur 30 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont une perte de poids, une anémie, une prostration, de la déshydratation, ou une septicémie. Un stress est envisagé lors des pesées et au moment du gavage. Des douleurs ponctuelles sont possibles lors des prélèvements et/ou des injections.
Devenir
A différents temps après irradiation, les animaux traités ou non seront mis à mort afin de prélever les tissus et organes connus pour être très impactés par l’irradiation. Les analyses permettront d’évaluer l’efficacité du traitement sur ces tissus au cours du temps.
Remplacement
1)Pour l’étude de la survie des individus après irradiation, aucune alternative non animale ne peut être mise en place. 2)Dans l’analyse de la reconstitution hématopoïétique après irradiation, il n’est pas possible d’utiliser des alternatives comme par exemple des organoïdes ou des cultures cellulaires. En effet, les cellules souches de la moelle osseuse agissent de concert avec leur microenvironnement, constitué de plusieurs types cellulaires, pour permettre la reconstitution hématopoïétique après irradiation. L’étude sur l’animal corps entier est donc la seule approche possible pour une analyse physiologique des effets d’un traitement après irradiation depuis la cellule souche jusqu’aux cellules matures. 3)Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal aigu, les organoïdes peuvent être une alternative dans le cadre d’une analyse moléculaire ciblée. Nous ne ferons pas ce type d’analyse dans ce projet. Notre but est de mesurer des paramètres physiologiques impliqués dans la restauration de la barrière intestinale après irradiation, ce qui nécessite une étude sur l’animal corps entier.
Réduction
Les modèles de souris que nous utiliserons sont des lignées consanguines montrant moins de variabilité phénotypique intra-souche. Ainsi, des résultats significatifs seront obtenus en utilisant moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. Ceci permet de réduire le nombre de souris. Nous avons également calculé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant par groupe d’étude à l’aide de tests statistiques et en s’appuyant sur des résultats antérieurs. Avec le traitement proposé dans ce projet, nous avons évalué un bénéfice d’environ 20%. Nous devons donc inclure 8 souris par groupe irradié avec ou sans traitement. Pour les souris non irradiées, aucun effet n’est attendu : 3 souris par groupe seront suffisantes. Sur la base de références bibliographiques, nous avons estimé que l’inclusion de 5 souris par groupe (groupes traités par cellules Muse, groupes traités avec produits de sécrétion de Muse, et groupe irradié contrôle) avec n=3 est nécessaire pour l’analyse des courbes de survie, afin de mettre en évidence une différence statistiquement significative. Enfin, pour les études de cinétique, un effectif de 4 souris par groupe avec n=2 a été retenu, ce qui est suffisant pour détecter des variations biologiquement pertinentes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Pour les souris non irradiées, aucun effet n’est attendu. Nous inclurons donc 3 souris dans ce groupe.
Raffinement
Les souris seront régulièrement pesées et observées . Nous utiliserons une grille de score pour évaluer leur état général et avons établi des points limites. Pour éviter une infection due à une diminution du système immunitaire, les cages seront placées, soit en portoirs ventilés, soit en portoir classique avec un couvercle filtrant. Les souris seront hébergées en groupe, avec enrichissement (coton, tunnels en carton). L'utilsation d'anesthésie et d'analgesie sera mise en place lors des procédures.
Choix des espèces
Les souris consanguines utilisées sont les mieux caractérisées en biomédecine et sont largement utilisées pour étudier le rôle d’un gène spécifique dans un organisme. Elles font l’objet d’un grand nombre d’étude pour analyser les effets biologiques des rayonnements ionisants et leur consanguinité réduit les effectifs utilisés car elles montrent moins de variabilité phénotypique. Ainsi, la puissance statistique est obtenue avec moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. De plus, les syndromes d’irradiation que nous souhaitons étudier sont bien caractérisés chez ces souris . Tout ceci présente des avantages scientifiques et éthiques. Nous utiliserons des souris adultes de 9 à 16 semaines (une souris est considérée comme étant adulte à l’âge de 7 semaines). Une souris prépubère (moins de 7 semaines) a un environnement médullaire (nécessaire à la production des cellules sanguines et à la préservation des cellules souches) qui n’est pas définitif. Une souris de plus de 7 mois est considérée comme âgée d’un point de vue hématopoïétique. Ceci restreint notre choix à l’utilisation de jeunes souris adultes. Pour des raisons de reproductibilité des expériences, le poids et la taille des souris doivent être identiques entre les groupes, ce qui est le cas chez les jeunes adultes à l’âge choisi.
MODIFICATION : Formation « Application de procédures expérimentales chez le rongeur » à destination des étudiants de BUT 1 BMB et des professionnels / diplômés en formation continue.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Former des étudiants et des professionnels aux gestes de l'expérimentation animale mobilise 440 rats, utilisés dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque animal sert de support d'entraînement à des injections et à des administrations orales répétées, avant d'être réutilisé d'une procédure à la suivante. Le RNT signale qu'une erreur d'anesthésie peut provoquer un œdème pulmonaire et une insuffisance respiratoire, et que la contention fait parfois vocaliser les rats. Les animaux sont tués à la fin pour une étude anatomique post-mortem, la chirurgie sur animal anesthésié n'étant pas permise aux apprenants.
Objectifs
MODIFICATION / Le projet a pour objectif de former les étudiants de Bachelor Universitaire de Technologie (BUT) aux fondamentaux de l’expérimentation animale, en les sensibilisant à la réglementation, à l’éthique et au bien-être animal, tout en leur permettant d’acquérir les gestes techniques de base nécessaires à leur insertion professionnelle. AJOUT : IL S’INSCRIT EGALEMENT DANS LE CADRE DE LA FORMATION D’APPLICATEUR DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ LE RONGEUR, CONFORMEMENT AUX REFERENTIELS EN VIGUEUR. À CE TITRE, IL VISE AUSSI A FORMER UN PUBLIC DE PROFESSIONNELS OU DE STAGIAIRES EN FORMATION CONTINUE, AMENES A METTRE EN ŒUVRE DES PROCEDURES EXPERIMENTALES DANS UN CADRE REGLEMENTE. Deux types de procédures sont proposés. La première porte sur le suivi de l’animal anesthésié et la surveillance des paramètres physiologiques. La seconde concerne la manipulation de l’animal vigile (rat) et l’étude anatomique post-mortem : apprentissage de la préhension et de la contention, initiation aux principales voies d’administration et sensibilisation à l’impact du stress, dans le respect de la réglementation et des principes de raffinement et mise en œuvre de procédures d’euthanasie conformes à la réglementation, et observation anatomique permettant d’établir des liens avec l’anatomie comparée. Ainsi, ce projet propose une approche progressive et complète de l’expérimentation animale, intégrant réglementation, éthique et pratique, et préparant les APPRENANTS TANT EN FORMATION INITIALE QUE CONTINUE A LA MISE EN ŒUVRE DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ L’ANIMAL DANS LE RESPECT DE LA REGLEMENTATION, LA CONNAISSANCE DES ACTEURS INSTITUTIONNELS IMPLIQUES (COMITE D’ETHIQUE, AUTORITE COMPETENTE, STRUCTURE DE BIEN-ETRE ANIMAL) ET L’APPLICATION DES PRINCIPES DES 3R.
Bénéfices attendus
MODIFICATION Les bénéfices attendus du projet concernent directement l’acquisition de compétences pratiques et la sensibilisation éthique des APPRENANTS, en lien étroit avec les activités réalisées en travaux pratiques. AJOUT : LEUR PERMETTANT DE VALIDER LA FORMATION APPLICATEUR DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ LE RONGEUR. Au cours des séances sur rat vigile, les APPRENANTS découvrent d’abord le comportement normal de l’animal et apprennent à interagir de manière non stressante (tickling). Ils développent ensuite la capacité à réaliser une contention correcte et sécurisée, préalable indispensable à toute procédure expérimentale. L’apprentissage progressif des différentes voies d’administration (per os, sous-cutanée, intrapéritonéale) leur permet de s’exercer à des gestes techniques précis, de comprendre leurs indications respectives et d’acquérir l’assurance nécessaire à leur bonne réalisation. L’ultime séance, consacrée à l’induction de l’anesthésie, permet de valider ces apprentissages par une situation complète, en liant technicité du geste, suivi physiologique et vigilance sur le bien-être animal. Au cours des séances sur rat anesthésié, les APPRENANTS apprennent à surveiller et interpréter certains paramètres physiologiques sous anesthésie. Ils comprennent ainsi concrètement les enjeux du monitoring et de la profondeur anesthésique. AJOUT : UNE DEMONSTRATION DE PRELEVEMENT SANGUIN AU NIVEAU DE LA VEINE CAUDALE SUR UN RAT ANESTHESIE SERA EGALEMENT REALISEE. La phase post-mortem offre l’opportunité d’étudier l’anatomie topographique des grands appareils, renforçant les connaissances acquises en biologie animale et leur permettant d’établir des liens entre structure et fonction. Ces activités procurent un bénéfice pédagogique direct : elles ancrent les notions de réglementation, d’éthique et de bien-être animal dans une pratique concrète, tout en développant les compétences techniques qui seront attendues dans leur futur parcours professionnel. Les APPRENANTS ne se limitent pas à une approche théorique de l’expérimentation animale : ils acquièrent par l’expérience les gestes de base, la compréhension du rôle des différents acteurs, et une posture responsable vis-à-vis de l’utilisation de l’animal.
Procédures
- Procédure 1 : deux injections par animal - Durée totale d’injection : 30 secondes MODIFICATION : 1 prélèvement sur un des 2 animaux – durée totale :30 secondes - Procédure 2 : 1 administration orale répétée sur 3 séances différentes - Durée de l’administration : 5 secondes MODIFICATION : 6 injections réparties sur 3 séances différentes : Durée totale d’injection : 2,5 minutes
Impact sur les animaux
L’administration des substances nécessaire à l’anesthésie au début de la procédure peut conduire au développement d’un œdème pulmonaire à l’origine d’une insuffisance respiratoire. Une partie des manipulations se produiront sur animal vigile : un risque de stress léger peut être encouru lors de la préhension / contention rats, cela peut engendrer occasionnellement des vocalisations. Lors des phases d’apprentissage des méthodes d’administration : - Per os : gêne légère possible lors de l’introduction de la sonde. - Sous-cutanée et intrapéritonéale : douleur légère brève au point d’injection.
Devenir
Les animaux de la première procédure sont réutilisés dans la procédure suivante. Les animaux sont euthanasiés à la fin de la dernière procédure afin que l’étude anatomique soit réalisée post-mortem, évitant ainsi le recours à une chirurgie sur animal anesthésié, non autorisée pour les APPRENANTS.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins expérimentales demeure, à ce jour, indispensable dans le cadre de notre formation, conformément aux exigences définies dans le Programme Pédagogique National. En effet, celui-ci précise que les diplômés doivent être en capacité de « participer à des activités mettant en œuvre de l’expérimentation sur animaux de laboratoire », compétence essentielle à leur insertion professionnelle. Les secteurs dans lesquels les diplômés sont susceptibles d’évoluer (pharmacologie, physiologie pharmaceutique, toxicologie, biotechnologies, etc.) continuent de recourir à l’expérimentation animale dans un cadre strictement réglementé. La maîtrise des techniques in vivo, associée à une compréhension rigoureuse des protocoles expérimentaux, constitue donc un savoir-faire fondamental garantissant l’adéquation entre la formation et les attentes du milieu professionnel, qu’il soit académique ou industriel. Le projet présenté s’intègre donc dans une approche réfléchie et progressive de l’expérimentation animale, limitée aux apprentissages pour lesquels aucune alternative pédagogique équivalente ne permet actuellement de transmettre les compétences pratiques visées. DE PLUS, LE PROJET VISE AUSSI A FORMER UN PUBLIC DE PROFESSIONNELS OU DE STAGIAIRES EN FORMATION CONTINUE, AMENES A METTRE EN ŒUVRE DES PROCEDURES EXPERIMENTALES DANS UN CADRE REGLEMENTE. Ce projet propose donc une approche progressive et complète de l’expérimentation animale, intégrant réglementation, éthique et pratique. Elle prépare ainsi les APPRENANTS TANT EN FORMATION INITIALE QUE CONTINUE A LA MISE EN ŒUVRE DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ L’ANIMAL DANS LE RESPECT DE LA REGLEMENTATION, LA CONNAISSANCE DES ACTEURS INSTITUTIONNELS IMPLIQUES (COMITE D’ETHIQUE, AUTORITE COMPETENTE, STRUCTURE DE BIEN-ETRE ANIMAL) ET L’APPLICATION DES PRINCIPES DES 3R.
Réduction
MODIFICATION / Nous limiterons le nombre de rats à 2 par groupe TP pour la première procédure, chaque groupe TP étant constitué de 14 APPRENANTS maximum. C’est un nombre minimum pour permettre une démonstration efficace. Pour la seconde procédure, nous utiliserons un rat par APPRENANT EN APPLIQUANT UN TAUX D’ENCADREMENT DE 1 ENCADRANT POUR 4 APPRENANTS et nous réutiliserons les rats de la procédure précédente). Ce nouveau projet permet de diminuer de 50 % le nombre d’animaux utilisés par rapport au précédent projet accepté.
Raffinement
Avant tout apprentissage pratique, les APPRENANTS bénéficient d’un enseignement théorique complet et spécifique dédié au bien-être animal, à l’éthique ainsi qu’à la réglementation en vigueur en matière d’expérimentation animale. Cet enseignement vise à sensibiliser les étudiants à leur responsabilité vis-à-vis de l’animal et à les former aux bonnes pratiques expérimentales. Chaque procédure expérimentale fait l’objet d’une séance préparatoire de Travaux Dirigés, au cours de laquelle les différentes étapes pratiques sont analysées à l’aide de supports vidéo et de documents pédagogiques. Cette préparation a pour objectif de garantir une prise en charge optimale de l’animal, en minimisant l’inconfort, le stress et la douleur, conformément au principe de Raffinement. Les animaux sont hébergés dans des conditions répondant pleinement à leurs besoins physiologiques et comportementaux : ils sont maintenus en groupes, dans un environnement enrichi, et font l’objet d’un suivi quotidien par le personnel compétent. Une période d’acclimatation d’au moins une semaine est systématiquement respectée après leur arrivée dans l’animalerie de l’établissement, avant toute manipulation. Sur le plan analgésique et anesthésique, une analgésie préventive est assurée 20 minutes avant l’induction de l’anesthésie. Durant chaque procédure, l’animal est placé sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie, et un monitoring continu de la température corporelle est effectué. La profondeur anesthésique est rigoureusement surveillée tout au long de la séance par l’enseignant responsable, à l’aide de plusieurs critères : réflexe de retrait de la patte, mouvements des vibrisses, fréquence respiratoire. En cas de signes indiquant une diminution de la profondeur de l’anesthésie, un renforcement immédiat de l'anesthésie est effectué par l'enseignant afin de maintenir un niveau anesthésie stable et compatible avec la procédure. Des points limites sont préalablement définis pour l'ensemble des procédures permettant d'interrompre l'expérimentation dès l'apparition de signes dépassant les critères d'acceptabilité. L’ensemble de ces mesures vise à garantir une expérimentation respectueuse de l’animal, tout en assurant un apprentissage de qualité dans un cadre éthique et réglementé.
Choix des espèces
Les rats présentent des caractéristiques physiologiques et anatomiques qui permettent l’apprentissage plus aisé des diverses techniques d’administration et de l’étude anatomique. De plus, le rat est un animal docile parfaitement adapté à l’apprentissage par les étudiants des principales procédures pratiques. Enfin, le rat est une des espèces les plus couramment utilisées dans les laboratoires de recherche recrutant nos étudiants futurs techniciens. En effet, de très nombreux modèles expérimentaux animaux sont développés chez cette espèce. Il s’agira précisément de rats jeunes adultes : Les organes sont de taille suffisamment importante ce qui facilite les études anatomiques. La taille des animaux adultes rend également leur manipulation plus aisée par les étudiants.