Procédures légères
Effet d’une stimulation non invasive sur l’insuffisance cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une insuffisance cardiaque induite par délétion d'un gène, elles reçoivent des injections de tamoxifène, sont maintenues chaque jour dans un tube de contention pour une stimulation électromagnétique pendant trois à quatre semaines, puis subissent une échocardiographie sous anesthésie avant la mise à mort pour prélever le cœur. Le porteur indique un stress lié à la contention, atténué par une habituation préalable. Il présente cette stimulation non invasive comme une piste transposable à l'humain et affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la régulation cardiaque intégrée.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une pathologie sévère caractérisée par une incapacité du cœur à assurer sa fonction de pompe et à irriguer correctement les organes périphériques. Ainsi, une modification des propriétés contractiles et une altération de l'architecture cellulaire du muscle cardiaque conduisent à des phénomènes de remodelage cardiaque (hypertrophie/dilatation) aboutissant dans un deuxième temps à l'insuffisance cardiaque. Bien que la transplantation cardiaque demeure le seul traitement radical, la pénurie de donneurs et les complications d’une lourde immunosuppression en limitent nécessairement les indications. L’assistance ventriculaire mécanique reste principalement une solution temporaire dans l’attente d’une transplantation et la resynchronisation bi-ventriculaire ne s’adresse qu’à une catégorie ciblée de patients. Il y a donc un besoin réel d’options thérapeutiques nouvelles et c’est dans ce cadre que s'inscrit notre projet de stimulation électromagnétique répétée de basse intensité (LI-rMS) avec pour objectif premier d’améliorer la fonction cardiaque chroniquement défaillante. Ses principes reposent sur l’induction de manière non invasive et de manière focale des courants électriques dans des régions endommagées, et ceci en fonction de la fréquence et de la durée de la stimulation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en place et valider l'effet potentiellement bénéfique de la stimulation électromagnétique répétée de basse intensité (LI-rMS) avec pour objectif premier d’améliorer la fonction cardiaque chroniquement défaillante. A plus long terme nous pensons que cette stratégie serait transposable chez l'Homme.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront: 1) 3 injections de tamoxifène (1 injection par jour) la durée de l'intervention est de 15 secondes par souris. 2 ) Stimulation éléctromagnétique (la durée de la stimulation est de 10 minutes quotidienne, pendant 21 ou 28 jours successives selon les groupes de souris avec une fréquence de 20Hz ou 40Hz. 3) Echocardiographie réalisé en dernière étape de la procédure sous anethésie (durée environ 30 minutes, 5 mesures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables consistent en une réduction de la fonction cardiaque chez les souris suite à la délétion du gène étudié. La contention pour l'injection de tamoxifène et l'utilisation d'un tube à contention pour la stimulation éléctromagnétique pourrait générer du stress à l'animal, cependant le même expérimentateur sera chargé de l'acte et les souris seront préalablement habituées à la personne et le tube de contention.
Devenir
L'ensemble des animaux (n=180) sera euthanasié suite à cette procédure après la dernière étape d'echocardiographie, le tissu cardiaque sera prélevé pour des analyses morphologiques et moléculaires et ceci afin d'évaluer les effets potentiellement bénéfiques de la LI-rMS sur le coeur au niveau morphologique et moléculaire.
Remplacement
Seules des études sur les animaux permettent de savoir si l’inactivation ou la surexpression d’un gène ont un impact sur le remodelage et la fonction cardiaque. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire de manière intégrée la régulation physiologique et métabolique des paramètres cardiaques.
Réduction
L’utilisation du même matériel biologique pour 3 types d’analyse (morphologie, ARN et protéine) permet de diviser par trois le nombre de souris nécessaire. Le principe de réduction est appliqué par le calcul de puissance statistique de nos test basés sur des expériences de même type dans d’autres modèles de souris qui nous permettent de réduire à 15 souris par groupe, le nombre de souris utilisées. Ce projet nécessitera l’utilisation de 90 souris de la lignée SRF ainsi qu'un nombre équivalent en souris contrôle. Ainsi 180 souris sont prévues pour l'ensemble du projet.
Raffinement
Les souris seront maintenues en cages (5/cages) et suivies par un personnel compétent et le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.La stimulation la stimulation électromagnétique de basse intensité (LI-rMS) sera précédée par une étape d'adaptation et d'habituation des souris au tube de contention afin de minimiser les phénomènes de stress. L’évolution du phénotype des souris sera surveillée par des personnes compétentes selon une grille de suivi qui sera mise en place. L'administration d’analgésique sera envisagée en cas de besoin. Enfin, la définition du point limite est clairement établie à partir d’un seuil d’insuffisance cardiaque observé qui déclenchera l’arrêt de l’expérience et l’euthanasie
Choix des espèces
La souris a été sélectionnée pour la possibilité de générer par recombinaison homologue ou transgénèse des modèles d’invalidation ou surexpression du gène. Les animaux utilisés auront entre 2 et 4mois d'âge (considéré comme l'âge où le coeur a fini sa croissance et represente les caractéristiques d'un coeur adulte) au début de la procédure. Les souris seront maintenues en cages (5/cages) et le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.
Alimentation des chiots en croissance
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
125 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés en vie. Des chiots reçoivent des aliments à tester et subissent des prises de sang hebdomadaires et des collectes d'urine, pour évaluer l'appétence et la tolérance digestive de formulations commerciales. Le porteur affirme que le protocole "n'entraîne ni douleur ni souffrance" et suit un standard américain de l'industrie (AAFCO). Il conclut qu'aucun modèle ne peut approcher la digestion d'un aliment complet chez le chien et que des essais in vivo restent "nécessaires".
Objectifs
Pour évaluer la bonne prise alimentaire et la tolérance des aliments chiots il est nécessaire de procéder à des évaluations. Pour être complets, ces tests doivent comprendre le suivi clinique, pondéral et alimentaire des animaux, ainsi qu’une évaluation de la tolérance digestive, des mesures d'odeur de selles, des analyses d'urines et des paramètres sanguins.
Bénéfices attendus
Connaissances sur les besoins nutritionnels et le comportement alimentaire des chiots en croissance. Formulation de produits au plus près des besoin des chiots pour leur garantir une appétence et une tolérance digestive optimales. Identification de nouvelles solutions nutritionnelles.
Procédures
La recolte d'urine et prise de sang seront faites avec les animaux vigiles. Une analyse de la biochimie sanguine au maximum une fois par semaine et par animal. Les paramètres pour les prises de sang incluent les mesures de la fonction rénale et hépatiques (urée, créatinine, phosphatase alcaline, albumine, gamma glutamyl transférase, glutamate-pyruvate transaminase, protéine totale, cholestérol, globuline, et bilirubine totale). L’hématologie inclura la numération des hématies et le dosage de l’hémoglobine, numération des globules blancs et plaquettes. Une analyse d’urines (couleur, turbidité, pH, protéine totale, glucose, cétones, bilirubine et sang, densité spécifique et sédiment) pourra être réalisée à la discrétion du vétérinaire. La collection d’urine se fera par collecte libre (free-catch): les urines émises par mictions spontanées sont collectées grâce à des boxes spécialement aménagés munis de plans inclinés, et récoltées dans des collas. Pendant les sorties d'exercice, les urines sont collectées directement lors de la miction. La récolte des urines se fait sur un maximum de 3 jours, seulement sur des chiots en fin de croissance (> 8 mois), et au maximum 1 fois par quinzaine (3 jours d'urines collectées tous les 15 jours). Lors de prises de sang, le volume minimum nécessaire (comme spécifié par les laboratoires d’analyses) pour analyse les marqueurs sera prélevé : 4ml/prise (sans exceder 15 % du volume sanguin sur une période de 28 jours). La prise de sang sera fait par un vétérinaire et si l’animal ne se débat pas: -sur la phase de prélèvement uniquement : 15 secondes (maximum 30 secondes) -En incluant la phase de contention, de tonte, de désinfection et de prélèvement 2 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. Le stress éventuel lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie et recevront un suivi vétérinaire et des soins adaptés à leur état de santé.
Remplacement
Le protocole et les procédures utilisés sont conformes aux standards définis par l'AAFCO ( Association of American Feeding Control Officials) et suivent le processus normal d’évaluation des projets R&D. De plus, aucune autre étude ne peut être utilisée comme alternative à celle actuellement en place. Le protocole a pour objectif d'évaluer l'appétence et la tolérance digestive d'aliments destinés aux chiots en croissance. A ce jour, il n’existe pas de modèle qui puisse approcher la digestion, absorption et métabolisation d’un aliment complet dans cette espèce. Il est donc nécessaire de passer par des essais in vivo au cours desquels les chiens reçoivent la formulation d’aliment à évaluer.
Réduction
Le nombre d'animaux inclus pour chaque étude est issu de la recommandation américaine lors de la réalisation d’un protocole dit "AAFCO" (Association of American Feeding Control Officials) utilisé par l’intégralité de la profession, soit 1 lot de 10 chiots ou chatons issus au minimum de 3 différentes mères. 10 chiots inclus au début de l’étude pour avoir au moins 8 retenus à la fin.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. L'état d'anxiété lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.
Choix des espèces
Chaque espèce animale possède son propre métabolisme, ses propres performances digestives , ainsi que ses propres préférences alimentaires et facteurs d’appétence pour un aliment donné. Il est donc important d’utiliser les espèces auxquelles les aliments sont destinés. Il n’existe pas à ce jour de modèle qui puisse approcher la tolérance digestive ainsi que de prédire l’appétence d’un aliment complet chez le chien. Il faut donc passer par des essais in vivo au cours desquels les chiots reçoivent la formulation de l’aliment à évaluer. Des études in vitro n’apporteraient aucune information pertinente. Stade chiots : de 2 à 12 mois pour les chiens de moins de 25 kg à l'age adulte et de 2 à 18 mois pour les chiens de plus de 25 kg à l'age adulte, la croissance étant plus longue chez les chiens de grandes races. Indépendemment de l'âge, les chiots devront peser plus de 500g pour être inclus dans ce projet.
Développement d’un vaccin contre l’hépatite à corps d’inclusion et le syndrome hépatite-hydropéricarde du poulet
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
1 450 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour une partie et sévère pour la majorité, 440 étant ensuite placés et le reste tué pour autopsie. Une partie est infectée par un adénovirus pathogène et une autre vaccinée, avec des prises de sang répétées, pour mettre au point un vaccin destiné aux élevages de reproducteurs. Le porteur indique que la maladie provoque léthargie, perte d'appétit et un pic de mortalité de 5 à 10 %, et précise qu'aucune anesthésie ni analgésie n'est possible pour ne pas fausser l'évaluation du produit. Il affirme que la réglementation impose de tester le vaccin sur l'espèce cible et qu'aucune méthode in vitro ne peut remplacer ces essais.
Objectifs
La prévention des adénoviroses des poulets repose sur une vaccination des reproducteurs à l’aide de vaccins vivants et inactivés. Certaines souches virales ne sont pas couverte par les vaccins utilisés sur le terrain. L’objectif du projet est la mise au point d’un nouveau vaccin efficace contre ces adénoviroses.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la prévention de cette maladie par la vaccination des reproducteurs grâce à un nouveau vaccin adapté aux nouvelles souches d'adénovirus apparues récemment.
Procédures
pour 120 animaux: injection de virus pathogène (2 secondes); pour 40 animaux : vaccination ( 2 secondes); Pour 40 animaux: vaccination (2 secondes), 2 prises de sang à 3 semaines d'interval (15 secondes); Pour 810 animaux: 2 prises de sang (15 secondes), injection de virus pathogène (2 secondes); Pour 440 animaux: 8 prises de sang à 4 semaines d'intervalles (15 secondes).
Impact sur les animaux
Les maladies engendrent de la léthargie, de l'inappétence associé avec un pic de mortalité brutal de 5 à 10% pendant quelques jours.
Devenir
P1 : euthanasie car les animaux sont contaminé par un virus pathogène P2 : euthanasie pour autopsie P3: euthanasie pour autopsie P4: euthanasie car les animaux sont contaminé par un virus pathogène P5: placement des animaux
Remplacement
Les essais d'innocuité et d'efficacité ne peuvent être réalisés que sur animaux. Ils sont réalisés sur l'espèce cible qui est le poulet, aucune étude in-vitro utilisable pour remplacer ces essais n'existe.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum afin de respecter les normes réglementaires pour que les résultats des études soient acceptables par les autorités de santé évaluant le dossier.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les mesures suivantes sont appliquées : - Respect des normes d’hébergement (taille des cages, densité etc.) spécifiées dans la directive 2010 63 UE ; -Application de conditions d’ambiance en accord avec l’âge et l’espèce (température, éclairage, hygrométrie) - Fourniture d’eau et d’aliment (adapté aux besoins d’entretien ou de croissance des poulets) sans restriction - Manipulation des poulets dans des box isolés prévus à cet effet par du personnel qualifié -Mise en place d’un suivi clinique rapproché par le vétérinaire responsable de l’essai -Mise en place d’une procédure d’évaluation des points limites permettant d’euthanasier les animaux de façon anticipée - Mise à disposition de système d'enrichissement du milieu (type perchoirs). Afin de ne pas interférer avec l'evaluation du produit, il n'y a pas d'anesthésie / analgésie possible.
Choix des espèces
Il s’agit de l’espèce cible du vaccin, sensible à l'adénovirues, permettant d’apporter les informations les plus pertinentes. La réglementation impose de réaliser les essais sur cette espèce cible Les animaux sont utilisés à partir de 7 jour d'âge pour l'essai d'efficacité par épreuve. Les adénovirus touchant les animaux dès 7 jours de vie, les épreuves par challenge doivent être réalisées au plus tôt (ils deviennent moins sensibles par la suite). Pour l'essai d'innocuité, ils seront utilisée à 8 semaines d'âge, qui est l'âge minimum d'utilisation du vaccin (ce test doit être fait à cet âge minimum selon la pharmacopée européenne). Pour l'essai d'efficacité par sproérologie, les animaux utilisés ont 10 semaines d'âge, qui est l'âge moyen de première injection du vaccin développé
Vers le développement d’une nouvelle stratégie vaccinale anti-tumorale: étude de l’induction de réponses immunitaires efficaces par des nanoparticules dérivées de virus de plantes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une à deux injections de nanoparticules dérivées d'un virus de plante et des injections de cellules, ainsi que jusqu'à dix prélèvements sanguins sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique une réaction inflammatoire locale de courte durée au point d'injection. Les retombées annoncées, une nouvelle stratégie de vaccination contre le cancer, sont renvoyées à un projet ultérieur, et il affirme qu'un "organisme animal" est "nécessaire" pour démontrer l'initiation d'une réponse immunitaire.
Objectifs
Depuis plusieurs années de nouvelles innovations révolutionnent et complètent l’arsenal de thérapies anti-tumorales. En effet, si les thérapies classiques comme la chimiothérapie ou la radiothérapie peuvent être efficaces elles affectent aussi les cellules saines non cancéreuses et sont responsables de lourds effets secondaires. De plus, certaines tumeurs développent même une résistance aux traitements. C’est pourquoi la recherche de stratégies thérapeutiques se poursuit en s’appuyant sur la compréhension des interactions entre les cellules du système immunitaire et les cellules cancéreuses. En particulier, il existe une population de cellules immunitaires qui sont de véritables chefs d’orchestre car elles sont capables d’induire et de contrôler une réponse immunitaire conduisant à la destruction des cellules tumorales mais pas des cellules saines. Alors développer des traitements qui ciblent ces cellules d’intérêt essentielles à la réponse immunitaire anti-tumorale est une stratégie thérapeutique prometteuse. Les nanoparticules sont des objets de petite taille (10-100 nm) et de composition variable (protéines, lipides…) qui peuvent pendant ou après leur synthèse être modifiés pour enfermer ou exposer différentes molécules d’intérêt (par exemple une molécule de ciblage et un agent thérapeutique). Les nanoparticules suscitent donc un grand intérêt pour des applications en vaccination antitumorale. Ce projet vise à étudier le potentiel thérapeutique d’une nouvelle nanoparticule protéique non-toxique dérivée d’un virus de plante qui peut renfermer à l’intérieur et/ou exposer à sa surface des molécules permettant son ciblage aux cellules d’intérêt et son activité anti-tumorale. Les molécules internalisées et exposées par cette nanoparticule peuvent être facilement remplacées par d’autres molécules ce qui permet de moduler la composition de la nanoparticule pour l’adapter au mieux à chaque type de cancer. Ici, nous souhaitons, en amont d’études sur des modèles de tumeurs, étudier si cette nanoparticule est capable de cibler les cellules d’intérêt et d’induire correctement une réponse immunitaire spécifique et robuste. Si les résultats sont concluants, nous mettrons en place un autre projet qui aura pour objectif d’étudier la capacité de cette nanoparticule à induire la destruction des cellules tumorales.
Bénéfices attendus
La nanoparticule plateforme de vaccination anti-tumorale de cette étude constitue une innovation intéressante qui pourrait enrichir les stratégies existantes pour lutter contre le cancer. En effet, si aujourd’hui les nouvelles immunothérapies ont certes permis d’améliorer la rémission de certains patients, d’autres demeurent résistants à ces composés. Pour ceux-ci, utiliser des nanoparticules innovantes seules ou en combinaison avec d’autres composés thérapeutiques déjà existants pourrait constituer une alternative thérapeutique. Par ailleurs, la fonctionnalisation de la nanoparticule utilisée dans cette étude est facilement modulable ce qui est un atout pour envisager des applications dans différentes pathologies tumorales.
Procédures
Au cours de l’expérimentation, les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques. Ils recevront : une ou deux injections de nanoparticules par voie intradermique dans l’oreille ou par voie sous-cutanée dans le flanc ainsi qu’une ou deux injections de cellules par voie intraveineuse. Par ailleurs, jusqu’à 10 prélèvements sanguins seront effectués. Ces trois types d’interventions (injections de nanoparticules ou de cellules et prélèvements de sang) seront tous réalisés sous anesthésie générale par un personnel compétent, habitué et formé au bien-être animal. L’anesthésie générale sera réalisée par induction gazeuse et durera 10 minutes pour les injections de nanoparticules, 1 minute pour les injections de cellules et 10 minutes pour les prélèvements sanguins. Par ailleurs pour les injections intraveineuses, l’anesthésié générale gazeuse sera complété d’une anesthésie locale au niveau du point d’injection. Les animaux se réveilleront rapidement (2 à 3 minutes) et en douceur de leur anesthésie. Les transferts de cellules se basent sur des protocoles largement décrits dans la littérature et sont des outils pour l’étude des caractéristiques de la réponse immunitaire provoquée par l’injection des nanoparticules. Les prélèvements sanguins quant à eux permettront de suivre au cours du temps dans le sang des animaux des marqueurs d’activation du système immunitaire comme par exemple, la production d’anticorps. Ils seront d’un volume adapté à la fréquence des prélèvements pour laisser le temps à l’organisme de l’animal de régénérer tout son volume sanguin avant le prélèvement suivant.
Impact sur les animaux
Les impacts cliniques prévus sur les animaux inclus dans cette étude sont décrits ci-dessous. Les injections de nanoparticules peuvent localement au niveau du site d’injection (oreille ou flanc) provoquer un une réaction inflammatoire locale courte et de faible amplitude qui pourrait causer une souffrance limitée (démangeaisons, rougeur cutanée, croûte) pour l’animal pendant au plus 2 jours. Dans de très rares cas, une infection pourrait survenir au niveau du site d’injection. La non-toxicité des nanoparticules a été vérifiée en amont ainsi, en elles-mêmes, les nanoparticules injectées ne seront pas sources d’effets indésirables. Les injections intraveineuses de cellules peuvent être la source du même genre de nuisance. Les cellules injectées proviendront d’animaux compatibles donc aucune réaction de rejet n’est à prévoir. Les prélèvements sanguins répétés (au plus 10) seront suffisamment espacés et d’un volume adapté pour laisser au temps à l’organisme de l’animal de regénérer son volume sanguin. Ainsi les animaux ne devraient que très légèrement être affaiblis par la réduction transitoire de leur volume sanguin. Après le prélèvement, au niveau du point de prélèvement du sang, une croûte pourrait se former et démanger l’animal, cette dernière devrait se résorber rapidement. Enfin toutes les manipulations répétées des animaux préalables aux injections et aux prélèvements sanguins peuvent être sources de stress. Pour limiter le stress et la douleur occasionnés par les injections et les prélèvements sanguins, les animaux seront placés sous anesthésie générale gazeuse parfois complétée avec une anesthésie locale au niveau du site d’injection. Les animaux seront toujours manipulés par du personnel compétent, habitué et sensibilisé au bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en sacrifice terminal en vue de récupérer les organes afin d’analyser les effets de la nanoparticule candidate sur la réponse immunitaire.
Remplacement
Lors d’études préliminaires in vitro nous avons obtenu des résultats très encourageants qui démontrent que les nanoparticules fonctionnalisées sont des outils prometteurs pour adresser spécifiquement une molécule bioactive aux cellules ciblées capables ensuite in vitro d’être fonctionnelles. Si ce type d’étude in vitro est une première étape pour la validation du potentiel thérapeutique des nanoparticules, il ne permet pas de démontrer qu’une réponse immunitaire est correctement initiée. Pour ces études, le recours à un organisme animal, dans lequel les cellules immunitaires interagissent entre elles de façon complexe au sein d’organes, est nécessaire. Nous pourrons alors étudier à l’aide de différents paramètres ou marqueurs la capacité des nanoparticules fonctionnalisées à favoriser l’initiation et le maintien d’une réponse immunitaire spécifique et robuste.
Réduction
Le nombre total de souris utilisées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Il est prévu de réaliser chaque expérimentation 4 fois afin de s’assurer que les effets observés soient constants et reproductibles d’une expérimentation à l’autre. Pour chaque condition testée, 3 animaux seront inclus par expérimentations pour atteindre au plus 12 souris par groupe. Si dès la troisième répétition d’expérience (effectif de 9 animaux) des effets sont mis en évidence par les tests statistiques alors nous ne réaliserons pas la quatrième répétition, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adéquats qui permettront de mettre en évidence sur tous les paramètres étudiés des différences entre les groupes de souris (par exemple entre la nanoparticule d’intérêt et la nanoparticule contrôle ou entre la voie intradermique et la voie sous-cutanée pour les injections de nanoparticules).
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes dans des cages enrichies avec l’ajout de nids et de bâtons à ronger. Les animaux seront surveillés et manipulés par des personnes compétentes et formées au bien-être animal. Quotidiennement, leur état général sera surveillé afin de déterminer l’éventuelle présence de signes de stress ou de souffrance (attitude prostrée, dos voûté, démarche anormale, …). En cas d’atteinte d’un des points limites l’arrêt anticipé de l’expérimentation sera alors décidé. Les injections (intradermiques, intraveineuses, sous-cutanées) et les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Par ailleurs, dans le cas des injections par voie intraveineuse l’anesthésie générale sera complétée d’une anesthésie locale au niveau du site d’injection.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont des mammifères dont le système immunitaire est très proche du système immunitaire humain tant du point de vue des caractéristiques des cellules immunitaires que des mécanismes globaux. En particulier, la type de cellules que nous souhaitons cibler dans cette étude est décrite avec des caractéristiques proches chez l’homme et chez la souris. Ainsi, pour nos études précliniques, la souris est un modèle de choix. Nous utiliserons des souris adultes jeunes (2 à 7 mois) qui possèdent un système immunitaire mature et fonctionnel.
Etude de l’inflammation dépendante des mastocytes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles subissent trois modèles d'inflammation provoquée, cutanée aux oreilles par application d'acide arachidonique, rénale et arthritique, avec des injections répétées et des prélèvements de sang et d'urine, avant la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique attendre gonflement, douleur articulaire et mobilité réduite, une buprénorphine étant prévue en analgésie. Il affirme avoir déjà caractérisé l'enzyme visée in vitro mais conclut que le remplacement complet par des méthodes sans animaux est "impossible", l'inflammation étant décrite comme un processus trop complexe.
Objectifs
L'inflammation est un mécanisme clé dans la réponse immunitaire. Néanmoins, une inflammation excessive, par exemple suite à des infections ou d'origine auto-immunitaire présente un risque sanitaire sérieux. Des traitements anti-inflammatoires existent mais ont des effets secondaires potentiellement importants. Une meilleure compréhension des acteurs cellulaires et moléculaires est donc requise pour une prise en charge optimale et un développement thérapeutique ciblé contre les acteurs de l’inflammation. Les mastocytes représentent un type de cellules immunes primordial dans l'orchestration de l'inflammation, mais dont le rôle précis reste à découvrir. Afin de limiter l’expérimentation sur l’animal, nous avons préalablement mené des études in vitro, qui nous ont permis d’identifier et de caractériser une enzyme présente dans les mastocytes. Nous avons démontré que cette enzyme est nécessaire à la libération de médiateurs pro-inflammatoires in vitro. En effet, les mastocytes dépourvus de cette enzyme présentent une diminution significative de la sécrétion des molécules pro-inflammatoires. De plus, des molécules bloquant l’enzyme étudiée sont disponibles. C’est pour cela que nous émettons l’hypothèse que l’enzyme d’intérêt est un nouveau candidat pour le traitement ciblé de l’inflammation indésirable. L'inflammation est un processus physiologique complexe impliquant le recrutement et l'activation de multiples acteurs cellulaires ainsi que les structures anatomiques, son étude in vitro reflète donc insuffisamment l'ensemble de ses mécanismes. C’est pour cela que l’utilisation de modèles inflammatoires in vivo chez la souris est indispensable. Nous prévoyons d’étudier le rôle de l’enzyme d’intérêt dans trois modèles inflammatoires in vivo. Dans chacun de ces modèles la gravité de l’inflammation de sera comparé entre les souris génétiquement invalidées pour l’enzyme étudiée, des souris traitées avec l’inhibiteur spécifique et des souris contrôles. Nous allons également reconstituer des souris dépourvues de mastocytes avec des mastocytes génétiquement invalidés pour l’enzyme étudiée ou contrôles. Ceci nous permettra d’évaluer la participation des molécules inflammatoires issues des mastocytes dans les pathologies étudiées. Ce projet aura donc pour objectif de consolider le rôle de l’enzyme en question dans l’inflammation dépendante des mastocytes et de la valider comme nouvelle cible thérapeutique potentielle.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus répondront à la fois à des questions de la recherche fondamentale en apportant une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’inflammation dépendante du mastocyte et également aux besoins de la recherche translationelle en permettant de valider la protéine d'intérêt comme nouvelle cible pour le développement de médicaments anti-inflammatoires à long terme.
Procédures
Modèle d’inflammation cutanée des oreilles: sur animaux vigiles: injection sous-cutanée d’un analgésique (1x, durée du geste
Impact sur les animaux
Les nuisances infligées aux animaux dans ce projet comprennent le stress et la douleur induits par la manipulation et l’injection des produits (i.p. et i.v.). L’application d’acide arachidonique déclenche une réaction allergique locale, caractérisée par un gonflement, de la chaleur et l’hypersensibilité cutanée. La douleur est attendue également suite au déclenchement de l’arthrite et l’inflammation rénale. Pour l’arthrite, la douleur dans les articulations des membres peut entrainer une mobilité réduite. Dans tous les cas, les protocoles expérimentaux prévoient la mise à mort à l’issue de la procédure. Les durées des procédures après déclenchement de l’inflammation sont variables en fonction de la pathologie declenchée (1 heure, 4 jours et 8 jours), ainsi limitant les nuisances potentielles, même légères, dans le temps. Une mise à mort anticipée aura lieu dès qu’un animal atteindra les points limites détaillés plus bas.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement et analyse des paramètres biochimiques des organes ciblés.
Remplacement
Les mastocytes dépourvus de la protéine d’intérêt ont été étudiés et caractérisés in vitro. Le mode d’action d’une molécule bloquant spécifiquement cette protéine a également été validé sur des cellules de cultures. Ces travaux préalables nous ont permis d’avoir recours à l’expérimentation animale de manière très ciblée en choisissant des modèles d’inflammation qui impliquent les mécanismes mis en évidence in vitro, notamment la sécrétion des médiateurs inflammatoires par les mastocytes. L'inflammation est un processus physiologique complexe impliquant le recrutement et l'activation de multiples acteurs cellulaires ainsi que les structures anatomiques; son étude in vitro reflète donc insuffisamment l'ensemble de ses mécanismes. C’est pour cela que le remplacement complet des modèles in vivo par des techniques in vitro dans le contexte de notre étude est impossible.
Réduction
Le nombre d’animaux est justifié par la nécessité d’atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant des test statistiques adéquats. Le nombre a été calculé avec l’aide de l’assistant de conception expérimentale (NC3RS) et confirmé avec le logiciel invivostat, utilisant un calcul basé sur la puissance statistique 90% et signification à 5%. Ce nombre sera davantage réduit si les premières expériences effectuées avec les souris génétiquement modifiées ne montrent pas de différence comparable aux souris contrôles. Dans ce cas, les procédures ne seront pas appliquées sur les souris déficientes en mastocytes.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin de limiter la souffrance due aux injections sous-cutanées, i.p. et i.v., les injections seront réalisées avec des seringues à insuline très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce au biseau à trois facettes. Les prélèvements sanguins par ponction à partir de la veine faciale seront réalisés avec une lancette pour animaux (traumatisme minime à l'encontre de l'animal). L’accès à l’eau pour une bonne hydratation des animaux sera contrôlé quotidiennement. Un traitement analgésique par injection sous-cutanée de buprénorphine à 0,1mg/kg est prévu pour tous les modèles d’inflammation. Si un animal démontre ressentir une douleur basée sur une expression modérée ou sévère, un renouvellement du traitement analgésique sera réalisée immédiatement. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Pour toutes les procédures, tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort par inhalation de CO2 dans un système dédié.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de faciliter d’élevage et de reproduction. Le modèle murin permet également l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus de nombreux outils expérimentaux et analytiques ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. De surcroît, le modèle d’inflammation rénale murin partage avec l’homme un nombre de néphrons fixés après la fin de la néphrogénèse contrairement aux poissons et aux batraciens. C’est également un modèle indispensable pour les essais pré-cliniques. Souris adultes âgées de 8 à 12 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit développé pour l'étude de l'inflammation dépendante des mastocytes. De plus, le nombre de mastocytes augmente avec l'âge ainsi augmentant le phénotype dans les modèles choisis. L'age de 8 semaines est indiqué dans la littérature spécifique sur ce modèle d'arthrite auto-inflammatoire.
Elaboration d’un modèle rongeur porteur d’un microbiote humain permettant de tester des stratégies nutritionnelles individualisées sur des pathologies liées au vieillissement
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dix étant proposés à l'adoption et les autres tués à l'issue pour prélèvements. Ils reçoivent un microbiote humain, un traitement au polyéthylène glycol qui provoque une forte diarrhée, puis de nombreux gavages et prélèvements sanguins, avec un hébergement individuel. Le porteur décrit une perte de poids et des troubles du comportement à surveiller, dont l'agressivité, l'arrachage de poils et l'automutilation. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit l'interaction entre microbiote et hôte et retient le rat comme modèle établi.
Objectifs
La proportion des personnes âgées (60 ans et +) représentera un tiers de la population française à l’horizon 2050. Cette population est très hétérogène et se caractérise, pour les extrêmes, par des individus en bonne santé, actifs, en bon état nutritionnel et vivant en général chez eux et par des individus dépendants, vivant parfois en institution et en état de sous-nutrition chronique (population fragile). Le déclin progressif des fonctions physiologiques et cognitives avec l’âge entraine cet état de fragilité qui favorise l’apparition de pathologies. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant dans l’intestin. Des études chez l’homme ont montré que la composition et les fonctions du microbiote intestinal jouent un rôle central dans de nombreuses pathologies. Des déséquilibres de la biodiversité du microbiote intestinal (dysbiose) apparaissent d’autant plus marqués que les sujets sont dans un état de santé fragile. Une corrélation étroite existe, chez les personnes âgées, entre état de santé et profil de microbiote. Des études de transfert de microbiote de rongeurs ont clairement identifié que ces dysbioses liées à l’âge peuvent jouer un rôle décisif vis-à-vis de pathologies ou complications liées au vieillissement : ainsi, il a été montré que le transfert d’un microbiote issu de souris âgées à des souris axéniques (sans microbiote) s’accompagne, chez les souris receveuses, de modifications mimant des caractéristiques métaboliques et immunitaires d’un organisme âgé. De nombreuses stratégies nutritionnelles ou pharmacologiques sont encouragées pour lutter contre ou ralentir le déclin physiologique au sens large lié à l’âge. Du fait de ces altérations du microbiote, des stratégies innovantes le prenant en compte doivent être maintenant considérées, nécessitant notamment des modèles animaux expérimentaux. Les rongeurs sont les modèles précliniques principaux, ainsi, notre projet consiste à développer et valider un modèle de rats à microbiote humain permettant ainsi d’étudier l’effet d’une dysbiose sur l’apparition de la fragilité liée à l’âge (pathologie et état de sous nutrition chronique). Nous allons implanter un microbiote de personnes âgées saines ou fragiles à des rats puis nous comparerons l’effet de cette transplantation sur la physiologie de l’hôte par rapport à des rats implantés avec un microbiote d’adulte jeune sain. Nous développerons ainsi un modèle préclinique original
Bénéfices attendus
La composition du microbiote, plus que l’âge, pourrait être un déterminant important d’un vieillissement sans pathologie. Des études se sont intéressées à des transferts de microbiote depuis des individus âgés vers des animaux sans microbiote et cela a permis de montrer l’apparition d’une partie du phénotype âgé, tel que l’inflammation de bas grade observée au cours du vieillissement ou de certains phénotypes associés au vieillissement. L’originalité de notre étude est que l’on s’intéresse aux différences majeures existant au sein des sujets âgés : c’est-à-dire comparer un microbiote de jeune avec un microbiote d’âgé en santé et un microbiote d’âgé présentant un syndrome de fragilité. Ce type d’étude qui s’intéresse à la diversité de phénotype et de microbiote n’a encore jamais été faite. Nous avons au préalable mené une étude clinique au cours de laquelle la fragilité d’individus âgés a été évaluée selon différents critères (questionnaires de dépendance, alimentaires, tests physiques et cognitifs). Au sein de cette population âgée nous avons pu déterminer quels étaient les plus représentatifs de la population âgée saine et de la population âgée fragile. Leur microbiote intestinal a été analysé quantitativement et qualitativement. En implantant à des rats le microbiote intestinal d’humains âgés en bonne santé ou en fragilité, nous souhaitons appréhender le lien causal des dérèglements du microbiote humain et des dérégulations métaboliques associées à la fragilité liée à l’âge. La mise en place d’un tel modèle est aujourd’hui indispensable pour prendre en compte de façon objective le microbiote dans les stratégies de prise en charge préventive de la fragilité des séniors. Ceci n’a, à notre connaissance, jamais été fait malgré la demande des partenaires socio-économiques. Nous aurons ici des échantillons d’origine clinique bien caractérisés qui seront transplantés aux animaux, participant ainsi à la validation du modèle. Le développement de ce modèle de rongeur, s’il permet de mettre en place une fragilité chez le rongeur âgé, nous permettra ensuite de tester des stratégies nutritionnelles innovantes et personnalisées ciblant spécifiquement les dérèglements du microbiote. Ces stratégies développées et testées chez les rongeurs permettront ensuite le développement de solutions de types probiotiques, prébiotiques ou symbiotiques à destination des séniors dans un but de préservation de leur autonomie.
Procédures
→Pour un premier groupe d’animaux, les interventions seront les suivantes : - 6 prélèvements de sang pour un test de tolérance au glucose. - 1 gavage d’une solution de glucose. - Chaque manipulation sera sur animal vigile et durera en moyenne 2 minutes. →Pour un second groupe d’animaux, les interventions seront les suivantes : - 6 prélèvements de sang dans pour l’étude de la perméabilité intestinale. - 1 gavage d’une molécule fluorescente destinée à mesurer la perméabilité intestinale. - Chaque manipulation sera sur animal vigile et durera en moyenne 2 minutes. → Pour un troisième groupe d’animaux, les interventions seront les suivantes : - 6 prélèvements de sang à la fin de l’étude. - 5 prélèvements de fèces au cours de la procédure. - 13 gavages au cours de la procédure - Chaque manipulation sera faite sur animal vigile et durera en moyenne 2 minutes pour les gavages et prélèvement de sang et 5 minutes pour les prélèvements de fèces. - Anesthésie générale gazeuse de tous les animaux par isoflurane à la fin de la procédure. - Injection unique d’analgésique à tous les animaux en fin de procédure. - 1 prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie. Tous les animaux sont concernés et cela durera 5 à 10 minutes maximum.
Impact sur les animaux
L’aspect le plus dommageable de ce protocole réside principalement dans le traitement au polyéthylène glycol, destiné à diminuer le microbiote, qui peut entrainer un inconfort lors des gavages. Suite au traitement, les rats développeront une forte diarrhée sur 1 à 2 jours et peuvent subir une légère perte de poids. De plus, les prises de sang peuvent s’accompagner de douleur et de stress. Dans le cadre de ce projet, aucune mortalité consécutive au traitement n’est attendue. Des nuisances peuvent aussi survenir lors de l’isolement des animaux. Des changements au niveau de leur comportement seront à surveiller (absence toilettage, hypoactivité, agressivité, trychophaghie, maigreur, hypo-réactivité, comportement de fuite, automutilation). Nous n’avons actuellement pas de recul sur les effets indésirables liés à la transplantation de matières fécales de personne âgée fragiles sur des rats. Les individus donneurs n’étaient pas porteurs de pathologie transmissible. Nous pouvons imaginer que les conséquences sur le rat se limiteront à une diminution de l’efficience des métabolismes protéique et énergétique et à la mise en place d’une inflammation chronique de bas grade.
Devenir
Dix animaux seront gardés en vie et placés à l'adoption. Les autres animaux seront mis à mort pour prélèvements sanguins nécessaires à la caractérisation de leur état physiologique.
Remplacement
La présente étude vise à comprendre les mécanismes complexes d’interaction entre le microbiote intestinal et l’hôte, son implantation chez le modèle rongeur et l’impact de différents microbiotes sur le métabolisme et l’immunité des animaux au niveau corporel d’une part et au niveau de tissus et organes spécifiques d’autre part. Ainsi, aucune méthode in vitro n’existe à ce jour permettant d’évaluer l’impact de ces microbiotes variés sur le métabolisme et l’immunité des rongeurs. Les mécanismes sous-jacents étant par ailleurs non entièrement élucidés, et l’interaction microbiote-hôte, dans le cadre du vieillissement, peu étudiée, il est difficile de pouvoir identifier des cibles prioritaires et donc un modèle in vitro fiable pour caractériser les interactions hôte-microbiote.
Réduction
Nous avons raisonné le nombre d’animaux selon une étude statistique permettant à la fois de mettre en évidence les potentiels effets des transferts de microbiote tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. La mesure de la masse musculaire, des activités enzymatiques, des paramètres biochimiques (insuline et glucose en particulier) et de l’expression de gènes dans divers tissus représentent une part importante des analyses que nous allons réaliser. Cette analyse détermine que 15 animaux minimum sont nécessaires pour obtenir une différence significative entre les lots en prévoyant une possible perte de quelques animaux au cours de leur vieillissement. Par ailleurs, l’espérance de vie de cette souche de rat étant de 24 mois, nous ne pouvons pas exclure que quelques animaux puissent mourir naturellement durant notre protocole expérimental. En effet, nous achetons les rats à 12-13 mois et les faisons « vieillir » jusqu’à 18 mois dans nos installations pour des raisons de disponibilité auprès des fournisseurs et pour éviter le transport d’animaux âgés (plus sensibles à ce type de stress) et afin qu’ils s’adaptent au mieux à nos locaux avant l’étude. Les échantillons obtenus sur les animaux seront mutualisés entre plusieurs laboratoires. L’objectif est d’avoir une vue la plus complète possible du transfert du microbiote sur un panel le plus large possible de paramètres physiologiques, métaboliques et immunitaires des rats. Par ailleurs, des animaux « tests » seront utilisés au début de l’étude pour permettre un transfert de compétences entre 2 partenaires (notamment la réalisation des tests de tolérance au glucose) et éviter ainsi la duplication de l’étude.
Raffinement
Trois semaines avant la procédure, les animaux passeront de deux à un par cage car un suivi quotidien de leur consommation alimentaire individuelle est nécessaire. Nous avons besoin de faire un pair-feeding (PF). Les rats PF recevront une ration inférieure à leur ingéré spontané : à plusieurs par cage, le dominant mangera plus et laissera les restes aux autres. Aussi, la baisse de consommation d’un animal nous alerte rapidement sur son état de santé/stress. Les cages seront conformes à la réglementation (1800 cm3), transparentes placées côte à côte afin qu’ils puissent se voir, s’entendre et se sentir et nous inclurons des enrichissements (bâtons à ronger, matériel pour la nidification, maisons). Les animaux seront pesés tous les jours et seront observés 7j/7 par des animaliers expérimentés. En cas d’apparition d’un point limite, l’animalier alertera les responsables de l’étude qui observeront l’animal et renseigneront le tableau des points limites. Si 3 points notables (réversibles) ou 1 point grave (irréversible) sont observés, selon les symptômes et l’arbre décisionnel, il pourra être apporté à l'animal des soins (nettoyage de plaie, prise d’antalgique, d’anti-inflammatoire). Si blessures, souffrance et stress ne peuvent être soulagés, l’animal sera euthanasié par inhalation de CO2. Les sondes de gavages sont fines (diamètre externe de 2,5 millimètres), à bords arrondis et adaptées (8cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. De plus, les animaux seront entrainés aux manipulations pour réduire le stress et améliorer le bien-être. Pour les gavages, ils seront habitués à être maintenus en contention et à voir une seringue arriver au niveau de leur bouche. Aussi, la sonde leur sera présentée plusieurs fois avant utilisation. Suite au traitement PEG, les animaux auront une forte diarrhée, une surveillance accrue sera mise en place durant les 2 jours suivant le traitement. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution saline sera réalisée. Pour les prélèvements de sang dans la veine caudale, un anesthésique local, la lidocaïne, sera utilisé pour anesthésier la zone de piqure. Les prélèvements seront réalisés par un manipulateur formé et expérimenté. Les animaux seront habitués à être maintenus en contention et à être manipulés afin de réduire le stress. Pour le prélèvement de sang terminal, les animaux recevront un traitement analgésique par injection sous-cutanée puis seront anesthésiés par voie gazeuse.
Choix des espèces
La présente étude vise à montrer l’impact d’un microbiote humain de jeune adulte, d’adulte âgé en bonne santé ou d’adulte âgé fragile, sur le métabolisme et l’immunité du receveur, le rat. Dans ce domaine, de nombreuses études ont prouvé l’intérêt de ce modèle rat pour appréhender le rôle causal du microbiote dans le développement de pathologies chroniques chez l’humain (ex : diabète, obésité). Le rongeur est ainsi le modèle animal le plus utilisé pour tester l’effet global d’un transfert de microbiote sur le métabolisme corporel et tissulaire. Le rat WISTAR est une lignée non consanguine polyvalente utilisée dans toutes les disciplines de la recherche médicale et biologique. Sa longévité ainsi que sa pathologie tumorale en font un modèle de choix pour les études à long terme, notamment pour les études de vieillissement. C’est un rat albinos de manipulation aisée et réceptif aux entrainements aux manipulations. Par ailleurs, la lignée de rat Wistar a été utilisée dans de nombreux travaux des participants au projet présenté dans la saisine, dans le cadre d’études sur le vieillissement et les métabolismes impactés. L’étude concerne le vieillissement. Les animaux que nous utiliserons, au moment de l’expérimentation, seront donc des animaux âgés de 18 mois minimum ce qui correspond à 60 ans en age humain chez cette lignée, âge à partir duquel on considère qu’une personne est âgée selon l’OMS. Les rats seront achetés à 13-14 mois et nous les laissons « vieillir » dans nos installations pour des raisons de disponibilité auprès des fournisseurs, d’évitement d’un transport d’animaux âgés (plus sensibles à ce type de stress) et afin qu’ils s’adaptent au mieux à nos locaux avant l’étude.
Etude comparative de deux techniques d’insémination et de constat de gestation sur le bien-être des bovins
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
10 génisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes à l'issue. Elles subissent deux inséminations et deux constats de gestation par voie transrectale ainsi que des prélèvements sanguins à la veine caudale, pour comparer deux techniques de reproduction au regard de leur bien-être. Le porteur attend peu de nuisances, ces pratiques étant courantes en élevage, et un stress transitoire lié aux prises de sang. Il justifie l'étude par une demande sociétale sur le bien-être des animaux non-humains et affirme qu'aucun système ex vivo ne permet de mesurer cet impact.
Objectifs
Dans un contexte de demandes sociétales accrues vis-à-vis du bien-être animal, les entreprises et organismes agricoles cherchent à prendre en compte cette notion au sein de leurs activités. Les entreprises de sélections et de mise en place souhaitent pouvoir étudier l’impact des technologies de la reproduction sur le bien-être des animaux en vue éventuellement de les améliorer. Principale technologie de la reproduction utilisée en élevage, l'insémination animale nécessite des manipulations transrectales pour faire progresser le dispositif d'insémination dans le col de l'utérus et déposer la semence du niveau du corps utérin. Récemment, un nouveau dispositif d'insémination a été développé permettant d'inséminer sans manipulation transrectale mais nécessitant l’introduction d’un dispositif vaginal de taille supérieure et une aspiration de l'entrée du col de l'utérus par dépression. Si les bénéfices pour l'opérateur sont évidents (diminution du risque de troubles musculo-squelettiques), l'impact de ce nouveau procédé sur le bien-être des femelles doit être objectivé en comparaison avec l'insémination classique. De plus, ce nouveau dispositif permet également la réalisation de constat de gestation habituellement réalisé par examen échographique transrectal. Pour cet usage également, l'impact sur le bien-être des animaux doit être évalué. Le projet présenté ici a donc pour objectif de mesurer l’impact de deux protocoles d’insémination et de constat de gestation (procédé "classique" vs procédé "sans manipulation transrectale") sur les bien-être de 10 génisses de race Holstein évalué de façon multicritère.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir des données préliminaires sur l’intérêt du nouveau procédé d’insémination et de constat de gestation au regard du bien-être animal. En fonction des résultats qui seront obtenus, de nouvelles perspectives de développement pourraient voir le jour pour raffiner ces technologies de la reproduction.
Procédures
Les 10 génisses expérimentales seront soumises au total et de façon chronologique à deux inséminations (durée de 3 minutes) puis, 30 à 40 jours plus tard, à deux constats de gestation (durée de 5 minutes) au cours d'une période de temps de l'ordre de deux mois. Afin d'évaluer les niveaux de stress et d'inflammation périphérique causés par l'une ou l'autre des 4 manipulations (correspondant à l'un des paramètres mesurés dans notre évaluation multicritères du bien-être), des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale (durée d'une minute).
Impact sur les animaux
Peu de nuisances sont attendues sur les animaux de ce projet. En effet, les pratiques utilisées dans ce projet sont des pratiques couramment utilisées par les professionnels chez les bovins qui ne semble pas impacter la santé et le bien-être des animaux. Le bien-être animal sera évalué par des mesures non invasives en dehors des prélèvements sanguins. Ces prélèvements, même si ils peuvent générer du stress de façon transitoire, ne devraient pas conduirent à des nuisances importantes (hématome de façon exceptionnelle) pour les animaux puisque ceux-ci sont peu nombreux et de faible volume.
Devenir
Les interventions réalisées sur les animaux étant des procédures d'élevage classiques qui n'induiront, à priori, que peu de nuisances, toutes les génisses seront normalement gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.
Remplacement
Aucun système ex vivo ne permet de mesurer l’impact des technologies étudiées sur le bien-être des animaux.
Réduction
L’effectif d’animaux utilisé a été déterminé en s’appuyant sur les autres études menées sur ce sujet et de manière à avoir un minimum de variabilité individuelle. Toutefois, chaque animal étant son propre témoin ceci permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation. Les animaux pressentis pour ce projet sont des animaux déjà présents en station expérimentale et n’ayant subi que des procédures légères.
Raffinement
Les résultats de cette étude serviront à étudier et éventuellement à raffiner deux des technologies de la reproduction les plus répandues en élevage. Les génisses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (10m²/animal avec un accès aisé à l’auge et aux points d’abreuvement, présence de tapis caoutchouc pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales…). Il n’est pas possible d’appliquer des procédures de renforcement positif dans cette étude afin de ne pas biaiser les impacts mesurés des procédés qui doivent être représentatifs de ce qui pourrait être mesuré en élevage classique.
Choix des espèces
Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. Les animaux utilisés sont nécessairement des femelles compte-tenu de l’objectif de l’étude. La race choisir est la race Prim Holstein qui est la première race en effectif en France et à l’étranger. En France, l’âge au premier vêlage varie entre 24 et 36 mois. Du fait de cette donnée et de la réutilisation d’animaux expérimentaux, l’utilisation ici de génisses ayant environ 2 ans correspond aux pratiques observables sur le terrain.
Formation opérateurs pour évaluation cardiovasculaire sur échographe petit animal Vevo 3100
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 50
100 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis proposés à d'autres protocoles ou tués faute de réutilisation. Ils sont anesthésiés au gaz pour subir jusqu'à dix échographies chacun, non pour la recherche mais pour entraîner les opérateurs d'une plateforme à manipuler un nouvel échographe. Le porteur indique qu'aucune douleur n'est attendue, les examens ayant lieu sous anesthésie. Il affirme que ni simulateur ni modèle ne reproduit l'anatomie du petit animal et compte constituer une base d'images de référence pour de futurs protocoles.
Objectifs
L’échographie est une technique non invasive de choix afin de mesurer les dimensions d’organes ou de flux circulatoires sans sacrifier l’animal et ainsi de mesurer l’évolution d’une pathologie au cours du temps. L’acquisition récente du système Vevo 3100 de VisualSonics avec ses sondes hautes fréquences dédiées au rat et à la souris va permettre l’acquisition d’images de haute qualité permettant la visualisation des structures cardiaques et vasculaires en mode B (images anatomiques bidimensionnelles). Les volumes du cœur pendant sa contraction (diastole / systole) et de son ventricule gauche peuvent être calculés à partir d’algorithmes utilisant des repères reportés sur les images de l’organe acquises en mode TM (temps mouvement). Le mode TM et le mode Doppler Couleur temps réel peuvent aussi être utilisés pour mesurer diverses constantes qui évaluent le bon fonctionnement du myocarde. Il est enfin possible d’explorer les gros vaisseaux pour notamment caractériser les défauts au niveau de l’aorte (anévrisme, plaque d’athérome), mais aussi de la crosse aortique et de la carotide. Le but du projet est de former du personnel et des étudiants en vue de pouvoir acquérir des images en échographie correctes, ceci de façon à pouvoir évaluer les paramètres cardiovasculaires, cités ci-dessus, qui nous intéressent dans la routine du laboratoire et de pouvoir prospecter ensuite de nouveaux paramètres innovants. Une formation adaptée permettra d’obtenir des opérateurs fiables qui seront directement opérationnels sur les projets qui seront déposés par la suite nécessitant l’utilisation de l’échographe. L’entrainement des opérateurs se fera sur des souris ou des rats ne présentant pas de pathologies et permettra d’aboutir à une expertise dans le maniement de l’échographe, mais aussi, d’avoir une base de données sur animaux sains qui pourra servir à des fins d’apprentissage. Mais surtout, l’opérateur sera en capacité de mieux identifier les défauts d’animaux pathologiques et ce faisant de permettre une éventuelle réduction du nombre d’animaux dans les projets de recherche à venir.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer les compétences quant à l’utilisation de l’échographe petit animal Vevo 3100 présent sur la plateforme d'animalerie. Les données récoltées lors de ces entraînements permettront de réaliser une base de données d’animaux sains pour faciliter les comparaisons dans de futurs protocoles. La maîtrise des gestes facilitera les prochaines expérimentations et améliorera la fiabilité des résultats.
Procédures
Pour réaliser l’acquisition d’images par échographie, les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse. Les rats ou souris effectueront jusqu’à 10 échographies par animal. Ces échographies seront espacées au minimum à une semaine d’intervalle. La durée d'une échographie n'excédera pas 2h. Aucun geste invasif ne sera réalisé.
Impact sur les animaux
L’échographie se faisant sous anesthésie gazeuse, aucune douleur n’est attendue. Afin d’éviter une contention physique, les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse avant d’être positionnés sur la plateforme d’échographie et ainsi d’éviter tout stress et de générer les meilleures acquisitions vidéos possibles.
Devenir
A la fin de la formation, les animaux seront proposés aux autres utilisateurs de la plateforme. Ils pourront être proposés pour des TP ou des prélèvements d'organes. A défaut d'une utlisation secondaire, ils seront euthanasiés.
Remplacement
Le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle à l’heure actuelle. En effet, lors de l’exploration échographique d’un petit animal (souris / rats), les structures anatomiques, la topologie des organes internes ainsi que leur fonctionnement ne peut-être reproduit ou simulé. Au cours du projet, nous allons acquérir une méthodologie, des paramètres d’acquisition et de nombreuses images et vidéos qui pourront servir de référence dans le cadre de l’apprentissage de nouveaux opérateurs.
Réduction
Nous indiquons l’utilisation d’un certain nombre d’animaux pour réaliser ce projet. Malgré tout, ce nombre est un nombre maximum et le nombre sera certainement moindre à la fin du projet selon le nombre d’opérateurs formés. Le nombre nécessaire et suffisant ne peut pas être précisément calculé pour le moment puisqu’il dépendra fortement des projets mis en place, des étudiants à former dans les 5 années à suivre et du nombre de sessions nécessaires afin de former efficacement un opérateur. Nous n’avons pas encore le recul nécessaire afin d’établir une rêgle de calcul précise. Nous proposons d’utiliser au maximum 50 souris et 50 rats au cours de ces 5 ans. Ce nombre ne sera pas bloquant en cas de fortes demande de formation d’opérateurs et le nombre de souris utilisées réellement sera certainement moindre. Nous proposons d’utiliser essentiellement les animaux surnuméraires issus de nos élevages ou une utilisation d’animaux non impliqués dans d'autres protocoles. L’achat d’animaux chez un fournisseur sera la dernière option envisagée.
Raffinement
Tous les animaux inclus dans ce projet sont hébergés en groupe dans un environnement avec un enrichissement optimal (tube, dôme, roue, frisettes, bâtons à ronger éventuellement, etc…) afin d’éviter angoisse ou stress. Afin d’éviter une contention physique, les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse avant d’être positionnés sur la plateforme d’échographie et ainsi d’éviter tout stress et de générer les meilleures acquisitions vidéos possibles. Les constantes (température, rythmes cardiaque et respiratoire,…) de l’animal seront surveillées au cours de l’acquisition et adaptées au besoin. L’animal sera placé sur plaque chauffante dès sa perte de conscience pour limiter la déperdition de chaleur dûe à l’anesthésie. Un gel oculaire sera appliqué pour limiter l’inconfort de l’animal. Cette anesthésie gazeuse pourra être répétée jusqu’à 10 fois par animal. Les anesthésies seront espacées d’une semaine minimum pour permettre à l’animal de récupérer.
Choix des espèces
L’animalerie locale permet l’hébergement de souris et de rats. Les espèces ne seront utilisées qu’en fonction des besoins de recherche des équipes utilisatrices de la plateforme. L’âge des individus n’a pas d’importance dans ce projet, le but est d’apprendre à repérer les organes / structures d’intérêt de façon fiable et répétée. Nous utiliserons des animaux adultes et mâtures sexuellement qui ne seront pas utilisés pour la reproduction, ne seront pas inclus dans une étude ou en seront sortis après utilisation.
Etude de l’infection du muscle squelettique par le virus Chikungunya
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
1 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont infectées par le virus Chikungunya en intradermique, puis reçoivent une injection intramusculaire de chlorure de baryum qui provoque une lésion du muscle, avant la mise à mort pour prélèvement terminal des organes. Le porteur indique traiter les souris à la buprénorphine deux fois par jour jusqu'à la mise à mort pour limiter la douleur. Il affirme que l'étude exige l'infection d'un "organisme dans son ensemble" et présente le modèle murin comme reproduisant l'infection humaine par piqûre de moustique.
Objectifs
Le virus Chikungunya (CHIKV) est transmis à l’homme par les piqûres de moustiques, responsables d'une infection invalidante et est considéré comme un virus émergent du fait de l’expansion géographique des espèces de moustiques vecteurs de l’infection. La physiopathologie de l’infection par CHIKV étant très mal connue, des modèles murins ont été développé permettant de reproduire expérimentalement les formes bénignes et sévères de l'infection par CHIKV. Ces modèles ont permis de mettre en évidence le rôle majeur de certaines molécules dans le contrôle de l'infection et identifié les principales cellules cibles du virus. Il a été montré que CHIKV infecte le muscle squelettique chez les jeunes souris mais l’épargne chez la souris adulte. La protéine FHL1 est essentielle à la réplication de CHIKV. Notre objectif est d'étudier l'infection du muscle squelettique par CHIKV au cours de la myogenèse. Nous identifierons les cellules musculaires sensibles à l'infection et étudierons la contribution respective de l’expression de FHL1 et la réponse IFN-I dans l’infection musculaire au cours de la myogenèse post-natale et de la régénération, en utilisant la souris comme modèle. Cette étude permettra ainsi de mieux comprendre la physiopathologie de l’infection, étape nécessaire pour le développement de thérapies contre ce virus émergent.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre de recherches fondamentales sur les maladies infectieuses émergentes et en particulier sur la maladie induit par le virus chikungunya transmis à l’homme par les piqûres de moustiques. Ce virus responsable d'une infection articulaire et musculo-squelettique invalidante a, par le passé, provoqué plusieurs épidémies et est considéré comme un virus émergent du fait de l’expansion géographique des espèces de moustiques vecteurs de l’infection, notamment en Europe et aux Etats-Unis. Les résultats obtenus permettront d’identifier les cellules cibles du muscle squelettique après infection par voie intra-dermique mimant l’infection naturelle par le virus chikungunya. De plus, les facteurs de l’hôte impliqué dans la sensibilité de ces cellules sera étudié plus précisément. Ce projet permettra ainsi de mieux comprendre la physiopathologie de l’infection, étape nécessaire pour le développement de thérapies contre ce virus émergent.
Procédures
- Infection (ou PBS) en intra-dermique au niveau du thorax : une fois, quelques secondes - Injection Chlorure de baryum en intra-musculaire : une fois, quelques secondes
Impact sur les animaux
L'effet indésirable attendus sur les animaux est la conséquence de l'injection du Chlorure de baryum qui provoque une lésion musculaire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés (animaux infectés, mis à mort pour prélèvements terminaux d’organes analysés ex vivo).
Remplacement
Cette étude nécessite l’infection d’un organisme dans son ensemble. En effet, le processus de myogenèse met en jeu de nombreux effecteurs autres que les fibres musculaires et leurs cellules souches, dont les cellules immunes et le tissu conjonctif. De plus, notre modèle murin est d’autant plus pertinent qu’il permet d’étudier l’infection du muscle dans le contexte d’une infection systémique comme cela est le cas chez l’homme. En effet, l’infection de la souris par voie intra-dermique avec le virus chikungunya (CHIKV) mime l’infection naturelle chez l’homme par piqûre de moustique et conduit comme chez l’homme, à une infection systémique. Pour CHIKV, les animaux sensibles à l'infection sont les primates non humains et les souris. Ainsi, nous utiliserons la souris comme modèle pour cette étude. Cependant des infections ex-vivo seront réalisées sur cellules et myofibres permettant de multiplier les conditions et expériences en diminuant le nombre de souris utilisée.
Réduction
Le nombre d’animaux que nous utiliserons sera réduits au minimum afin d’obtenir des résultats estimés comme exploitables par des biostatisticiens. Concernant les expériences qualitatives (microscopie, tri-cellulaire, extraction protéines et acides nucléqiues) le nombre de souris sera réduit au maximum afin d’obtenir des résultats exploitables. En effets, il faut un nombre d’animaux suffisant pour isoler et cultiver des cellules primaires. Afin de réduire le nombre de souris, pour deux des trois procédures, nous prélèverons le muscle de la patte gauche pour titrage et le muscle de la patte droite pour la microscopie. De plus des infections ex-vivo seront réalisées sur cellules et myofibres permettant de multiplier les conditions et expériences en diminuant le nombre de souris utilisée.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Les souris seront traitées avec un analgésique (buprénorphine) afin de réduire la douleur. Les souris seront traitées 2 fois par jours à la buprénorphine jusqu’au jour de la mise à mort afin de réduire la douleur et répondre aux points limites attendus provoqués par l’injection du Chlorure de baryum (œdème, inflammation localisée au site de l’injection, boiterie). De plus, de la nourriture et de l’eau gélifiée sera déposée dans le fond de la cage. Les injections de Chlorure de baryum dans le muscle et les injections de virus seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de réduire la douleur des animaux. L’ensemble des animaux qui seront infectés ne souffriront pas des conséquences de l’infection car ils seront mis à mort entre 1 et 4 jours après infection alors que le premiers signes cliniques liés à l’infection, n’apparaissent qu’à 7 jours. Les souris seront surveillées quotidiennement pour surveiller un éventuel mal-être : animal qui ne tête pas, poiles hérissés, expressions faciales de la douleur (resserrement orbitaire, renflement du nez, contrôle du renflement, position de l'oreille et changement de moustache. Dès que les points limites (prostration/faciès de souffrance, Body Condition Score de 1, perte de poids >20% du poids initial) sont atteints, les animaux seront mis à mort. Une réhydratation par voie sous-cutanée sera effectuée et de l’eau gélifiée sera mise à disposition pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané).
Choix des espèces
Pour le virus Chikungunya (CHIKV), les animaux sensibles à l'infection sont les primates non humains et les souris. L’infection de la souris par voie intra-dermique avec CHIKV mime l’infection naturelle chez l’homme par piqûre de moustique et conduit comme chez l’homme, à une infection systémique. De plus, il a été montré que CHIKV infecte les mêmes tissus cibles que chez l’homme dont le muscle squelettique. Ainsi, le modèle murin est pertinent pour étudier l’infection du muscle dans le contexte d’une infection systémique comme cela est le cas chez l’homme. Des souris âgées de 9 jours seront utilisées pour étudier l’infection du muscle squelettique au cours du développement post-natal et des souris adultes de 8 semaines seront utilisées pour étudier l’infection du muscle squelettique au cours du processus de régénération musculaire. Enfin, des souris mutantes Dmd (mdx-beta geo) âgées de 4 semaines sensibles à l’infection seront utilisées pour étudier l’infection du muscle au cours d’un processus de régénération musculaire chez un modèle murin de dystrophies comparativement à des souris de la même lignée âgées de 14 semaines non sensibles à l’infection.
Etude de l’implication des cellules satellites dans le développement d’anomalies musculaires dans des modèles murins de la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent un modèle de dystrophie myotonique et reçoivent une alimentation enrichie, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine pendant huit semaines, des injections intramusculaires et des prélèvements sanguins, avant une mesure de force musculaire sous anesthésie suivie de la mise à mort. Le porteur décrit une myotonie, une atrophie et une faiblesse musculaires pouvant entraîner des troubles de la mobilité et des difficultés respiratoires légères. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit le muscle adulte et présente la souris comme "indispensable" pour comprendre la maladie in vivo.
Objectifs
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une des maladies musculaires les plus fréquentes chez l’adulte. Elle conduit à de multiples symptômes musculaires comprenant une faiblesse musculaire invalidante, un défaut de relaxation et une fonte musculaire. Les causes du dysfonctionnement musculaire sont peu claires, limitant le développement de thérapies innovantes et ciblées. L’objectif de ce projet est de comprendre si les cellules souches musculaires contribuent aux symptômes observés dans le cadre de la DM1 et de quelle façon. Notre projet de recherche s’articule autour de 3 axes : 1) Les cellules souches musculaires permettent d’assurer la maintenance du muscle lors d’une lésion, soit en créant de nouvelles fibres et/ou réparant des fibres lésées. En inactivant les cellules souches musculaires dans un modèle de DM1, nous allons tout d’abord vérifier l’implication ou non des cellules souches musculaires dans l’établissement du phénotype musculaire lié à la DM1. 2) Lors d’une lésion, les cellules souches musculaires sont activées, puis elles viennent fusionner avec la fibre à réparer. Nous allons vérifier si l’activation et la fusion des cellules satellites se déroule normalement dans des muscles murins DM1. 3) Un dysfonctionnement des cellules souches musculaires peut être causé par un défaut des cellules souches, ou par des défauts de communications de l’environnement. Dans cet axe 3, nous étudierons la contribution d’un défaut des cellules souches musculaires dans l’établissement du phénotype musculaire.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucune thérapie n’est disponible pour soigner la dystrophie myotonique de type 1. Ce projet vise à obtenir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine de la pathologie et des mécanismes physiopathologiques, prérequis pour le développement de thérapies ciblées.
Procédures
Afin de mener à bien notre projet de recherche translationnelle, les animaux seront soumis à différentes interventions. Les interventions englobent l'apport de nourriture enrichie avec divers composés, des injections intrapéritonéales, des injections intramusculaires, des prélèvements sanguins, et des mesures de force in situ. Un maximum de 4 interventions différentes sera réalisé sur les mêmes animaux. L'apport de nourriture enrichie pourra durer jusqu'à 12 semaines continues et se fera sur animal vigile. Les injections intrapéritonéales d'une durée de 1 minute seront réalisées au maximum 2 fois par semaine sur une période de 8 semaines et seront réalisées sur animal vigile. Les injections intramusculaires d'une durée de 30 minutes seront réalisées sous anesthésie et une seule fois. Les prélèvements sanguins d'une durée de 10 minutes seront réalisés sous anesthésie toutes les deux semaines sur une période maximale de 10 semaines. Les mesures de force in situ durent maximum 30 minutes et sont réalisées sous anesthésie, une fois juste avant l'euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les symptômes ou effets attendus pendant ou à l'issue des procédures sont exclusivement musculaires compte tenu de la spécificité d'expression des modifications génétiques et des vecteurs viraux utilisés. Les effets attendus englobent : une myotonie, une atrophie, une faiblesse ou une fatigabilité musculaire plus importante pouvant se traduire par des troubles légers de la mobilité et des difficultés respiratoires légères. Lors des procédures, les souris pourront ressentir un stress léger lors des manipulations ou de l'ordre de la gêne ressentie lors d'une piqure. Les anesthésies, effectuées dans le cadre de certains actes invasifs, peuvent induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures. En effet, l'étude du muscle squelettique nécessite des analyses histologiques, morphologiques et de biologie moléculaire qui ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux.
Remplacement
A ce jour, l'utilisation de cultures cellulaires ne permet pas de modéliser un muscle adulte qui est un tissu composé de cellules hautement spécialisées et différenciées. Etant donné que la dystrophie myotonique est une maladie progressive généralement absente à la naissance, l'utilisation de souris est indispensable, à ce stade, pour comprendre la physiopathologie de la maladie in vivo.
Réduction
Afin de mener à bien ce projet, nous prévoyons d’utiliser 15 souris/groupe pour garantir une bonne puissance statistique, et ainsi garantir la validité scientifique de l’étude. Un maximum de 345 souris sera utilisé. Afin d'optimiser et de réduire le nombre d'animaux, tous les animaux avec le génotype d'intérêt seront analysés sans distinction de sexe. Les souris seront analysées in vivo/in situ et les tissus seront prélevés post-mortem et conservés pour des expériences ultérieures éventuelles. Concernant les injections intramusculaires de vecteurs viraux, le virus contrôle sera injecté dans la patte controlatérale afin de diviser par deux le nombre d'animaux à utiliser. Les groupes seront comparés par des tests paramétriques ou non paramétriques suivis du test post hoc approprié. D'autre part, le test de puissance statistique permettra d'assurer a posteriori et pour l'avenir l'échantillonnage minimal nécessaire à une différence significative dans le cadre de ces expériences.
Raffinement
Les conditions d'hébergement des animaux seront adaptées pour réduire à son minimum le stress et la souffrance animale. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30-18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec des nids de lanière kraft. Afin de s'assurer que les souris ne souffrent pas, elles seront surveillées quotidiennement. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids de 20% seront considérées comme points limites et critères d’arrêts en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. L'entretien des souris ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié.
Choix des espèces
Le choix de Mus musculus est fondé sur la très grande proximité de structure et de fonction du muscle entre l'humain et la souris. La maturation du muscle se prolongeant jusqu'à 8 semaines chez les souris, celles que nous utiliserons seront donc sevrées et adultes, âgées de 8 semaines au minimum au début des procédures. A ce jour, les modèles in vitro de cellules musculaires ne reproduisent pas le contexte tissulaire adulte de la fibre musculaire qui est une cellule hautement spécialisée et différenciée. De plus, les connaissances concernant la physiopathologie de l'atteinte musculaire liée à la DM1 sont lacunaires et ne permettent pas le développement d'un modèle in silico en mesure de rendre compte du contexte pathologique de la DM1. La compréhension des mécanismes à l’origine de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) nécessite donc d’avoir recours à des modèles animaux de cette pathologie qui reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique, comme c'est le cas avec l'utilisation des vecteurs viraux utilisés dans ce projet.
Evaluation de la susceptibilité à la fibrillation atriale dans un modèle de rongeur de vieillissement cardiaque accéléré
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
195 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections quotidiennes pendant huit semaines pour induire un vieillissement cardiaque accéléré, un médicament ou un placebo par gavage, un suivi par IRM, puis une étude électrophysiologique de deux heures sous anesthésie sans réveil avant le prélèvement des organes. Le porteur indique un stress lié aux injections sur animal vigile et au gavage, et n'attend pas d'effet indésirable des médicaments. Il affirme que l'étude du remodelage lié à la sénescence exige l'"organisme entier" et écarte le remplacement, présentant comme "nécessaire" d'investiguer un vieillissement de la population.
Objectifs
L’âge reste le premier facteur de risque de la fibrillation atriale. Cette maladie cardiaque est due au trouble du rythme cardiaque et peut engendrer des palpitations, douleurs à la poitrine, essoufflement, fatigue... ainsi que le décès de la personne. L’incidence augmente dans la population de plus de 70 ans (17/1000) et cela est particulièrement frappant sachant que l’incidence chez les personnes de moins de 50 ans est estimée à 0.9/1000. En considérant le taux de vieillissement prévu de la population (le nombre de personnes de plus de 65 ans doublera d’ici à 2040), il est nécessaire d’investiguer les causes reliant le processus complexe du vieillissement à la vulnérabilité à développer la fibrillation atriale, afin de développer la prévention et/ou d’améliorer les thérapies existantes. Actuellement, les facteurs qui déterminent la corrélation entre le vieillissement cardiaque et la susceptibilité à développer la fibrillation atriale ne sont pas bien connus. Dans ce projet nous souhaitons mettre en place un modèle de vieillissement chez le rongeur (rat) déjà validé par la communauté scientifique afin de pouvoir étudier les facteurs liés vieillissement influençant l’installation de la fibrillation atriale. Le projet vise à décrire la différence entre un groupe d’animaux possédant un vieillissement accéléré et des groupes contrôles, 195 rats maximum seraient inclus dans le projet pour répondre aux objectifs de recherche . Le point de comparaison sera la sensibilité des animaux à développer de la fibrillation atriale par stimulation cardiaque. L’objectif sera d’essayer de corréler la susceptibilité à la fibrillation atriale avec les modifications tissulaires afin de faire émerger de nouveaux mécanismes qui pourront être testés ultérieurement dans le cadre du développement de nouvelles orientations thérapeutiques pour la prise en charge et le traitement de la fibrillation atriale chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Le modèle de rat avec vieillissement accéléré permettra d’évaluer le lien direct entre l’installation de la sénescence, qui est un processus physiologique qui entraîne une lente dégradation des fonctions de la cellule à l'origine du vieillissement des organismes, qui fait partie des processus du vieillissement, et la sensibilité aux arythmies atriales, notamment la fibrillation atriale. L’induction de la sénescence chez de jeunes animaux permettra de corréler directement ce processus aux arythmies atriales en comparaison avec des animaux âgés. L’utilisation de médicaments qui agissent en tuant les cellules sénescentes (dégradées), permettra d’évaluer les bénéfices potentiels de ces médicaments pour prévenir ou traiter la fibrillation atriale.
Procédures
Les rats auront des injections journalières de dix secondes maximales sur une période de huit semaines. Ensuite, les animaux auront une administration journalière de médicament ou de placebo par voie orale pendant cinq jours. Le suivi des animaux se fera par imagerie non invasive (IRM - Imagerie par résonance magnétique). En fin de projet, ces derniers subiront une étude électrophysiologique pour une durée de deux heures sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptée.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liés aux actes réalisés, notamment lors des injections quotidiennes, celles-ci seront effectuées sur les animaux vigiles ce qui peut induire un stress lors de la manipulation ainsi qu'une faible douleur au site de l'injection. La prise par voie orale pendant 5 jours se fera par gavage, ce geste engendrera également un stress le temps de la manipulation. Les médicaments utilisés ne devraient pas avoir d'effets indésirables sur les animaux. La procédure d’imagerie, ainsi que la procédure de stimulation cardiaque, n'engendreront pas d'effets indésirables, les animaux étant sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptée, et la dernière expérimentation étant sans réveil de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie et couverture analgésique adaptée, pour permettre le prélèvement des organes afin de caractériser les marqueurs de senescence ainsi que les changements structurels et métaboliques des tissus et des cellules.
Remplacement
Le remplacement des animaux est impossible pour ce type d’étude car l’hypothèse nécessite de pouvoir étudier les réponses physiologiques et le remodelage induit par la senescence et le vieillissement précoce sur l’organisme entier. Cependant, les résultats des études ex vivo permettront la mise en évidence des mécanismes impliqués dans la vulnérabilité des tissus sénescents à la fibrillation auriculaire. Cela nous permettra de dessiner de nouvelles études in vitro sur des cellules de patients avec ou sans FA et/ou sur des lignées cellulaires cardiaques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet est calculé sur la base du test statistique de contingence concernant l’objectif primaire (quantifier et comparer la susceptibilité à la fibrillation atriale entre les groupes). Nous recalculerons régulièrement la taille des échantillons nécessaire permettant de discerner les différences statistiques avec l’intervalle de confiance souhaité, et éventuellement réduire le nombre d’animaux utilisé dans le projet. L’utilisation des tissus explantés pour la réalisation de multiples analyses enrichira le contenu d’information scientifique disponible pour chaque animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les conditions adaptées en groupes sociaux, disposeront de l'espace nécessaire et de stimulation avec la mise à disposition d'un enrichissement environnemental régulièrement changé. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de l'animalerie, formé et soucieux du bien-être des animaux. Lors de l'opération, les animax seront sous anesthésie générale avec une couverture analgésique adaptée et une surveillance constante des paramêtres vitaux.
Choix des espèces
Le modèle de vieillissement accéléré chez le rat induit est décrit dans la littérature scientifique. Le modèle de rat permet une évaluation fiable de la vulnérabilité de la fibrillation atriale secondairement à la stimulation cardiaque. Des rats adultes seront inclus au projet afin d’avoir des animaux dont la croissance est achevée. Plusieurs stades de vieillisement seront étudiés : 10 semaines (jeune adultes), 19 semaines (adultes), 18/24 mois (âgés), permettant ainsi de comparer les différents groupes et l'impact du vieillissement sur l'apparition de la fibrillation atriale.
Etude de l’exposition chronique périnatale aux pesticides dans un modèle murin d’allergie et de marche atopique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles reproductrices et leur descendance reçoivent un cocktail de pesticides, puis subissent l'induction d'une allergie alimentaire par gavage pendant cinq semaines et d'une allergie respiratoire par dépôt intra-nasal sous anesthésie pendant six semaines, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur indique attendre une baisse de température corporelle au déclenchement de l'allergie alimentaire et une gêne respiratoire chez certaines souris. Les retombées annoncées, mieux comprendre l'influence des pesticides sur les allergies humaines, restent des espoirs de connaissance, et le porteur affirme qu'il est "impossible" de reproduire le système immunitaire in vitro ou in silico.
Objectifs
Les allergies sont très répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’OMS et leur prévalence est en constante augmentation. Elles constituent un vrai problème de santé publique. Les mécanismes en œuvre dans le développement des allergies et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence ne sont pas totalement connus. L’exposition aux composés chimiques dans l’environnement est une source de sensibilisation allergique et de sévérité des réactions. En effet, les composés chimiques incluant les pesticides sont considérés comme une véritable menace pour la santé affectant le système immunitaire humain et contribuant à l’augmentation des maladies allergiques. Le concept du DOHaD (Developmental Origins of Health and Disease) suggère que l’embryon, le fœtus et l’enfant (les 1000 premiers jours) sont sous l’influence constante de l’environnement. Les polluants peuvent passer de la mère à l’enfant au cours de la période périnatale, créant une « empreinte développementale ». En France, la prévalence des allergies est estimée à 25-30% chez les enfants et est plus élevée en raison de l’immaturité de leur système immunitaire, leur microbiote et leur barrière intestinale. Cette immaturité au est une cible pour les composés toxiques. De plus, les allergies les plus communément trouvées chez l’enfant sont les allergies alimentaires (8%), l’eczéma (10%) et l’asthme (10%) et elles coexistent souvent. Il est maintenant bien établi qu’une allergie alimentaire dans l’enfance augmente le risque de développer un asthme plus tard et la progression en séquence de cette maladie est appelée la marche atopique. L’objectif de ce projet est donc de déterminer si une exposition périnatale à un mélange de pesticides à faible dose (dose journalière tolérable) peut impacter la progression de la marche atopique. Ce travail nous permettra de déterminer l’effet sur le métabolisme d’un mélange de pesticides, composé de boscalid, captan, chlorpyrifos, thiofanate, thiacloprid et ziram. Nous voulons déterminer si un mélange de pesticides à un effet sur la sensibilisation et/ou la sévérité de l’allergie alimentaire et de l’asthme et ainsi déchiffrer les facteurs et le mécanisme à l’oeuvre notamment au cours de la période périnatale. La recherche dans ce domaine implique l’utilisation de modèles animaux d’allergie alimentaire et respiratoire. Ainsi l’utilisation de souris est nécessaire pour étudier de façon optimale la réaction in vivo.
Bénéfices attendus
Nous espérons obtenir des résultats nous permettant de comprendre et d’identifier l’influence d’un cocktail de pesticides aux doses journalières tolérables (DJT) dans la mise en place ainsi que dans la sévérité des allergies alimentaires, respiratoires mais aussi dans la marche atopique. Les résultats que nous espérons obtenir nous permettrons de décrire de façon détailler l’immunologie et la physiologie des allergies chez la descendance dans le cadre d’une exposition chronique aux pesticides.
Procédures
Accouplement sur 5 jours une fois. Pesée 1 fois par semaine tout au long du protocole pour les parents reproducteurs et les souriceaux (environ 1 minute par animal). Pesée tous les 2 à 3 jours pour les femelles après accouplement pour évaluer le nombre de femelles gestantes pendant les 21 jours suivant la reproduction (environ 1 minute par animal). Gavage tous les 7 jours pour l’induction de l’allergie alimentaire pendant 5 semaines (1minute par animal). Anesthésie tous les 7 jours pour l’induction de l’allergie respiratoire pendant 6 semaines (durée jusqu'au réveil complet de l'animal 2 heures environ). Lors de la récupération des fèces, les souris sont placées dans une cage individuelle le temps de récupérer un nombre suffisant de fèces pour les analyses (durée dépendante du temps de transit entre 5 à 15 minutes maximum).
Impact sur les animaux
Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge) par gavage oral, une baisse de température corporelle des animaux est généralement observée. Lors du déclenchement de l’allergie respiratoire (challenge) par dépôt intra-nasal, certaines souris peuvent ressentir une gêne respiratoire suite au deuxième dépôt intra nasal.
Devenir
Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude physiologique, immunologique et du microbiote de l’influence d’un cocktail de pesticide sur la survenue et la sévérité des allergies.
Remplacement
Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interaction complexe comme ici avec un cocktail de pesticides et son influence au cours de la période périnatale.
Réduction
Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques robustes. De plus, trois protocoles indépendants seront nécessaires pour valider les différentes études et leurs résultats ce qui fait un total de 30 souris par groupes.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux.L’évaluation des points limites est basée sur la présence de signes cliniques notables et sévères. Si un animal est repéré comme étant en souffrance, le responsable SBEA et le responsable de l’étude observeront l’animal. En présence signes cliniques sévères et ou notables, le responsable SBEA et le responsable de l’étude prendront la décision, en accord avec la cellule bien-être animal, d’agir. En cas de trop grande souffrance l’étude sera stoppée pour l’animal, Sinon ils prendront la décision de laisser l’animal dans le protocole sous surveillance en appliquant des mesures correctrices. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 4 ou 5 par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Lors de la mise en reproduction et de la gestation les femelles seront réparties à 2 souris par cage.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles et males de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l'expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les femelles et les mâles reproducteurs seront mis en reproduction à 8 semaines de vie (après une semaine d’acclimatation). Pour le protocole d’induction des allergies chez les souriceaux : des souris Balb/cj âgées de 4 semaines ce qui correspond à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature