Procédures légères

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumis à un régime gras et sucré, ils subissent des mises à jeun, des gavages de glucose avec prélèvements de sang répétés à la queue et des isolements de 24 heures pour l'analyse vidéo de leurs déplacements. Le projet, mené pour une entreprise, teste si une eau traitée par électrolyse limite le syndrome métabolique. Le porteur présente le rat comme un "donneur" d'organes et affirme qu'une étude in vitro n'aurait "pas d'intérêt" ici.

Objectifs

La prévalence de l'obésité ne cesse de croître. D'ici 2030, on prévoit que 40% de la population mondiale sera en surpoids et 20% sera obèse. L'obésité est un facteur de risque important pour de nombreuses maladies non transmissibles, notamment : les troubles métaboliques (par exemple, le diabète et la résistance à l'insuline), les maladies pulmonaires (syndrome d'hypoventilation lié à l'obésité, apnée du sommeil), les maladies cardiovasculaires, les maladies digestives (stéatose hépatique non alcoolique) et les cancers. De nombreux mécanismes expliquent ces complications, mais l'inflammation associée à l'obésité figure parmi les principaux. En effet, l'obésité se caractérise par un dysfonctionnement immunitaire, une altération de la perméabilité intestinale (qui favorise la translocation bactérienne et l'inflammation systémique). Cette inflammation de bas grade va avoir un impact sur le métabolisme, notamment en favorisant le développement d'une résistance à l'insuline et le développement d'un syndrome métabolique (première étape vers le diabète de type 2). Ainsi, toute stratégie permettant de limiter l'inflammation de bas grade au cours du syndrome métabolique permettra de limiter ses conséquences délétères. Parmi ces stratégies, l'apport d'une eau de boisson traitée pour éliminer tout matériel organique pourrait contribuer à diminuer l'inflammation de bas grade. Nous proposons d'évaluer le potentiel d'une telle eau traitée par un procédé innovant dans un modèle de syndrome métabolique et d'obésité chez le rongeur. Le 1er critère sera de déterminer la capacité de cette eau à limiter et/ou à prévenir le syndrome métabolique évaluée par une meilleure tolérance au glucose déterminée par un test de charge orale en glucose. Afin de contrôler l'impactéventuel d'une modification de lactivité locomotrice, celle-ci sera déterminée à l'aide d'un système de video-tracking.

Bénéfices attendus

Selon l'entreprise sollicitant cette prestation, cette eau traitée pourrait permettre de limiter l'inflammation de bas grade associée au syndrome métabolique permettant ainsi de limiter ses conséquences délétères.

Procédures

Certains animaux seront soumis à un régime riche en graisses et en sucres. Ils recevront également soit l'eau du réseau de ville qui répond aux critères très stricts dictés par le Ministère de la Santé et le Conseil supérieur du secteur d’Hygiène Publique soit cette même eau traitée par électrolyse, durant 8 à 16 semaines, selon les groupes concernés. Tous les animaux seront soumis à 3 tests de tolérance au glucose en début de protocole (S0), au mileu (8 semaines de régime et/ou de traitement par l’eau traitée) et à la fin du protocole à 16 semaines de régime et/ou traitement. Les animaux seront mis à jeun à 16 heures, la veille de chaque test. De l’eau sera laissée à leur disposition. Le matin du test, vers 8 heures, les animaux seront pesés puis laissés au calme pendant 30 minutes. Le test débutera par une prise de sang à la queue sur animal vigile. Une goutte de sang suffit pour le dosage de la glycémie en direct grâce à un glucomètre (T0). Le test se poursuit par l'administration d'une dose de glucose en fonction du poids de chaque animal par gavage oral (niveau de douleur 0). Une goutte de sang est ensuite prélevée 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 90 et 120 min après l'administration de la dose de glucose pour le dosage de la glycémie. Après le test, le site de prélèvement est désinfecté à la Chlorhexidine. L'activité locomotrice spontanée des animaux sera déterminée à partir de l'enregistrement de leur déplacement pendant 24h à l'aide d'un système de video-tracking en début de protocole (S0), au mileu (8 semaines de régime et/ou de traitement par l’eau traitée) et à la fin du protocole à 16 semaines de régime et/ou traitement). Pendant cette mesure, les animaux seront placés en cage individuelle, de modèle identique à celui utilisé pour le reste de l'hébergement. Pendant le durée de l'étude, les animaux seront pesés 2 fois par semaine nécessitant brièvement une préhension et une lègère contention réalisée par du personnel habitué à effectuer ces gestes.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu d’effets indésirables de cette eau traitée. Le régime gras et sucré utilisé sur les animaux favorisera la prise de masse grasse et le développement d'un syndrome métabolique. Ceux recevant l'eau traitée devraient montrer des symptomes moindres que ceux recevant de l'eau classique. Il est attendu des nuisances légères liées à : - l'isolement en cages individuelles pendant 24, prévu pour l'analyse de l'activité locomotrice spontanée par videotracking - la mise à jeune à 3 reprises pendant la durée du projet, préalable aux tests de tolérance au glucose - le prélèvement de sang selon les détails indiqués dans la procédure 1.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure 1. Le sang et divers tissus d'intérêt sont prélevés sur l'animal une fois mort, pour être conservés en vue d'analyses futures.

Remplacement

Ce projet étudie les conséquences d'un modèle d'induction de syndrome métabolique sur les différents organes ou systèmes physiologiques. Le recours à l’utilisation de modèles alternatifs comme des cellules en culture ne permet pas d'étudier les relations inter-organes ni d'avoir une approche fonctionnelle des organes. Le choix du rat se justifie par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire et dans la littérature sur ce modèle d'induction du syndrome métabolique sur cette espèce. Le rat est utilisé comme "source" de tissus d'intérêt en vue de constituer une tissuthèque permettant des analyses ultérieures. Il n’est pas possible d’évaluer un effet in vitro, car une eau ultra pure sera fortement hypo-osmotique et entrainera une mort cellulaire immédiate. Si elle est diluée dans un mélange complexe, elle n’a plus d’intérêt.

Réduction

Nous prendrons le soin d’utiliser le nombre minimal d’animaux mais qui permette cependant de tirer des conclusions statistiques avec une puissance suffisante. Le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base d’études publiées, qui utilisent le même modèle d'exposition à un régime riche en graisses et en sucres. Les expériences ont été soigneusement planifiées (par rapport aux données bibliographiques et à nos résultats préalables) pour permettre la collecte d’un maximum d’informations à partir des individus étudiés. De plus, les organes non utilisés seront congelés pour des études complémentaires éventuelles.

Raffinement

Ce protocole ne fait appel qu’à des procédures expérimentales légères ou sans réveil (après anesthésie gazeuse à isoflurane puis exsanguination) et à des prélèvements de tissus sur animal mort ne pouvant donc pas entraîner de douleur ou une douleur ou une contrainte légère et très brève (manipulation/contention). Outre la surveillance réglementaire quotidienne, nous suivrons très précisément l’état général des animaux, leur poids ainsi que leur prise alimentaire à raison de 2 fois par semaine tout au long du protocole. S’il s’avérait que l’un d’entre eux perde du poids de façon importante (15% au cours d'une semaine), soit blessé ou souffrant, il sera exclu du projet et mis à mort. Une autopsie sera réalisée pour identifier plus précisément les causes de cet état ayant justifié la mise à mort le cas échéant, de façon à optimiser nos procédures pour d'éventuelles études futures. La décision sera prise par un des responsables du projet.

Choix des espèces

Le choix du rat se justifie par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire et dans la littérature sur le modèle d'exposition à un régime riche en graisses et en sucres sur cette espèce. Pour ces études, le rat est utilisé comme « donneur » d’organes. C'est également une des espèces la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous n’utilisons que des rats males car il est difficile de maitriser le cycle menstruel chez la rate et celui-ci modifie le métabolisme en particulier le métabolisme du glucose qui nous intéresse particulièrement. De plus, nous utiliserons une souche connue dans la littérature pour être plus sensible à l’installation d’un syndrome métabolique sous régime gras et sucré que d’autres souches.

54 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des immunisations et jusqu'à trois prélèvements de sang, pour mesurer la réponse immunitaire à deux candidats vaccins, l'un anti-COVID par voie nasale, l'autre thérapeutique contre le papillomavirus. Le porteur indique que ces rats immunisés ne peuvent être ni réutilisés, ni adoptés, et seront donc tués. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'établir l'immunogénicité d'un vaccin et qualifie les futures études réglementaires d'"indispensables".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de déterminer de façon préalable l’immunogénicité, chez le rat, des produits suivants: 1- un candidat vaccin anti-COVID à administrer par la voie nasale. Ce vaccin est plus efficace que les vaccines à base d’ARN messager et présente l’avantage d’être administrable par la voie nasale et donc de protéger directement les voies respiratoires, de réduire la transmission virale et dont l’efficacité n’est pas affectée par les mutations qui s’accumulent dans l’antigène Spike des variants émergeants du SARS-CoV-2, et 2- un candidat vaccin à usage thérapeutique contre le papillomavirus humain qui est responsable de tous les cancers du col de l’utérus, ainsi qu’une grande proportion des cancers oro-pharyngés. Ce candidat vaccin permet une éradication totale tumorale dans le modèle préclinique. Ce projet permettra de valider l’espèce animale rat pour sa capacité à répondre à la vaccination par les produits développés. Une fois l’immunogénicité établie chez le rat, un organisme indépendant réalisera les expériences précliniques réglementaires chez cette espèce animale. Les futures expériences réglementaires, qui ne font pas partie de ce projet, sont nécessaires pour établir l’innocuité de ces produits et sont requises pour l’obtention de l’autorisation des autorités réglementaires avant d’administrer ces produits chez l’humain.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est d’obtenir l’autorisation de réaliser les deux essais cliniques que nous mettons en place: un pour un candidat vaccin de seconde génération contre le COVID et un autre pour une immunothérapie des cancers de col de l’utérus et des cancers oro-pharyngés liés à l’infection par HPV. Il est à noter que les vaccins anti-HPV actuellement disponibles sont des vaccins préventifs et n’ont aucun effet bénéfique sur les tumeurs déjà développées. En effet, une fois l’immunogénicité établie chez le rat selon le projet présenté ici, un organisme indépendant réalisera les expériences précliniques réglementaires chez cette espèce animale pour établir l’innocuité de ces deux candidats vaccins. Ces futures expériences précliniques réglementaires sont indispensables pour l’obtention de l’autorisation des autorités réglementaires pour réaliser les essais d’administration chez l’humain.

Procédures

Prise de sang (quelques secondes) sur animal vigile, maximum de 3 prélèvements espacés au moins de 10 jours.

Impact sur les animaux

Bien que les procédures proposées soient de classe légère et qu’aucune souffrance animale particulière ne soit attendue, la grille d'évaluation de la douleur nous permettra d'établir des points limites qui entraineraient la mise à mort des rats dès l'apparition de critères définis. Il n’est pas attendu que les injections/administration nécessaires pour l’anesthésie générale ou immunisation génèrent de la douleur particulière. De même, aucune perte de poids, inactivité, réduction de la mobilité, manifestation de stress notable ou de comportement anomal n’est attendue chez les animaux suite aux traitements envisagés.

Devenir

Les animaux des procédures 2 et 3 seront mis à mort, ce que le prélèvement d’organe oblige. Tous les animaux de la procédure 1 seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, ces animaux traités et immunisés peuvent difficilement être réformés pour d’autres expériences. Nous n’aurons par ailleurs pas d’autres utilisations possibles de ces animaux rarement utilisés dans nos projets.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les expériences in vivo d’immunisation et l’étude de l’immunogénicité par d’autres type d’expériences. En effet, aucune méthode alternative in vitro n’est disponible pour établir l’immunogénicité d’un candidat vaccin. Cependant le modèle animal envisagé reste un modèle de petit rongeur qui évitera l’utilisation d’animaux de plus grande taille.

Réduction

Le nombre de rats utilisés est réduit tout en conservant un minimum d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et interprétables. Le nombre d’animaux à utiliser a été déterminé avec l’aide d’un biostatisticien et des tests statistiques recommandés seront réalisés pour déterminer la significativité des résultats.

Raffinement

Bien que les expériences envisagées soient de classe légère et qu’aucune souffrance particulière ne soit attendue, la grille d'évaluation de la douleur nous permettra d'établir des points limites qui entraineraient la mise à mort des rats dès l'apparition de critères définis. Une réhydratation sous-cutanée avec NaCl (1ml) sera réalisée entre les épaules après chaque prélèvement sanguin. Les rats ne seront pas hébergés seuls, mais - 2 rats de 350 g/cage - 3 rats de 300 g/cage - 4 rats de 200 g/cage Après l’anesthésie générale, donnée par la méthode gazeuse, une surveillance renforcée sera planifiée jusqu’à ce que les animaux se réveillent.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale de choix pour valider les expériences précliniques réglementaires en vaccinologie en vue d’obtention des autorisations nécessaires pour réaliser des essais cliniques. Dans les essais envisagés, l’espèce animale doit être différente par rapport à celle chez laquelle le développement du produit a été réalisé, en l’occurrence souris. Un second rongeur de petite taille est parfaitement accepté pour les autorités réglementaires pour établir l’innocuité du produit. L’étude de l’immunogénicité est aisée chez ce petit rongeur, ce qui évite également l’utilisation d’animaux de plus grande taille. De nombreux outils immunologiques sont disponibles pour réaliser l’étude envisagée de façon complète. Par ailleurs, les rats Sprague Dawley ont été utilisés auparavant pour d’autres études impliquant des vecteurs lentiviraux. Nous avons donc une expérience précédente qui nous indique que ces animaux répondront bien à une immunisation par nos nouveaux candidats vaccins proposés. Les rats de 6 semaines d’âge seront commandés. Après au moins une semaine de stabulation, la première injection sera réalisée. Les rats de 7 semaines sont considérés comme adultes et leur système immunitaire sera mature à partir de cet âge pour répondre à l’immunisation envisagée.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour développer une leucodystrophie métachromatique, elles reçoivent la molécule Leriglitazone dans leur nourriture pendant deux à six mois et donnent jusqu'à six prélèvements de sang sous anesthésie. Le projet évalue si ce traitement freine la démyélinisation d'une maladie neurodégénérative mortelle, les bénéfices pour les patients restant au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe et que la souris est la seule espèce chez qui un modèle de cette maladie a été créé.

Objectifs

Nous avons pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule, la Leriglitazone, dans le traitement des patients symptomatiques souffrant de leucodystrophie métachromatique (MLD), maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (isolation de la gaine nerveuse). L’efficacité de la thérapie sera conduite In vivo dans un modèle de souris préclinique de MLD déjà connu.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Les patients MLD présentent des troubles sévères cognitifs et moteurs (perte de l’équilibre, trouble de la marche) qui sont un calvaire au quotidien et, dès l’apparition des premiers symptômes, l’état des patients se dégrade de façon fulgurante avec un décès certain dans les 2 ans au maximum. Le traitement à la Leriglitazone dont nous proposons d’évaluer l’efficacité, pourrait au niveau cellulaire diminuer la neuro-inflammations, diminuer les lésions cérébrales et prévenir la démyélinisation. Ces bénéfices pourraient s’accompagner au niveau clinique d’une amélioration des fonctions motrices et cognitives des patients et de ce fait soulager leur lourd quotidien et augmenter leur espérance de vie. Il est à savoir également que contrairement à d’autres traitements en cours d’études (comme la transplantation cellulaire), le traitement à la Leriglitazone est non invasif et facile d’administration car per os.

Procédures

Pour évaluer l’efficacité thérapeutique de l’administration orale de Leriglitazone sur le modèle murin de leucodystrophie métachromatique (MLD), le traitement à la Leriglitazone est administré en continu à partir de l’âge de 6mois (dans les croquettes ad libitum) pendant 2 mois ou 6 mois (2 temps d’analyse) avant l’euthanasie des animaux. Pour suivre en longitudinal les effets du traitement à la Leriglitazone, des prises de sang mensuelles sont effectuées. Le nombre de prise de sang est de 2 à 6 selon le temps d’analyse et groupe étudié (à 6 et 7 mois ; ou à 6,7,8,9,10 et 11 mois). Ces prises de sang sont réalisées sous anesthésie et ne durent que 2 minutes au maximum par animal. Durant toute la durée de l’anesthésie, la souris est placée sur un tapis chauffant afin d’éviter un éventuel début d’hypothermie, dont le risque reste faible aux vues de la durée de l’anesthésie qui est de 2 minutes au maximum.

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable concerne le stress que pourrait engendrer les prises de sang mensuelles sur l’animal. Le traitement à la Leriglitazone devrait améliorer quant à lui le phénotype des souris.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologiques et biochimiques) sont nécessaires post-mortem.

Remplacement

À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la leucodystrophie métachromatique (MLD). Nous avons donc besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier cette maladie et surtout évaluer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. La prise par voie orale nécessite aussi de tester la voie digestive comme voie d’administration, il faut donc un organisme pour tester ce type de traitement.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façons à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un nombre de 12 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables et adéquats pour analyser nos résultats. Un nombre total de 144 souris (comprenant 2 répétitions des expériences par groupe) sera nécessaire pour ce projet. Nous avons décidé également de ne pas ajouter un groupe contrôle supplémentaire à notre étude car ces données ont déjà été publiées.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress (anesthésie pour les prises de sang, manipulation en amont de la procédure pour une habituation au manipulateur, prise de poids mensuelle). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et d'un enrichissement du milieu à l’aide de carré de coton, lanières de kraft et de maison de type celldom. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et de soins adaptés.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la leucodystrophie métachromatique (MLD) et surtout évaluer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu de MLD qui est génétiquement modifié, dont le phénotype est très proche de ce que l’on retrouve chez les patients. Notre projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de l’administration de Leriglitazone sur notre modèle murin de MLD lorsque les symptômes sont installés, en vue d’une thérapie pour le traitement de patients MLD symptomatiques. Pour cela, les animaux entreront en procédure à 5mois et 2 semaines (pour une acclimatation et habituation au manipulateur) avant le début du traitement qui sera administré à partir 6 mois, âge auquel débutent des premiers symptômes chez la souris. La fin de la procédure aura lieu lorsque les souris auront 8 ou 12 mois afin de déterminer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone sur le court et long terme.

11 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de souffrance légère pour cet établissement, qui n'assure que l'hébergement post-opératoire. Un second établissement leur incise le foie et la peau pour y déposer une poudre hémostatique à base d'alginate dont le projet suit la résorption, à titre de preuve de concept d'un futur dispositif médical. Les lapins sont pesés puis tués à deux, treize et vingt-six semaines pour prélever le foie et le muscle. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reproduire in vitro les organes et les fluides corporels.

Objectifs

Le pansement idéal n’existe pas. Mais il doit présenter certaines caractéristiques : maintenir la plaie en milieu humide et chaud, être modifié selon les stades de cicatrisation, être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, ne pas être toxique et être hypoallergénique, protéger des chocs, être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanées et très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies capillaires dites « en nappe », des hémostatiques chirurgicaux résorbables sont utilisés comme traitement. L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate sous forme de poudre, et de suivre sa résorption et son impact au niveau du tissu lésé et des zones proches. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire et sous-cutané en cours de chirurgie et d’observer sa résorption à la surface du tissu lésé à différents temps post-opératoire. En plus de la preuve de concept sur un organe intra-cavitaire, nous voulons observer le taux de résorption de la poudre hémostatique sur un tissu non lésé (muscle). Pour cela, l’établissement 1/2 réalisera une incision cutanée et introduira entre le plan sous-cutané et le plan musculaire un volume équivalent à celui appliqué sur le foie. Le plan musculaire sera prélevé pour histologie aux mêmes temps que pour le foie. Cette manipulation permet ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisé.

Bénéfices attendus

Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit (sous format de poudre) sur le saignement d’un organe intra-abdominal comme le foie et sur un tissu non lésé (muscle) mais aussi de suivre la résorption du produit dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) pour le traitement des plaies chirurgicales et qui ne nécessite pas son retrait avant fermeture de l’incision chirurgicale comme les pansements actuels commercialisés.

Procédures

Les animaux seront pesés régulièrement. La pesée est un acte de courte durée. Après euthanasie des animaux, des prélèvements des zones d’intérêts seront réalisés afin de pouvoir effectuer les analyses demandées. Ces prélèvements seront de courte durée et ne seront réalisés qu’une seule fois par animal puisqu’ils seront in fine euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux pour la partie chirurgie sont développées dans la DAP de l’établissement n°1/2. Dans notre établissement, les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à l’arrivée dans un nouvel environnement, stress dû à la contention pour la réalisation des pesées et de l’anesthésie précédant la mise à mort.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort, soit parce qu’ils auront atteint un point limite soit parce qu’ils auront atteint le temps du prélèvement final : J+2 semaines établissement n°1/2, J+13 semaines et J+26 semaines établissement n°2/2. L'étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée et nécessite le prélèvement du foie. Pour obtenir ces prélèvements, il est nécessaire que les animaux soient mis à mort au préalable.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu lésé et de suivre sa résorption sur un tissu lésé et un autre non lésé. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique sous forme de poudre, permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire et cutanés en cours de chirurgie et d’observer son intégration sur le tissu à différents temps post-opératoire. Il est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

11 animaux seront utilisés au total, dont 9 animaux répartis en 3 groupes (3 animaux par groupe). Il y a 2 animaux supplémentaires prévus afin de compléter l’un des groupes si nécessaire. Ce nombre a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Etant donné que c’est une preuve de concept, il n’y a pas besoin de plus 3 animaux par groupe pour obtenir la réponse au questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et amène à faire une intervention chirurgicale pour l’arrêter, le projet pourra être stoppé sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, l’Etablissement n°1/2 a d’abord développé la voie chirurgicale dans leur structure sur des animaux décédés, issus de procédures antérieures. Dans un principe de réduction, sur le même animal, une incision cutanée de 1,5 cm sera faite sur le flanc opposé et à distance de l’abord hépatique pour déposer une quantité de poudre hémostatique équivalente à celle mise sur le foie afin de mesurer le taux de résorption sur un tissu non lésé. Il s’agit d’une preuve de concept, ce faible nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats suffisants pour cette étape du projet.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement chez nous (établissement n°2/2), les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : foin/paille, bois à ronger, chaînette, de quoi se cacher et grimper…). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Des pesées de suivi seront également réalisées à des fréquences adaptées. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal.

Choix des espèces

Le lapin est un animal de taille intermédiaire, dont le foie a une suffisante pour supporter les scarifications prévues et l’implantation de la poudre hémostatique (le produit) en quantité suffisante pour obtenir l'effet pharmacologique souhaité (hémostatique). Les animaux seront réceptionnés dans l’établissement n°1/2 à 2,5-3 kg environ pour atteindre 3,5-4 kg environ (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de bénéficier d’une taille permettant la chirurgie sur le foie.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Anesthésiées jusqu'à une fois par semaine pendant quarante minutes, elles sont posées par deux sur des cages de moustiques pour servir de repas sanguin vivant destiné à maintenir six populations de moustiques en élevage. Le porteur décrit une réaction immunitaire à la salive des insectes et une anémie liée aux piqûres, surveillées par une pesée hebdomadaire. Il qualifie l'usage des souris de "gold standard" et affirme que les poches de sang ne produisent pas d'œufs en quantité et qualité acceptables.

Objectifs

Afin de pouvoir étudier la capacité de transmission de virus par différentes populations de moustiques, nous devons pouvoir maintenir en élevage ces insectes sur plusieurs générations. L’obtention d’œufs de moustiques et le développement ultérieur de ces œufs en larves, puis en nymphes et ensuite en adultes repose sur le prélèvement régulier de sang de mammifères par les moustiques femelles adultes (hématophages). La prise d’un repas sanguin leur est indispensable pour pouvoir pondre leurs œufs. Un moustique femelle prélève environ de deux à quatre microlitres de sang. Après un délai de 48 à 72 h, la femelle pond une cinquantaine d’œufs. Ces œufs peuvent ou ne peuvent pas, selon les espèces, être conservés un certain temps à sec avant d’être mis à éclore pour générer de nouveaux adultes.

Bénéfices attendus

Tous les projets de recherche de notre unité ont pour base l’étude de la capacité de certaines populations de moustiques à s’infecter, ou non, et transmettre des virus pathogènes pour l’homme ou des animaux. La compréhension de ces systèmes permet d’évaluer et d’anticiper la survenue d’épidémie. Notre époque, avec les dérèglements climatiques, la pollution, les déforestations, l’utilisations de pesticides et d’insecticides, entrainent des modifications qui impactent fortement les insectes et augmentent les risques d’émergence de virus. L’utilisation des souris comme source de sang pour les moustiques est un « gold standard » pour produire suffisamment d’œufs qui seront destinés aux études des systèmes vectoriels. En effet, chaque combinaison moustique-virus varie selon l’origine géographique de la population de moustiques et du génotype/sérotype de virus. La connaissance de l’efficacité de chaque combinaison est importante pour mesurer le risque épidémique. Même si une espèce de moustique a une distribution très large englobant la ceinture tropicale et parfois tempérée, chaque population géographique peut présenter une réceptivité différente vis à vis d’un même virus. De façon similaire, un virus existe sous forme de différents sérotypes et génotypes et tous ne présentent pas la même efficacité à infecter une même espèce de moustique. Donc la combinaison moustique-virus est unique. En général, les moustiques à l’origine des épidémies sont minoritaires (moins de 15% des 3500 espèces de moustiques) mais sont omniprésents dans l’environnement urbain. Ces moustiques sont des espèces invasives fortement adaptés à l’homme et qui voyagent avec l’homme et les marchandises. Ils ont la propriété de pouvoir se reproduire en cage et se nourrir en captivité sur animaux dont les souris. Ces caractéristiques ont permis des avancées majeures dans la connaissance des maladies vectorielles affectant la santé de l’homme (dengue, chikungunya, fièvre jaune et Zika) et de ce fait, il a été possible d’élaborer des stratégies de contrôle efficace.

Procédures

Les souris seront anesthésiées au maximum une fois/semaine pendant 40 min par injection d’un mélange de Xylazine + Ketamine, puis seront placés sur des cages de moustiques d’élevage pendant 30 min. Une injection de solution de chlorure de sodium 0,9% sera pratiquée après chaque anesthésie.

Impact sur les animaux

Les souris sont anesthésiées avant d’être positionnées sur les cages d’insectes dans l’insectarium à 25 ou 28°C, selon l’espèce. La piqure par les femelles de moustiques engendre une légère réaction immunitaire due au contact de la salive injectée par l’insecte au moment de la prise de sang. Il n’y a pas de démangeaison cutanée constatée. A son réveil, les souris ne se grattent pas et ont un comportement normal. L’anémie due au prélèvement du sang (2 à 4 µL / moustique) est prise en compte en limitant le temps de contact et donc le nombre de piqure. Une pesée hebdomadaire des animaux, au moment du change, permet de détecter une éventuelle perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Les moustiques femelles étant hématophages, il est impossible de les maintenir en élevage sans avoir recours à du sang. Le sang apporte les substances nutritives indispensables à la fabrication des œufs. Dans la nature, les sources de sang sont des vertébrés (oiseaux, mammifères ou humains) avec lesquels les moustiques cohabitent. Au sein du laboratoire, les sources de sang les plus biologiquement pertinentes sont les souris ou les lapins de laboratoire. Dans le présent projet visant à maintenir des populations de moustiques sains en élevage, les souris de laboratoire ont été identifiées comme des sources régulières de sang. Le recours à l’animal est nécessaire car l’utilisation d’autres sources de sang (poche de sang, globules rouges lyophilisés) ne permet pas la production d’œufs de qualité et en quantité acceptables pour les infections réalisées ultérieurement.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulement du projet tient compte : - des six espèces de moustiques de différentes origines à maintenir en élevage ; - des nuisances occasionnées par les piqures des moustiques femelles (anémie, réaction immunitaire à la salive) et par des anesthésies répétées. Dix cages de six souris femelles IOPS maintenues et renouvelées quatre fois/an est selon notre expérience la quantité minimale d’animaux pour un préjudice moindre. Il faut toujours mettre deux souris anesthésiées sur une cage pour laisser le « choix » de l’animal aux femelles (préférences d’attractivité) et diminuer le nombre de piqure par animal. Il y a en moyenne toujours 6 à 8 populations de moustiques en élevage. Un lot de six souris ne sera anesthésié qu’une fois par semaine. La présence de six lots permet un temps de récupération indispensable au bien-être des animaux.

Raffinement

Les souris sont déposées sur les cages une fois anesthésiées, toujours par deux, quel que soit la taille de la cage et le nombre de moustiques femelles, pendant un temps de contact variable, allant de cinq minutes à quinze minutes. Le temps de contact est décidé en fonction du nombre d’insectes par cage, de leur âge et de leur espèce (comportement de piqûre différent). Nos connaissances en entomologie nous permettent d’apprécier ces différents paramètres. Un même binôme de souris peut être déposé successivement sur deux cages au plus, soit trente minutes d’exposition maximum. La pommade Ocry-gel, un produit de soin oculaire destiné à la lubrification des yeux des animaux sera appliquée aux yeux des souris anesthésiées. Un volume de 0,15 mL d’une solution de chlorure de sodium à 0,9% sera injecté en sous cutané pour prévenir la baisse volumique. Ensuite, les souris sont placées dans une cage posée sur un tapis chauffant, avant leur réveil pour compenser la baisse de température de l’animal due à l’anesthésie. Les souris réveillées sont ensuite remises dans leurs cages. Il n’a jamais été observé de démangeaison chez les rongeurs mais l’application d’une crème apaisante type Quotane 0,5% sur les régions exposées sera faite si nécessaire,. Les animaux (marquage par traits sur la queue) seront pesés chaque semaine, au moment de leur change, afin de détecter une éventuelle perte de poids signe de mauvaise santé. Les cages d’hébergement sont pourvues d’enrichissement, avec eau et nourriture à volonté.

Choix des espèces

Le choix des souris est justifié par leur facilité d’approvisionnement, leur qualité sanitaire, l’absence de démangeaison (aucune observation de grattage des parties exposées) après piqûre par les moustiques, leur petite taille qui rend possible : - leur stabulation en nombre suffisant ; - leur mise en contact des insectes sur les cages. Les femelles sont âgées de 4 à 5 semaines et ont un poids de 20/22g à leur arrivée. Après la période d’acclimatation elles atteignent 30g, poids à partir duquel on peut les anesthésier et les présenter aux moustiques.