Procédures légères

Une partie d'entre elles finit remise à un service de formation aux gestes techniques : 351 souris exposées par leur alimentation à un herbicide très répandu vont être utilisées pour en étudier les effets indirects via le microbiote intestinal, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont suivies jusqu'à l'âge adulte avec pesées, mesures de glycémie et un modèle d'inflammation intestinale provoquant perte de poids et diarrhées. La plupart sont tuées pour prélever des échantillons ou fabriquer des organoïdes intestinaux, tandis que 45 reproductrices sont ensuite remises à un service de formation à la contention et aux gestes techniques. Le porteur présente cette réaffectation comme un moyen d'"optimiser leur utilisation".

Objectifs

Nous étudierons un des herbicides les plus utilisés dans le monde qui agit en bloquant un mécanisme essentiel chez les plantes, ce qui entraîne leur mort. Comme ce mécanisme n’existe pas chez les mammifères, cet herbicide a longtemps été considéré comme sans danger pour la santé humaine. Cependant, certaines bactéries présentes dans notre intestin possèdent ce mécanisme. Or, ces bactéries forment le microbiote intestinal, qui joue un rôle important dans la digestion, le système immunitaire et le bon fonctionnement de l’organisme. Des études chez la souris ont montré que l'herbicide peut modifier la composition de ce microbiote. Ces modifications pourraient avoir des conséquences sur la santé, notamment en favorisant des troubles digestifs ou métaboliques. Toutefois, on ne sait pas encore si l'herbicide peut réellement contribuer au développement de ces maladies via le microbiote. Ce projet vise donc à mieux comprendre ces effets en étudiant des souris exposées à l'herbicide par l’alimentation tout au long de leur vie, de manière à se rapprocher des conditions d’exposition humaine.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire à un herbicide et fournir des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde. Nous étudierons certains paramètres peu explorés dans les études toxicologiques réglementaires, à savoir les effets sur le microbiote intestinal, l'inflammation intestinale et le métabolisme. Ces données indépendantes pourront servir aux agences réglementaires et aux politiques pour formuler des recommandations sur l’utilisation de ce pesticide.

Procédures

Les animaux sont répartis en trois groupes (12 mâles et 12 femelles par groupe) et suivis jusqu’à l’âge adulte (J130). Les 3 groupes correspondent à des souris non exposées, exposées à une dose faible et exposées à une dose plus forte d'herbicide incorporé dans l'alimentation. Tous les animaux font l’objet d’un suivi régulier comprenant une pesée hebdomadaire et un suivi de la consommation alimentaire et hydrique (toute la durée de l’étude). Des prélèvements de fèces non invasifs sont réalisés toutes les deux semaines (environ 1–2 minutes par animal). Une mesure de la glycémie à jeun, similaire à celle réalisée chez l’Homme (prélèvement d’une goutte de sang), est effectuée une fois par mois (moins de 1 minute par animal). À partir de J84, trois interventions sont réalisées à deux semaines d’intervalle : • placement en cage individuelle spécifique pendant 23 heures pour la collecte des urines, • test de tolérance au glucose (durée totale d’environ 2 heures avec mesures répétées), • autre test de tolérance métabolique (durée totale d’environ 2 heures avec mesures répétées). En fin d’expérimentation, un prélèvement sanguin est réalisé (moins d’1 minute), suivi de la mise à mort des animaux. Dans un second groupe d’animaux, un suivi similaire est réalisé (pesée hebdomadaire, consommation, prélèvements de fèces toutes les deux semaines). Ces animaux reçoivent en plus un traitement de 7 jours visant à induire une inflammation intestinale, suivi d’une période de récupération de 5 jours, avec observation quotidienne de leur état général (quelques minutes par animal).

Impact sur les animaux

Aucun signe de toxicité notable n’a été observé dans des conditions d’exposition similaires lors d’études précédentes. Les interventions prévues peuvent néanmoins entraîner des effets indésirables modérés et transitoires, incluant un stress lié aux manipulations répétées et une gêne ponctuelle lors des prélèvements. L’hébergement temporaire en cage individuelle peut induire un stress léger à modéré. Le modèle d’inflammation intestinale induit entraîne des signes cliniques modérés à marqués sur une durée limitée, comprenant une perte de poids, des diarrhées et une altération de l’état général. Ces effets sont réversibles chez la majorité des animaux après la phase d’induction.

Devenir

Les souris F1 seront euthanasiées à la fin de l’expérimentation afin de prélever des échantillons qui seront analysés pour répondre à la question scientifique. Les souris F1 surnuméraires seront mises à mort au sevrage pour préparer des organoïdes intestinaux. Les souris F0 des deux sexes (10 femelles et 5 mâles par procédure, soit 45 souris au total) seront mises à disposition de la DAP de formation à la contention et aux gestes techniques de l’établissement déjà autorisée à cet effet, permettant d’optimiser leur utilisation.

Remplacement

Notre laboratoire utilise habituellement des modèles simplifiés (comme des cellules ou des tissus isolés) pour étudier les effets directs de certaines substances sur les organes. Cependant, dans ce projet, nous cherchons à comprendre des effets indirects d'un herbicide, qui pourraient passer par les bactéries présentes dans l’intestin, appelées microbiote intestinal. En effet, cet herbicide agit principalement sur une cible présente chez certaines bactéries, mais absente chez les cellules humaines, ce qui suggère que ses effets pourraient dépendre de ces micro-organismes. Pour étudier ces interactions complexes, il est nécessaire d’utiliser un organisme entier, car le microbiote, l’intestin, le système immunitaire et d’autres organes (comme le foie ou les tissus adipeux) communiquent entre eux et fonctionnent ensemble. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire fidèlement ces interactions dans leur globalité. Dans un second temps, les résultats obtenus permettront d’orienter des études complémentaires sur des modèles plus simples, afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu et de limiter à l’avenir le recours aux animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un outil de biostatistique (R), sur la base de données issues d’études préliminaires. Cette approche permet de définir l’effectif minimal nécessaire pour mettre en évidence des effets biologiquement pertinents tout en garantissant une puissance statistique suffisante. Ainsi, un effectif de 12 animaux par groupe a été retenu afin d’assurer la robustesse des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes de 4 dans des cages enrichies comprenant des dispositifs permettant l’isolement si nécessaire. Ils seront manipulés régulièrement afin de les habituer à la contention et de limiter le stress lié aux interventions expérimentales. Une surveillance régulière des animaux sera mise en place tout au long de l’étude afin d’évaluer leur état général et de détecter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Cette surveillance repose sur une grille de scoring intégrant plusieurs paramètres (poids, apparence physique, comportement spontané et réponse aux stimuli), permettant une évaluation globale et standardisée de l’état de l’animal. Une surveillance renforcée sera appliquée lors des phases expérimentales les plus sensibles, notamment lors de l’induction de l’inflammation intestinale. La grille de score, associée à des points limites prédéfinis et adaptés à chaque procédure, permettra de guider les décisions de prise en charge et, si nécessaire, de déclencher l’arrêt de l’expérimentation afin de préserver le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé en recherche biomédicale, car son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain, notamment pour l’étude du métabolisme, du système immunitaire et du fonctionnement intestinal. De plus, de nombreux outils scientifiques permettent d’analyser précisément ces fonctions chez cet animal. Dans ce projet, des souris adultes seront utilisées pour permettre la reproduction, puis leurs descendants seront suivis jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet d’étudier les effets d’une exposition précoce, dès la vie avant la naissance, ainsi que ses conséquences à long terme sur la santé intestinale et métabolique.

La moitié en cage enrichie, l'autre en cage standard : 192 souris vont être utilisées pour tester si un environnement enrichi limite les pertes de mémoire dans un modèle de maladie d'Alzheimer débutante, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal vit d'abord quatre mois dans son type de cage, puis passe une série de tests comportementaux en étant isolé 48 heures, 24 heures puis 4 heures. À la fin, 64 souris subissent un prélèvement de sang terminal et 64 une perfusion terminale sous anesthésie profonde. Le porteur justifie l'usage de souris par l'impossibilité de détecter ce stade précoce de la maladie chez l'humain.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie du cerveau encore incurable et irréversible. Elle est caractérisée par un déclin des fonctions cognitives telles que la mémoire. En novembre 2024, l’Agence européenne des médicaments a autorisé la commercialisation en Europe d’un traitement ciblant une des causes supposées de la maladie. Cependant, le rapport bénéfice/risque actuel de ce traitement destiné qu’aux patients en début de maladie, n’est pas suffisant pour le rendre accessible en France. Il est donc crucial de trouver d’autres approches thérapeutiques, en complément des approches existantes, pour mieux traiter la MA. Les approches non médicamenteuses comme une activité physique adaptée, la danse, la musicothérapie ou la médiation animale, sont de plus en plus utilisées pour accompagner les personnes atteintes de MA. Ces interventions non pharmacologiques exposent les malades à de nombreuses stimulations cognitives, sensorielles, motrices et sociales produisant un enrichissement de leur environnement capable de ralentir la progression de la MA, de maintenir plus longtemps l’autonomie de ces malades, et d’améliorer leur qualité de vie. Des études réalisées chez l’Homme comme chez l’animal (surtout rongeurs), indiquent qu’une exposition prolongée à un environnement enrichi améliore notamment les capacités mnésiques et stimule le système immunitaire. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets d’un enrichissement de l’environnement restent encore à élucider. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le bénéfice d’un hébergement en environnement enrichi sur un modèle de souris Alzheimer génétiquement modifié, notamment sur les déficits cognitifs, sur les biomarqueurs caractéristiques de la MA et sur les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet de recherche est la mise en évidence de modifications comportementales (capacités mnésiques), moléculaires et cellulaires (biomarqueurs MA, inflammation), qui sous-tendent les effets bénéfiques de l’enrichissement de l’environnement (EE) dans un modèle de maladie d’Alzheimer. Les analyses conjointes sur les deux sexes permettront d’étudier les différences entre mâles et femelles au niveau cognitif et permettront une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires/cellulaires, dépendants du sexe, qui sous-tendent les interventions non pharmacologiques telles que l’EE. Cela pourrait contribuer à développer des approches thérapeutiques personnalisées (Homme versus Femme) et à leur mise en place aux stades les plus précoces. En apportant des bases mécanistiques dans notre modèle animal de MA, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales sur la MA (pathologie amyloïde et déficit cognitif), sur les effets bénéfiques de l’EE et leur implication en santé humaine. Enfin, l’identification et le traçage biologique sanguin et cérébraux de marqueurs de la MA permettra le développement de stratégies thérapeutiques nouvelles, ou combinatoires soutenant des stratégies non pharmacologiques.

Procédures

Pour 192 animaux : 96 animaux seront hébergés en cage standard et 96 animaux seront hébergés en environnement enrichi pendant 4 mois (de 1 à 5 mois d’âge). Les tests comportementaux seront réalisés sur l’ensemble des animaux sur une période de 13 jours durant laquelle les animaux seront hébergés transitoirement en cage individuelle pendant 48h pour le premier test, 24h pour le second test et 4h pour le dernier test. Pour 64 animaux : Environ une semaine après le dernier test comportemental, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang terminal sous anesthésie profonde (durée totale de la procédure : environ 15 minutes) Pour 64 animaux : Environ une semaine après le dernier test comportemental, les animaux seront soumis à une perfusion terminale pour la fixation de tissus sous anesthésie profonde (durée totale de la procédure : environ 15 minutes).

Impact sur les animaux

Tous les animaux seront transférés en cage individuelle transitoirement avant de commencer chaque test, puis retourneront dans leur cage d’origine à la fin de chaque test (période d’isolement : 48h pour le premier test, 24h pour le deuxième test et 4h pour le dernier test). Cet hébergement en cage individuelle des congénères peut générer un stress. L’injection d’anesthésiques et/ou d’analgésiques aux souris, à l’aide d’une aiguille, entraîne une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. De plus, nous nous intéressons au stade prodromal de la MA difficilement détectable chez l’Homme. Nous ne pouvons, de ce fait, pas réaliser les analyses cellulaires et moléculaires sur l’Homme, ni utiliser d’alternative cellulaire ou de simulation par des techniques informatiques. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. De plus, nous nous intéressons au stade prodromal de la MA difficilement détectable chez l’Homme. Nous ne pouvons, de ce fait, pas réaliser les analyses cellulaires et moléculaires sur l’Homme, ni utiliser d’alternative cellulaire ou de simulation par des techniques informatiques. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Raffinement

Pour appliquer le principe de raffinement, un enrichissement environnemental est apporté dans les cages standards : dispositif de nidification (certifié contact alimentaire) chaque semaine. Dans le cas d’hébergement en cage individuelle (comportement), plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation pour ne pas créer d’isolement visuel, ni olfactif. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des tests comportementaux. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie. Une anesthésie générale et une analgésie adaptée sont utilisées pour les procédures qui le nécessitent.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront testés à l’âge de 5 mois, âge ou au moins un des déficits mnésiques est bien marqué (nos études antérieures ayant montré que les premiers déficits apparaissent à l’âge de 4 mois) dans ce modèle de souris transgéniques. De plus, ce modèle permet de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuroanatomiques comparables à celles du cerveau humain.

322 macaques à longue queue vont être utilisés pour étudier la réponse immunitaire du nouveau-né à une infection respiratoire, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les adultes subissent jusqu'à dix-sept anesthésies, vingt-trois prélèvements sanguins et des lavages broncho-alvéolaires, tandis que tous les nouveau-nés sont tués, parfois jusqu'à l'âge de trois ans, pour prélever leurs organes. Une partie des adultes, 214 individus, est gardée en vie et réutilisée après contrôle de leur état de santé. Le porteur qualifie le recours au primate d'"indispensable", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui les interactions étudiées.

Objectifs

L’objectif du projet est d’explorer le rôle du microbiote dans l’immunité à la naissance, et d’anticiper les effets délétères causés par son altération (dysbiose) précoce, notamment face à des infections respiratoires virales chez l’enfant. Le système immunitaire est immature à la naissance et se développe au cours des premières années par interaction avec l’environnement. Le microbiote intestinal, soit l’ensemble des micro-organismes peuplant nos intestins, est acquis principalement lors de l’accouchement par voie basse puis via l’allaitement. Il interagit avec le système immunitaire via la production de métabolites et module les composés produits par les cellules immunitaires hôte. Le microbiote, indispensable au rôle de barrière des muqueuses et à l’apprentissage de l’immunité locale, régule la reconnaissance des pathogènes et assure le bon fonctionnement du tissu. La littérature montre qu’une dysbiose altère la capacité du système immunitaire à répondre à une infection. Or, le microbiote peut être fragilisé par l’utilisation d’antibiotiques, pratique fréquente en pédiatrie. Malgré sa reconstitution, les conséquences à court et long terme de cette perturbation passagère restent mal comprises. Notre hypothèse est qu’une telle altération chez le nouveau-né contribue à la sévérité de certaines maladies respiratoires de la petite enfance. La compréhension du rôle du microbiote est donc déterminante pour envisager des stratégies thérapeutiques adaptées. Ce projet vise le virus respiratoire syncytial (VRS), principal agent responsable des bronchiolites aiguës chez l’enfant, dont les symptômes peuvent être très sévères. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du microbiote sur la réponse immunitaire à une infection virale chez le primate non-humain nouveau-né. Une procédure préliminaire sera menée chez des macaques juvéniles et adultes afin d’évaluer la quantité et la présence dans l’organisme des différents antibiotiques utilisés en pédiatrie. Une phase pilote sera ensuite réalisée chez des macaques juvéniles et adultes pour mettre au point le modèle d’infection par le VRS afin de limiter les études préliminaires chez les nouveau-nés. Puis nous comparerons des microbiotes altérés ou non par une antibiothérapie dans les premiers jours de vie. Enfin, des stratégies thérapeutiques fondées sur la vaccination maternelle ou sur une intervention néonatale (vaccinale ou probiotique) seront évaluées.

Bénéfices attendus

Ces travaux sur le primate non-humain permettront d’approfondir les connaissances en immunité pédiatrique actuellement limitées chez le nouveau-né humain pour des raisons évidentes d’éthique, mais également de difficulté d’accès aux différents compartiments (sang, muqueuses, moelle, poumons) et de volume disponible pour les échantillons. Le bénéfice attendu dans un premier temps est une meilleure compréhension des interactions et des mécanismes régulateurs entre système immunitaire et microbiote au cours des premiers temps de vie d’un nouveau-né. C’est au cours de cette période que se façonne la capacité du système immunitaire à réagir à une infection virale ainsi que sa mémoire immunitaire. En analysant ensuite l’impact d’un microbiote intacte ou altéré sur la réponse immunitaire à une infection, nous espérons pouvoir anticiper les effets délétères causés par un déséquilibre du microbiote (dysbiose) précoce. Enfin, l’exploration de stratégies préventives (vaccination maternelle ou administration néonatale de vaccin ou de probiotiques), permettra d’envisager l’ajustement de la prévention et le traitement des nouveau-nés. Au-delà des connaissances fondamentales attendues, ce projet vise également des applications pour la santé humaine. La collaboration avec les pédiatres a pour objectif de transposer ces résultats à l’amélioration des stratégies thérapeutiques lors des dysbioses précoces et à la prévention et la maitrise des infections respiratoires chez les enfants en clinique.

Procédures

Adultes pour pharmacocinétique : - Anesthésie : 17/animal (entre 30 min et1h) - Traitement antibiotique : 1 administration/jour (10min) jusqu’à 7 jours max/animal. - Prélèvements sanguins : 23/animal (5 min). - Écouvillonnages mucosaux : 9/animal (5 min). - Urines : 10/animal (récupération dans la cage sans intervention sur l’animal) - Imagerie in vivo : jusqu’à 6 sessions/animal (durée < 1 h). - Lavage broncho-alvéolaire (LBA) : 3 prélèvements (20 min). Juvéniles et adultes : - Anesthésie : 11/animal (30min à 1h) - Prélèvement de sang : 10/animal (5 min) - Ecouvillonnage des muqueuses : jusqu’à 10 fois par animal (5 min). - LBA : 5 max (20 min) - Exposition virale : 1 exposition, 30 min - Implantation d’une puce de suivi de la température : 1 fois, 30 min - Imagerie in vivo : 4 sessions max (< 1 h). - Suivi de la respiration : 3/animal (10 min) - Hébergement individuel : 1 fois, 4 semaines max Mères : - Anesthésie : jusqu’à 40/ animal (30 min-1h) - Echographies : 2-3 fois (intervalle 1 mois entre, 30 min) - Prélèvement de sang : Jusqu’à 25 fois en moyenne/animal (durée 5 min) - Ecouvillonnage des muqueuses : Jusqu’à 25 fois en moyenne (5min) - Lait maternel : 25 collectes (10 min) - LBA : Jusqu’à 7 lavages (20min) - Ponction de moelle osseuse : 5 ponctions (20 min) - Vaccination : 1 injection au cours de la gestation (5min) Nouveau-nés : - Anesthésie : jusqu’à 45/animal (15 et 30min) - Prélèvement de sang : jusqu’à 45/animal (5min par prélèvement) - Ecouvillonnage des muqueuses : jusqu’à 45/animal (5min) - LBA : jusqu’à 17 lavages (20min) - Ponction de moelle osseuse : jusqu’à 10 (20min) - Exposition virale : 1 exposition (30min) - Traitement antibiotique ou probiotique : 1 administration/jour pendant 1 à 4 semaines (20min) - Imagerie in vivo : 3 sessions (< 1 h)Euthanasie en fin d’étude

Impact sur les animaux

Nous distinguons les effets de l’expérimentation des effets liés aux infections et traitements. Chez les nouveau-nés, les juvéniles et les adultes, l’infection par le VRS entraîne, d’après la littérature, des formes le plus souvent asymptomatiques, légères ou modérées. Des symptômes pourront être relevés (fièvre, baisse d’activité, lésions pulmonaires) mais sont transitoires et résolus en moyenne après deux semaines. La vaccination maternelle et néonatale pourrait être associée à une réaction locale au site d’injection qui serait transitoire, avec rougeur et gonflement, résolue en quelques jours. Enfin l’administration de probiotiques par voie orale se fera autant que possible par succion et non par gavage, en respectant les volumes préconisés. Nous devons maîtriser la fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie afin de ne pas interférer avec la croissance du nouveau-né ni impacter la relation mère/nouveau-né. La fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie, sous anesthésie ou vigiles, peuvent engendrer une hypothermie transitoire, un stress, interférer avec la croissance du nouveau-né ou impacter la relation mère/nouveau-né voire un risque de rejet. De même, le sevrage peut entraîner un stress lié à la séparation avec la mère. Les prélèvements de sang répétés peuvent engendrer des perturbations transitoires du profil hématologique. Ce projet repose sur notre expérience passée qui a démontré que nous pouvons suivre un schéma expérimental tel que celui décrit, sans impacter la croissance des nouveau-nés ni la relation avec les mères.

Devenir

Les juvéniles et les adultes seront gardés en vie à la fin de l’étude pilote et réutilisés une fois que l’état sanitaire des animaux aura été vérifié. Tous les nouveau-nés primates non-humains seront euthanasiés, jusqu’à l’âge de 3 ans, pour accéder aux organes et ainsi à l’analyse fine des différents compartiments d’intérêt (charge virale, populations immunitaires, microbiote, métabolites, histologie…). Les femelles primates non-humains seront sorties du projet un mois après le sevrage et pourront être réutilisées sur avis vétérinaire. Elles servent de contrôle des différents systèmes matures et adultes, mais il n’est pas nécessaire d’accéder aux tissus, nos données de laboratoire seront utilisées si nécessaire.

Remplacement

Ce projet nécessite l’étude du système immunitaire et du microbiote en fonctionnement, et ces systèmes intégrés et leurs interactions ne peuvent pas être reproduits in vitro. De même, reproduire in vitro des symptômes dans le cadre d’une pathologie respiratoire n’est pas possible. Le recours à l’animal reste donc indispensable. Nous utiliserons un modèle de primate non humain, le macaque cynomolgus, pour sa proximité phylogénétique avec l’humain : il présente une forte homologie au niveau des acteurs et de l’organisation de la réponse immunitaire et vaccinale mais aussi de la composition microbiotique, contrairement à ce que l’on peut retrouver chez d’autres modèles animaux. Ce modèle, sensible à l’infection par le virus étudié, fera l’objet d’une phase pilote préalable destinée à optimiser les conditions expérimentales et à valider leur pertinence biologique dans ce contexte.

Réduction

Le nombre d’animaux a été ajusté au strict minimum nécessaire pour permettre l’interprétation des effets des conditions expérimentales, tout en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Pour les études de pharmacocinétique et de mise au point du modèle juvénile/adulte d’infection, la réduction est obtenue par une évaluation séquentielle des conditions, avec des groupes de 2 animaux pour chaque combinaison testée. Cette approche permet d’écarter rapidement les conditions non pertinentes sans multiplier les groupes. Deux animaux supplémentaires ne seront ajoutés que pour la combinaison ayant montré les résultats les plus concluants, afin de confirmer les observations. Pour l’étude sur le modèle d’infection néonatale, l’effectif est limité à six animaux par groupe, correspondant au minimum requis pour l’analyse prévue. Les paramètres expérimentaux appliqués aux nouveau-nés sont ceux ajustés au cours de la phase préliminaire incluse dans ce projet, évitant ainsi toute répétition d’essais exploratoires à ce stade.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les jours avec une attention particulière pendant les deux premières semaines de vie. Des grilles d’évaluation permettront de suivre et détecter tout écart au bien-être animal. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront prises (arrêt des interventions, traitement, sortie d’étude), selon avis du vétérinaire et de la structure du bien-être animal. Également, en cas d’apparition de douleurs ou de signes cliniques liés aux prélèvements ou à l’infection, un traitement symptomatique pourra être mis en place. L’unité minimale d’hébergement des animaux sera le couple mère/enfant qui ne sera séparé qu’au-delà de l’âge minimal réglementaire (8 mois) de sevrage pour cette espèce afin de reformer de nouveaux groupes. Dans l’ensemble, le groupe social multifemelles et multi-nouveau-nés sera favorisé au maximum. Toute intervention sera faite sous anesthésie générale réversible pour permettre un réveil rapide des animaux, avec une anesthésie non systématique du nouveau-né lors des premières semaines de vie, lorsque la balance bénéfice/risque n’est pas favorable (risques d’hypothermie ou de rejet maternel trop importants) par rapport au temps nécessaire pour l’intervention. Enfin, toutes les techniques et analyses ont été miniaturisées pour la procédure chez les nouveau-nés, afin de réduire les volumes de sang nécessaires à prélever.

Choix des espèces

Ce projet a pour objectif final d’évaluer l’impact d’une perturbation du microbiote d’un nouveau-né sur sa réponse immunitaire à une infection respiratoire, et ainsi évaluer le bénéfice de certains traitements ou vaccins sur les effets délétères liés à cette perturbation. Seuls les primates non-humains présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et immunologiques, en termes de réponse immunitaire et vaccinale, suffisamment proches de l’humain pour permettre une étude pertinente de ces phénomènes. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, qui a déjà été modèle d’infection pour nos virus d’intérêt dans des études scientifiques, et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire et du microbiote sont disponibles et maitrisés. L’étude pharmacocinétique de molécules telles que les antibiotiques, ne nécessite pas d’être faite chez le juvénile ou le nouveau-né et se fera sur l’adulte car leur maturité physiologique permet une caractérisation stable et reproductible des profils d’exposition, ce qui facilite l’optimisation des doses et des modalités d’administration avant leur transposition aux animaux plus jeunes. Des animaux juvéniles et adultes sont également mobilisés pour la mise au point et la validation du modèle d’infection par le RSV, les juvéniles présentant un système immunitaire encore en développement, plus proche de celui des nouveau-nés que celui des adultes, tout en permettant des investigations expérimentales plus robustes et moins contraignantes. Cette étape est nécessaire pour établir les conditions d’infection, évaluer la pertinence immunologique du modèle et sécuriser son transfert ultérieur aux stades néonataux. Enfin, notre étude, qui s’intéresse à des développements in utero et néonataux, nécessite d’avoir accès à des femelles gestantes et aux nouveau-nés issus de ces gestations.

Immunodéprimées puis dotées d'un système immunitaire humain, 14 400 souris vont être utilisées pour produire un modèle dit humanisé, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une irradiation, des greffes de tumeurs ou de tissus humains, des infections par le VIH ou d'autres pathogènes, et jusqu'à huit prélèvements ou injections chacune. Leur immunodéficience les rend très sensibles aux infections, et l'irradiation peut provoquer des tumeurs. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non humain, jusque-là "modèle de choix" pour ces études.

Objectifs

L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines telles que le VIH (virus de l'Immunodéficience humaine) et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité anti-infectieuse ou anti-tumorale et/ou leur impact sur le système immunitaire humain et/ou d’autres tissus humains.

Bénéfices attendus

Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).

Procédures

- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie luminescente intravitale (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois) - greffe de tissus humain (1 par animal, durée 20min)

Impact sur les animaux

Du fait de leur degré d’immunodéficience et après infection par le VIH, ces animaux sont très sensibles aux infections. Après irradiation certaines souris transgéniques peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. De potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection hydrodynamique. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort. Après injection cellules tumorales humaines les souris développeront des tumeurs.

Devenir

Les animaux portant un système immunitaire humain(HIS), générés dans la procédure « génération de souris HIS » pourront être inclus dans des procédures permettant de stimuler les cellules immunitaires humaines et/ou de valider l’activité d’immuno-modulateurs. Les souris HIS dont la population de cellules immunitaires aura été augmentée, pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme dans les procédures permettant de greffer des tumeurs ou des tissus humains et/ou d’infecter les souris par des pathogènes afin d’étudier in vivo la réponse immunitaire humaine contre des pathogènes humains ou des tumeurs humaines. Ces animaux pourront également être inclus dans la procédure permettant de valider l’activité d’immuno-modulateurs ou dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet. Certaines souris issues de la procédure « génération de souris HIS » pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris HIS issues de la procédure permettant de valider, dans ce modèle de souris, l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort par analyse des différents organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.

Réduction

MODIFICATION texte en majuscules Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 938 souris (75SOURIS/UTILISATEUR X10UTILISATEURS X1.25 car la greffe ne prend que dans 80% de cas) par an soit un total de 4690 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme. 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé en moyenne à 10 par an. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an). LE BESOIN DE NOS UTILISATEURS EN SOURIS IMMUNODEFICIENTES A 840 CHAQUE ANNEE, EST DE 4200 SUR 5 ANS EN TENANT COMPTE DE 1. NOMBRE D’OPERATEURS DE LA PLATEFORME. 2. NOMBRE D’UTILISATEURS INTERESSES PAR LES MODELES ESTIME A 8 PAR AN. 3. CE QUE LA PLATEFORME FOURNIRA 105 SOURIS IMMUNODEFICIENTES PAR UTILISATEUR ET PAR AN (15 POUR ETUDE PILOTE 30 POUR EXPERIENCE PRINCIPALE, 1 ETUDE PILOTE ET 3 EXPERIENCES PRINCIPALES /UTILISATEUR/AN). Pour produire ces souris POUR NOS COLLABORATEURS, nous maintenons, en continu, un élevage de 8 LIGNEES DE SOURIS immuno-déficientes. Les souris immunodéficientes seront hébergées en groupe dans un environnement protégé pour assurer leur bien-être, NOUS ESTIMONS POUVOIR FOURNIR 4690 SOURIS HIS ET 4200 SOURIS IMMUNO-DEFICIENTES ET MAINTENIR LES LIGNEES. NOUS UTILISERONS UN TOTAL DE 14400. Nous aurons 3 trios reproducteurs de chaque lignée en continu pendant les 5 années. Ce nombre est le minimum possible pour maintenir un élevage sans croiser les frères/sœurs EN TENANT COMPTE QUE CES LIGNEES PRODUISENT PEU DE PETITS. En partant du fait que chaque femelle d’un trio produit 5 petits par mois, chaque trio produit 10 petits/mois soit 10x12 = 120 petits/an. Ainsi pour chaque lignée, 120x3trios= 360 animaux seront produits chaque année. Pour chaque lignée, il y aura donc une production de 360x5ans = 1800 animaux/lignée sur 5 ans. Nous produirons donc, pour les 8 lignées, 1800x8 = 14400 animaux produits en 5ans. Parmi ces 14400 animaux produits en 5 ans, environ 3600 animaux (25%) seront sacrifiés pour mauvais génotype, 4690 seront humanisés, 4200 SERONT UTILISES POUR TESTER LES NOUVEAUX TRAITEMENTS DE NOS COLLABORATEURS, les 1910 animaux restants assureront le maintien des colonies.

Raffinement

La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Un outil informatique de randomisation sera utilisé en amont des expériences pour garantir la répartition équilibrée entre les groupes de souris de variables susceptibles d'interférer (biais) avec la mesure ou l'analyse des résultats de l'essai. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de dermatite, les animaux seront placés sur une litière à base de cellulose et les lésions traitées avec un désinfectant. Après chaque intervention chirurgicale, les animaux seront placés dans des cages chauffées pendant la phase de réveil, et auront du gel hydrique à disposition pendant plusieurs jours. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. MODIFICATION texte en majuscules Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines dans des souriceaux nouveau-nés (

Pour fabriquer un modèle de dépression, 592 souris reçoivent une hormone de stress dans leur eau de boisson afin de déclencher un comportement anxieux et dépressif ainsi que des troubles de la mémoire, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent ensuite jusqu'à huit tests comportementaux censés mesurer l'anxiété, la dépression et les performances cognitives. Le traitement peut aussi dégrader leur pelage et modifier leur poids. Le porteur affirme que la recherche de nouveaux médicaments contre la dépression "nécessite", scientifiquement et réglementairement, le recours à des rongeurs.

Objectifs

La dépression est une maladie fréquente qui touche environ 15 à 20 % de la population générale. Elle se traduit par une grande tristesse, une perte de plaisir ou d’intérêt, de l’anxiété, un isolement social, ainsi que des difficultés de mémoire et d’apprentissage. Les traitements actuellement disponibles présentent plusieurs limites importantes. Ils agissent souvent lentement, ne sont pas efficaces chez tous les patients, et certains symptômes persistent, ce qui favorise les rechutes. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie. Ce projet de recherche vise à participer au développement de nouveaux médicaments pour mieux traiter la dépression et limiter les rechutes. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux qui reproduisent certains aspects de la maladie humaine. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris qui repose sur l’administration prolongée d’une hormone de stress. Ce modèle permet d’induire des comportements anxieux et dépressifs durables chez le rongeur, similaires à ceux observés chez les patients souffrant de dépression. L’objectif principal de ce projet est d’adapter et de caractériser plus en détail ce modèle animal afin d’évaluer le risque de rechutes et les troubles de la mémoire associés à la dépression. Une meilleure compréhension de ces aspects permettra de développer, à terme, des stratégies thérapeutiques plus adaptées et plus efficaces. La dépression touchant environ deux fois plus les femmes que les hommes, des souris mâles et femelles seront utilisées afin de mieux refléter la diversité observée dans la population humaine. Le développement et l’amélioration de ce modèle constituent une étape clé de ce projet. Il servira ensuite à tester de nouveaux médicaments pour mieux traiter la dépression et prévenir les rechutes.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de valider un nouveau modèle animal au sein de notre laboratoire, destiné à l’étude de la dépression et la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les différences entre mâles et femelles ont été très peu étudiées à ce jour. Ainsi, l’utilisation des 2 sexes permettra d’apporter de nouvelles données à ce sujet, d’autant que la dépression touche plus fréquemment les femmes que les hommes. Par ailleurs, l’évaluation des capacités de mémorisation des animaux permettra d’étudier le rôle des troubles de la mémoire et de l’apprentissage dans ce modèle. Ces données permettront d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans la dépression et pourront, à terme, orienter le développement de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, l’impact de la dépression sur le rythme biologique n’a, à ce jour, pas beaucoup été étudié dans ce modèle. L’analyse de ce paramètre apportera des informations complémentaires importantes, en lien avec les troubles du sommeil fréquemment observés chez les patients souffrant de dépression. En conclusion, le développement et la caractérisation de ce modèle constitueront une ressource durable pour le laboratoire. Ce modèle offrira un outil pertinent pour l’évaluation préclinique de nouveaux candidats-médicaments à visée thérapeutique, dans le cadre de ce projet et de futurs projets de recherche du laboratoire.

Procédures

Toutes les souris du projet seront exposées à un maximum de 3 expositions à 8 tests comportementaux d’une durée maximale de 48h selon le test utilisé. Les tests comportementaux choisis sont non invasifs et engendrent peu de nuisance chez l’animal. Ces tests ont pour but de tester le comportement anxieux et dépressif, les performances cognitives ainsi que le rythme biologique des animaux suite au traitement à l’hormone de stress.

Impact sur les animaux

Lors de ce projet, les animaux seront exposés à un traitement à une hormone de stress administré par eau de boisson visant à induire un comportement de type anxieux et dépressif ainsi que des troubles de la mémoire et de l’apprentissage. Ce traitement peut également entraîner des modifications physiques modérées, telles qu’un pelage de moins bonne qualité, lié à une diminution du toilettage, ainsi qu’une prise de poids (nuisance modérée)..

Devenir

A l’issue de ce projet, les 592 souris seront mises à mort.

Remplacement

Ce projet vise à développer et caractériser un modèle animal de dépression. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes des troubles dépressifs et d’en améliorer la prise en charge à travers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. La recherche de nouveaux médicaments nécessite (scientifiquement et règlementairement) l’utilisation d’espèces animales. De plus, seuls des organismes vivants complexes tels que les rongeurs disposent d’un répertoire comportemental suffisamment riche et élaboré pour permettre une évaluation fiable des comportements anxieux et dépressifs et des fonctions cognitives. Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou in silico (modèles mathématiques, bio-informatique) ne peut être réalisé.

Réduction

Un total de 592 souris sera nécessaire pour cette étude. Le nombre d’animaux prévus dans cette étude a été réduit au maximum – au regard des approches comportementales envisagées pour lequel le laboratoire possède une expertise internationale ainsi que sur la base de la littérature.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux auront une semaine d’habituation à l’animalerie. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation sera mis en place. Ainsi, avant le début des expérimentations, les animaux seront progressivement habitués à l’expérimentateur par des manipulations régulières. A noter que l’ensemble des évaluations comportementales sera réalisé exclusivement par un personnel qualifié. Les différents traitements seront administrés dans l’eau de boisson, permettant d’éviter toute injection. Enfin, des points limites précoces et compatibles avec les objectifs scientifiques de notre recherche ont été choisis afin d’éviter toute douleur et détresse de nos animaux.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. L’idée est en effet de mesurer l’impact des processus cognitifs sur la propension à la rechute après induction d’un syndrome anxio-dépressif. Le modèle dépression induite par administration chronique d’une hormone de stress dans l’eau de boisson a été développé et validé chez la souris. Le phénotype anxio-dépressif des souris dans les différents tests choisis est bien décrit et caractérisé dans la littérature. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines seront utilisées dans ce projet. Ce modèle animal a été décrit et publié avec des animaux à ce stade de développement.

4 435 souris vont être utilisées par une plateforme commerciale de création de lignées génétiquement modifiées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles sont superovulées puis tuées pour récupérer leurs embryons, les mâles vasectomisés et les femelles ovariectomisées tués après un an devenus "trop âgés", les porteuses tuées six semaines après la chirurgie. Les souris hétérozygotes produites sont expédiées aux clients, aucun bénéfice direct n'étant attendu de ces actes. Le porteur revendique une baisse de 930 à 887 animaux par an, à l'échelle d'une activité qui répond à la demande de ses clients.

Objectifs

Pour comprendre les fonctions de l’ensemble de nos gènes, il est nécessaire de générer, analyser et caractériser des modèles de souris génétiquement modifiées. Notre module est en charge de la création des lignées de souris génétiquement modifiées par des techniques de transgénèses. Ces lignées de souris peuvent devenir des modèles de maladie humaine et vont permettre de mieux comprendre le processus de développement de ces maladies. Ces modèles peuvent également répondre à d’autres intérêts scientifiques tout aussi importants (comme par exemple devenir des modèles de choix pour la recherche fondamentale). Ces souris, en tant que modèle de maladies humaines, vont également permettre de tester des médicaments et de valider ou d’invalider des cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices ne sont pas directs après nos procédures dans le cas de création de modèles murins génétiquement modifiés. Tous les animaux hétérozygotes pour la mutation souhaitée sont expédiés et étudiés chez nos clients. Les nouveaux modèles permettront de mieux comprendre des mécanismes biologiques ou des maladies humaines, de tester de nouveaux traitements ou encore d’améliorer les stratégies thérapeutiques, en contribuant ainsi aux progrès de la recherche biomédicale.

Procédures

Une injection sous cutanées et intrapéritonéale sont réalisées sur 240 femelles par afin de les super-ovuler (1200 sur 5 ans). Pour toutes les autres procédures les animaux (587 au total par an soit 2935 sur 5 ans) subissent des injections en sous cutanée et en intrapéritonéale pour l'analgésie et l'anesthésie pour les différentes chirurgies. Nous réalisons également sur tous ces animaux une laparotomie. La vasectomie est réalisée sur 55 mâles par an (275 sur 5 ans). L'ovariectomie est réalisée sur 40 femelles par an (200 sur 5 ans). La réimplantation d'embryons est réalisée sur 480 femelles par an, cela consiste à l'injection des embryons modifiés dans l'utérus ou dans l'oviducte. Le protocole i-GONAD est réalisé sur 12 femelles par an, cela consiste à l'injection d'une molécule dans l'ampoule ovarienne et son électroporation in situ.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité de nos chirurgies est de classe modéré (laparotomie). Les points de surveillance en phase post-opératoire sont : l’apparence et la posture de l’animal (apparence du pelage et animal prostré), son comportement (utilisation de son environnement, toilette et fèces), l’aspect du site de chirurgie (rougeur, gonflement, écoulement, automutilation, cicatrisation,). La prise de poids ou la non perte de poids est surveillée à différents moments de la période de convalescence (au plus tard deux semaines après la chirurgie).

Devenir

A la fin de chaque procédure (fin du projet), les animaux sont mis à mort. Les femelles super-ovulées sont mises à mort pour la récupération de leurs embryons afin d'effectuer leur modification. Les mâles vasectomisés sont mis à mort après un an d'utilisation car après ils deviennent trop âgés pour produire des femelles porteuses nécessaires à la réimplantation de nos embryons génétiquement modifiés. Les femelles ovariectomisées sont mises à mort après un an d'utilisation car elles deviennent trop âgées et peuvent mettre en danger le statut sanitaire de l’animalerie. Les femelles réimplantées sont mises à mort 6 semaines après leur chirurgie et après le sevrage des animaux d'intérêt… Les femelles utilisées dans le protocole i-GONAD sont également mises à mort 6 semaines après la chirurgie et après le sevrage des animaux d'intérêt. Les animaux générés hétérozygotes (non dommageables) sont envoyés chez le client pour maintient et utilisation des animaux. Aucun animal est gardé sur Ciphe pour maintient, élevage ou utilisation.

Remplacement

Le modèle animal ne connait pas à ce jour de remplacement total et notamment pour notre domaine qui est la création de modèle murin. Il est primordial d'avoir le modèle animal pour comprendre ou étudier certaines maladies ou fonction physiologique. Aucune méthode alternative ne reproduit entièrement la complexité d'un organisme vivant et ses interactions globales. Cependant, les alternatives développées permettent de réduire progressivement l’utilisation des animaux et notamment son nombre.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum afin de garantir le succès d'une création de lignée. Nous ne pouvons pas descendre en dessous de ce nombre car sinon nous devrions reproduire la procédure plusieurs fois et ainsi utiliser plus d'animaux que prévus. Il est cependant réduit depuis notre dernière demande d'autorisation de projet. Nous sommes passés de 930 animaux utilisés annuellement à 887 animaux. Nous avons mis en place plusieurs éléments (exemple l'utilisation d'une hormone synchronisant les cycles ovariens) afin de permettre une réduction du nombre d'animaux tout en garantissant le succès expérimental. Nous sommes une plateforme de prestation de service, nous devons répondre à la demande de nos clients et assurer la création des modèles.

Raffinement

La prise en charge de la douleur ainsi que le bien-être animal est au centre de nos procédures. L'analgésie et la douleur sont prises en charge par plusieurs médicaments et couvrent une période plus longue que la période de convalescence. Une grille de score est mise en place pour chacune de nos procédures et nous permettent de suivre les premiers signes de souffrance. Des points limites sont mis en place et une surveillance quotidienne est effectuée sur les animaux. Nous respectons au mieux l'asepsie pour réaliser les chirurgies, en effet tous nos instruments sont lavés puis autoclavés et nous utilisons des champs stériles pour chaque animal. Durant la phase per-opératoire, un tapis chauffant ou isolant est installé sous la hotte de chirurgie pour pallier l'hypothermie des animaux. Les conditions d'hébergement sont également surveillées. La température, l'hygrométrie et le cycle nycthéméral sont relevés quotidiennement. L'enrichissement dans les cages est présent et les animaux disposent de plusieurs objets pour effectuer leur nid. Nous faisons également en sorte qu'aucune cage soit isolée sur le portoir ventilé afin d'éviter l'isolement visuel des congénères. Sauf contre-indication, tous nos animaux sont plusieurs dans la cage afin d'éviter l'isolement social. Toutes les manipulations sur ces animaux sont réalisées par du personnel formé afin de réduire le stress et éviter les blessures. Nous plateforme de prestation de service veille à appliquer les meilleures recommandations dans ce domaine.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. C'est également un animal de petite taille et à reproduction rapide. La gestation de trois semaines environ permet d'obtenir rapidement un grand nombre de descendants. La modification génétique est facile et reproductible sur la souris, ce qui permet d'obtenir des animaux génétiquement modifiés pour différentes études. L'hébergement des souris est moins coûteux que certaines autres espèces animales et il est possible de la maintenir dans différentes conditions d'hébergements (statut sanitaire différent). La souris est l'animal le plus utilisé et étudié depuis de nombreuses années ce qui permet d'avoir un large panel d'études bibliographiques et peut faciliter les résultats pour d'autres études. Nous avons également une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Tous les animaux seront utilisés à maturité sexuelle sauf pour certaines femelles qui rentre dans la procédure de superovulation. Selon les fonds génétiques, il est impératif d'utiliser des femelles prépubères pour assurer une meilleure production d'ovocytes. Tous les animaux seront utilisés à maturité sexuelle sauf pour certines femelles qui rentre dans la procédure de superovulation. Selon les fond génétique, il est impératif d'utiliser des femelles pré-pubères pour assurer une meilleure production d'ovocytes.