Procédures légères
Modèle préclinique de vaccination avec biopuces
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées une fois avec des salmonelles vivantes, 696 souris sont utilisées pour tester un vaccin à base de biopuces, 120 d'entre elles dans des procédures classées en souffrance sévère. L'infection provoque perte de poids, pelage hérissé, prostration et anorexie, et le RNT signale qu'une mortalité aiguë peut survenir sans aucun signe clinique préalable. Le même document affirme par ailleurs que l'injection des biopuces n'induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus, l'écart restant net entre les procédures dites indolores et une infection qui peut tuer sans prévenir.
Objectifs
Les salmonelles sont des bactéries qui peuvent infecter les cellules de l’organisme et représentent un problème important de santé publique. Certaines formes provoquent des infections digestives généralement bénignes, mais dans certains cas, notamment chez les personnes fragiles (personnes âgées ou immunodéprimées), elles peuvent entraîner des infections graves pouvant être mortelles. La transmission se fait principalement par contact avec des animaux ou par la consommation d’aliments contaminés (viandes, œufs, produits laitiers). Il est donc important de développer de nouvelles stratégies pour mieux protéger les populations à risque, notamment par la vaccination. Dans ce projet, nous développons une approche vaccinale innovante basée sur des « biopuces ». Il s’agit de petits dispositifs en silicium capables de transporter des bactéries inactivées dans l’organisme. Ces biopuces, appelées ICARO (Intracellular Carriers Against Resistant microOrganisms), peuvent être internalisées par certaines cellules du système immunitaire. Elles permettraient ainsi de déclencher une réponse immunitaire efficace contre la bactérie, en particulier une réponse dite « cytotoxique », essentielle pour éliminer les cellules infectées. L’objectif est de démontrer que cette stratégie peut protéger les souris contre une infection par les salmonelles, constituant ainsi une première preuve de concept pour le développement de nouveaux vaccins.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une preuve de concept de l'utilisation de biopuces en silicium chargées en agents pathogènes inactivés comme méthode de protection contre ces agents in vivo et potentiellement une solution vaccinale innovante. En effet, s’il existe une solution vaccinale disponible dans un cadre vétérinaire pour les poulets, aucun vaccin contre les salmonelles n’est disponible chez les mammifères. Or, comme indiqué plus haut, les souches de salmonelles non typhiques comme Salmonella enterica Typhimurium peuvent entrainer des infections systémiques chez les enfants, personnes âgées et patients immunodéprimés avec des taux de létalité élevés, rendant la recherche de nouvelles approches vaccinales telles que celle proposée dans ce projet indispensable.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. 1- Le gavage des souris Salmonella enterica Typhimurium sauvage sera effectué une seule fois sur des souris vigiles, pendant environ 1 minute. 2- L’injection des biopuces par différentes voies (10 secondes par injection) sera réalisée une à trois fois, à une semaine d’intervalle, sur des souris vigiles (injections intrapéritonéales), ou anesthésiées (injections intraveineuses par voie rétro-orbitale et injections intraplantaires). 3- Dans certaines expériences, nous préleverons du sang chez les souris immunisées ou infectées. Cela sera réalisé une fois par semaine dans le cadre du schéma d’immunisation, et une seule fois chez les souris infectées.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de courte durée attendus (incluent le stress, un inconfort léger et la douleur modérée) sont les anesthésies à l'isoflurane nécessaires à l'injection des biopuces, aux prélèvements rétroorbitaux ainsi qu’aux injections intrapéritonéales et gavages sur des souris vigiles. Dans des études précédentes, nous avons démontré que l’injection de ces bioparticules n’induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Pour la procédure impliquant une infection par les salmonelles, les symptômes classiques de la maladie chez la souris, seront observés chaque jour dès le début de l’infection (signes extérieurs : perte de poids, pelage hirsute, yeux tirés larmoyants, posture voûtée, dos rond, prostration, anorexie). Une mortalité aiguë peut survenir sans signes cliniques dans les infections fulminantes chez les individus très sensibles.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure et les tissus d'intérêt prélevés en vue d'analyses.
Remplacement
Les analyses préalables effectuées in vitro sur des cellules primaires pertinentes permettent d’évaluer la cytotoxicité et la dose optimale de biopuces par cellule cible. Ces approches in vitro et ex vivo permettront de réduire de manière substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. En revanche, la protection conférée par cette stratégie vaccinale innovante ne peut être évaluée que dans un modèle murin entier dont l’infection par Salmonella Typhimurium est connue pour reproduire les conditions d’infection systémique chez l’homme (recherche préclinique).
Réduction
Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de tests et donc de souris utilisées. Le nombre estimé de souris nécessaires à ce projet (696) a été calculé à l'aide de méthodes statistiques validées () afin d’obtenir une puissance statistique. Ce calcul inclut la réalisation de mesures multiples par animal afin de réduire le nombre total de souris utilisées.
Raffinement
Afin de limiter leur stress, les souris seront acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant toute expérimentation. Les souris seront anesthésiées à l'isoflurane pour réaliser les injections des biopuces et les prélévements sanguins rétroorbitaux. Les injections intraplantaires seront réalisées sur le dessus de la patte pour éviter toute gêne lors de la marche. Lors des expériences d’injection des biopuces et d'infection par les salmonelles sur les animaux vaccinés ou non avec les biopuces, le poids et l’apparition des symptômes de la salmonellose seront suivis quotidiennement en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Lors des procédures de biodistribution des biopuces, d’optimisation de la cross-présentation antigénique et d’évaluation de l’immunogénicité (procédures de gravité légère), les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et le suivi sera réalisé selon une grille d’évaluation du bien-être adaptée, incluant notamment l’apparence générale, le comportement et la prise alimentaire. Une surveillance accrue et, si nécessaire, une prise en charge analgésique seront mises en place en cas d’altération de l’état général. Lors de la procédure d’infection par Salmonella (procédure de gravité sévère), les animaux seront suivis quotidiennement afin d’évaluer l’apparition de signes cliniques et l’évolution de la pathologie. Un score de souffrance sera utilisé pour le suivi du bien-être animal. Les critères d’arrêt immédiat incluent notamment une perte de poids supérieure à 20 %, l’apparition de signes cliniques sévères ou une altération marquée de l’état général, entraînant une euthanasie immédiate. Pour l’ensemble des procédures, en cas de dégradation de l’état des animaux, une surveillance renforcée sera mise en place (trois fois par jour) avec administration d’un analgésique (buprénorphine, voie sous-cutanée, 0,1 mg/kg en dose initiale, renouvelée à 0,05-0,1 mg/kg toutes les 6-8 h si nécessaire) et, si nécessaire, apport de nourriture adaptée et réhydratation sous-cutanée. La buprénorphine est utilisée à visée préventive ou curative selon les procédures. En cas de persistance de la souffrance malgré les mesures mises en place pendant plus de deux jours, une euthanasie sera réalisée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Des critères d’arrêt indépendants du score, tels que définis dans la grille d’évaluation, s’appliquent à tout moment.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle idéal pour effectuer les expérimentations prévues dans ce projet. Son infection orale par Salmonella enterica Typhimurium est en effet connue pour mimer une infection systémique par les salmonelles chez l’homme et est donc idéale pour tester l’efficacité vaccinale dans un modèle préclinique. Le modèle murin permet aussi d'étudier les réponses immunitaires spécifiques d'antigènes modèles utilisés dans le cadre de ce projet et d'analyser précisément les populations immunitaires et leur état d'activation grâce au grand nombre d'anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce.
Évaluation des effets radio-protecteurs et pro-régénératifs de traitements sur le syndrome d’irradiation aiguë survenant après une exposition à doses fortes et modérées de rayonnements ionisants_MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Jusqu'à vingt-neuf gestes techniques en trente jours par animal : 1 413 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever les organes les plus atteints, dont 765 dans des procédures classées en souffrance sévère. Elles reçoivent une irradiation du corps entier, des gavages, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des injections, avec pour effets attendus perte de poids, anémie, prostration, déshydratation ou septicémie. Le scénario invoqué est celui d'un accident ou d'une attaque nucléaire exposant des populations humaines. L'effet radioprotecteur recherché reste à démontrer, quand l'irradiation et ses suites sont, elles, provoquées à coup sûr.
Objectifs
MODIFICATION – Le protocole 1 du projet a été modifié en supprimant l’étude de l’effet protecteur des molécules après une forte dose d’irradiation, remplacée par l’étude de leur effet curatif après une dose modérée. En effet, la majorité des individus irradiés se trouvera autour du point d’impact de l’accident, recevant ainsi une dose modérée, non létale, qu’il est donc important d’étudier. Le protocole 2 du projet intègre désormais l’étude d’un traitement du syndrome gastro-intestinal radio-induit (forte dose d’irradiation localisée) via l’administration de produits acellulaires (EV). Les individus exposés brièvement (quelques minutes) à une dose d’irradiation forte ou modérée (accident ou attaque nucléaire), vont souffrir d’un syndrome d’irradiation aiguë (SIA) engageant le pronostic vital. Les traitements curatifs actuels sont très invasifs (greffes de moelle osseuse) ou inexistants. Certains médicaments soulagent les symptômes (diarrhées et vomissements) ou préviennent les infections, sans améliorer significativement la survie. Nous proposons donc un projet pré-clinique chez la souris pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements contre le syndrome d’irradiation aiguë. Le SIA combine trois syndromes : hématopoïétique, gastro-intestinal et neurovasculaire. Ce projet se concentre sur les deux premiers. L’effet curatif sera mesuré par la capacité de deux tissus très radiosensibles, la moelle osseuse et l’intestin grêle, à se reconstituer plus ou moins rapidement après irradiation. Ces tissus se renouvellent constamment tout au long de la vie d’un individu et l’impact d’une irradiation sur leur fonctionnement est donc majeur pour la survie. En effet, la moelle osseuse contient les cellules souches hématopoïétiques responsables de la production et du renouvellement des cellules sanguines tout au long de la vie. De même, l’intestin grêle contient des cellules souches permettant le renouvellement tous les 4 à 5 jours des cellules intestinales maintenant une barrière imperméable empêchant le passage des bactéries du microbiote dans le sang. Préserver ces tissus est essentiel à la survie. Nous nous attendons à ce que l’administration de ces traitements après une irradiation ait un effet curatif en améliorant l’état général, mais également la survie des animaux. Le modèle rongeur est pertinent car il a été utilisé et validé dans de nombreuses études précliniques dans le cadre d’une irradiation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de révéler si le traitement des animaux avec les molécules d’intérêt (composés chimiques ou produits acellulaires), administrées après irradiation, (1) améliore leur survie, (2) diminue les effets indésirables associés à l’irradiation, (3) permet une récupération plus rapide de l’état général des souris grâce à une accélération de la régénération des tissus lésés (moelle osseuse et intestin grêle). Des bénéfices sur la population humaine sont susceptibles de découler de ce projet, comme une prise en charge immédiate des personnes ayant été exposées à des doses d’irradiation ionisante fortes et modérées avec l’administration rapide d’un traitement permettant un meilleur pronostic vital et une meilleure récupération hématopoïétique et intestinale (exemple : après un accident ou une attaque nucléaire). Ce projet a donc un intérêt clinique majeur car les traitements curatifs actuels sont inexistants et/ou inapplicables à grande échelle. En effet, actuellement, - la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte sévère du tissu hématopoïétique nécessite des traitements invasifs et coûteux, non généralisables à grande échelle (greffe de moelle osseuse) et présentant de nombreux inconvénients (recherche d’un donneur compatible, traitement immunosuppresseur à vie, risque de rejet). - la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte gastro-intestinale sévère repose uniquement sur des traitements symptomatiques (antibiotiques, anti-diarrhéiques et antiémétiques). Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif.
Procédures
Dans l’étude du syndrome hématopoïétique induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : - 1 irradiation corps entier (durée < 10 minutes) - gavages (4 maximum d’une durée de 2 minutes) - des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (30 secondes) - prélèvements de sang 1 fois/semaine sur animal vigile sur une durée de 30 jours (4 maximum de 3 minutes), puis un prélèvement de sang, sous anesthésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). 1 à 2 injections (1 minute) en vigile pour tous les animaux Les souris subiront au maximum 29 gestes techniques sur 30 jours. Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : - 1 irradiation locale au niveau abdominal, sous anesthésie (durée < 10 minutes) - 1 gavage avec de l’eau ou avec la molécule à tester (2 minutes) ou 1 injection i sous anesthésie de produits acellulaires ou cellules Muse (durée < 10 minutes) - des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) - 1 gavage post-irradiation abdominale localisée (2 minutes) - 1 prélèvement de sang juste avant la mise à mort, sous anesthésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). - 2 injections sur animal vigile (2 x 1 minute). Les souris subiront au maximum 22 gestes techniques sur 30 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont une perte de poids, une anémie, une prostration, de la déshydratation, ou une septicémie. Un stress est envisagé lors des pesées et au moment du gavage. Des douleurs ponctuelles sont possibles lors des prélèvements et/ou des injections.
Devenir
A différents temps après irradiation, les animaux traités ou non seront mis à mort afin de prélever les tissus et organes connus pour être très impactés par l’irradiation. Les analyses permettront d’évaluer l’efficacité du traitement sur ces tissus au cours du temps.
Remplacement
1)Pour l’étude de la survie des individus après irradiation, aucune alternative non animale ne peut être mise en place. 2)Dans l’analyse de la reconstitution hématopoïétique après irradiation, il n’est pas possible d’utiliser des alternatives comme par exemple des organoïdes ou des cultures cellulaires. En effet, les cellules souches de la moelle osseuse agissent de concert avec leur microenvironnement, constitué de plusieurs types cellulaires, pour permettre la reconstitution hématopoïétique après irradiation. L’étude sur l’animal corps entier est donc la seule approche possible pour une analyse physiologique des effets d’un traitement après irradiation depuis la cellule souche jusqu’aux cellules matures. 3)Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal aigu, les organoïdes peuvent être une alternative dans le cadre d’une analyse moléculaire ciblée. Nous ne ferons pas ce type d’analyse dans ce projet. Notre but est de mesurer des paramètres physiologiques impliqués dans la restauration de la barrière intestinale après irradiation, ce qui nécessite une étude sur l’animal corps entier.
Réduction
Les modèles de souris que nous utiliserons sont des lignées consanguines montrant moins de variabilité phénotypique intra-souche. Ainsi, des résultats significatifs seront obtenus en utilisant moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. Ceci permet de réduire le nombre de souris. Nous avons également calculé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant par groupe d’étude à l’aide de tests statistiques et en s’appuyant sur des résultats antérieurs. Avec le traitement proposé dans ce projet, nous avons évalué un bénéfice d’environ 20%. Nous devons donc inclure 8 souris par groupe irradié avec ou sans traitement. Pour les souris non irradiées, aucun effet n’est attendu : 3 souris par groupe seront suffisantes. Sur la base de références bibliographiques, nous avons estimé que l’inclusion de 5 souris par groupe (groupes traités par cellules Muse, groupes traités avec produits de sécrétion de Muse, et groupe irradié contrôle) avec n=3 est nécessaire pour l’analyse des courbes de survie, afin de mettre en évidence une différence statistiquement significative. Enfin, pour les études de cinétique, un effectif de 4 souris par groupe avec n=2 a été retenu, ce qui est suffisant pour détecter des variations biologiquement pertinentes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Pour les souris non irradiées, aucun effet n’est attendu. Nous inclurons donc 3 souris dans ce groupe.
Raffinement
Les souris seront régulièrement pesées et observées . Nous utiliserons une grille de score pour évaluer leur état général et avons établi des points limites. Pour éviter une infection due à une diminution du système immunitaire, les cages seront placées, soit en portoirs ventilés, soit en portoir classique avec un couvercle filtrant. Les souris seront hébergées en groupe, avec enrichissement (coton, tunnels en carton). L'utilsation d'anesthésie et d'analgesie sera mise en place lors des procédures.
Choix des espèces
Les souris consanguines utilisées sont les mieux caractérisées en biomédecine et sont largement utilisées pour étudier le rôle d’un gène spécifique dans un organisme. Elles font l’objet d’un grand nombre d’étude pour analyser les effets biologiques des rayonnements ionisants et leur consanguinité réduit les effectifs utilisés car elles montrent moins de variabilité phénotypique. Ainsi, la puissance statistique est obtenue avec moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. De plus, les syndromes d’irradiation que nous souhaitons étudier sont bien caractérisés chez ces souris . Tout ceci présente des avantages scientifiques et éthiques. Nous utiliserons des souris adultes de 9 à 16 semaines (une souris est considérée comme étant adulte à l’âge de 7 semaines). Une souris prépubère (moins de 7 semaines) a un environnement médullaire (nécessaire à la production des cellules sanguines et à la préservation des cellules souches) qui n’est pas définitif. Une souris de plus de 7 mois est considérée comme âgée d’un point de vue hématopoïétique. Ceci restreint notre choix à l’utilisation de jeunes souris adultes. Pour des raisons de reproductibilité des expériences, le poids et la taille des souris doivent être identiques entre les groupes, ce qui est le cas chez les jeunes adultes à l’âge choisi.
MODIFICATION : Formation « Application de procédures expérimentales chez le rongeur » à destination des étudiants de BUT 1 BMB et des professionnels / diplômés en formation continue.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Former des étudiants et des professionnels aux gestes de l'expérimentation animale mobilise 440 rats, utilisés dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque animal sert de support d'entraînement à des injections et à des administrations orales répétées, avant d'être réutilisé d'une procédure à la suivante. Le RNT signale qu'une erreur d'anesthésie peut provoquer un œdème pulmonaire et une insuffisance respiratoire, et que la contention fait parfois vocaliser les rats. Les animaux sont tués à la fin pour une étude anatomique post-mortem, la chirurgie sur animal anesthésié n'étant pas permise aux apprenants.
Objectifs
MODIFICATION / Le projet a pour objectif de former les étudiants de Bachelor Universitaire de Technologie (BUT) aux fondamentaux de l’expérimentation animale, en les sensibilisant à la réglementation, à l’éthique et au bien-être animal, tout en leur permettant d’acquérir les gestes techniques de base nécessaires à leur insertion professionnelle. AJOUT : IL S’INSCRIT EGALEMENT DANS LE CADRE DE LA FORMATION D’APPLICATEUR DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ LE RONGEUR, CONFORMEMENT AUX REFERENTIELS EN VIGUEUR. À CE TITRE, IL VISE AUSSI A FORMER UN PUBLIC DE PROFESSIONNELS OU DE STAGIAIRES EN FORMATION CONTINUE, AMENES A METTRE EN ŒUVRE DES PROCEDURES EXPERIMENTALES DANS UN CADRE REGLEMENTE. Deux types de procédures sont proposés. La première porte sur le suivi de l’animal anesthésié et la surveillance des paramètres physiologiques. La seconde concerne la manipulation de l’animal vigile (rat) et l’étude anatomique post-mortem : apprentissage de la préhension et de la contention, initiation aux principales voies d’administration et sensibilisation à l’impact du stress, dans le respect de la réglementation et des principes de raffinement et mise en œuvre de procédures d’euthanasie conformes à la réglementation, et observation anatomique permettant d’établir des liens avec l’anatomie comparée. Ainsi, ce projet propose une approche progressive et complète de l’expérimentation animale, intégrant réglementation, éthique et pratique, et préparant les APPRENANTS TANT EN FORMATION INITIALE QUE CONTINUE A LA MISE EN ŒUVRE DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ L’ANIMAL DANS LE RESPECT DE LA REGLEMENTATION, LA CONNAISSANCE DES ACTEURS INSTITUTIONNELS IMPLIQUES (COMITE D’ETHIQUE, AUTORITE COMPETENTE, STRUCTURE DE BIEN-ETRE ANIMAL) ET L’APPLICATION DES PRINCIPES DES 3R.
Bénéfices attendus
MODIFICATION Les bénéfices attendus du projet concernent directement l’acquisition de compétences pratiques et la sensibilisation éthique des APPRENANTS, en lien étroit avec les activités réalisées en travaux pratiques. AJOUT : LEUR PERMETTANT DE VALIDER LA FORMATION APPLICATEUR DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ LE RONGEUR. Au cours des séances sur rat vigile, les APPRENANTS découvrent d’abord le comportement normal de l’animal et apprennent à interagir de manière non stressante (tickling). Ils développent ensuite la capacité à réaliser une contention correcte et sécurisée, préalable indispensable à toute procédure expérimentale. L’apprentissage progressif des différentes voies d’administration (per os, sous-cutanée, intrapéritonéale) leur permet de s’exercer à des gestes techniques précis, de comprendre leurs indications respectives et d’acquérir l’assurance nécessaire à leur bonne réalisation. L’ultime séance, consacrée à l’induction de l’anesthésie, permet de valider ces apprentissages par une situation complète, en liant technicité du geste, suivi physiologique et vigilance sur le bien-être animal. Au cours des séances sur rat anesthésié, les APPRENANTS apprennent à surveiller et interpréter certains paramètres physiologiques sous anesthésie. Ils comprennent ainsi concrètement les enjeux du monitoring et de la profondeur anesthésique. AJOUT : UNE DEMONSTRATION DE PRELEVEMENT SANGUIN AU NIVEAU DE LA VEINE CAUDALE SUR UN RAT ANESTHESIE SERA EGALEMENT REALISEE. La phase post-mortem offre l’opportunité d’étudier l’anatomie topographique des grands appareils, renforçant les connaissances acquises en biologie animale et leur permettant d’établir des liens entre structure et fonction. Ces activités procurent un bénéfice pédagogique direct : elles ancrent les notions de réglementation, d’éthique et de bien-être animal dans une pratique concrète, tout en développant les compétences techniques qui seront attendues dans leur futur parcours professionnel. Les APPRENANTS ne se limitent pas à une approche théorique de l’expérimentation animale : ils acquièrent par l’expérience les gestes de base, la compréhension du rôle des différents acteurs, et une posture responsable vis-à-vis de l’utilisation de l’animal.
Procédures
- Procédure 1 : deux injections par animal - Durée totale d’injection : 30 secondes MODIFICATION : 1 prélèvement sur un des 2 animaux – durée totale :30 secondes - Procédure 2 : 1 administration orale répétée sur 3 séances différentes - Durée de l’administration : 5 secondes MODIFICATION : 6 injections réparties sur 3 séances différentes : Durée totale d’injection : 2,5 minutes
Impact sur les animaux
L’administration des substances nécessaire à l’anesthésie au début de la procédure peut conduire au développement d’un œdème pulmonaire à l’origine d’une insuffisance respiratoire. Une partie des manipulations se produiront sur animal vigile : un risque de stress léger peut être encouru lors de la préhension / contention rats, cela peut engendrer occasionnellement des vocalisations. Lors des phases d’apprentissage des méthodes d’administration : - Per os : gêne légère possible lors de l’introduction de la sonde. - Sous-cutanée et intrapéritonéale : douleur légère brève au point d’injection.
Devenir
Les animaux de la première procédure sont réutilisés dans la procédure suivante. Les animaux sont euthanasiés à la fin de la dernière procédure afin que l’étude anatomique soit réalisée post-mortem, évitant ainsi le recours à une chirurgie sur animal anesthésié, non autorisée pour les APPRENANTS.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins expérimentales demeure, à ce jour, indispensable dans le cadre de notre formation, conformément aux exigences définies dans le Programme Pédagogique National. En effet, celui-ci précise que les diplômés doivent être en capacité de « participer à des activités mettant en œuvre de l’expérimentation sur animaux de laboratoire », compétence essentielle à leur insertion professionnelle. Les secteurs dans lesquels les diplômés sont susceptibles d’évoluer (pharmacologie, physiologie pharmaceutique, toxicologie, biotechnologies, etc.) continuent de recourir à l’expérimentation animale dans un cadre strictement réglementé. La maîtrise des techniques in vivo, associée à une compréhension rigoureuse des protocoles expérimentaux, constitue donc un savoir-faire fondamental garantissant l’adéquation entre la formation et les attentes du milieu professionnel, qu’il soit académique ou industriel. Le projet présenté s’intègre donc dans une approche réfléchie et progressive de l’expérimentation animale, limitée aux apprentissages pour lesquels aucune alternative pédagogique équivalente ne permet actuellement de transmettre les compétences pratiques visées. DE PLUS, LE PROJET VISE AUSSI A FORMER UN PUBLIC DE PROFESSIONNELS OU DE STAGIAIRES EN FORMATION CONTINUE, AMENES A METTRE EN ŒUVRE DES PROCEDURES EXPERIMENTALES DANS UN CADRE REGLEMENTE. Ce projet propose donc une approche progressive et complète de l’expérimentation animale, intégrant réglementation, éthique et pratique. Elle prépare ainsi les APPRENANTS TANT EN FORMATION INITIALE QUE CONTINUE A LA MISE EN ŒUVRE DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ L’ANIMAL DANS LE RESPECT DE LA REGLEMENTATION, LA CONNAISSANCE DES ACTEURS INSTITUTIONNELS IMPLIQUES (COMITE D’ETHIQUE, AUTORITE COMPETENTE, STRUCTURE DE BIEN-ETRE ANIMAL) ET L’APPLICATION DES PRINCIPES DES 3R.
Réduction
MODIFICATION / Nous limiterons le nombre de rats à 2 par groupe TP pour la première procédure, chaque groupe TP étant constitué de 14 APPRENANTS maximum. C’est un nombre minimum pour permettre une démonstration efficace. Pour la seconde procédure, nous utiliserons un rat par APPRENANT EN APPLIQUANT UN TAUX D’ENCADREMENT DE 1 ENCADRANT POUR 4 APPRENANTS et nous réutiliserons les rats de la procédure précédente). Ce nouveau projet permet de diminuer de 50 % le nombre d’animaux utilisés par rapport au précédent projet accepté.
Raffinement
Avant tout apprentissage pratique, les APPRENANTS bénéficient d’un enseignement théorique complet et spécifique dédié au bien-être animal, à l’éthique ainsi qu’à la réglementation en vigueur en matière d’expérimentation animale. Cet enseignement vise à sensibiliser les étudiants à leur responsabilité vis-à-vis de l’animal et à les former aux bonnes pratiques expérimentales. Chaque procédure expérimentale fait l’objet d’une séance préparatoire de Travaux Dirigés, au cours de laquelle les différentes étapes pratiques sont analysées à l’aide de supports vidéo et de documents pédagogiques. Cette préparation a pour objectif de garantir une prise en charge optimale de l’animal, en minimisant l’inconfort, le stress et la douleur, conformément au principe de Raffinement. Les animaux sont hébergés dans des conditions répondant pleinement à leurs besoins physiologiques et comportementaux : ils sont maintenus en groupes, dans un environnement enrichi, et font l’objet d’un suivi quotidien par le personnel compétent. Une période d’acclimatation d’au moins une semaine est systématiquement respectée après leur arrivée dans l’animalerie de l’établissement, avant toute manipulation. Sur le plan analgésique et anesthésique, une analgésie préventive est assurée 20 minutes avant l’induction de l’anesthésie. Durant chaque procédure, l’animal est placé sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie, et un monitoring continu de la température corporelle est effectué. La profondeur anesthésique est rigoureusement surveillée tout au long de la séance par l’enseignant responsable, à l’aide de plusieurs critères : réflexe de retrait de la patte, mouvements des vibrisses, fréquence respiratoire. En cas de signes indiquant une diminution de la profondeur de l’anesthésie, un renforcement immédiat de l'anesthésie est effectué par l'enseignant afin de maintenir un niveau anesthésie stable et compatible avec la procédure. Des points limites sont préalablement définis pour l'ensemble des procédures permettant d'interrompre l'expérimentation dès l'apparition de signes dépassant les critères d'acceptabilité. L’ensemble de ces mesures vise à garantir une expérimentation respectueuse de l’animal, tout en assurant un apprentissage de qualité dans un cadre éthique et réglementé.
Choix des espèces
Les rats présentent des caractéristiques physiologiques et anatomiques qui permettent l’apprentissage plus aisé des diverses techniques d’administration et de l’étude anatomique. De plus, le rat est un animal docile parfaitement adapté à l’apprentissage par les étudiants des principales procédures pratiques. Enfin, le rat est une des espèces les plus couramment utilisées dans les laboratoires de recherche recrutant nos étudiants futurs techniciens. En effet, de très nombreux modèles expérimentaux animaux sont développés chez cette espèce. Il s’agira précisément de rats jeunes adultes : Les organes sont de taille suffisamment importante ce qui facilite les études anatomiques. La taille des animaux adultes rend également leur manipulation plus aisée par les étudiants.
Génotypage en vue de l’obtention d’une lignée simple transgénique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées si leur génotype n'a pas d'intérêt, gardées pour la reproduction sinon, 80 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance légère. Le seul acte est un prélèvement de poil sous anesthésie de courte durée, répété sur les souriceaux jusqu'à ce que la lignée transgénique soit établie. Le RNT prévoit un suivi clinique pour détecter un éventuel effet inattendu de la modification génétique. L'opération relève de la gestion d'élevage, produire et trier des animaux modifiés, plus que d'une expérience à proprement parler.
Objectifs
Génotyper les animaux de génotype(s) inconnu(s) suite à des croisements en vue d'établir une lignée simple transgénique
Bénéfices attendus
Différencier les souris homozygotes mutantes, homozygotes non mutante et hétérozygotes pour la mutation. Ceci permettra de sélectionner uniquement les souris de génotypes d'intérêts.
Procédures
Prélèvement de poil sous anesthésie: L’induction dure environ 1 à 2 minutes, le maintien le temps du prélèvement 1 à 3 minutes, et le réveil intervient généralement en 2 à 5 minutes. La durée totale de la procédure, incluant l’anesthésie et le réveil, est en moyenne de 5 à 10 minutes. Tous les animaux F1 seront concernés jusqu'à ce que la lignée soit établie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement liées aux manipulations (ex:génotypage), et restent légères. Aucun effet indésirable majeur n'est prévu du fait de la modification génétique, mais un suivi clinique sera mis en place pour détecter tout phénotype innatendu. Des mesures seront prises si des signes de souffrance ou de gêne apparaissent, en accord avec les critères d'arrêt définis.
Devenir
Les souris de génotypes qui ne sont pas d'intérêts (hétérozygotes) seront mise à mort ou utilisées pour de la mise au point dans le cadre des projets de recherches. Les autres souris ( mutante et non mutante/sauvage) serviront à la reproduction ou à l'expérimentation.
Remplacement
Le génotypage est indispensable pour différencier les génotypes d'intérêts et établir les lignées. Le prélèvement de poil sera privéliégié dès que c'est possible, lorsque la mise au point du protocole de génotypage sera terminé.
Réduction
Le nombre d'individu à été calculé au minima pour permettre la création de la lignée sans devoir épuisée les géniteurs (si effectif trop petit, plus de portée par géniteur) ni surproduire (si nombre trop important).
Raffinement
L'enrichissement sera adapté aux besoins de cette nouvelle lignée. Des tests d'enrichissement nous permettra d'établir le choix préférentiel de la lignée et donc de respecter ses besoins et préférences. Le prélèvement de poil sera utilisé au détriment de la biospie, dès que la mise au point du protocole de génotypage sera terminé.
Choix des espèces
La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Reproduction à partir de souches déjà établies au laboratoire. Les animaux seront génotypés à partir de 4 semaines de vie
Génération et validation de souris génétiquement modifiées par techniques de transgénèse
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Générées pour créer des lignées transgéniques, 26 300 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère à modérée. Les femelles donneuses reçoivent des injections d'hormones, les receveuses une chirurgie de réimplantation d'embryons sous anesthésie, et les souriceaux de moins de huit jours sont identifiés par prélèvement de phalanges. Ce nombre, le plus élevé du lot, tient à la production en série d'animaux génétiquement modifiés. Les femelles fécondées sont tuées, les souris transgéniques transférées vers des partenaires et les non fécondées réutilisées pour de la formation.
Objectifs
Génération de souris génétiquement modifiées par des différentes techniques de transgénèse additive ou ciblée et validation génotypique
Bénéfices attendus
Les projets de transgénèse de cette demande vont contribuer à l’élargissement des connaissances scientifiques à partir de résultats ciblés liées aux différents modèles souris créés pour une vaste variété de sujets de recherche dans multiple domaines (immunologie, cancérologie, audition, développement, infectiologie, etc.). Les modèles murins de nouvelle création, seuls ou en combination avec d’autres déjà existants contribueront ainsi au progrès de la recherche fondamentale et/ou appliquée
Procédures
-Pour les femelles donneuses : injection d’hormones 2 fois à 46 heures d’intervalle. Durée 1-2 minutes -Pour les femelles receveuses, chirurgie bilatérale de réimplantation avec anesthésie chimique/gazeuse avec analgésie complémentaire. Intervention: 1 fois, 15 minutes d’intervention/femelle -Pour les animaux nés des femelles receveuses/accouplements, Identification des souriceaux par prélèvement de phalanges distales
Impact sur les animaux
-Douleur et inconfort légers de courte durée (1 min) liés à l’injection des hormones. -Douleur et inconfort modérés de durée de 3 jours, liés à la chirurgie. -Douleur et inconfort léger de courte durée liée à l’introduction de la aiguille (quelques sec-quelques min) liés à un putatif prélèvement sanguin (le cas échéant)
Devenir
-Toutes les femelles qui ont été fécondées devront être mises à mort (au moment du prélèvement d’embryons ou du sevrage des souriceaux). -Les souris mâles et femelles transgéniques positives identifiés seront utilisées pour la suite de l’établissement des modèles de souris génétiquement modifiée chez nos partenaires -Les souris mâles et femelles non fécondées peuvent être re-utilisés dans le cadre de formations sur animaux
Remplacement
Malgré le développement actuel croissant de différents modèles ex vivo incluant des modèles organoïdes, le modèle souris continue à être essentiel en recherche afin d’avoir accès à toutes les régulations dans le cadre de l’organisme entier. L’intérêt et besoin de recourir à l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées dans les projets scientifiques de nos collaborateurs est évalué et justifié dans le cadre de chacun des projets autorisés. Toutefois, nous avons réussi à remplacer un nombre important de nos femelles grâce à des embryons fertilisés congelés commerciaux capables de remplacer les embryons frais avec efficacité pour leur modification par transgénèse. Ainsi des embryons frais seront seulement nécessaires en cas de superovulation de souris génétiquement altérées précédemment et/ou fonds génétiques particuliers.
Réduction
-Le nombre de souris femelles donneuses vient principalement de notre longue expérience et est dépendant principalement du fonds génétique des embryons à modifier et du type de manipulation. Pour chaque fonds génétique de femelles donneuses, nous essayons d’optimiser l’âge et les conditions de d’injection afin d’obtenir un maximum d’embryons par femelle et réduire ainsi le nombre de femelles donneuses. -La technique montre une viabilité plus élevée des embryons modifiés et permet une réduction des femelles donneuses requises. -Le nombre de souris receveuses à réimplanter est en fonction du nombre d’embryons qui auront survécu à la manipulation. -Pour chaque transgène ou chaque clone de cellules injecter, nous arrêtons les séries de manipulation dès que nous arrivons dans un premier temps à une dizaine de femelles réimplantées. Nous attendons ensuite la naissance des souriceaux afin de décider, à partir du nombre de petits obtenu, de la reprise ou pas de nouvelles séries de micromanipulation. Ce qui nous permet encore de réduire le nombre de femelles donneuses et receveuses utilisées. -Le fonds génétique choisi pour les femelles receveuses (excellentes mères et capables de donner naissance à de grandes portées de nouveau-nés) permet aussi d’optimiser le nombre de femelles mères-porteuses utilisées par rapport à l’utilisation d’un autre fonds génétique moins « efficace » -Le renouvellement de la batterie de mâles reproducteurs et vasectomisés environ chaque 6-9 mois permet d’améliorer leur performance quant aux capacités d’accouplement et de fécondation permettant à son tour d’optimiser le nombre de femelles donneuses et receveuses et réduire son nombre.
Raffinement
Le souris injectées et les femelles ayant subi la chirurgie seront surveillées quotidiennement. Les femelles receveuses reçoivent un traitement antalgique avant et après l'acte chirurgical et sont surveillées soigneusement pour assurer la bonne cicatrisation pendant au moins les 5 premiers jours après-chirurgie. Nous serons toujours particulièrement attentifs à tout signe de détresse (signes cli-niques externes, prostration, poils hérissés évaluation du Body Condition Score-BCS) afin de réduire/éliminer la souffrance des animaux transgéniques fondateurs et leurs descendants. En cas de souffrance et avant la mise à mort au plus tard au bout de 24h après con-firmation des signes cliniques externes, nous aurons recours au besoin de la nourriture humidifiée / gel hydrique, la réhydratation sous-cutanée ou le chauffage des animaux si hypothermie associée.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui montre 90% d’homologie avec le génome humain, d’où l’intérêt majeur de la création de souris gé-nétiquement modifiées pour la découverte de mécanismes globaux en recherche fon-damentale ainsi que pour la modélisation de maladies humaines. La pertinence du choix de la souris pour ces projets est justifiée dans les projets scientifiques des parte-naires demandeurs. -Les mâles et femelles reproducteurs sont des adultes matures sexuellement (2-12 mois), les femelles receveuses sont des adultes (matures sexuellement, âgées de 8-12 semaines). -Les femelles donneuses d’embryons sont des jeunes, généralement prépubères âgées de 3-4 semaines, pour bien répondre au traitement hormonal de superovulation (âge dépendant du fonds génétique). -Les souris transgéniques positives seront des jeunes remises aux entités de recherche peu de temps après le sevrage une fois caractérisés génétiquement (pour avancement du projet)
Déterminer le rôle des cellules T de souris dans la protection vaccinale avec un vaccin candidat contre le virus du Nil Occidental EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Moins de trente minutes exposées aux piqûres de moustiques infectés par le virus du Nil occidental, sous anesthésie : 602 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance légère à modérée, toutes tuées à l'issue. Certaines sont vaccinées puis anesthésiées pour prélever les cellules immunitaires de leur rate, d'autres reçoivent ces cellules avant l'exposition aux moustiques, avec un suivi des symptômes sur quatorze jours. Le projet vise à soutenir une demande d'essai clinique pour un vaccin candidat. Les souris servant à produire les cellules immunitaires sont tuées pour en récupérer la rate, les autres à la fin des procédures d'infection.
Objectifs
Le projet de recherche permettra de soutenir une demande d’essais cliniques pour un candidat vaccin contre le virus du Nil Occidental. C'est un virus transmis par les moustiques. Il circule surtout chez les oiseaux, qui servent de réservoir naturel. Chez l’être humain, la plupart des infections ne provoquent aucun symptôme (environ 80 % des cas). Cependant, environ 20 % des personnes peuvent avoir de la fièvre et se sentir mal pendant quelques jours. Dans moins de 1 % des cas, le virus peut toucher le système nerveux et provoquer des complications plus graves, comme des inflammations du cerveau ou des méninges, voire une paralysie soudaine ou encore la mort. Ces formes graves sont plus fréquentes chez les personnes âgées ou celles dont le système immunitaire est affaibli. Il est présent dans de nombreuses régions du monde dont l’Europe. Il n’existe actuellement pas de vaccin contre cette maladie et le vaccin candidat que nous proposons pourra répondre à un besoin en santé publique mondiale. La cible du vaccin candidat a été identifiée et correspond à un composé présent dans la salive du moustique. L’équipe de recherche a déjà démontré que l’immunisation contre ce composé protège contre l’infection par le virus de la fièvre du Nil Occidental. Pour soutenir le développement vaccinal, le projet décrit ici a pour objectif de déterminer si la protection vaccinale est liée aux cellules immunitaires ou à d'autres acteurs de l'immunité. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le bénéfice à court terme est la compréhension des mécanismes cellulaires de protection du vaccin candidat. A long terme, les résultats soutiendront le développement d’un vaccin contre ce virus transmis par les moustiques. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique de cette maladie transmise par les moustiques.
Procédures
Dans un premier temps, nous évaluerons la fonction des cellules immunitaires dans la protection vaccinale. Nous vaccinerons des souris en les injectant à deux reprises avec le candidat vaccin. Les injections dureront quelques minutes. Deux semaines après la dernière injection, les souris seront anesthésiées pour prélever les cellules immunitaires de la rate, puis euthanasiées. Dans des souris non immunisées, nous injecterons les cellules immunitaires isolées puis les exposeront à la piqûre de moustiques infectés par le virus de la fièvre du Nil Occidental. L’exposition aux moustiques, sous anesthésie, durera moins de 30 minutes. Nous effectuerons ensuite un seul prélèvement sanguin pour vérifier l’infection et évaluerons les symptômes pendant 14 jours. Dans un deuxième temps, nous testerons si ces cellules immunitaires injectées sont recrutées au niveau de la peau suite à la piqûre de moustiques infectés. Toutes les expériences d'infection seront réalisées dans l'EU1, alors que le reste des expériences sera conduit dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Douleur passagère au niveau du site d’injection lors de l’administration du vaccin candidat et des anesthésiques, ainsi que lors des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendue aux points de piqûres des moustiques. Les troubles liés à l’infection par le virus peuvent inclure des modifications de l’apparence, de l’alimentation et du comportement. Les souris seront surveillées quotidiennement pour évaluer leurs éventuels symptômes.
Devenir
Les animaux utilisés pour la production de cellules immunitaires seront euthanasiés afin de permettre la collecte de leur rate. Tous les animaux infectés seront euthanasiés à la fin des procédures, conformément à l’obligation légale.
Remplacement
Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. A ce jour, aucun modèle autre que le modèle animal ne permet d’évaluer la réponse immunitaire à un vaccin et la protection contre une infection par exposition à une piqûre de moustique infecté. Néanmoins, nous avons généré les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles cellulaires. Ces travaux antérieurs nous on permit d’identifier notre vaccin candidat.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris, nous avons calculé le nombre limite nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Des travaux préliminaires ont été réalisés pour calculer ce nombre au plus juste.
Raffinement
Les souris auront un temps d’acclimatation (5 jours) avec visite quotidienne pour limiter le stress lié à la manipulation. Les souris seront hébergées de 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements variés, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Une grille de score évaluant l'état général des souris sera quotidiennement suivie. Cette grille permet d’observer différents signes de bien-être ou de malaise (comme l’apparence, l’activité, le comportement ou la perte de poids). Nous avons défini des seuils à ne pas dépasser pour garantir la santé et le bien-être des animaux. Si l’un de ces seuils est atteint, l’expérience sera immédiatement arrêtée afin d’éviter toute souffrance inutile. L’évaluation quotidienne sera effectuée par les responsables de la mise en oeuvre générale du projet dans l’EU. Pour une note supérieure à 4, nous considérerons l’injection de 0.05 mg/kg de buprénorphine en S/C de 3 à 4 fois par jour. A partir de 8, la surveillance sera renforcée et nous considèrerons l’euthanasie. Une note supérieure ou égale à 12 est le point limite. Si ce point limite est atteint, une révision du protocole expérimental sera effectuée.
Choix des espèces
Nous allons utiliser des souris avec lesquelles nous avons développé et évalué la stratégie vaccinale. Nous continuerons à documenter la protection conférée par notre vaccin candidat sur souris avant de tester le vaccin candidat sur des animaux plus grands pour soutenir une demande d’essais cliniques. Nous allons utiliser des souris adultes de 6-8 semaines car elles ont un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate. Leur taille permet aussi la piqûre simultanée par plusieurs moustiques, nécessaire pour maximiser l’effet de l’infection.
Impact des polluants environnementaux sur le vieillissement et les pathologies associées telles que la maladie d’Alzheimer, ainsi que les interactions gène-environnement.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
10 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Elles absorbent des polluants chimiques dans leur eau de boisson pendant toute leur vie, à des doses calées sur les limites réglementaires de l'eau potable, pour étudier un lien possible avec le vieillissement et la maladie d'Alzheimer. Le suivi comportemental porte sur l'ouverture des yeux et des oreilles, la motricité, les interactions sociales et la mémoire des souriceaux exposés pendant la gestation. Le RNT rapporte des retards de développement et des troubles de la mémoire tout en indiquant que les animaux ne montraient ni douleur ni perte de poids, et les bénéfices de prévention pour l'humain restent au conditionnel.
Objectifs
En 2019, 57 millions de personnes dans le monde étaient atteintes de démence, dont 60 à 70 % de cas de maladie d'Alzheimer, et ce chiffre pourrait atteindre 152 millions en 2050. Selon le rapport 2024 de la Lancet Commission, 14 facteurs de risque modifiables, en dehors des facteurs génétiques (7–36 %), expliquent environ 45 % des cas de démence dans le monde, qui pourraient être prévenus ou retardés, dont 3 % attribuables à la pollution de l’air. Ainsi, d’autres facteurs de risque interviennent dans les 55 % restants de démence, et notamment les polluants chimiques pourraient interférer dans l’apparition ou l’aggravation de la maladie. D’autre part, l’exposition aux polluants pendant la gestation pourraient interférer sur le développement du cerveau. Cet impact chimique peut entrainer des maladies comme des déficits de l’attention avec hyperactivité (TDAH) et des troubles autistiques chez l’enfant, et se révéler être des facteurs de risque pour le vieillissement du cerveau plus tard dans la vie. Nous nous intéressons à des fongicides, des produits très utilisés pour protéger les cultures, notamment la vigne et les fruits, contre les moisissures. Des études ont montré que ces substances sont parmi les pesticides les plus souvent retrouvés dans l'alimentation en France, y compris dans les petits pots pour bébés, mais aussi dans l'air et dans l'eau. Nous avons déjà observé que l'exposition à trois de ces fongicides, à des doses autorisées dans l'eau potable, aggrave les symptômes de la maladie d'Alzheimer chez des souris génétiquement modifiées. Par ailleurs, nous sommes impliqués dans un projet européen pour analyser des échantillons biologiques humains de patients atteints de démences. L'objectif étant d'identifier des traces spécifiques de polluants, appelées "signatures", qui pourraient être associées à un déclin des capacités intellectuelles ou à une maladie d'Alzheimer. Nos objectifs sont: 1. Etudier l'impact des fongicides sur le développement du cerveau et le vieillissment chez la souris afin de comprendre leurs effets sur le fonctionnement du cerveau et le comportement des animaux pouvant induire des troubles ou des symptômes apparentés à ceux observés dans l'autisme ou le TDAH. 2.Etudier les effets des signatures identifiées chez les patients sur nos modèles de souris Alzheimer afin de mieux comprendre comment ces mélanges de polluants influencent la progression de la maladie, le comportement et les mécanismes moléculaires.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter des bénéfices importants pour la santé humaine et la protection de l’environnement: 1. Mieux comprendre l’impact des polluants sur la santé : Le projet vise à identifier des polluants, présents dans notre environnement quotidien qui pourraient perturber le développement du cerveau, le vieillissement, en lien avec plusieurs maladies : l’autisme, trouble de l’attention (TDAH) et Alzheimer. Ces recherches apporteront des réponses quant à l’impact de ces polluants sur le comportement des animaux, notamment sur les troubles de la mémoire, l’apparition ou l’aggravation de ces maladies et leurs mécanismes. 2. Vérifier la sécurité des normes actuelles : Les doses de polluants utilisées dans ces études correspondent aux limites autorisées dans l’eau potable voire plus faibles. Grâce aux résultats obtenus, il sera possible de vérifier si ces normes sont suffisamment protectrices. Si nécessaire, ces données pourraient contribuer à faire évoluer la réglementation, comme cela a déjà été le cas pour certains produits. 3. Proposer des solutions pour prévenir les maladies : Si les animaux exposés à ces polluants développent des symptômes similaires à ceux observés chez les humains (comme des troubles de l’apprentissage, des comportements répétitifs ou des problèmes de mémoire), ces résultats pourraient contribuer à identifier les origines de certaines maladies. Ces recherches ouvriraient la voie vers des méthodes de prévention plus efficaces. Ainsi, des alertes et des recommandations auprès des instances en santé publique et environnementale pourraient être émises afin de limiter l’exposition à ces substances. Alternativement, des stratégies pourraient être proposées pour protéger les populations les plus vulnérables de contracter des pathologies, comme les femmes enceintes, les jeunes enfants, les personnes âgés, ainsi qu’éviter l’agravation des pathologies chez les patients.
Procédures
Les animaux seront exposés uniquement à des polluants, à des doses très faibles correspondant aux limites réglementaires maximales autorisées dans l’eau potable, et ce via leur eau de boisson tout au long de leur vie. Aucune intervention supplémentaire ne sera appliquée.
Impact sur les animaux
Des études de comportement chez les animaux ont révélé que les souriceaux exposés aux polluants pendant la grossesse et après la naissance présentaient des retards dans leur développement. L’ouverture des yeux et des oreilles étaient retardées par rapport aux souriceaux non exposés aux polluants. Elles avaient également des retards de motricité. De plus, des problèmes d’interactions sociales ont été montré. En vieillissant, ces animaux présentaient des difficultés d’apprentissage et de mémoire. Malgré ces retards et observations, les animaux ne montraient pas de signes de douleur, de perte de poids ou de stress.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures.
Remplacement
Nous avons déjà étudié les effets des fongicides sur des modèles cellulaires. Nos travaux ont montré que les fongicides ciblés dans ce projet sont toxiques pour les cultures de neurones à de faibles concentrations. Nous étudions également les effets des fongicides sur les cellules souches issues de patients Alzheimer. Toutefois, étudier les effets de ces polluants sur la cognition et le comportement, en lien avec des pathologies de type autisme ou des maladies du vieillissement telles que la maladie d’Alzheimer, nécessite d'avoir recours à un modèle plus complexe tel que la souris.
Réduction
Pour ce projet nous envisageons d'utiliser 10008 souris sur la durée du projet. Nous procéderons par étapes, avec des études pilotes avec un faible nombre d'animaux avant de générer l'ensemble des expériences prévues. Le nombre d'animaux adéquat a été calculé grâce à un logiciel permettant d'avoir des analyses robustes. Nous avons également tenu compte de notre expertise de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant un nombre suffisant d'animaux pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Une réduction possible de 3360 animaux sera effectuée selon les résultats obtenus au début du projet.
Raffinement
Les animaux utilisés seront sous surveillance quotidienne avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson, avec ou sans polluants. Avant les tests de comportement, les animaux seront acclimatés dans la pièce, 1h avant le début des tests, afin de limiter au maximum le stress des animaux lié à un changement d’environnement.
Choix des espèces
Dans les modèles d'expositions aux polluants environnementaux pendant la gestation, la souris représente un modèle de choix, pour les raisons suivantes : -Ce sont des mammifères donc le mode de transmission des polluants via le placenta et le lait est similaire à l’humain ; -La reproduction et la gestation sont relativement rapides ce qui permet de générer les groupes nécessaires à l'étude assez rapidement ; -Le nombre de petits par portée est élevé, ce qui permet d'avoir une robustesse dans nos études comportementales, de prendre en compte le sexe dans les groupes et d'avoir des échantillons en nombre suffisant pour les analyses biochimiques et histologiques ; -Des études précédentes sur l'exposition aux polluants ont permis de mettre en évidence du TDAH chez la souris. Les souris sont donc un bon modèle de pathologies neurodéveloppementales et de vieillissement, c'est pourquoi nous privilégions les souris dans ce projet. Les mères seront traitées avec les polluants avant l'accouplement (1 mois), puis pendant l'accouplement et la gestation. Elles seront en permanence sous traitement à la concentration résiduelle, comme c'est le cas de la population humaine exposée chroniquement aux polluants tout au long de leur vie. Les petits issus de ces portées seront soumis aux polluants à faibles doses pendant le développement (stade foetal), pendant la lactation et jusqu'à la date d'euthanasie prévue des animaux.
Rôle de la régulation énergétique des cellules immunitaires dans le contexte des maladies cardiovasculaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 018 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une irradiation, une greffe de moelle osseuse puis des injections trois fois par semaine pendant six semaines, sur un fond génétique qui développe des plaques dans les artères. Les souris qui n'ont pas le génotype recherché sont mises à mort d'emblée, les autres après le prélèvement des organes. Le projet étudie le rôle du métabolisme de cellules immunitaires dans l'athérosclérose.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires, comme l’athérosclérose, se développent à cause d’une inflammation chronique dans les artères aboutissant à la formation de dépôts de graisse dans les artères. Cette inflammation est entretenue par certaines cellules du système immunitaire qui s’accumulent dans les dépôts de graisse et perturbent progressivement le bon fonctionnement des vaisseaux sanguins. Des travaux récents montrent que le système énergétique interne des cellules du système immunitaire joue un rôle clé dans cette inflammation et dans la formation des dépôts de graisse. Notre projet a pour objectif de comprendre comment le fonctionnement interne de ces cellules immunitaires influence leur activité et contribue au développement de l’athérosclérose à travers trois aspects : la composition en graisses des structures énergétiques, leur déplacement à l’intérieur de la cellule et leur réaction lorsque la cellule est exposée à un excès de lipides. L’analyse de données scientifiques publiques nous a permis d’identifier trois gènes importants pour ces fonctions. Pour vérifier leur rôle, nous utiliserons des souris dans lesquelles chacun de ces gènes est inactivé uniquement dans les cellules immunitaires. Nous obtiendrons ces animaux par un croisement génétique contrôlé. Comme les souris développent peu spontanément des maladies cardiovasculaires, nous transférerons ensuite leur moelle osseuse dans un modèle bien établi d’athérosclérose. Cela nous permettra d’évaluer de manière précise comment la modification du fonctionnement interne de ces cellules influence la formation des plaques.
Bénéfices attendus
Cette étude ouvrira de nouvelles perspectives de diagnostic et de traitement des maladies cardiovasculaires telles que l'athérosclérose. Ainsi, à terme, cette recherche devrait contribuer à réduire la morbi-mortalité associée aux maladies cardiovasculaires en proposant des interventions diagnostiques et thérapeutiques mieux adaptées aux besoins des patients.
Procédures
Toutes les souris subiront 1 prélèvement de l'extrémité caudale sur animal vigile. Certains groupes de souris subiront 1 irradiation sur animal vigile, 1 injection sur animal anesthésié, et 3 prélèvements de sang sur animal vigile. Certains groupes de souris subiront 1 irradiation sur animal vigile, 1 injection sur animal anesthésié, 3 prélèvements de sang sur animal vigile, et 1 injection 3 fois/semaine pendant 6 semaines sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les souris soumises au prélèvement d'une biopsie de l'extrémité caudale peuvent ressentir une légère inflammation temporaire. Certains groupes de souris soumises à l'irradiation perdront temporairement (18h) les cellules de la moelle osseuse sans effet sur leur comportement. Les souris subissant un prélèvement de sang peuvent ressentir une inflammation légère temporaire, le temps que la peau cicatrise.
Devenir
Les animaux avec le bon génotype participeront aux procédures d'expérimentation (612), les autres seront euthanasiés. Tous les animaux des procédures d'expérimentation seront euthanasiés à la fin des procédures d'expérimentation afin de récupérer les organes pour analyse.
Remplacement
Les maladies cardiovasculaires sont des pathologies complexes dans lesquelles de multiples voies métaboliques et physiologiques interviennent. De ce fait, une approche in vivo reproduisant ces interactions nous est indispensable pour répondre à notre problématique. De plus, l'étude du dépôt de cholestérol dans les artères ne peut être réalisé in vitro. Des modèles murins capables de développer de l'athérosclérose ont donc été développés et validés par la communauté scientifique comme outils d’études précliniques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été strictement optimisé afin de répondre aux principes de réduction. Une analyse de puissance a été réalisée avec un logiciel dédié et a déterminé l'effectif nécessaire par groupe expérimental pour obtenir une significativité statistique robuste auquel nous ajoutons 15% de marge si des animaux doivent être sortis des groupes d'expérimentation. Chaque groupe comprendra des souris mâles et femelles afin de prendre en compte les variations liées au sexe sans augmenter le nombre total d’animaux au-delà du strict nécessaire. L’ensemble de ces paramètres garantit l’utilisation du plus faible nombre d’individus tout en assurant la validité scientifique des résultats.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure permettront de limiter la sévérité de celles-ci. Nous avons choisi d'injecter en sous-cutané plutôt qu'en intra-péritonéal car cela permet de diminuer la douleur et le stress, d'augmenter la fiabilité, et permet la translation vers l'Homme.
Choix des espèces
1) Nous avons choisi le modèle murin car c’est un modèle standard bien reconnu dans le domaine scientifique pour l’investigation de manipulations génétiques liées aux maladies cardio-métaboliques. 2) Nous avons également des souris génétiquement modifiées connues pour développer des plaques d'athérome après un régime riche en graisse. 3) De plus, le modèle murin présente plusieurs avantages par rapport à d’autres espèces : cycle de vie court, natalité importante. 4) Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 8 semaines car c'est l'âge à partir duquel les souris sont physiologiquement matures : les systèmes immunitaire et vasculaire sont complètement développés.
Evaluation d’une nouvelle stratégie de thérapie génique dans des modèles murins humanisé ou simianisé de polyarthrite Rhumatoïde
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 510 souris dépourvues de système immunitaire sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une greffe de cellules souches sanguines humaines ou simiennes, puis une polyarthrite rhumatoïde lui est induite, avec douleur, gonflement des articulations et perte de poids, avant jusqu'à huit prélèvements de sang. Le projet cherche à modifier des lymphocytes B pour calmer l'inflammation. Le porteur écrit que les immunothérapies ont "révolutionné" la prise en charge de certains cancers et juge l'expérimentation animale "indispensable", quand ces souris sont maintenues sans défenses et rendues malades pour la durée de l'étude.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde est une maladie chronique qui touche les articulations. Elle concerne environ 300 000 personnes en France, en majorité des femmes. Dans cette maladie, le système immunitaire, qui est censé nous protéger, se dérègle et attaque par erreur les articulations. Cela provoque une inflammation persistante, des douleurs, des gonflements et, avec le temps, une destruction du cartilage et de l’os. Les traitements actuels permettent de ralentir la maladie et de soulager les symptômes. Certains médicaments très utilisés, comme le méthotrexate ou les biothérapies, ont nettement amélioré la prise en charge des patients. Mais ils ne guérissent pas la maladie et doivent être pris régulièrement pendant des années, avec parfois une diminution de leur efficacité. Environ un tiers des patients répond mal à ces traitements ou rechute, ce qui montre qu’il reste un réel besoin de nouvelles solutions thérapeutiques. Depuis quelques années, les immunothérapies, des traitements qui agissent directement sur le système immunitaire, ont révolutionné la prise en charge de certains cancers et maladies graves. L’idée de ce projet est d’exploiter ces nouvelles thérapies pour la polyarthrite rhumatoïde. L’objectif de ce projet est de modifier génétiquement certaines cellules du système immunitaire, les lymphocytes B, ou les cellules souches du sang dont ils proviennent afin que les lymphocytes B modifiés soient capables de calmer durablement l’inflammation au lieu de l’entretenir. Pour cela nous devons réaliser des études précliniques de transplantation dans des modèles de souris ne disposant pas de système immunitaire : ces modèles permettent la prise de greffe de cellules souches sanguines humaines ou simiennes et l’induction d’une polyarthrite rhumatoïde permettant d’évaluer l’efficacité de notre approche.
Bénéfices attendus
A long terme, la validation de l’efficacité de notre approche pour traiter la polyarthrite rhumatoïde serait une avancée majeure pour les patients. Cette approche pourrait également être étendue à d’autres maladies auto-immunes ou des maladies infectieuses.
Procédures
Anesthésie générale (3 anesthésies, durée 2-3 minutes) pour les injections des cellules et de molécules thérapeutiques Injection de cellules génétiquement modifiées (2 maximum) qui ne dure que quelques secondes réalisée sous anesthésie Injections (2 fois) d’une molécule qui induit une polyarthrite rhumatoïde qui ne dure que quelques secondes réalisée sous anesthésie. Prélèvement de sang sur animal vigile (8 maximum) qui ne dure que quelques secondes
Impact sur les animaux
Les souris dépourvues de système immunitaire ont un risque de développer des infections diverses en lien avec des pathogènes (virus, bactéries). L’injection de cellules ne provoque pas de douleur et se fait sous anesthésie générale. Cependant, il y a un risque d’infection. La manipulation des souriceaux représente un risque de rejet de la mère. Les prélèvements sanguins peuvent générer du stress dû à la contention de l’animal, une brève douleur ainsi qu’un risque d’infection chez la souris dépourvue de système immunitaire. L’induction de la polyarthrite rhumatoïde entraine une douleur, un gonflement articulaire, une perte de mobilité et une perte de poids.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin d’analyser les cellules sanguines, les atteintes du cartilage et des os afin d’évaluer l’efficacité de l’approche thérapeutique.
Remplacement
La greffe de cellules souches de la moëlle osseuse est un processus très complexe pour lequel il n’existe aucune méthode alternative in vitro. Les cellules doivent être capables de trouver le bon endroit dans l’organisme (la moëlle osseuse), de s’y installer, de survivre, puis de se transformer en toutes les différentes cellules du sang (globules rouges, globules blancs, etc). La transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des cellules modifiées par thérapie génique à se loger au niveau de la moëlle osseuse et reconstituer des cellules sanguines à long terme. Pour tester de nouveaux traitements contre la polyarthrite rhumatoïde, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux qui permettent d’observer l’ensemble du fonctionnement du système immunitaire. En effet, cette maladie fait intervenir à la fois des cellules immunitaires et des anticorps. Ces deux acteurs du système immunitaire interagissent entre eux et évoluent dans le temps sous l’effet d’un traitement. Or, il n’est pas possible aujourd’hui d’étudier correctement ces mécanismes complexes en dehors d’un organisme vivant. L’expérimentation animale reste aujourd’hui indispensable pour comprendre si des cellules modifiées restent fonctionnelles et évaluer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la polyarthrite rhumatoïde.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’efficacité du transfert de gène dans des systèmes de culture in vitro et seules les stratégies qui sont efficaces et ne génèrent pas de toxicité cellulaire seront évalués in vivo. Notre expérience dans le domaine de la thérapie génique des cellules sanguines ainsi que des données de la littérature nous indiquent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe est de 6 à 8 animaux en fonction du type de cellules greffées pour rendre des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris dépourvues de système immunitaire sont élevées en conditions stériles. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est stérilisée. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants désinfectés à l'alcool. Les cages des animaux disposent de cotons (pour l’enrichissement des animaux) qui ont été au préalable stérilisés. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux, les injections sont réalisées sous anesthésie. Les souris seront examinées entre 3 fois par semaine et tous les jours en fonction des symptômes et une grille de suivi sera remplie en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir alerter le vétérinaire et intervenir rapidement en cas d’effet inattendu. Des critères ont été définis pour mettre en place un traitement approprié ou envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint.
Choix des espèces
Les souris montrent de grandes similarités de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Elles sont couramment utilisées pour l’étude des cellules sanguines après transplantation de cellules souches du sang. Les souris utilisées pour ce projet sont dépourvues de système immunitaire ce qui permet d’éviter le rejet de greffe de cellules d’une autre espèce (humaine/simienne). De plus, ces souris n’ont pas besoin de traitement de chimiothérapie conditionnement avant la greffe des cellules souches sanguines contrairement à d’autres souches de souris ce qui évite les effets secondaires liés à ce traitement au conditionnement. Dans ce projet, les animaux sont utilisés au stade de jeune adulte (comme les patients) ou au stade de souriceaux chez lesquels la prise de greffe est encore plus forte.
Etude morpho-fonctionnelle des réseaux neuronaux chez l’animal vigil, non anesthésié, à l’aide d’approches d’imagerie in vivo
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris nouveau-nées reçoivent une injection virale dans le cerveau, puis une fenêtre optique implantée dans le crâne pour observer leurs neurones pendant des semaines. 1 750 souris sont utilisées, dont 1 400 dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, toutes tuées à l'issue. Le résumé présente ces observations comme réalisées chez l'animal éveillé, dans des conditions "proches du comportement naturel", quand sa propre grille prévoit de coter des vocalisations persistantes et des comportements d'automutilation. Le cerveau est prélevé après la mise à mort.
Objectifs
Cette plateforme permet d’étudier les circuits neuronaux chez la souris, de la naissance à l’âge adulte, grâce à des techniques d’imagerie réalisées chez des animaux éveillés et dans des conditions proches du comportement naturel. Selon les expériences, différentes méthodes sont employées afin d’observer le cerveau en profondeur ou chez des animaux libres de leurs mouvements. Les animaux subissent d’abord une intervention permettant d’installer un petit dispositif donnant accès au cerveau. Après une période de récupération, ils sont progressivement habitués aux conditions expérimentales. Les observations sont ensuite réalisées chez des animaux éveillés. Trois types de protocoles sont utilisés :1) observation de l’activité du cerveau chez les très jeunes animaux, 2) suivi de cette activité au cours du développement jusqu’à l’âge adulte, et 3) analyse du cerveau après la fin de l’expérimentation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer et valider des méthodes fiables pour observer le fonctionnement du cerveau chez la souris éveillée, dans différentes conditions expérimentales, avec ou sans immobilisation de la tête. Sur le plan scientifique, ces méthodes permettront de mieux comprendre comment les neurones fonctionnent ensemble, dès les premières étapes du développement, et dans des situations plus proches du comportement naturel, notamment lorsque l’animal peut se déplacer librement. Sur le plan technique, ce projet permettra d’améliorer et de structurer les outils disponibles sur la plateforme, afin de les rendre plus accessibles et plus simples à utiliser pour les chercheurs, tout en respectant les exigences éthiques liées à l’expérimentation animale. Enfin, ce travail contribuera à garantir la qualité et la fiabilité des résultats scientifiques, ainsi qu’à former les utilisateurs aux bonnes pratiques expérimentales.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs étapes : identification et prélèvement pour génotypage, injection virale à la naissance, chirurgie pour l’implantation d’une fenêtre optique, sessions répétées d’imagerie chez l’animal éveillé, puis mise à mort suivie d’analyses du cerveau. À la naissance, les animaux sont brièvement manipulés pour identification, prélèvement et injection sous anesthésie adaptée, avant d’être replacés avec leur mère. Une chirurgie est ensuite réalisée sous anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur, afin d’installer un dispositif permettant l’observation du cerveau. Après quelques jours de récupération, les animaux sont progressivement habitués au dispositif. Les séances d’imagerie sont réalisées chez l’animal éveillé, soit en position fixe, soit en déplacement libre, pour des durées limitées avec des périodes de repos. Une stimulation lumineuse peut être appliquée dans certains cas. En fin d’expérimentation, les animaux sont mis à mort sous anesthésie profonde, puis leur cerveau est prélevé pour analyses.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés aux procédures chirurgicales, notamment les injections intracérébrales et l’implantation d’une fenêtre optique crânienne pour l’imagerie in vivo. Ces interventions peuvent entraîner une douleur ou un inconfort transitoire associé à l’incision cutanée, à la manipulation des tissus périphériques (crâne, dure-mère) et à la réaction inflammatoire locale. Après une injection intracérébrale, une gêne ou une sensibilité au niveau du site opératoire peut survenir durant les premières heures à 1–2 jours. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal. L’implantation chronique d’une fenêtre optique constitue une intervention plus invasive, susceptible de provoquer une douleur post-opératoire modérée et une inflammation locale pouvant persister plusieurs jours (en général 2 à 5 jours). Cette chirurgie est également réalisée une seule fois par animal, mais l’implant reste en place sur le long terme. Dans certains cas, des effets indésirables peuvent inclure une perte de poids transitoire, une diminution temporaire de l’activité ou des signes de stress liés à la récupération post-chirurgicale ou au port du dispositif d’imagerie. De manière plus rare, des complications peuvent survenir, telles qu’une infection locale, un déplacement de l’implant ou une détérioration de l’état général.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. La mise à mort est justifiée par le caractère invasif des procédures expérimentales et par la nécessité de réaliser des analyses post-mortem des tissus cérébraux afin de compléter les données obtenues in vivo. De plus, les dispositifs implantés et les interventions chirurgicales ne permettent pas une réutilisation des animaux dans d’autres procédures expérimentales sans risque de compromettre leur bien-être ou la validité scientifique des résultats.
Remplacement
Répondre à notre objectif nécessite de pouvoir étudier le cerveau vivant, éveillé et en comportement. En ce sens, seules des approches menées sur un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau, ciblées par notre projet et dont pourront bénéficier à terme les études menées chez l’homme. En effet, les méthodes alternatives comme les organoïdes cérébrales ne permettent pas d’étudier des réseaux neuronaux fonctionnellement connectés et matures, et nous ne possédons pas encore les connaissances suffisantes pour établir des modèles in silico de ces réseaux corticaux complexes. C’est d’ailleurs un des aspects clés de notre projet : nous visons à établir une description fonctionnelle précise de ces réseaux de neurones, en se concentrant sur les différents types cellulaires, avec l’espoir que dans le futur cela rende possible des modèles in silico de ce type.
Réduction
Nous nous engageons à limiter le nombre d’animaux utilisés en maximisant la quantité et la qualité des données obtenues par individu. L’utilisation de protocoles d’imagerie longitudinaux sur les mêmes animaux, la standardisation des procédures chirurgicales et le recours à des outils analytiques puissants (imagerie multiphotonique, systèmes miniaturisés) permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant la robustesse statistique des résultats. Lorsque cela est compatible avec les objectifs scientifiques des projets, des animaux des deux sexes (mâles et femelles) seront inclus afin d’éviter toute discrimination de sexe et de permettre une meilleure représentativité des résultats. Enfin, la mutualisation des données entre projets, lorsque possible, et la formation des utilisateurs aux bonnes pratiques visent également à limiter les pertes expérimentales et les répétitions inutiles.
Raffinement
Le bien-être des animaux, qu’il s’agisse des souris gestantes ou de leur progéniture, sera rigoureusement suivi tout au long du protocole (croissance, état général, comportement). Une surveillance quotidienne sera assurée afin d’évaluer l’activité, l’aspect du pelage, l’alimentation ainsi que tout signe de douleur ou de stress. Des grilles de scores de souffrance seront utilisées pour permettre une prise en charge rapide et adaptée (cf annexe 1). Tout score de 3 attribué à l’un des paramètres (vocalisations persistantes, posture anormale, automutilation, perte de poids importante, absence de prise alimentaire, etc.) sera considéré comme un signe de souffrance sévère et entraînera systématiquement une action corrective immédiate. Ainsi, un animal présentant des vocalisations ou des comportements d’auto-mutilation ne sera en aucun cas considéré comme “normal”, mais fera l’objet d’une prise en charge renforcée et, si nécessaire, d’une consultation vétérinaire. Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés et juvéniles lors des chirurgies afin de minimiser douleur et stress : anesthésie générale et locale adaptée, administration systématique d’analgésiques en péri- et post-opératoire, maintien thermique (tapis chauffant), conditions strictes d’asepsie, protection oculaire, réhydratation, et suivi post-opératoire renforcé, notamment lors de la réintégration des petits à la portée. En cas de dépassement des seuils définis, une analgésie supplémentaire sera administrée, par exemple buprénorphine (0,1 mg/kg, SC, toutes les 8–12 h si nécessaire), avec une réévaluation quotidienne. Si malgré ces mesures l’état de l’animal ne s’améliore pas rapidement, ou si plusieurs paramètres atteignent un score critique, des critères d’arrêt anticipé seront appliqués et l’animal sera euthanasié afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les mères et leurs petits, opérés ou non, seront hébergés dans des armoires ventilées en environnement contrôlé, avec un enrichissement adapté (igloos, rouleaux de papier, matériaux de nidification) favorisant le comportement naturel. Les animaux plus âgés bénéficieront des mêmes conditions d’hébergement, avec un suivi quotidien.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de référence en neurosciences, en raison de la complexité de son organisation cérébrale, de la disponibilité de nombreux outils génétiques, et de l’existence de nombreuses lignées transgéniques permettant un ciblage cellulaire précis via le système Cre-loxP. Ce modèle est particulièrement adapté aux approches d’imagerie fonctionnelle in vivo développées sur la plateforme. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement, du stade néonatal (P0) à l’âge adulte, afin d’étudier à la fois la mise en place progressive des circuits neuronaux au cours du développement et le fonctionnement de réseaux matures. Cette diversité de stades est essentielle pour comprendre l’évolution des dynamiques neuronales au cours de la vie et répondre aux objectifs des projets menés sur la plateforme, notamment dans le contexte du développement normal ou de troubles neurodéveloppementaux.
Impact du son sur le bien-être de la petite roussette en captivité
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturées deux fois à l'épuisette et soumises à un "test de surprise" où une barre métallique est lâchée près du bassin une fois par mois, 70 petites roussettes, de petits requins, subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger avant d'être relâchées à leur lieu de capture. Le projet mesure l'effet du bruit sur leur comportement en élevage. Une règle européenne applicable fin 2026 impose de mieux maîtriser bruit et vibrations dans les lieux d'élevage, ce qui motive cet état des lieux. Le projet entend améliorer les conditions de captivité en soumettant les animaux à des captures et des chocs sonores répétés.
Objectifs
À partir de décembre 2026, une nouvelle règle européenne exigera que le bruit et les vibrations dans les lieux où sont élevés des animaux pour la recherche soient mieux maîtrisés. L’objectif est simple : éviter que les équipements, comme les pompes ou les systèmes de filtration, ne perturbent le bien-être des animaux. Aujourd’hui, si l’on connaît assez bien les effets du bruit dans la nature, on dispose encore de peu d’informations sur ce qui se passe en milieu d’élevage. Or, ces environnements sont souvent bruyants et complexes, avec des sons et des vibrations provenant de nombreuses sources (machines, circulation de l’eau, structure des bassins…). Ce projet vise donc à mieux comprendre ces phénomènes en combinant des mesures de bruit, l’observation du comportement des animaux et l’analyse des installations. L’objectif est de créer une première base de référence sur les niveaux sonores dans ce type de structure. Concrètement, il permettra d’évaluer comment le bruit influencent le comportement et le bien-être des petites roussettes (de petits requins), et de proposer des solutions simples pour réduire les nuisances et améliorer leurs conditions de vie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier l’impact du son sur le bien-être des juvéniles et génitrices de petite roussette, et faire un état des lieux sonore des infrastructures aquacoles du laboratoire.
Procédures
Sur la période d’expérimentation (4 mois), les juvéniles (Nb = 30) et les adultes (Nb=40) subiront chacun deux captures à l’épuisette (nuisance légère d’une dizaine de seconde).
Impact sur les animaux
Les 40 génitrices subiront un « test de surprise » qui consiste à lâcher volontairement une barre métallique à proximité des bassins. Cette procédure est répétée une fois par mois, soit 4 tests sur la durée de l’expérimentation, et pourrait constituer une nuisance légère avec l’induction de comportement de stress.
Devenir
A la fin de l’expérimentation, tous les animaux sont replacés dans le milieu naturel.
Remplacement
Ce projet vise à appréhender l’impact de l’environnement sonore chez la petite roussette. La perception du son et les comportements associés nécessite un organisme entier intègre. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle.
Réduction
Le nombre de roussette est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. A la fin de l’expérimentation, tous les animaux sont replacés dans le milieu naturel sur le lieu de leurs captures.
Raffinement
Un enrichissement environnemental est mis à disposition dans chaque bassin pour les génitrices sous la forme de deux supports de ponte artificiel. Pour les juvéniles, l’enrichissement environnemental est composé de pièces pvc. L’éclairage des aquariums est composé de rampes LED « lumière du jour » dimmable afin de simuler un levé/couché du soleil progressif. Les animaux sont nourris 2 fois par semaine avec du lieu noir, des lamelles de calamar, et des crevette rose. Les biométries initiales et finales sont réalisées sous anesthésie avec une solution anesthésiante. Les génitrices sont manipulées à l’aide d’un torchon mouillé à l’eau de mer et leurs yeux sont couvert durant toute la durée des manipulations. Le bien-être des animaux est évalué quotidiennement par une feuille de suivi permettant de quantifier l’expression de critères spécifiques de ce projet.
Choix des espèces
L'espèce de cette étude est la petite roussette. Ce petit requin est une espèce phare de la biologie du développement, un stock annuel de génitrice est maintenu en élevage afin de produire des œufs datés pour la communauté scientifique. Le projet comporte 30 juvéniles et 40 femelles adultes de petite roussette.
Développement d’un vaccin contre Clostridioides difficile : étude de sa répartition et devenir dans l’organisme
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à sept administrations de produit et six anesthésies gazeuses pour l'imagerie par animal : 184 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Le projet suit la répartition dans l'organisme d'un vaccin expérimental contre Clostridioides difficile, une bactérie responsable de diarrhées graves, pour savoir où il se loge et combien de temps. Les administrations passent par plusieurs voies et chaque séance d'imagerie se fait sous anesthésie. Le porteur décrit le recours à l'animal comme "incontournable", faute de modèle reproduisant la réponse immunitaire complète.
Objectifs
La bactérie pathogène Clostridioides difficile est une cause fréquente de diarrhées graves, en particulier chez les personnes agées et les personnes hospitalisées. Ces infections peuvent récidiver après traitement et représenter un problème important pour la santé publique. Trouver de nouvelles façons de prévenir ces infections est donc essentiel. Parmi les stratégies de prévention les plus pertinentes se situe la vaccination. Ce projet a pour objectif d’étudier un nouveau type de vaccin qui utilise un véhicule pour délivrer le vaccin dans les cellules cibles. Nous cherchons à comprendre comment ce vaccin se répartit dans l’organisme et combien de temps il reste présent après son administration afin d’évaluer son efficacité et sa sécurité. Pour cela, des expériences sont réalisées chez la souris en utilisant une technique d’imagerie qui permet de suivre le vaccin sans avoir à intervenir de manière répétée sur les animaux. Les informations obtenues permettront d’améliorer la conception de futurs vaccins et de vérifier que cette approche est adaptée et sûre avant de poursuivre son développement. Ce travail pourrait, à terme, contribuer à réduire le nombre d’infections et leurs récidives chez les patients.
Bénéfices attendus
Le développement de nouvelles stratégies de prévention des infections à Clostridioides difficile représente un enjeu majeur de santé publique, compte tenu de leur fréquence, du risque de récidive et de leur impact en milieu hospitalier et communautaire. Une approche vaccinale efficace contribuerait à réduire l’incidence de ces infections, à limiter leur dissémination et à diminuer la charge sanitaire associée. De manière plus générale, cette étude contribuera à la validation préclinique de cette nouvelle technologie vaccinale, avec des perspectives d’application en santé humaine et animale. Les résultats obtenus seront directement exploitables dans le cadre du projet parallèle de développement d’un vaccin ciblant Clostridioides difficile.
Procédures
Les souris vigiles seront soumises à plusieurs administrations de produits par différentes voies. Un premier groupe de 40 souris recevra 7 administrations (4 administrations le jour 1 puis 1 administration par jour pendant 4 jours). Un deuxième groupe de 144 souris recevra 4 administrations (2 administrations le jour 1 et 1 administration par jour sur les 2 jours suivants). Chaque administration dure une dizaine de secondes. Les souris subiront 3 (144 souris) à 6 (40 souris) anesthésies gazeuses pour les mesures d’imagerie qui dureront entre 12 à 30 minutes et qui seront réparties sur 3 à 5 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus au cours de cette étude sont principalement liés aux manipulations de l’animal et aux différentes administrations réalisées chez l’animal soit par injections soit par voie orale. Ces administrations peuvent engendrer une douleur et une angoisse légère et transitoire. D’autre part, les souris seront anesthésiées par voie gazeuse ce qui peut entraîner ponctuellement un stress bref chez l’animal.
Devenir
En raison des administrations expérimentales réalisées et afin de permettre les analyses prévues en fin d’étude, l’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue du protocole.
Remplacement
La vaccination met en jeu une réponse immunitaire complexe qu’il est difficile de modéliser in vitro ou à l’aide de modèle informatique car elle fait intervenir différents acteurs cellulaires. Des tests préliminaires in vivo, réalisés avec ce nouveau vaccin ont montré une forte réaction immunitaire. Nous souhaitons désormais analyser plus finement sa répartition et son devenir dans l’organisme (dans quels tissus ou organes se répartit le vaccin et sur quelle durée). Le recours à l’animal est incontournable car il n’existe, à ce jour, aucun modèle autre qu’animal reproduisant la complexité des interactions ayant lieu au sein des systèmes vivants.
Réduction
Une étude pilote nous permettra de définir les conditions expérimentales optimales d’imagerie dans le cadre de notre modèle. Nous privilégierons une étude longitudinale qui contribuera à réduire le nombre d’animaux utilisés, raffiner la procédure expérimentale et optimiser la quantité de données obtenues sur chaque animal. Puis dans un deuxième temps, nous allons étudier la répartition du vaccin dans différents organes dont le tube digestif. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été déterminé par une approche statistique qui permet de définir le juste nombre d’animaux à inclure dans l'étude afin de pouvoir exploiter les résultats de façon fiable. Les résultats seront analysés par une méthode statistique adaptée au traitement des petits échantillons
Raffinement
Les animaux sont acclimatés pendant une période d’au moins 7 jours dans des cages présentant de l’enrichissement. Une surveillance quotidienne de leur état général est réalisée, de leur réception à la fin de la procédure. Les animaux seront manipulés de façon à leur causer le moins de stress possible et l’imagerie se fera sous anesthésie générale gazeuse, permettant à la fois une perte de conscience contrôlée et réversible avec un réveil rapide. Des points limites sont définis et seront strictement appliqués en cas de souffrance avérée déterminée à partir de signes cliniques précis.
Choix des espèces
Les études de distribution nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est une espèce animale très bien documentée dans la littérature et l’utilisation de lignées consanguines permet de réduire la variabilité inter individuelle. Le choix de la souris est aussi dicté, dans notre cas, par des résultats déjà existants in vivo dans cette espèce (essais préliminaires de vaccination). Les souris seront manipulées à l'âge adulte de de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle et du système immunitaire). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte, qui correspond à la classe d’âge de la population ciblée par la vaccination contre Clostridioides difficile.