Procédures légères

Pour mettre au point une thérapie génique contre une myopathie congénitale très rare, 116 souris porteuses de la mutation sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des tests d'effort répétés jusqu'à l'âge de douze mois, des prélèvements de sang et une injection de vecteur viral ou de solution saline. Les muscles et les organes sont prélevés après la mise à mort pour mesurer l'effet du traitement. Le porteur situe le bénéfice pour les patients après la fin du projet, avec un passage attendu vers l'essai clinique, quand les atteintes portées aux souris sont immédiates.

Objectifs

Les myopathies congénitales constituent un groupe hétérogène de troubles neuromusculaires héréditaires dont les symptômes sont une faiblesse musculaire et des déformations squelettiques, ayant pour certaines un fort impact sur la survie et la qualité de vie des patients. Ce projet vise à combler une lacune majeure dans le traitement d'une myopathie congénitale très rare liée à des mutations du gène mypn engendrant un défaut de production de la protéine myopalladine (MYPN-CM, MYPN-associated congenital myopathy). Les mutations dans ce gène mypn entraînent une absence totale ou une diminution de la quantité de protéine MYPN fonctionnelle specifiquement dans les muscles, altérant l’intégrité du tissu musculaire cardiaque et squelettique, à l’origine de myopathies congénitales rares diagnostiquées généralement dès la naissance ou durant l’enfance. Le but du projet présenté pour une durée de 5 ans vise à caractériser plus précisément l'une de ces myopathies congénitales et de mettre au point une thérapie génique pour traiter cette maladie encore incurable, en rétablissant l’expression de la myopalladine manquante. Dans ce but, un modèle de souris déficient pour cette protéine MYPN (souris MKO) sera utilisé, reproduisant les caractéristiques de la maladie humaine du point de vue clinique. Un premier objectif de l'étude est de caractériser les souris MKO à différents âges afin de mieux comprendre l'évolution de la maladie dans ce modèle. Cette première étude permettra également d'établir les paramètres à évaluer lors de la thérapie génique expérimentale qui constitue le deuxième objectif. Les différents paramètres seront analysés avant et après administration d'un traitement permettant une expression de la protéine MYPN chez les souris MKO, afin de déterminer les bénéfices thérapeutiques de ce traitement, mais également d’écarter tout potentiel effet indésirable sur les autres organes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à répondre à un besoin médical non satisfait en fournissant une approche de traitement novatrice pour la MYPN-CM qui consiste en une approche de thérapie génique. Ce projet devrait produire un bénéfice à court terme avec la caractérisation en profondeur du modèle de souris déficient pour la proteine MYPN (modèle MKO) qui pourra ensuite être comparé à la trajectoire de la maladie chez l’humain. Cela permettra de caractériser la maladie et de mieux comprendre son évolution au fil du temps. Le bénéfice à long terme sera obtenu après l’achèvement du projet grâce auquel il est attendu une rapide évolution vers une phase pré-clinique puis clinique pour la thérapie génique de la MYPN-CM.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une étude de leur force/résistance musculaire par 4 tests non invasifs de courte durée. Chaque test sera réalisé à différents âges des souris 1.5, 3, 6, 9 et 12 mois. Certaines souris seront également soumises à deux prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue et une unique injection intraveineuse de vecteur viral ou solution saline sous anesthésie générale + anesthésie locale, ne dépassant pas 10 min afin d'éviter stress et douleur. Certaines souris ne recevront que deux injections intramusculaires (une dans chaque patte arrière, solution saline ou traitement).

Impact sur les animaux

Dans les conditions de vie courante en cage, les souris MKO sont de plus petites tailles mais ont une longevité comparable aux souris sauvages et du fait d'une activité réduite elles ne semblent pas génées par l'absence de myopalladine. La réalisation des tests fonctionnels d'effort peut engendrer un léger stress, un essoufflement et une faiblesse musculaire. L’injection des vecteurs viraux par voie intramusculaire ou systémique peut engendrer une légère douleur jusqu’à quelques heures après l’injection qui sera prise en charge par un traitement antalgique.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de pouvoir procéder à une caractérisation moléculaire et histologique de différents tissus. Selon les procédures, les muscles et/ou plusieurs organes d’intérêt seront prélevés afin de vérifier les bénéfices et éventuels effets indésirables sur d'autres organes (foie, cœur, rate, etc…) que ceux ciblés par la thérapie (les muscles).

Remplacement

En amont de l'étude expérimentale chez les souris MKO déficientes en myopalladine, le traitement développé sera d’abord testés sur des cellules musculaires in vitro, ce qui permettra de valider leur efficacité avant l’injection chez l’animal, et ainsi réduira le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Du fait de la visée thérapeutique de ce projet, il est cependant essentiel de réaliser des tests pré-cliniques dans le modèle animal afin de vérifier l'expression de la myopalladine in vivo suite à l'injection du traitement, et ceci sans effets secondaires tels qu'une réaction inflammlatoire violente ou toxique pour l'organisme, toutes deux malheureusment déjà observées dans d'autres thérapies géniques. A ce titre, il est nécessaire de tester l'efficacité de la thérapie génique in vivo, dans un organisme entier dont l’ensemble des organes est en interrelation constante afin de vérifier le tropisme et l'innocuité du traitement.

Réduction

Pour la caractérisation clinique (force et endurance), les mêmes animaux seront utilisés à différents âges (1.5, 3, 6, 9 et 12 mois), ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Ces souris seront ensuite mises à mort afin de prélever tous les muscles qui serviront pour plusieurs analyses. Pour les analyses histologiques et moléculaires à 1.5, 3, 6, 9 et 12 mois d’autres souris, seront mises à mort hors procédure pour prélèvement d'organes uniquement. Le modèle MKO n’a fait l’objet que d’une seule publication et les auteurs se sont principalement concentrés sur les défauts cardiaques du modèle et n’ont pas caractérisé en profondeur le phénotype musculaire, ce que nous souhaitons faire. Cette myopathie est extrêmement rare chez l’homme et n’est donc que très mal caractérisée également. La faiblesse musculaire est par ailleurs légère comparée à d’autres myopathies telle que la dystrophie musculaire de Duchenne ou même celle de Becker. Les marqueurs conventionnels utilisés comme la phosphocréatine kinase ne sont pas appropriés pour comparer les animaux sauvages et les MKO, c’est pourquoi nous souhaitons conduire cette étude. Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes donc basés sur notre expérience avec d’autres modèles de myopathie notamment les rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Dans ce modèle, il a été calculé par une approche statistique que 8 rats seraient nécessaires afin d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution de la maladie. Il se trouve que ce nombre est également celui utilisé dans la première étude de ce modèle, c'est pourquoi nous avons choisi ce même nombre de souris par condition pour cette étude. Enfin, en travaillant par étape, cela nous permettra d’appréhender et d’optimiser les expérimentations au fur et à mesure afin de réduire au mieux le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont dans des cages ventilées dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères et sont uniquement séparées par sexe afin d’éviter les accouplements non contrôlés. Les souris sont dans un environnement avec un cycle d’éclairage de 12h par jour. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de papier et d’abris en carton dans les cages. Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de s’habituer à l’homme et éviter tout stress lors des procédures animales. Les méthodes expérimentales ont été choisies pour éviter au maximum les douleurs lors des interventions sur les animaux. Les tests cliniques ne sont pas douloureux et ne correspondent qu’à des exercices physiques, et les injections des vecteurs dans le muscle ou dans les veines se feront sous anesthésie et n'entraîneront qu’une très légère douleur. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleurs chez les animaux.

Choix des espèces

La souris MKO présente des similarités cliniques et histologiques avec les patients MYPN-CM que nous souhaitons caractériser plus en profondeur. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée des expériences proposées, particulièrement pour la caractérisation des souris à 12 mois. Les approches de thérapie génique expérimentale sont facilement réalisables sur ce petit modèle, et sont essentielles avant de passer à une étude pré-clinique chez un modèle animal plus gros comme le chien, puis à une étude clinique chez l’homme. Les caractérisations phénotypiques se feront à partir de 1.5 mois, âge qui correspond au début de la puberté chez l’homme. En effet, nous savons que les phénotypes apparaissent à la naissance ou durant l’enfance. Ensuite, la maladie est progressive et à 3 mois, les souris MKO commencent à montrer une faiblesse musculaire. La caractérisation phénotypique se poursuivra entre 3 mois, âge correspondant au jeune adulte dont les muscles sont complètement formés, et 12 mois, âge adulte avancé chez l’homme. Cette stratégie permettra d’établir une trajectoire précise de la maladie au fil du temps, ce qui aidera à mieux comprendre l’évolution de la maladie chez l’homme. Puis ce modèle servira à évaluer les effets bénéfiques du traitement lorsque celui-ci est administré (1) avant l'apparition des symptômes (6 semaines) pour voir s’il est possible d’empêcher ou retarder l’apparition de la maladie ; et (2) après l'apparition des symptômes de la maladie (6 mois), pour voir s’il est possible de ralentir voir d’arrêter la progression de la maladie ou d’en promouvoir le décours.

200 000 souris pour un seul acte de quelques secondes chacune, la coupe d'un bout d'oreille ou de queue, un prélèvement de sang ou d'un orteil pour lire leur génotype. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance déclaré léger pour 187 500 d'entre elles et modéré pour 12 500. Les souris qui portent le génotype recherché rejoignent d'autres projets ou l'élevage, les autres sont mises à mort. Le projet couvre des lignées dites à "phénotype dommageable", modifiées pour développer des anomalies, sans que le résumé précise lesquelles.

Objectifs

Dans le cadre des projets utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment des demandes d’autorisation de projet), des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important de détecter et gérer les pathologies induites par les mutations de ces modèles et de bien caractériser génétiquement les animaux produits. L’ensemble permet un élevage adapté pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et optimisée aux besoins des projets de recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'optimiser la gestion des élevages d’animaux génétiquement modifiés utilisés dans des projets de recherche dont l’objectif est la compréhension ou le traitement de maladies humaines.

Procédures

Prélèvements sur souris vigiles : Soit Un prélèvement de petit bout de tissu à l’oreille ou à la queue (3mm maximum) Soit un prélèvement de sang (50 à 100ul) Soit un prélèvement de phalange- Dans les 3 cas, moins de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances lors d'un prélèvement de tissus pour le génotypage sont essentiellement du stress léger lors de la contention et de la douleur légère à modérée lors de la coupe du tissu.

Devenir

Les animaux du génotype d'intérêt sont utilisés dans les projets expérimentaux du laboratoire ou gardés en vie pour renouveler les reproducteurs nécessaires à l'entretien des colonies. Les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt sont mis à mort.

Remplacement

Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement altérés pour des projets scientifiques. Bien que les chercheurs développent leurs hypothèses sur des systèmes alternatifs (moléculaires et cellulaires), le recours à l’animal dans son ensemble est indispensable. L'étude de mécanismes ou pathologies complexes qui font intervenir plusieurs grands systèmes biologiques entre eux nécessitent et justifient le recours à l'animal et la détermination du génotype des animaux ne peut être réalisé sans prélèvement de tissus.

Réduction

La production des souris génétiquement altérées est basée et réduite au stict besoins expérimentaux établis de façon statistique. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Nous utilisons des schémas d’accouplement optimisés pour produire un maximum d’animaux « utiles » (lignées avec plusieurs modifications génétiques). Quand cela est possible nous utilisons des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage. Les élevages des lignées non utilisées sont arrêtées (cryoconservation). Les chercheurs donnent des consignes lorsqu'il n'est pas nécessaire de prélever du tissu des souris. Nous cherchons au maximum à optimiser les schémas d’accouplements (mutations portées par les parents) pour réduire le génotypage ou éviter l’apparition d’un phénotype dommageable. Il est compliqué d’apprécier l’impact de ces mesures sur la réduction mais il est aisé de comprendre qu’elles concourent toutes à l’optimisation de la production aux seuls animaux qui seront utilisés dans les projets scientifiques ou en gestion de colonies et donc de réduire le nombre d’animaux à génotyper ou exprimant le phénotype dommageable.

Raffinement

Les techniques de prélèvement de tissus pour le génotypage sont effectuées par des zootechniciens expérimentés dont le geste est précis. Les biopsies sont effectuées rapidement et précisément effectuée avec un matériel désinfecté et adapté pour réduire le temps et l'intensité de la douleur. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi et des points limites (activité, aspect physique, cicatrisation..) ont été mis en place pour détecter toute souffrance éventuelle et y remédier. Pour les lignées à phénotypes dommageables, la stratégie de raffinement est de mettre en place le plus tôt possible une procédure de surveillance de l’apparition des nuisances et si besoin des conditions d’hébergement adaptées, une DAP spécifique (d’élevage ou avec l’expérimentation) sera soumise à évaluation.

Choix des espèces

La souris est un modèle trés développé pour la compréhension des pathologies humaines. Ce modèle présente de nombreuses similitudes dans les processus biologiques avec l’Homme. De plus son temps de génération est court et son élevage simple. Les biopsies de queue ou d'oreille seront faites sur des souris à partir de 10 jours d'âge jusqu'à 4 semaines. La phalangectomie sera effectuée de 5,5j à 10 jours d'âge. Les prélèvements de sang seront effectués sur des souris de 15 jours d'âge jusqu'à 4 semaines. Cela permet d'obtenir le génotype rapidement et de ne sélectionner au sevrage que les animaux d'intérêt.

Issues d'un élevage qui met à mort les petits ne portant pas le bon génotype, 3 098 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit un aimant implanté sous la peau du dos et une injection de nanoparticules magnétiques, avant un suivi par colonoscopie sous anesthésie. Le génotypage se fait par biopsie de l'oreille sur animal vigile. Les tissus sont prélevés après la mise à mort, l'étude portant sur une protéine liée à la croissance des cellules du cancer du côlon.

Objectifs

Le cancer colorectal est le troisième cancer le plus fréquent et la quatrième cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Il résulte d’une accumulation d’anomalies moléculaires perturbant les mécanismes normaux de contrôle de la croissance et de la survie des cellules intestinales. Bien que les traitements actuels aient permis d’améliorer la prise en charge des patients, une récidive survient encore chez environ 50% d’entre eux. Les mécanismes responsables de cette rechute restent en partie inconnus et doivent être élucidés afin de réduire le risque de progression tumorale et de mortalité. Ces dernières années, des facteurs mécaniques tels que l’augmentation de la rigidité tissulaire, les modifications du flux sanguin et la pression due à la croissance tumorale, ont été proposés comme éléments favorisant la progression du cancer. Dans ce contexte, la protéine d’intérêt, présente à la surface des cellules, agit comme un récepteur capable de capter ces signaux de l’environnement et de déclencher à l’intérieur de la cellule des mécanismes contrôlant sa croissance et sa survie. Elle pourrait ainsi fonctionner comme un capteur mécanique, transformant les forces physiques exercées sur les cellules en signaux biologiques qui activent des gènes impliqués dans l’aggravation du cancer. Dans certains cancers, des anomalies (comme de mutations ou une activité trop élevée) ont été décrites . Toutefois, son rôle précis dans le développement et la progression du cancer colorectal reste insuffisamment caractérisé. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment des forces physiques exercées sur les cellules peuvent favoriser l’apparition et la progression des cancers. Nous étudierons plus particulièrement le rôle de notre protéine dans les processus conduisant à la transformation tumorale des cellules du côlon. Pour cela, nous analyserons sa présence et son activité dans les cellules, ainsi que ses effets sur leur comportement, comme leur multiplication, leur survie et leur capacité à envahir les tissus voisins. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et contribuer à l’amélioration des stratégies de prise en charge des patients atteints de cancer colorectal.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront, à court terme, d’approfondir les connaissances sur les mécanismes impliqués dans le développement tumoral et la formation de métastases dans le cancer du côlon chez la souris. Ce travail explore un axe encore peu étudié, à l’interface entre la physique et la biologie, en analysant l’impact des contraintes mécaniques sur les processus biochimiques et cellulaires impliqués dans la progression tumorale. À plus long terme, ces connaissances pourraient être transposables au cancer colorectal humain, compte tenu de la forte conservation des mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des tumeurs entre la souris et l’homme. Par ailleurs, des données disponibles suggèrent une activation anormale de la protéine étudiée dans plusieurs autres tumeurs solides humaines, ce qui pourrait élargir la portée des résultats obtenus au-delà du cancer du côlon. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes reliant contraintes mécaniques (comme les pressions exercées dans l’intestin par le passage des aliments, appelé bol alimentaire, ou par la croissance d’une tumeur qui pousse sur les tissus environnants) et progression tumorale pourrait contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Ces travaux pourraient donc participer au développement de stratégies visant à limiter les effets favorisant le cancer associés à la pression mécanique exercée par la croissance tumorale, notamment la formation de métastases, l’échappement au système immunitaire, la résistance aux traitements et la récidive.

Procédures

Dans un premier temps, une biopsie d’oreille sera réalisée sur les animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec) puis les souris seront réparties en deux groupes. Le groupe contrôle ne fera l’objet d’aucune intervention chirurgicale. L’autre groupe subira une intervention chirurgicale consistant en l’implantation sous-cutanée d’un aimant dans le dos, suivie d’une injection intraveineuse de nanoparticules magnétiques (administrée une seule fois au cours de l’expérience). La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et ne dépassera pas 15 minutes. Ensuite, chaque groupe sera subdivisé en deux sous-groupes. L’un des groupes recevra une injection (une fois; durée du geste < 10 secondes). L’autre groupe ne recevra pas cette injection. Une partie des souris sera ensuite suivie par imagerie (colonoscopie) sous anesthésie, à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. La durée de chaque procédure sera inférieure à 20 minutes par animal. À des temps prédéterminés (30 minutes, 4 heures, 5 jours ou 1 mois), les animaux seront mis à mort afin de prélever des échantillons du côlon et de l’intestin.

Impact sur les animaux

Le génotypage par biopsie d’oreille peut provoquer une douleur légère et de très courte durée, comparable à une petite piqûre, ainsi qu’un léger stress lié à la manipulation. Une petite plaie peut apparaître à l’endroit du prélèvement, avec un faible saignement. Ces effets sont transitoires. Les effets indésirables attendus suite à l’injection de particules magnétiques et à l’implantation d’un petit aimant sous la peau sont une douleur transitoire liée à la piqûre et à l’incision. La contrainte mécanique appliquée ne devrait pas induire de douleur persistante en dehors de la phase post-opératoire immédiate. L’injection de traitement est susceptible d’entraîner une gêne transitoire liée à la piqûre de courte durée et entrainer une perte de poids. Le développement tumoral attendu au niveau de l’intestin et du côlon pourra être associé à des signes cliniques tels qu’une perte de poids, des difficultés à d’alimenter, une déshydratation, des saignements, des diarrhées, prolapsus ou des douleurs d’intensité moyenne Le temps maximal prévu pour les expériences sera de 1 mois.

Devenir

Les animaux inclus dans les procédures expérimentales sont mis à mort à l’issue des expériences afin de permettre la réalisation d’analyses post-mortem nécessaires à l’atteinte des objectifs scientifiques. Les animaux issus de l’élevage ne présentant pas le génotype d’intérêt pour le projet ne peuvent être inclus dans les procédures expérimentales et sont donc également mis à mort conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

Le projet vise à étudier l’influence des contraintes mécaniques sur les processus d’initiation et de progression tumorale du côlon, ainsi que leurs implications thérapeutiques potentielles. Ces processus reposent sur des interactions complexes entre cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, vascularisation, système immunitaire et contraintes physiques, qui ne peuvent être intégralement reproduites par des modèles in vitro. En amont du projet, des approches alternatives ont été mises en œuvre, notamment l’analyse de données cliniques issues de patients. Des expérimentations ont également été conduites sur deux modèles alternatifs (Drosophile et anémone). Ces travaux ont permis d’obtenir des informations essentielles et de valider les hypothèses expérimentales. Cependant, ces systèmes ne permettent pas de reproduire l’architecture tissulaire intégrée, la dynamique des contraintes mécaniques in vivo, ni les interactions indispensables à l’étude de la progression tumorale dans un organisme entier. Dans ce contexte, l’utilisation de la souris, y compris de lignées transgéniques adaptées à la question scientifique posée, apparaît indispensable pour répondre aux objectifs du projet dans un environnement physiopathologique pertinent.

Réduction

Les résultats obtenus dans nos projets précédents nous ont permis de réduire et d’ajuster le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir de résultats statistiquement fiables. Le nombre de souris prévu dans ce projet a été donné comme un nombre maximum mais pourra être réduit en fonction des résultats obtenus à chaque étape, permettant de cibler les meilleures conditions d’analyse. Nous affinerons constamment notre technique chirurgicale et nos routines de soins postopératoires afin de garantir que seul le nombre minimum de souris strictement nécessaire sera utilisé. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Toutes les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel formé, et les procédures expérimentales seront réalisées de manière à prévenir et minimiser toute douleur, détresse ou souffrance. Un protocole analgésique adapté sera systématiquement mis en place pour toute procédure chirurgicale, incluant anesthésie, analgésie, anti-inflammatoires et soins pré- et post-opératoires appropriés. Un suivi sera assuré pendant la période post-chirurgicale afin de contrôler la récupération et le processus de cicatrisation. Toutes les mesures possibles seront mises en place pour que les animaux soumis à cette procédure expérimentale avec un maintien permanent de l’aimant ne se trouvent pas isolés dans des cages individuelles pendant tout le reste de la procédure (pour éviter des possibles dommages occasionnés par l’attirance des aimants entre eux) en utilisant des animaux de compagnie sans aimant. En complément de la surveillance quotidienne, un examen clinique approfondi sera réalisé au minimum trois fois par semaine tout au long de l’expérimentation afin de s'assurer du bon état clinique des animaux. Des soins de support adaptés (hydratation, enrichissement alimentaire, mesures de confort, etc.) seront mis en place si nécessaire. Une grille de score sera appliquée pour contrôler le bien-être des animaux de façon objective à toutes les étapes du projet proposé et sera utilisée afin d’arrêter l’expérimentation dès atteinte de point-limites.

Choix des espèces

L’utilisation des souris transgéniques constitue un modèle pertinent et largement validé pour l’étude des mécanismes de cancérogenèse colorectale. Les lignées disponibles permettent de reproduire de manière contrôlée des altérations génétiques et des processus physiopathologiques proches de ceux observés chez l’homme. Ce projet nécessite un modèle in vivo intégrant l’architecture tissulaire du côlon, les contraintes mécaniques locales, les interactions avec le microenvironnement tumoral, la vascularisation et le système immunitaire. À ce jour, la souris représente l’organisme le plus adapté pour étudier conjointement ces dimensions dans un contexte expérimental maîtrisé. Par ailleurs, la souris constitue le modèle de référence en cancérogenèse colorectale préclinique. Elle bénéficie d’outils génétiques étendus, d’un recul bibliographique important et d’une bonne caractérisation des réponses aux agents thérapeutiques, facilitant ainsi la transposition des résultats vers la recherche clinique. Les souris utilisées dans ce projet seront des adultes âgés de 3 à 8 mois. Cet âge est choisi afin d’éviter l’apparition spontanée de tumeurs liées à leur modification génétique, qui surviennent généralement à partir d’un an.

Pour tester de nouvelles thérapies contre le lupus, une maladie auto-immune, 4 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chez les animaux, la maladie ou son induction chimique provoque perte de poids, lésions cutanées, alopécie, prostration, difficultés respiratoires et douleurs abdominales. Ils reçoivent les composés à tester jusqu'à quatre fois par semaine, avec des prélèvements de sang et d'urine réguliers. Les organes sont prélevés après la mise à mort, et l'effectif de 4 500 animaux n'est pas justifié dans le résumé.

Objectifs

Le lupus érythémateux est une maladie auto-immune chronique qui existe sous deux formes principales : le lupus érythémateux systémique et le lupus cutané. Le lupus érythémateux systémique, forme la plus sévère, affecte plusieurs organes car le système immunitaire produit des auto-anticorps qui attaquent les tissus sains. Les symptômes caractéristiques incluent l'érythème en "ailes de papillon" sur le visage, une fatigue intense, des douleurs articulaires, de la fièvre et une photosensibilité. Ce projet vise à développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies auto-immunes en utilisant des modèles murins spontanément lupiques ou des modèles induits. Les modèles murins de Lupus sont essentiels pour la recherche car ils permettent de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de cette maladie auto-immune. Ces modèles offrent une approche pour tester de nouvelles thérapies et interventions avant de les appliquer chez l'homme, De plus, ils aident à identifier les facteurs génétiques et environnementaux qui contribuent au développement du Lupus, facilitant ainsi la mise au point de stratégies de prévention et de traitement plus efficaces. Les objectifs du projet sont : Étude des mécanismes pathogéniques, le développement et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, les études précliniques et la compréhension des facteurs de risques. Ces objectifs font des modèles murins un outil indispensable pour la recherche lupus, contribuant à des avancées significatives dans la compréhension et le traitement de cette maladie complexe. Environ 15 études sont prévues par an dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

Les modèles murins sont très utiles pour la recherche sur les maladies inflammatoires tel que le lupus. En recréant les conditions de cette maladie chez les souris, les chercheurs peuvent mieux comprendre les mécanismes de celle-ci, trouver de nouvelles cibles pour les traitements et tester l'efficacité de nouveaux médicaments. Les traitements actuels sont les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les corticostéroïdes, des immunosuppresseurs et des biothérapies ciblées. Ces traitements visent essentiellement à contrôler les symptômes de la maladie et prévenir les poussées mais le lupus reste une maladie chronique incurable. Ces modèles permettent donc d'accélérer le développement de médicaments et d'améliorer les stratégies de prévention et de gestion des maladies inflammatoires intestinales, offrant ainsi de meilleures perspectives pour les patients. Les données obtenues grâce à ces recherches sont partagées avec la communauté scientifique et aident à faire avancer les essais cliniques et à obtenir les autorisations nécessaires pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments.

Procédures

Pour l’induction du modèle par agent chimique, injection intrapéritonéale unique sur animal vigile, environ 10 secondes. Pour l’administration des composés à tester : Administrations sur animal vigile, environ 10secondes, réalisée au maximum 4 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Prélèvements de sang, sur animal vigile, environ 15-20 secondes, au maximum 1 fois toutes les 2 semaines. Prélèvements urinaires, environ 10 secondes au maximum 5 fois par semaine.

Impact sur les animaux

L'utilisation de souris pour étudier le lupus peut entraîner plusieurs effets indésirables pour les animaux : Perte de poids progressive; Altération de l’état général : absence de toilettage, alopécie, lésions cutanées, sécrétions nasales ou oculaires; Troubles du comportement : prostration, agressivité, difficultés respiratoires; Présence de ganglions hypertrophiés; Douleurs abdominales.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour les prélèvements d’organes nécessaires à l’atteinte des objectifs de l’étude.

Remplacement

L'utilisation de modèles de souris pour le lupus est essentielle pour développer et tester de nouveaux traitements pour cette maladie complexe. Ces modèles permettent d'étudier les réponses du système immunitaire dans un environnement contrôlé, ce qui aide à comprendre comment les cellules interagissent et comment la maladie progresse. Contrairement aux tests en laboratoire (in vitro) ou aux simulations informatiques (in silico), les modèles de souris peuvent reproduire la complexité d'un organisme entier. Les tests en laboratoire sont utiles pour étudier les cellules, mais ils ne peuvent pas montrer les interactions dynamiques dans le corps. Les simulations informatiques sont limitées par la complexité biologique et la qualité des données. C'est pourquoi les modèles animaux sont nécessaires pour obtenir des résultats pertinents et applicables aux humains. En utilisant différents modèles de souris, nous pouvons explorer divers aspects du lupus. Les de souris spontanées nous aident à comprendre les aspects génétiques et auto-immuns et le modèle induit par une molécule de référence permettent de contrôler l'induction du lupus. Cette approche intégrée est cruciale pour développer des traitements efficaces et applicables aux humains.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur des publications scientifiques et optimisé par un biostatisticien en fonction des objectifs de l’étude Des méthodes statistiques sont appliquées pour minimiser le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats fiables et en réduisant les biais expérimentaux. Seules les molécules ayant montré en amont une activité anti-inflammatoire in vitro sont testées sur les animaux (in vivo). L’utilisation de techniques précises comme la cytométrie en flux, l’analyse de biomarqueurs et l’histologie permettra d’obtenir des données détaillées à partir de petits échantillons. De plus, on pourra avoir un suivi non invasif et multiparamétrique des animaux pour mesurer la distribution des composés et l’évolution de la réponse inflammatoire, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Les modèles décrits dans ce projet sont choisis pour leur pertinence clinique, réduisant ainsi le besoin de tests supplémentaires sur d’autres animaux.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe. Nous utiliserons également une litière adaptée, douce (exemple : litière de cellulose) et un enrichissement qui favorise l’expression des comportements normaux de la souris (abri, enfouissement, nidification…). Les techniques de manipulation douce, telles que l’utilisation de tunnels et la préhension dans le creux des mains, sont mises en œuvre pour réduire le stress et l’angoisse des animaux. Un apport nutritif (gel hydrique, gel boost …) pourra être mis en place 1 semaine avant le début de l’étude pour faciliter l’accès des animaux. Les animaux pourront être hébergés dans des cages connectées capables de détecter 24h/24 toute anomalie dans l’activité des animaux (hypoactivité ou hyperactivité) permettant de mettre en place très rapidement les actions pour la prise en charge vétérinaire. Une grille de score a été mise en place afin de permettre la définition et l’application de points limites, généraux et spécifiques à la procédure, une fréquence accrue des observations et ainsi intervenir de manière anticipée pour éviter toute douleur ou dommages pour les animaux au-delà de la classe de gravité définie pour la procédure. Les protocoles expérimentaux seront continuellement améliorés pour minimiser la douleur et le stress des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix en pharmacologie. Elles partagent une grande partie de leur génome avec les humains, permettant de modéliser les maladies humaines et d'étudier les effets des médicaments. Leur petite taille et leur cycle de reproduction rapide facilitent les études à long terme et les expériences génétiques. Les souris, étant des mammifères, ont des systèmes biologiques comparables à ceux des humains, rendant les résultats plus pertinents. Les souris adultes (à partir de 8 semaines d’âge) sont utilisées dans ce projet pour mimer la pathologie chez les patients adultes car l’immunité varie fortement en fonction de l’âge. De plus le système immunitaire est complètement mature à partir de 6 semaines d’âge chez la souris.

6 570 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le paludisme et développer un vaccin. Chacune peut recevoir des infections par Plasmodium, par injection ou par piqûres de moustiques infectés, des prélèvements sanguins quotidiens sur près de trois semaines, et pour certaines des chirurgies comme l'implantation d'un anneau de titane, une ablation de la rate ou une greffe de peau humaine. Le RNT classe ces manipulations répétées en souffrance légère. Les souris sont mises à mort avant l'apparition des symptômes du paludisme, que le porteur cherche à devancer.

Objectifs

Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de la phase initiale de l’infection palustre dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique pré-érythrocytaire. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo, en utilisant l'expérimentation animale, car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant principalement P.berghei et P.yoelii dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle de la phase pré-érythrocytaire de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre la phase pré-érythrocytaire 3. Développement préclinique d'un vaccin pré-érythrocytaire contre le paludisme.

Bénéfices attendus

Dans ce projet nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.

Procédures

[MODIFICATION] IMMUNISATIONS POUR VOIE INTRANASALE et DUREE DU PROJET Afin d’identifier et d’évaluer l’activité protectrice de nouvelles cibles vaccinales ou plateformes d’administration et d’élucider leur mécanisme d’action, les souris impliquées dans cette procédure expérimentale pourront être soumises à des injections sous-cutanées (15 sec), intrapéritonéales (15 sec), intramusculaires (15 sec) ou intraveineuses (30 sec) ainsi qu’à des prélèvements sanguins et un ou plusieurs challenges infectieux par des parasites de Plasmodium. Bien que susceptibles d’être répétées, ces manipulations sont toutes considérées de sévérité légère et seront, de plus, suffisamment espacées dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux. Pour infecter les souris vigiles avec des sporozoïtes, le parasite sera micro-injecté dans le coussinet plantaire (15 sec) ou par la voie intraveineuse (30 sec). Les souris anesthésiées seront infectées par micro-injection dans la peau du pavillon auriculaire (15 sec) ou par des piqûres de moustiques infectés. Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée par frottis sanguins ou cytométrie en flux, à partir d’une goutte de sang prélevée par ponction de la veine caudale de la queue (30 sec). Pendant la phase de croissance exponentielle du parasite, qui se produit normalement entre le 3ème et le 6ème jour post-infection les prélèvements seront réalisés quotidiennement. Alternativement, l’infection hépatique sera mesurée de manière non invasive par bioluminescence, ou par microscopie/ RT-PCR dans le foie disséqué. Des souris anesthésiées seront soumises à un acte chirurgical sans réveil (20 min) pour réaliser l’imagerie à court terme dans le foie ou la rate. Des souris anesthésiées et analgésiées seront soumises à un acte chirurgical avec réveil pour l’implantation abdominale d’un anneau en titane (imagerie longitudinale – foie, rate) (45 min), pour une splenectomie (45 min), ou pour la greffe de la peau humaine (30 min) (imagerie longitudinale de P. falciparum – peau).

Impact sur les animaux

Le rongeur vigile pourra souffrir de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, intraveineuse), par la micro-injection dans la peau, ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue, au menton ou à la joue. Bien que susceptibles d’être répétés, les prélèvements seront suffisamment espacés dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux : les prélèvements d’un volume sanguin de 25 µL à 50 µL au niveau d’un même site (joue, menton, veine caudale) seront espacés au minimum d’une semaine et les prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue pourront être répétés au plus quotidiennement pendant 20 jours consécutifs mais en aucun cas le volume prélevé n’excèdera 20 µL par période glissante de 7 jours. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par la dislocation cervicale ou par exposition au CO2, avant l'apparition des symptômes du paludisme expérimental.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront infectées par des parasites type Plasmodium. Il ne sera donc pas possible de les maintenir en vie ou les réutiliser. Les souris seront mises à mort avant la phase symptomatique du paludisme. Seulement méthodes de mis à mort validées par le comité étique seront utilisées.

Remplacement

Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. L’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Pour évaluer les activités cellulaires des sporozoïtes (motilité, traversée cellulaire, infection cellulaire), et les effets neutralisants des effecteurs immunitaires ou antipaludiques, les expériences seront effectuées in vitro. Malheureusement, certains effets observés in vitro ne correspondent pas à ce qui est observé in vivo, nous obligeant à valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles expérimentaux animaux.

Réduction

Nous utilisons le nombre minimum possible d’animaux pour nos expériences calculé à l'aide d'un logiciel développé à l'Institut Pasteur (shade.pasteur.fr) qui compare deux moyennes de groupes non jumelés à l'aide d'un test bilatéral paramétrique, en tenant compte des données expérimentales. Pour l’analyse statistique de nos expériences, nous appliquerons un test paramétrique ANOVA non jumelé, si nécessaire, ajusté pour comparaison multiple. Nous normaliserons les tests statistiques sur un effet "répétition/cage" grâce à l'utilisation de modèles mixtes. Également, nous rechercherons toujours à réduire ce nombre en améliorant les procédures, par exemple, en développant des méthodes d'imagerie intravitale non invasive pour diminuer le nombre de souris utilisées dans les études longitudinales.

Raffinement

Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés. Les souris auxquelles sont inoculées les espèces de Plasmodium adaptées aux rongeurs de laboratoire sont suivies quotidiennement durant la phase sanguine de l’infection afin de déterminer leur niveau de parasitémie. Les animaux sont mis à mort avant que n’émergent des symptômes signant des dommages systémiques – prostration, aspect du pelage, perte de poids - et témoignant du développement asexué non contrôlé du parasite dans le sang. Il est important de souligner que la phase de l’infection que nous analysons est asymptomatique, et que lorsque les procédures expérimentales nécessitent d’atteindre la phase érythrocytaire de l’infection, les animaux sont sacrifiés avant la survenue de symptômes ou complications létales- neuropaludisme, anémie prolongée. Nous utiliserons la grille comportementale/clinique de la SBEA pour évaluer l'état de santé des souris. Les souris avec plus de 1% de parasitémie seront observées quotidiennement, les autres seront suivies hebdomadairement. Les animaux obtenant un score de deux points (ex : poil hérissé, prostration) bénéficieront de mesures d'amélioration des conditions d'hébergement (enrichissement, chaufferette), de l'aliment (gel diététique) ou de traitements médicamenteux (analgésie). Les souris présentant un score supérieur à deux seront mises à mort par exposition au CO2.

Choix des espèces

Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Nous privilégions l’utilisation de souris dans nos études car la plupart des concepts issus des modèles souris, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-palustre, se sont révélés exacts chez l’Homme. De plus, la disponibilité de diverses souris transgéniques rend cette espèce adaptée aux études fonctionnelles des voies impliquées dans l'infection et la protection de l'hôte. Les inoculations de parasites aux souris seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences d’imagerie in vivo seront réalisées sur des souris de 4-12 semaines. Les expériences sur les réponses immunitaires seront réalisées sur des souris adultes immunocompétentes âgées de plus de 6 semaines.