Procédures légères
Analyse immunohistochimique de l’activation cellulaire dans le système trigéminal dans un modèle de migraine chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
112 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'un composé déclenchant la migraine, puis des stimulations cutanées mécaniques ou électriques sous anesthésie générale irréversible, pour mesurer l'activité de protéines dans le système trigéminal. Le porteur indique que la douleur provoquée constitue l'objet même du projet et qu'aucun antalgique ne peut donc être administré. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et juge l'étude in vivo "nécessaire" parce que l'intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux.
Objectifs
Le but de ce travail est de mesurer sur tissu (coupe d'encéphale), via une approche immunohistochimique, les variations d'expression des différentes protéines, notamment des marqueurs d'activité neuronale/cellulaire, induites par l'injection unique ou répétée d’ISDN, avec ou sans traitement préventif (SNC80), afin de mettre en evidence le rôle du recepteur delta opioide dans le traitement de la migraine. Nous profiterons de cette éxpérience pour valider un nouvel appareil de stimulation électrique, acquis très récemment, et qui doit remplacer la procédure de stimulation manuelle. L’avantage de cet appareil est l’automatisation ce qui nous permets de raffiner notre procédure (moins d’erreur humaine, meilleure reproductibilité, réduction des animaux)
Bénéfices attendus
Nous validons le paramettrage du nouveau stimulateur et nous connaitrons l’effet de la condition de migraine aigu et chronique sur l’activité au niveau du système trigeminal et la possible prevention de cet effet par d’un agoniste DOP
Procédures
Les interventions prévus dans ce projet sont des injections s.c. et i.p sur des animaux vigiles. Chaque animal reçoit au maximum 1 injection s.c. (durée d'intervention: 1min) et entre 2 à 6 injections i.p. (durée d'intervention: 1min, 1 injection / jour). Réalisation des stimulations cutanées sous anesthésie générale irréversible.
Impact sur les animaux
La douleur provoquée constitue la mesure et l'objet de ce projet, aucun antalgique ne peut donc être utilisé. L'allodynie ne se traduit pas par une fuite ou une agressivité lors de la manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort .
Remplacement
Il n’y a pas de méthode alternative permettant de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.
Réduction
Le nombre de groupes de rats et le nombre de rats par groupe sera réduit au maximum tout en préservant une puissance statistique significative. Le nombre de rats par groupe a été fixé à 6/8 en tenant compte du fait, qu’en moyenne et d'après les études précédentes, le groupe ISDN est un peu plus variable par rapport au groupe saline. Les résultats obtenus chez les groupes saline permettront d’une part de valider l’utilisation du stimulateur électrique au sein du laboratoire et d’autre part serviront de contrôles négatifs (témoin) pour comparer aux résultats obtenus avec le groupe ISDN. Nous avons choisis comme groupe temoin de l'effet de l'agoniste SNC810 le worst-case (injections repetée de saline).
Raffinement
Dans le respect du "R "de Raffiner, il est à noter que nos animaux sont sous anesthésie générale lors des stimulations mécanique ou électrique. Concernant la période avant anesthésie, les animaux sont hébergés dans des cages standards bénéficiant d'un enrichissement social et environnemental adapté avec visites quotidiennes. L'expérience du présent modèle de migraine montre que les animaux ne présentent jamais de problème liés aux injections et au développement de l'allodynie mécanique qui pourraient altérer leurs besoins physiologiques et bien être (motricité, postures, reactions aux stimuli lors de la manipulation...). Les manipulateurs sont experimentés pour executer les procedures decrits dans le present projet.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. Rats adultes (6-8 semaines) par raport à la prevalence de pathologie en étude (la migraine).
Rôle de CD44 sur les fonctions des lymphocytes T au cours des complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles sont soumises à un régime gras ou à une alcoolisation, avec des injections intrapéritonéales pour induire une fibrose hépatique et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle de la glycoprotéine CD44 dans les complications hépatiques liées à l'obésité et à l'alcool. Le porteur indique que l'alcoolisation peut provoquer une détresse respiratoire et des signes d'ébriété, et que les injections peuvent entraîner rougeur, infection ou nécrose au point d'injection. Il affirme qu'une étude in vivo est "nécessaire" car les cultures cellulaires ne reproduisent pas les interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Une consommation chronique d'alcool conduit au même spectre d'altérations hépatiques qui vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, qui peut progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux dont le gène CD44 est non-fonctionnel, dans les cellules immunitaires, et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 dans la souffrance hépatique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, d’une part, la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8, dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise régulière d’alcool. D’autre part, de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. De plus, l’invalidation spécifique de CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou dans les lymphocytes CD8 permettrait de mettre en lumière de nouveaux mécanismes moléculaires.
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Le sang des animaux soumis à un régime alcoolisé sera prélevé en fin de procédure et ce prélèvement ne durera pas plus d'une minute. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. L'alcoolisation peut entraîner des signes de détresse respiratoire, des signes d’ébriété chez les animaux suivis d’un endormissement. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour les procédures 2 et 3 (souris mâles ou femelles), la mise sous régime alcool sera effectuée à environ 12-13 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 20g. Pour la procédure 4 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour étudier le vieillissement hépatique (procédure 5), les animaux ne seront utilisés qu’à un stade très avancé de leur développement et seront donc maintenus jusqu’à l’âge de 22 mois maximum.
Conséquences de la salinisation des zones humides côtières sur la physiologie des amphibiens
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
96 crapauds épineux, une espèce sauvage, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, maintenus en vie puis relâchés sur leur site de capture. Ils subissent des mesures morphométriques, des pesées hebdomadaires pendant un an et deux ponctions cardiaques sur animal vigile, pour étudier les effets de la salinisation des zones humides côtières sur leur physiologie. Le porteur indique que la salinité testée reste proche de celle rencontrée dans le milieu naturel et n'affecte que légèrement la croissance. Il affirme préférer une espèce sauvage aux lignées de laboratoire, dont la domestication aurait "canalisé" les phénotypes.
Objectifs
La salinisation de l’environnement a été identifiée comme une menace globale pour les systèmes océaniques, dulçaquicoles (d'eau douce) et terrestres. Plus d’un quart des zones humides de la planète ont déjà été touchées par la salinisation, d’autres sont en voie d’être affectées par ce processus, notamment les zones côtières menacées par la montée des niveaux marins et l'augmentation de la fréquence d'évènements extrêmes (submersions marines). A l’échelle globale, l’impact de la salinisation sur la biodiversité est en voie de devenir un problème de conservation majeur. Il est connu que la salinisation du milieu peut avoir des conséquences importantes sur l’utilisation de l’habitat, les dépenses énergétiques ou la reproduction chez de nombreuses espèces. Mais ces travaux ont souvent examiné les effets aigüs (à court terme) de niveau de salinité élevés (effets souvent toxiques ou létaux). Par ailleurs, certaines espèces possèdent des capacités de dispersion élevés qui leur permettent d’échapper à ces conditions négatives et de se reporter sur des habitats encore favorables (par exemple les oiseaux). D’autres groupes sont beaucoup moins mobiles et sont particulièrement soumis à ce type de perturbation. C’est typiquement le cas des amphibiens qui sont caractérisés par de faibles capacités locomotrices. Ils sont également caractérisés par une peau très perméable qui facilite les échanges avec le milieu ce qui peut poser des problèmes de maintien de l’équilibre hydro-minéral (osmotique). Ces caractéristiques font des amphibiens des espèces particulièrement adaptées pour examiner l’impact de la salinisation de leur environnement sur leur physiologie. Le projet consiste à évaluer l’impact de la salinité environnementale (similaire aux mesures effectuées sur le terrain) sur la physiologie d’un amphibien répandu, le crapaud épineux (Bufo spinosus). Afin d’évaluer les capacités d’adaptation des amphibiens à la salinisation de l’environnement, nous comparerons les réponses d'individus capturés en zones côtières (présumés habitués à ces conditions de salinité) et en zones continentales (non soumis à cette contrainte environnementale) afin d’identifier si des mécanismes spécifiques permettent aux populations côtières de faire face à cette contrainte environnementale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de répondre à deux questions cruciales. D'une part, ce projet permettra d'évaluer si la salinité environnementale affecte négativement les mécanismes physiologiques des amphibiens côtiers. D'autre part, ce projet permettra d'élucider les capacités d'adaptation des populations côtières à ce paramètre environnemental en comparant les réponses de populations naturellement soumises ou non à la salinité environnementale. Les données récoltées seront utilisables dans un objectif de conservation (protection contre les intrusions marines, aménagement de zones refuge ou tampon qui permettront de limiter les effets de la salinisation en recréant un gradient d'habitat, et qui permettront aux populations naturelles de se réfugier). Les résultats permettront de proposer des pistes pour la gestion des milieux côtiers. La création d'un gradient d'habitat grâce à des zones tampons permettra aux individus de subsister si la salinité augmente.
Procédures
Préhension et contention pour mesure morphométriques : 2 fois 1 min séparée par 1 an. Préhension pour pesée : 30 secondes toutes les semaines (52 fois) Préhension et cardiocentèse sur animal vigile : 2 fois 1 minute séparée par 1 an.
Impact sur les animaux
Les niveaux modérés de salinité testés dans ce projet sont similaires à ceux auxquels les individus font face dans l'environnement naturel (zones côtières). Les effets indésirables potentiels seront donc similaires à ceux auxquels les individus font face sur le terrain. Pour les animaux exposés à la salinité : altération légère de la croissance sans impact sur la survie de l’animal. Pour tous les inidividus : inconfort de courte durée (environ 1 min) lors des prélèvements sanguins, stress de courte durée lors des manipulations.
Devenir
Les niveaux sublétaux de salinité testés dans ce projet sont similaires à ceux auxquels les individus font face dans l'environnement naturel (zones côtières). Les effets indésirable potentiels seront donc similaires à ceux auxquels les individus font face sur le terrain. Tous les individus seront donc maintenus en vie et relâchés sur leur site de capture.
Remplacement
L'étude de l'influence de la salinité environnementale sur les réponses physiologiques des amphibiens a des implications importantes à la fois pour la recherche fondamentale en écologie et la recherche appliquée en conservation. La domestication et la sélection de lignées de laboratoire a canalisé l’expression de phénotypes qui sont beaucoup plus diversifiés chez les organismes sauvages. Les réponses des organismes sauvages face aux contraintes de l’environnement seront plus complexes que chez leurs homologues de laboratoires. Par ailleurs, nous souhaitons tester l’existence d’adaptations locales à la salinité. Il est donc nécessaire d'examiner les réponses des populations naturellement soumises (ou non) à ce paramètre environnemental. C’est là que réside l’intérêt de travailler sur des populations côtières ou continentales. L’espèce sélectionnée est présente sur ces deux milieux et nous maitrisons son maintien au laboratoire. De manière ultime, le projet vise un but de conservation qui nécessite de comprendre les réponses des populations naturelles à la salinité.
Réduction
Sur la base d’un test statistique (test de puissance) et des expériences antérieures, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, c’est-à-dire concluants.
Raffinement
Tout au long de la procédure, les individus disposeront de conditions de maintien en captivité optimisées. La température sera maintenue à 17°C. Ils seront maintenus dans des terrariums dédiés, dont le substrat et l'eau de boisson seront changés de façon hebdomadaire (plus souvent en cas de besoins) et auront un accès à la nourriture adapté à leur taille et leur besoin. L'accès à l'eau a été raffiné pour correspondre aux besoins de cette espèce lors de sa phase terrestre sans induire d'effets indésirables. Afin de maintenir un comportement d'animal sauvage (enrichissement), les individus disposent d'abri pour se cacher, et leur alimentation (insectes) sera vivante pour entrenir le comportement de chasse. Pour raffiner nos approches, nous avons développé les méthodes de prélèvement les moins stressantes et les méthodes de contention adaptées pour le prélèvement sanguin. Les gestes techniques sont réalisés par des personnels expérimentés. Un suivi journalier de l'état de chaque individu et de son terrarium sera effectué. Afin de limiter limiter le dérangement des animaux pendant leur phase de repos diurne pour réaliser les surveillances quotidiennes et les manipulations hebdomadaires, celles-ci seront effectuées tôt en début de journée (fin de la période d'activité). Les points limites spécifiques au projet sont associés à un suivi de l'apparence physique et posturale, du comportement, de l'alimentation et de la masse corporelle. En cas d’atteinte du bien-être animal, des mesures adaptées seront prises sans délai.
Choix des espèces
Nous étudions une espèce sauvage non-domestique le crapaud épineux (Bufo spinosus). La domestication et la sélection de lignées de laboratoire (par exemple Xénope du Cap) a canalisé l’expression de phénotypes qui sont beaucoup plus diversifiés chez les organismes sauvages. Les réponses des organismes sauvages face aux contraintes de l’environnement seront plus complexes que chez leurs homologues de laboratoires. Par ailleurs, nous souhaitons tester l’existence d’adaptations locales à la salinité. Il est donc nécessaire d'examiner les réponses des populations naturellement soumises (ou non) à ce paramètre environnemental. C’est là que réside l’intérêt de travailler sur des populations côtières ou continentales. L’espèce sélectionnée est présente sur ces deux milieux et nous maitrisons son maintien au laboratoire. Animaux adultes afin de statuer sur les effets d'une exposition chronique à la salinité lors de la phase terrestre du cycle de vie de ces organismes.
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Bovins : 970
1 470 moutons et bovins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent une substance d'essai puis sont inoculés avec les agents de la fièvre catarrhale ovine, de la diarrhée virale bovine ou du virus respiratoire syncytial, et subissent des prélèvements et des écouvillonnages nasaux, pour évaluer l'efficacité de produits immunologiques vétérinaires. Le porteur indique que l'épreuve virulente peut provoquer boiteries, salivation, pétéchies, érythèmes et jetage, et que tous les animaux sont euthanasiés en fin de projet car infectés ou vaccinés avec des vaccins vivants. Il présente l'évaluation sur l'"espèce cible" comme une exigence réglementaire.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité de substances d’essai chez les bovins et chez les ovins contre 3 pathologies : la Fièvre Catarrhale Ovine chez les ovins et chez les bovins, contre la Diarrhée Virale des Bovins chez les bovins et contre l’infection au Virus Syncithial Respiratoire chez les bovins. Les études d’efficacité par épreuve consistent dans un premier temps à immuniser les animaux par administration de la substance d’essai puis dans un second temps à inoculer l’agent pathogène de la maladie concernée afin d’évaluer la protection apportée par la substance d’essai testée. Ces études sont des obligations règlementaires menées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de différents guidelines et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. Avant de réaliser ces études règlementaires d’efficacité par épreuve, il est nécessaire de mettre au point les modèles d’épreuve et parfois d’amplifier le pathogène in vivo pour constituer un stock suffisant de souche d’épreuve. Aussi, dans un but d’amélioration continue, en fonction de l’évolution des connaissances, de nouvelles études peuvent être réalisées pour optimiser le modèle d’épreuve. Cette optimisation permet d’obtenir un modèle plus fiable, plus reproductif et plus représentatif de la pathologie dans son développement réel. La finalité des études menées au sein de ce projet est la mise au point de vaccins d’un niveau d’efficacité satisfaisant. Les vaccins sont essentiels en élevage afin de protéger les animaux contre les maladies infectieuses, de diminuer l’usage des antibiotiques et de garantir les performances zootechniques et économiques.
Bénéfices attendus
La finalité des procédures décrites dans ce projet est de valider l’efficacité de produits immunologiques contre 3 pathologies dont les effets sanitaire et économique sont très importants. La disponibilité de produits efficaces permet : - de protéger l’animal en tant qu’individu, - de réduire le nombre d’animaux affectés et/ou la gravité de la maladie, ce qui augmente la protection au niveau du troupeau, - d’améliorer le contrôle de la dispersion géographique de la maladie.
Procédures
Pour la première étape d’immunisation des animaux, l’administration de la substance d’essai est réalisée sur des animaux vigiles, 1 à 3 injections sont réalisés avec 1 à 3 semaines d’intervalles. Ces injections durent de 1 à 2 minutes maximum en incluant la contention. Pour la deuxième étape d’administration, les injections s'effectuent sur animal vigile, une cage de contention pourra être utilisée. Ces administrations durent de 1 à 2 minutes maximum, à l’exeption de l’administration avec une nébulisation électronique qui dure approximativement 5 minutes. Les prélèvements s'effectuent sur animaux vigiles, des cages de contentions pourront être utilisées, un miminum de 48H entre deux prélèvements. Des prélèvements terminaux pourront être réalisés, ils seront toujours réalisés sous anesthésie. Des prélèvements par écouvillonnage nasaux s'effectuent sur animal vigle, des cages de contention pourront être utilisées, un miminum de 24H entre deux écouvillonnages. Ces prélèvements durent de 2 à 3 minutes maximum en incluant la contention. Pour les administrations de substances – de la souche de challenge et/ou pour les prélèvements une tranquilisation des animaux pourra être réalisée si les animaux présentent un niveau de stress important, se caractérisant par un comportement défensif, et/ou de fuite. Des prélèvements terminaux de sang ou de liquide broncho-alvéolaire seront toujours réalisés sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans ce document vont avoir des effets directs et indirects sur les animaux. Les effets directs sont considérés comme peu invasifs car les manipulations (contention, administration) et les prélèvements (prélèvement sanguin, écouvillonnage) sont de courte durée. Les effets indirects découlent des effets potentiels des souches d’épreuve administrées. Pour les effets indirects, lié à l’administration de la souche d’épreuve, les différentes épreuves incluses dans le projet peuvent être classées en deux catégories, celles dont la pathologie reste frustre et sous-clinique, avec des signes cliniques rares et légers et celle qui entrainent des signes cliniques modérées : boiteries, salivation, pétéchies, érythèmes, jetage, fièvre, hyperthermie, toux, dyspnée… ces modèles d’épreuve nécessitent un suivi clinique adapté et des points limites spécifiques permettant d’anticiper la dégradation de l’état général des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du projet, car animaux hébergés, possiblement vaccinés avec des vaccins vivants diffusibles et/ou infectés avec des agents pathogènes.
Remplacement
Ces ruminants représentent les espèces cibles des substances d’essai testées. Les essais in vivo réalisés dans ce projet doivent être conduits chez l’animal afin qu’ils puissent répondre aux exigences règlementaires. Dans le cadre d’études non règlementaires, les procédures expérimentales réalisées chez les espèces cibles permettent d’avoir des résultats plus conclusifs. De plus, les procédures expérimentales sur l’espèce cible, décrites dans le présent projet, ne disposent pas d’un modèle in vitro ou in vivo sur espèces alternatives.
Réduction
Pour les études règlementaires, le nombre d’animaux requis est souvent déterminé par les textes (pharmacopées et/ou autres textes règlementaires concernés). Lors des phases de recherche en amont des études réglementaires, les effectifs sont évalués au plus juste (en fonction de la bibliographie, des guidelines, de l’historique, de la définition des objectifs…) de façon à limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont également déterminés de façon à empêcher les études non conclusives.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, la Structure chargée du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques et des conditions de vie pour les animaux. Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans un but d’habituation avec l’environnement et le personnel, afin de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental- animaux devant être manipulés au moment du sevrage, et que l’on préfère laisser le plus possible avec leur mère). Des points limites, spécifiques ou non de la pathologie, ainsi qu’un suivi adapté (observations quotidiennes, bi-quotidiennes…) sont mis en place afin de prendre en charge les animaux le plus rapidement et efficacement possible lors du développement de pathologies entrainant une potentielle douleur chez l’animal. Ces critères sont en constante évolution afin qu’ils reflètent au mieux l’état des connaissances vétérinaires actuelles. Une gêne peut également être occasionnée en fonction de l’occurrence des administrations et/ou prélèvements. Afin de réduire cet inconfort, les opérateurs hautement qualifiés réalisent une contention adaptée (potentiellement incluant anesthésie et /ou analgésie) de l’animal et une alternance des sites d’administrations et/ou de prélèvements peut être mise en place.
Choix des espèces
L’évaluation chez l’espèce cible est une exigence règlementaire. Les bovins et les ovins sont les espèces cibles des substances d’essai étudiées. Les animaux utilisés peuvent être des nouveau-nés, de jeunes animaux en croissance et/ou des adultes (y compris des femelles gestantes). L’âge dépend des besoins pour les études d’efficacité par épreuve, de production de souches et/ou d’études de mise au point de modèle d’épreuve qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, de la substance d’essai testée et répondent à l’exigence expérimentale d’utilisation du produit mis sur le marché et des exigences des autorités.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
24 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intraveineuse de stimulation hormonale et une échographie, avant d'être mises à mort pour prélever les cellules épithéliales de leur glande mammaire, dans un projet visant à modéliser in vitro la glande mammaire afin de produire des protéines thérapeutiques dans le lait de lapines transgéniques. Le porteur qualifie les nuisances de "minimes". Il affirme que la production de protéines recombinantes dans le lait de lapines est le "principe fondateur" de sa société et qu'elle n'est "pas remplaçable".
Objectifs
Notre société est intéressée par la production des protéines recombinantes thérapeutiques (protéines produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) avec l’objectif de soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales et a choisi de produire ces protéines dans le lait de lapines transgéniques. La lapine a été séléctionné parce qu’elle synthétise des protéines en qualité (nécessaires pour soigner efficacement ces patients) et en quantité, que l’on ne peut obtenir par d’autres systèmes d’expression (bactéries ou levures). Pour la création des animaux transgéniques, nous devons modifier le génome des lapins par micro-injection dans des embryons de lapine avant de les transférer dans des receveuses. Comme la production de ces protéines dépend de la modification effectuée, nous devons utiliser plusieurs stratégies de modification génomique. Nous avons mis en place des cultures cellulaires commerciales afin de sélectionner les meilleures stratégies. Nous avons déterminé la présence et l’integrité de l’ARNm correspondant à la protéine recombinante cible pour chaque stratégie, mais nous ne pouvions pas estimer l’efficacité de production des ARNm ou de la protéine produite dans le lait. Ces critères sont impératifs afin de poursuivre des études precliniques.. Il n’existe pas de lignées de cellules de glande mammaire de lapines, commerciales ou non, avec lesquelles nous pourrions étudier les différentes stratégies pour la production des protéines d’intérêts. Nous souhaiterions mettre au point des systèmes cellulaires en deux dimensions (2D) pour quantifier les ARNm codant pour les protéines d’intérêts et dans un deuxième temps trois dimensions (3D, organoïde) afin d’analyser les protéines d’intérêts produites. La génération d’un tel système mammaire modélisant les processus de lactation peut être utile pour estimer la quantité de la protéine recombinante produite et sélectionner les meilleures protéines pouvant être produire dans le lait des lapines. Avec ce système, nous pensons pouvoir diminuer d’au moins 75 pour cent le nombre d’animaux utilisés pour la création des animaux transgéniques produisant des protéines recombinantes thérapeutiques. Pour réussir le plus rapidement possible la mise au point de ces systèmes, nous collaborons avec une équipe ayant de l’experience sur la glande mammaire et les cellules souches, nécessaires à la création des cultures cellulaires 3D.
Bénéfices attendus
Notre société s’est focalisée sur le traitement enzymatique substitutif pour soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales. Nous avons déjà produit des protéines thérapeutiques dont un médicament autorisé et nous voulons produire de nouvelles protéines thérapeutiques par l’intermédiaire de lapines trangéniques. La mise au point de systèmes cellulaires 2D/3D pour modéliser in vitro la glande mammaire de lapine en lactation va nous permettre de tester plusieurs constructions génétiques pour multiplier les chances de produire en grande quantité des protéines thérapeutiques. Nous pourrons ainsi commencer des études précliniques pour vérifier l’efficacité de ces protéines à soigner différentes maladies, tout en diminuant le nombre d'animaux dont nous aurions besoin pour produire ces médicaments. Jusqu’à présent, nous avons besoin d’euthanasier 4 lapines pour récupérer des embryons au stade 1 cellule pour les microinjecter avec une construction génétique puis d’utiliser 4 lapines receveuses des embryons micro-injectés pour être capable d’avoir 1 animal transgénique mosaïque F0 et étudier l’expression de la protéine recombinante d’intérêt sur une géneration F1 et/ou F2. Nous estimons que nous pouvons diminuer au moins 75 pour cent le nombre d’animaux utilisés si nous pouvons tester nos constructions génétiques dans des organoïdes de la glande mammaire de lapines, car nous aurons besoin de juste 1 lapine gestante pour valider nos constructions génétiques.
Procédures
2 injections en intraveineuse d'une durée de 30 secondes environ : une pour la stimulation hormonale, l’autre pour l’euthanasie. 1 échographie de 5 à 10 minutes environ. Prélèvement de glande mammaire sur animal euthanasié.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés subiront des nuisances minimes à savoir : - une injection intra-veineuse mais sur une veine précédemment anesthésiée localement, - une contention lors de l'échographie de conrôle de la gestation.
Devenir
Nous devons euthanasier les lapines pour pouvoir récupérer les cellules épithéliales de la glande mammaire.
Remplacement
La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques est le principe fondateur de notre société et n’est pas remplaçable. En tant que mammifère, la lapine synthétise des protéines recombinantes complexes, de l’ordre de centaines de milligrammes à plusieurs grammes par litres de lait, dont la glycosylation et la gamma-carboxylation sont nécessaires pour soigner efficacement les patients et que l’on ne peut obtenir en qualité et en quantité par d’autres systèmes d’expression (bactéries ou levures).
Réduction
Pour créer des animaux transgéniques, nous devons modifier le génome de lapins en transférant une construction génétique nécessaire à la production de la protéine recombinante thérapeutique d’intérêt, par des cellules de la glande mammaire. Ce transfert génétique se fait par micro-injection de la construction génétique dans des embryons de lapine au stade une cellule, qui seront ensuite transférés chirurgicalement dans des femelles dites receveuses (transfert d’embryon). Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons décidé de tester nos constructions génétiques dans des cultures cellulaires de glande mammaire avant de passer au modèle animal. Actuellement, nous utilisons des cultures de cellules non issues de la glande mammaire de lapines (il n’existe pas des cellules de glande mammaire de lapins, commerciales ou non) pour sélectionner les meilleures constructions génétiques. L’utilisation de ces cultures cellulaires nous a permis de faire un premier tri et de déterminer la présence et l’intégrité de la protéine recombinante, mais nous n’avons pas d’informations sur la quantité de protéine produite (du fait d’un site d’expression différent entre une cellule lambda et une cellule de glande mammaire). C’est pourquoi nous voudrions mettre au point des systèmes cellulaires 2D et 3D pour modéliser in vitro la glande mammaire de lapine en lactation. Quand ces systèmes seront mis au point, nous pensons diminuer d’au moins 75 pour cent le nombre d’animaux que nous utilisons, pour produire des protéines recombinantes thérapeutiques humaines.
Raffinement
Les lapins sont hébergés seuls dans leur cage, reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie, et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent permettant de maintenir un niveau d’interaction entre les individus. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de pouvoir se cacher. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux, et elle est associée à la lumière et la présence des techniciens animaliers. Dans ce projet, il n’y a peu de gestes invasifs : deux intraveineuses mais après application de crème anesthésiante et l’échographie est un peu contraignante pour la lapine mais des mesures sont prises pour atténuer la contrainte : la tête de lapine est cachée par le bras d’une technicienne, ce qui peut la rassurer car le lapin apprécie de pouvoir se cacher, et elle reçoit des caresses de la part de la technicienne qui réalise l’échographie, pour l’apaiser. Certaines lapines se sont endormies dans cette position.
Choix des espèces
Le lapin (de souche New Zealand White) a été choisi pour : sa courte période de gestation (30 jours), sa maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), le volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), la synthèse de protéines complexes (glycosylation et gamma carboxylation). Les lapins sont utilisés dès la la maturité sexuelle atteinte, à 4 mois et demi pour les femelles, 5 mois pour les mâles.
Effet d’un blocage pharmacologique des voies d’inflammation sur un modèle murin d’hyperstimulation ovarienne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections hormonales de superovulation puis des cotraitements anti-inflammatoires, et subissent un prélèvement sanguin sous-mandibulaire terminal avant leur mise à mort, pour étudier l'étiologie du syndrome d'hyperstimulation ovarienne sur des souris invalidées pour les récepteurs LXR. Le porteur affirme anticiper l'"absence d'effets indésirables" liés au protocole, qu'il dit pratiquer en routine. Il indique avoir d'abord mené des tests in vitro sur cellules de granulosa, censés limiter le nombre d'individus utilisés in vivo.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans l’étude l’étiologie moléculaire de l’OHSS. Nous utiliserons des échantillons ovariens issues de souris sauvages, invalidées pour les récepteurs LXRs et ces mêmes souris avec un transgène permettant le sauvetage spécifique des cellules de Granulosa. En effet, le modèle invalidées pour les récepteurs LXRs a été identifié et publié comme un modèle de référence pour ce syndrome. Les études seront conduites sur des animaux de 7 mois environ puisque la mise en place du phénotype est associé à l'age des souris. Les souris seront soumises à un protocole de stimulation hormonale comme suit en vue d’une superovulation. - Jour 1 : Injection IP de l'hormone 1 (PMSG, 7,5UI/souris) - Jour 3 : Injection IP de l'hormone 2 (hCG, 5UI/souris). Nous envisageons donc de réaliser des cotraitements avec des corticoïdes (methylprednisolone), avec des AINS (Ketophen) et enfin avec des inhibiteurs de l'inflammasome (MCC950). Les tissus prélevés seront prélevés à 2 temps spécifiques : 40 heures apres la première stimulation par la PMSG (lot H40) et en fin de protocole après l'ovulation (lot J4). Les échantillons tissulaires seront analysés par des techniques d’histologie et d’immunohistochimie par l’étude de marqueurs d’acteurs de la stéroïdogenèse ovarienne et de l'inflammation. En parallèle des tests de fécondation in vitro (FIV) seront conduit pour déterminer la qualité des ovocytes produits et leurs capacités à reprendre la méiose après fécondation.
Bénéfices attendus
Nous avons précédemment montré le rôle qu'occupe les récepteurs LXR dans l'étiologie moléculaire de l'hyperstimulation ovarienne. Il est maintenant très clair que le phénotype est associé chez la souris à une réponse inflammatoire anormale et à la constitution d'un infiltrat de cellules immunitaires au nievau ovarien qui et totalement anormal et incontrolé. L'etude de l'effet de traitements anti-inflammatoires dans un contexte d'hyperstimulation pathologique de l'ovaire, nous permettra ainsi de connaître le potentiel thérapeutique d'un telle traitement dans le cadre de la clinique humaine.
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement unique sous-mandibulaire sanguin de 150microlitres environ en point final juste avant leur mise à mort. Cette procédure aura lieu une fois avec une durée moyenne d'une minute.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans la présente demande sont largement utilisée dans de nombreux laboratoire, et notre groupe de recherche les utilisent en routine sur ces même modèles génétiques. Ainsi, nous pouvons aidsement anticiper l'absence d'effets indésirables liés au protocole présenté dans la demande. En parallèle, nous pouvons anticiper aue les traitements anti-inflammatoires vont diminués au moins partiellement les manifestations phénotypiques d'hyperstimulation, donc plutôt des effets bénéfiques. Néanmoins, une surveillance renforcée (2 fois par jourà) sera conduite sur les animaux en protocole.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort en fin de protocole pour le prélèvement pour l'analyse des ovaires par des techniques d'histologie et d'immunodétection in situ.
Remplacement
Cette étude fait suite à des tests réalisés in vitro en culture de cellules ayant permis de caractériser le comportement des cellules de granulosa en modulant le contexte inflammatoire. Ceci permet donc de limiter notre étude fonctionnelle sur un nombre limiter d’individus pour valider le phénotype in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante (test ANOVA) à l’issue du protocole, celui-ci a été fixé à 15 individus par lot.
Raffinement
Les animaux en particulier les lignées transgéniques peuvent répondre de manière « exagérée » au traitement hormonale qui induit l’hyperstimulation. De fait, ces lots de souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) pour détecter toute manifestation occasionnelle de mal-être ou de souffrance. Cependant, le protocole post induction est relativement court puisque les souris seront mis à mort 96 heures après l’injection de PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin, les études antérieures n'ont pas montrées de manifestation délétère pour l'animal. En parallèle, un erichissement renforcé des cages d'hébergement sera conduit (cabane et/ou tube carton, pads cellulose pour formation de nids). Si des signes de souffrance ou de mal-être se manisfeste, l'application des points limites décrit dans la DAP seront mis en oeuvre.
Choix des espèces
Le cycle oestrien et la physiologie de l’ovaire chez la souris sont très proche de l’espèce humaine. En parallèle, l’existence de lignées transgéniques d’intérêt pour l’étude de l’OHSS justifie le choix du modèle murin. Nous utiliserons des individus de 7 mois, ce stade de développemente est justifié par le lien qu’il existe entre la survenue d’OHSS chez la femme et la réponse inflammatoire que nous avons observé dans nos études précédentes dans lesquelles cette fenêtre temporelle présente une réponse significativement pathologique dans le modèle Lxr ab-/-.
Étude pilote d’une stratégie de thérapie génique pour le traitement préclinique d’un modèle de rat myopathe
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
132 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Porteurs d'une dystrophie musculaire qui leur fait perdre progressivement de la masse corporelle, ils reçoivent des injections de vecteurs viraux, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie avant d'être mis à mort par injection létale de pentobarbital, pour tester une thérapie génique de la myopathie de Duchenne. Le porteur indique que la mort des cellules musculaires peut provoquer un processus inflammatoire douloureux, anticipé par de la buprénorphine. Il affirme que le rat mime la maladie humaine "beaucoup plus fidèlement" que la souris myopathe et conclut à la nécessité d'une validation in vivo.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) survient lorsque la mutation du gène de la dystrophine provoque un manque de protéine fonctionnelle, entraînant une faiblesse musculaire progressive profonde. La transmission de la maladie est liée au chromosome X, les garçons atteints de la maladie perdent graduellement la capacité de marcher, et la plupart deviennent dépendants du fauteuil roulant et de la ventilation artificielle au fil du temps. Cette maladie est à ce jour incurable et l’âge moyen de survie sans traitement est de 19 ans, l'insuffisance cardio-respiratoire étant la cause la plus fréquente de décès. La prise en charge symptomatique, pluridisciplinaire, vise à optimiser la qualité de vie des patients mais aussi leur espérance de vie. Les progrès thérapeutiques réalisés au cours des dernières décennies ont permis de transformer le pronostic. Plus de 90 % des enfants atteints de DMD vivent désormais jusqu’à l’âge adulte et certains atteignent aujourd’hui l’âge de 40 ans. Plusieurs nouvelles approches pour le traitement de la DMD sont en cours d'approbation et de développement. Une étape critique est d'abord de déterminer l'efficacité et la sécurité de ces traitements en utilisant un modèle animal de la maladie. La stratégie de thérapie utilisée dans ce projet vise à démontrer l'efficacité d'un vecteur viral de thérapie génique permettant de rétablie l'expression d'une dystrophine plus courte mais fonctionnelle qui pourra préserver ou restaurer la structure et la fonction des cellules musculaires touchées par la maladie.
Bénéfices attendus
Grâce à l'étude des effets de cette stratégie thérapeutique sur la structure du tissu musculaire, nous comptons déterminer le meilleur vecteur de thérapie génique et évaluer l'efficacité de ce type de thérapie sur le processus de reconstruction musculaire suite à la restauration de la dystrophine musculaire et sur l'évolution de la maladie. A court terme si une des stratégies se révèle avoir un effet thérapeutique positif, elle sera testée à l'aide d'une injection dans la circulation sanguine générale pour permettre une analyse des fonctions des muscles squelettiques et cardiaque à l'echelle de l'organisme entier. A plus long terme, on peut espérer un essai pré-clinique dans un modèle animal myopathe de plus grande taille et une transposition aux patients dans un essai clinique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles, ni aucune chirurgie ne sont prévus. L'injection des vecteurs viraux (procédure test du sérotype et procédures test de thérapie génique précoce et tardive), n'est pas douloureuse en soit mais peut produire une réaction inflammatoire prise en charge par antalgique. La mesure de force des muscles traités, critère d’évaluation de l’efficacité du traitement, nécessite une immobilisation et l'utilisation d'éléctrodes musculaires est rélaisée sous anesthésie injectable, 1 fois avant la mise à mort pour les animaux inclus dans les essais de thérapie précoce et tardive. Les animaux étant anesthésié et mis à mort immédiatement après la mesure de force, ils ne ressentent pas de douleur.
Impact sur les animaux
La mort des cellules musculaires peut induire un processus transistoire douloureux d'origine inflammatoire dont nous connaissons bien les conséquences que nous anticipons par des injections de buprénorphine. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. Nous connaissons bien l'évolution de la maladie, ce qui permet une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Les procédures 2 et 3 de ce projet incluent des animaux chez lesquels les nuisances musculaires de l'évolution spontanée de la maladie sont limitées et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers. Les vecteurs viraux utilisés ont été choisis pour optimiser l’efficacité de la thérapie génique et minimiser la réponse immunitaire.
Devenir
A l'issue des trois procédures expérimentales, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par une injection létale de pentobarbital.
Remplacement
Toutes les constructions incluses dans les vecteurs viraux et utilisées dans cette saisine ont été évaluées et validées in vitro sur cellules musculaires isolées à partir de rats DMD. Elles ont donc un potentiel thérapeutique qu'il faut maintenant évaluer in vivo lorsque les cellules musculaires sont dans leur environnement en interactions avec les autres types cellulaires présents dans un muscle en conditions pathologiques ce qui n'est possible que sur un animal vivant.
Réduction
Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec d'autres candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Il apparaît que pour chacun des lots, traiter 5 à 7 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution de la maladie. Le problème majeur auquel nous avons été confrontés est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Malgré nos soins, nous avons déploré l'absence de réveil chez quelques animaux. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique, on puisse traiter les données de 5 à 7 animaux arrivés au terme de la procédure. Au bilan, chacun des lots a pu être réduit à 6-8 animaux en fonction des analyses faites. Dans le cas présent, 6 animaux par lot seront suffisants. A des fins de réduction et de formation, les femelles sauvages issues de nos croisements, dont nous ne nous servons pas dans nos procédures d'élevage ou expérimentales, serviront lors de leur mise à mort à l'entrainement de nos étudiants au prélèvement post-mortem d'organes .
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début puis ce nombre est progressivement réduit jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. Dans le cadre du développement de la pathologie nous prêterons attention à l'apparatition des points limites tels que la perte de mobilité, la prostration, une lordose excessive, la dégradation du pelage, la vocalisation anormale (hors contention) ou des grimaces faciales. La cause de la douleur sera recherchée et des antalgiques pourront être prescrits, notamment sur les animaux DMD au delà de 8 mois, nous pourrons utiliser un anti-inflammatoire ou un opioïde après consultation du vétérinaire référent. La survenue de l'un des points ci-dessus associé à une perte de poids sur une semaine dépassant 20% du poids maximal atteint par l’animal et non compensée par la mise à disposition de nourriture humide et d’hydrogel en fond de cage entrainera la mise à mort compassionnelle de l'animal concerné. Lors de l'infection virale les animaux sont injectés une fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie (au démarrage de la procédure puis en fin de procédure) et une fois dans le muscle pour l'injection des vecteurs viraux (procédure test du sérotype et procédures test de thérapie génique précoce et tardive ). Ils sont préventivement injectés 3 fois par jours pendant 2-3 jours avec une molécule qui supprime la douleur, par voie sous-cutanée, en même temps que l'examen clinique pour éviter de les déranger inutilement. La mesure de force inclue également des antalgiques en plus de l'anesthésie générale garantissant que les animaux ne souffrent pas.
Choix des espèces
Le rat, une espèce de mammifère phylogénétiquement proche de l'homme, constitue un modèle apprécié. Les récents outils de manipulation du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris myopathe, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Dans cette saisine nous utiliserons, 1) des jeunes animaux sevrés reçus dans notre EU à l'âge de 3 semaines pour une semaine d'acclimatation puis inclus dans nos cohortes d'étude à partir de 4 semaines, pour les essais de vecteurs et la thérapie précoce, parce qu'ils correspondent au stade post-sevrage le plus précoce pour initier un traitement dans la phase asymptomatique de la maladie; 2) des animaux âgés de 6 mois pour l'essai de thérapie tardive parce qu'ils sont clairement symptomatiques. Si le traitement est efficace, il est attendu une diminution voir un arrêt de l'évolution de la maladie dans le muscle traité chez les animaux jeunes, et un ralentissement ou un arrêt voir une réversion du développement de la maladie dans le muscle traité chez les animaux âgés.
Etude des bases cellulaires de l‘oubli adaptatif chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
54 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent une craniotomie avec implantation d'électrodes intracérébrales sous anesthésie, puis une restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pendant toute une tâche de mémoire spatiale dans un labyrinthe radial, pour étudier les bases cellulaires de l'oubli adaptatif. Le porteur indique que tous les animaux sont mis à mort afin de vérifier l'emplacement des électrodes et de réaliser des marquages histologiques. Sur le remplacement, il affirme que cette tâche d'apprentissage exige l'"animal entier" et conclut qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut s'y substituer.
Objectifs
L’oubli adaptatif est un processus nécessaire à la vie quotidienne permettant d’oublier des informations non pertinente à un moment donné afin qu’elles n’interfèrent pas avec d’autres informations utiles. Cet oubli adaptatif est notamment indispensable au bon fonctionnement d’une mémoire à court terme appelée mémoire de travail que nous utilisons dans la vie quotidienne. Le principal objectif du projet est d’avoir une meilleure compréhension des bases cellulaires de l’oubli adaptatif se mettant en place (ou non) au cours de tâches de mémoire spatiale. Plus particulièrement il s’agira de caractériser les modifications individuelles d’activité de différents types de neurones dans différentes structures connues pour être impliquées dans la mémoire et l’oubli adaptatif. Cette caractérisation nous permettra également de mieux connaître les dynamiques (d’un point de vue localisation et temporalité) de réseaux soutenant la mise en mémoire ou l’oubli adaptatif d’informations spatiales. Un objectif annexe sera d’étudier l’effet particulier de ces mêmes tâches sur les cellules de lieux présentes dans l’hippocampe et de caractériser leurs interactions avec les réseaux évoqués précédemment.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux connaître les bases neuronales nécessaires à la mise en place de l’oubli adaptatif mais également comment les modifications supportant cet oubli évoluent dans le temps et l’espace. Notre hypotèse principale est qu’un mécanisme de dépotentialisation de la transmission entre deux neurones déjà connu (LTD pour long-term depression) serai le support de cet oubli adaptatif et permettrai de faire le « tri » entre les informations pertinentes à conserver en mémoire et celles inutiles qui créeraient des interférences. Or, de récentes études montrer qu’une dérégulation des gènes impliqués dans cette LTD pourrait être associée aux troubles du spectre autistique qui, certes, peuvent dans certains cas « booster » les capacités de mémorisation (diminution de l’oubli « normal »), mais aussi profondément perturber le comportement d’un individu. Déterminer les mécanismes moléculaires de cette LTD qui sous-tendrait l’oubli adaptatif et la gestion efficace des interférences en mémoire de travail parait donc aujourd’hui tout aussi essentiel que comprendre ceux régissant la consolidation des informations en mémoire à long terme. L’étude de ces mécanismes pourraient nous permettre à long terme de mieux comprendre et donc éventuellement traiter des pathologies liées à la perturbation de la transmission neuronale.
Procédures
Les principales interventions sur les animaux sont les suivantes : - Une chirurgie d’implantation d’électrodes, impliquant une craniotomie, réalisée sous anesthésie (1 chirurgie/animal, environ 4h prévues pour chaque intervention) - Une restriction alimentaire aboutissant à un maintien des animaux à 90% de leur poids normal au meme age. Cette restriction alimentaire est maintenue tout au long du protocole sauf en pré- et post-chirurgie. - La passation dans une tâche comportementale dans un labyrinthe radial. En phase d’habituation les animaux effectueront 1 session d’environ 1h/jour (le nombre de jours d’habituation varie en fonction de l’animal, entre 12 et 15). En phase de test, les animaux effectueront 1 session de 3h environ/jour x2 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie pour implanter des électrodes au sein des structures visées : gyrus denté, CA1 et cortex pariétal pour l’enregistrement et voie perforante et cortex cingulaire pour les stimulations, ainsi qu’une électrodes d‘electroencephalogramme et une d’electromyogramme en controlatéral. Les autres effets indésirables attendus sur les animaux découlent principalement de la restriction alimentaire qu’ils subiront tout le long de la procédure comportementale : les rats seront maintenus à 90% de leur poids durant la totalité de la procédure. Durant cette même procédure les animaux seront manipulés quotidiennement par l'expérimentateur. Le stress que cela pourrait générer sera toutefois minimisé par une habituation longue et adaptée selon les besoins de chaque animal. Pour des raisons de sécurité dues à la présence des électrodes et la restriction alimentaire, les animaux seront hébergés individuellement.
Devenir
Tous les animaux de cette étude seront mis a mort à l'issue du protocole. En effet des vérifications histologiques d’implantation des électrodes devront être effectuées avant de pouvoir inclure les enregistrements issus d’un animal dans nos données. Des marquages immunohistochimiques seront réalisés pour réaliser une comparaison avec de précédents résultats de l’équipe et pouvoir valider ce nouveau protocole.
Remplacement
La nature même de l’expérience ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elle repose sur une tâche d'apprentissage complexe que les animaux effectuent et ne peut donc pas être réalisée à partir de modèles in vitro ou in silico car nécessitant l’animal entier comme modèle expérimental. Par ailleurs, du fait du caractère invasif de la procédure (implantation d'électrodes intra-cérebrales), cette procédure ne peut pas non plus être conduite chez l'humain. On ne peut donc envisager pour l'instant une méthode alternative de modélisation qui ne nécessiterait pas l'utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum (n = 6 pour chaque groupe, soit 18 animaux). Le protocole utilisé étant nouveau., il sera nécessaire de refaire passer des animaux uniquement en comportement pour vérifier que le changement de paradigme ne modifie pas les résultats comportementaux attendus (n = 10 pour chaque groupe, soit 30 animaux). Ce nombre d’animaux est nécessaire car nous allons étudier différents apprentissages comportementaux ainsi que leur contrôles et de par la nature des tâches, un rat ne peut en effectuer plusieurs (les phénomènes de sur-apprentissage biaisant les performances comportementales). A ce nombre minimum s’ajoutent 6 animaux afin de prendre en compte les risques de mortalité liés aux chirurgies et à la perte des électrodes. Notre étude nécessitera donc 54 animaux au total (3 groupes de 6 animaux par groupe + 6 pour prendre en compte les risques de mortalité (chirurgie, implant, etc) + 3x10 pour un groupe de rats validant notre protocole comportemental). L’utilisation de microdescendeurs à haute densité permet de réduire le nombre d’animaux en permettant d’enregistrer plus de neurones et plus longtemps. Le fait d’étudier différentes structures chez un même animal et le fait que chaque animal sera son propre contrôle par rapport aux effets de l’habituation permet également de réduire le nombre de rats nécessaire à ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en binômes avant la mise en place de la restriction alimentaire. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés, toujours individuellement dans des cages rehaussées (+13cm) afin qu’ils puissent se déplacer sans que l'implant n’entrave leurs mouvements. Pour pallier au maximum à l’hébergement individuel, une fois l’isolement nécessaire les anciens binômes seront hébergés côte à côte dans des cages transparentes et ouvertes où ils pourront se voir, se sentir et communiquer. Chirurgie : durant la procédure chirurgicale l'anesthésie générale profonde sera assurée par l'association d'un agent volatil (isoflurane) et d'un dérivé morphinique (buprénorphine). La buprénorphine agira également comme un analgésique puissant pendant 6h après l'injection, couvrant donc la totalité de la durée de la chirugie et sera également associée à un AINS longue durée (carprophène, 24h d'action) et un analgésique local (lidocaïne) assurant ainsi une couverture analgésique optimale pendant la chirurgie. Durant la phase post-chirurgicale, l'animal aura accès à un complément alimentaire riche en eau et en nutriments (hydrogel) en plus de sa nourriture standard ad libitum pour faciliter sa rémission. Le suivi de l'état de l'animal dans la phase post-chirurgicale sera fait deux fois par jour durant toute la période de rémission (5 à 10 jours) et visera à évaluer le niveau de douleur et/ou de détresse du rat. Une prise en charge analgésique sera mise en place si nécessaire. Le degré sera adapté à l'état de l'animal pour faire disparaître toute manifestation de douleur ou de détresse. Nous mettons aussi en place des points limites stricts et spécifiques au projet pour evaluer toute détresse et y pallier. Tâches comportementales : la restriction alimentaire nécessaire à l’induction de la motivation dans notre tâche d’apprentissage ainsi que ses conséquences seront hautement contrôlées (de précédentes expériences de l’équipe montrent que la perte de poids modérée (maximum 10% de leur poids initial) est bien supportée par les rats). La procédure comportementale sera précédée d’une période d’habituation à l’expérimentateur, à la pièce et au matériel d’expérimentation, dans le but de faire disparaître tout stress lié à la manipulation des animaux ou l’agencement du labyrinthe. La durée de cette période d’habituation sera adaptée aux besoins de chaque animal.
Choix des espèces
Ce protocole nécessite un apprentissage de paradigmes comportementaux. Le rat est donc préféré à la souris quand cela est possible puisqu’il est moins facilement stressé et possède un répertoire comportemental plus riche. Il existe notamment une large littérature traitant des bonnes performances des rats dans des tâches d’orientation spatiale et de planification. La souche Dark Agouti possède une bonne vision ce qui est nécessaire pour nos tâches d'orientation spatiale dans un labyrinthe. Cette souche est également peu agressive et facilement manipulable. Les rats de souche Dark Agouti sont de plus consanguins ce qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle. Les animaux auront 10 semaines lors de leur réception et de leur intégration dans le protocole, ce qui correspond à de jeunes adultes ayant atteint leur maturité cérébrale et étant à leur pic de capacités cognitives, qui resteront inchangées tout au long de l’expérience.
Formation pratique à la manipulation des chiens et aux gestes techniques associés à leur utilisation à des fins scientifiques
- Formation professionnelle
100 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réutilisés puis adoptés, sans mise à mort. Chaque animal sert une fois à un prélèvement sanguin ou à une administration réalisés par du personnel en formation, dont les gestes hésitants peuvent occasionner un stress ou une douleur plus marqués, avec hématomes et petits saignements. Ces séances entraînent le personnel à manipuler des chiens sains avant les actes de routine. Le porteur affirme qu'il n'y a "pas de remplacement possible" sans former directement sur les animaux utilisés.
Objectifs
Ce projet répond à différents besoins de formation internes. En effet notre personnel a régulièrement besoin de suivre des formations au poste de travail suite à une évolution dans ses missions et tâches, ou à une évolution dans les pratiques du site ; ou encore après une longue période sans pratique. Certaines manipulations nécessitent une phase d’apprentissage, sur des chiens sains, dans un environnement sans stress afin que le geste soit acquis avant de le réaliser en routine le moment voulu.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont que cela offre des possibilités supplémentaires de former du personnel. Une bonne formation pratique permet au personnel de prendre conscience de ses capacités et de ses limites, de la difficulté liée à la variabilité des individus et des circonstances. Du personnel bien formé permet de limiter au mieux les manipulations stressantes ou douloureuses pour les animaux comme pour les personnes, donc les risques d’accident. Cela permet de réaliser les procédures rapidement, dans de bonnes conditions et selon les bonnes pratiques ce qui favorise la coopération des animaux et la qualité globale des résultats.
Procédures
Une séance de manipulation pour les administrations ou les prélèvements sur animaux vigiles durera moins de 30 minutes par animal, et chacun ne sera utilisé que pour : • un seul prélèvement sanguin de quelques millilitres à la veine jugulaire, céphalique ou saphène, • ou une à deux administrations par les voies standards (sous-cutanée, intramusculaire, orale…) avec des volumes mimant des actes vétérinaires une seule fois. • ou un prélèvement de substance pour mimer des analyses biologique selon les bonnes pratiques vétérinaires • ou un examen complémentaire comme un electrocardiogramme.
Impact sur les animaux
Les apprenants risquent de manipuler les chiens de manière hésitante. Cela peut donc entrainer une lenteur dans la réalisation des procédures, un stress voire une douleur plus importantes que lorsqu’elles sont réalisées par une personne expérimentée. Vu les interventions réalisées sur le site, les dommages seront limités à la durée de l’acte lui-même (contention, administration, prélèvement) ou à quelques jours. Les effets indésirables prévus sont des hématomes, de petits saignements, et majoritairement seulement l’effet de l’introduction d’une aiguille par les différentes voies d'administrations ou de prélèvements qui impliquera une sensibilité/inconfort transitoire ou point d’introduction de l'aiguille.
Devenir
Environ les trois quarts des chiens seront des chiens qui ne sont pas adaptés aux besoins de la recherche (défaut de croissance, mâles qui n’ont qu’un seul testicule etc ) ou des anciens reproducteurs qui seront donc adoptés après leur utilisation. Un quart seront des chiens de stock ou des reproducteurs actifs, qui resteront dans la colonie jusqu’à leur vente ou jusqu’à leur mise à la retraite et adoption. Les chiens ne seront pas euthanasiés après leur utilisation dans ce projet.
Remplacement
Il n’y a pas de remplacement possible, à moins de former le personnel directement sur les animaux utilisés en étude, ce qui n’est pas pertinent si l’on souhaite que ces derniers soient utilisés dans des conditions assurant le bien-être des animaux et que les résultats de l’étude ne soient pas impactés. Avant d’utiliser les animaux, pour se former au geste technique, les apprenants commenceront par lire des procédures expliquant les différentes étapes de la manipulation et observer la réalisation du geste par une personne qualifiée lors de plusieurs séances durant des études ou des soins d'élevage. Cette formation sur le terrain sera complétée par des petites formations théoriques avec des supports tels que des images, schémas ou vidéo présentés par le tuteur.
Réduction
Ce projet utilise le nombre minimal de chiens par personne et par formation. Il permet aussi d’optimiser l’utilisation de chiens déjà présents sur le site qui présentent des défauts de croissance ou autre anomalie mineure (exemple : présence d’un seul testicule) ne leur permettant pas d’être des modèles animaux ou qui sont d’anciens reproducteurs avant leur replacement.
Raffinement
Les manipulations des chiens seront limitées à des administrations, des prélèvements classiques et des gestes techniques simples déjà autorisés dans d’autres procédures expérimentales. Le nombre de séances et de chiens utilisés au total par personne dépendra de la technique à acquérir et de la technicité de la personne à former. Les chiens sont tous habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés pour les procédures standards, ce qui rend toute manipulation facile. Le tuteur présent en permanence lors de la manipulation sera à même de reconnaitre les signes de stress ou de souffrance d’un animal et pourra informer le vétérinaire si nécessaire. Il sera facile de remplacer l’animal vu le nombre de chiens disponibles sur le site. Les animaux utilisés pour une séance de formation seront examinés attentivement dans les jours suivant leur utilisation et le vétérinaire sera informé dès l’observation d’un signe clinique quelconque pour procéder à un examen vétérinaire et mettre en place des soins appropriés le cas échéant.
Choix des espèces
Il s’agit de la seule espèce manipulée par le personnel sur le site. Les chiens seront en général soit de jeunes chiens en fin de croissance soit des adultes, donc typiquement âgés de 6 mois à 5 ans. Si un collaborateur doit être formé à un geste appliqué à des animaux particuliers (exemple prises de sang sur de jeunes chiots), alors des chiens ayant les caractéristiques requises seront utilisés pour la formation.
TP chez le rat et la souris mâle ou femelle : Formation spéciale à l’expérimentation animale niveau praticien
- Formation professionnelle
Rats : 567
1 125 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie des rats réutilisés pour d'autres sessions, les autres animaux tués. Ils subissent différentes voies d'injection de produits neutres et des prélèvements sanguins, réalisés par des personnes en cours de formation à l'expérimentation animale. Ces séances servent à valider une formation réglementaire de niveau praticien, non à produire des connaissances. Le porteur affirme que la pratique directe sur l'animal est "incontournable" et "indispensable" malgré la place faite aux méthodes alternatives.
Objectifs
Le projet ci-après a déjà été autorisé au sein de notre animalerie pédagogique, mais cette dernière est en travaux actuellement. Ainsi le temps des travaux, les formations pratiques se dérouleront dans un autre établissement d'enseignements de la région. C'est pourquoi, nous représentons la demande d'autorisation de projet au sein de cet établissement. Pour rappel, ce projet s'inscrit dans la formation réglementaire à l'expérimentation animale décrite dans l’arrêté du 1er février 2013 n° AGRG 1238729, proposée à des personnes appliquant des procédures expérimentales aux animaux. Cette formation est proposée à 20 stagiaires au maximum. Ce projet consiste à former des personnes travaillant au sein d’établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques d'un point de vue pratique sur les procédures faiblement invasives chez les rongeurs (rat et souris) (procédures régulièrement utilisées en expérimentation animale), de s’assurer que le bien-être des animaux soit respecté en les accompagnant dans leurs apprentissages pratiques afin de valider la formation réglementaire. Ce TP permettra à certaines personnes d’appliquer ces procédures pour la première fois de façon individuelle et sera l’occasion de manipuler des animaux vigiles et d'acquérir de l’autonomie.
Bénéfices attendus
Ce TP permettra une acceptation au niveau pratique de la formation à l’expérimentation animale niveau praticien dispensée par notre établissement. En effet, la réalisation de ce TP (partie apprentissage) est incluse dans le dossier de validation de notre formation praticien. Etant donné que cette formation à l'expérimentation animale niveau praticien donne aux personnes, l'ayant validée, la possibilité de travailler avec des animaux de laboratoire, il nous semble nécessaire de leur donner des bases pratiques pour s'assurer qu'ils sont bien capables de travailler avec des animaux dans les meilleures conditions pour le bien-être de ces derniers. En outre, le retour des employeurs et personnes sur notre formation praticien est très positif, car ils attestent être rapidement autonomes après une prise de poste et que leur maîtrise des gestes techniques leur permetttent d'assurer un travail respectueux de l'animal.
Procédures
Les animaux seront répartis en 3 lots qui seront soumis à des protocoles différents faisant appel à la réalisation de procédures faiblement invasives (différentes voies d'injections de produits neutres et de prélèvements sanguins). Ces procédures expérimentales seront réalisés sur animal vigile ou anesthésié, quand la procédure le nécessite. Un laps de temps pouvant aller de 30 minutes à 180 minutes, entre chaque procédure est observé afin de respecter le bien-être animal .
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées dans ces TP sont faiblement invasives. Les produits adminisitrés de volumes réduits sont neutres (sérum physiologiques, eau). Les administrations de produits et prélèvements se feront sous le strict contrôle de l’équipe formatrice/enseignante. Ainsi les deux nuisances attendues pour les animaux seront liées au stress de la manipulation et aux douleurs éventuelles associées aux injections effectuées par des étudiants en aprrentissage. Afin de diminuer ce stress, les animaux seront préalablement habitués à la manipulation par le personnel technique ainsi que celles liées aux douleurs d'injections éventuelles effectuées par les apprenants. Pour réduire le stress des animaux, les souris commandées en provenance d'éleveurs agrées seront réceptionnées 10 jours avant le début de la session de formation pour leur permettre une bonne acclimatation. Dans le cas où l'animalerie de l'IUT disposerait de rats de poids initial (200gr pour les femelles et 225 gr pour les mâles) ils seront intégrés dans les TP réduisant ainsi fortement la nuisance de transport. Dans le cas contraire (pas le poids demandé) les rats seront commandés auprès d'éleveurs agréés également et seront aussi réceptionnés 10 jours avant le début de la session. Pour les douleurs éventuelles liées aux piqures, l'équipe enseignante/formatrice insistera sur la précision du geste technique avant de procéder à l'injection, qui ne sera réalisée qu'une seule fois par les étudiants.
Devenir
En fin de session (si le temps entre 2 sessions est inférieur à 1 mois, afin de garder des animaux avec un poids adéquat), les rats seront gardés en vie et réutilisés pour une autre session. Au delà d'un mois, les animaux seront réutilisés dans des protocoles hors champs dans notre établissement ou au sein des autres établissements de notre université. Si les animaux ne sont pas réutilisés, ils seront mis à mort et pourront servir pour les TP de dissection.
Remplacement
Afin de valider la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau praticien), il est nécessaire que les personnes pratiquent les techniques les plus usuelles et les moins invasives (différentes voies d'injections de produits et de prélèvements sanguins) sur animal vigile ou anesthésié pour les maîtriser et ceci en complément des autres supports utilisés (démonstrations...). Même si une large part est faite aux méthodes alternatives à l’expérimentation animale, la réalisation d’interventions directes sur l’animal, avec encadrement professionnel, est incontournable et reste l’objectif principal de ces formations professionnelles.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été calculé de manière à prendre en compte le degré de stress et/ou de douleur potentiellement occasionné chez l'animal, tout en permettant une bonne formation pratique des personnes. L'administration par voie orale sera réalisée une fois par rat/souris et par personne, l'injection par voie SC et IP et le prélèvement de sang par voie IV seront réalisés une seule fois par rat/souris et par personne et enfin l'injection IM sera réalisée par une personne sur une cuisse par rat/souris. Un formateur réalisera une démonstration de chaque procédure en utilisant 2 rats et 1 souris. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, l'ensemble des rats et souris sera réutilisé pour les prélèvements sanguins. Ainsi, 3 rats et 3 souris seront nécessaires pour 1 personne, soit 60 rats et 60 souris pour 20 personnes, effectif maximum de notre formation. A cela nous souhaitons ajouter 1 animal rat et souris supplémentaire par session, en cas de problème de manipulation ou d’animaux dont l'état de santé initial ne permettrait pas d'entrer dans ce projet, ainsi que 2 rats et 1 souris pour la démonstration du formateur. Cela représente 63 rats et 62 souris par session. Il est envisagé 3 sessions par an sur 3 ans, soit un total de 567 rats et 558 souris pour les 3 ans. Ce chiffre sera bien entendu revu à la baisse si le nombre d'inscrits à la formation est inférieur à 20 et si le nombre de session est atteint ou le temps entre 2 sessions est inféreur à un mois. Enfin, certains animaux pourront provenir d'un précédent protocole classé hors champ, dans lequel les rats femelles auront eu 2 frottis vaginaux.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés évidemment, par groupe socialement harmonieux, en présence de deux éléments d'enrichissement (tunnel en plastique et bâton de bois à ronger ou noix). Les animaux auront été habitués à la préhension / contention avec le personnel de l’animalerie, afin qu'ils soient moins stressés lors des procédures réalisées par les personnes. Avant toute intervention sur l'animal, les personnes auront observé la démonstration par les formateurs. La pratique des personnes sur l'animal ne sera réalisée que sous contrôle rigoureux des formateurs. Une attention particulière sera portée sur la nécessité de travailler dans le calme afin d'éviter tout stress inutile chez l'animal. Enfin une même intervention ne sera réalisée qu'une seule fois sur un même animal. A noter qu'avant les séances de TP, les personnes auront suivi plusieurs enseignements théoriques de la formation à l'expérimentation animale et seront donc particulièrement sensibilisés au respect des procédures. De plus, les rats et souris seront récompensés à la fin de chaque manipulation à l'aide d'un aliment appétent sucré (type pop corn, biscuit sec...), ce qui permettra de diminuer leur stress tout en sensibilisant les stagiaires à l'importance du renforcement positif. La réalisation de certains procédures expérimentales (prélèvements sanguins) nécessitent l'emploi du poste à anesthésie volatile afin de limiter la douleur pour l'animal. Pour cela, lors des apports théoriques la notion et l'explication de points limites pour limiter la douleur est abordée. Les points limites requis pour ces procédures seront mis en place pendant toute la période de manipulation de ces animaux.
Choix des espèces
Cette formation à l'expérimentation animale (niveau praticien) aura pour spécialisation d'espèces animales : les rongeurs rats et souris. Ces deux espèces sont couramment utilisées en expérimentation animale. Il est indispensable de réaliser une séance de TP chez la souris et le rat, pendant laquelle les personnes réaliseront certaines procédures faiblement invasives (différentes voies d'injections de produits neutres et de prélèvements sanguins) pour consolider et s’assurer que les procédures les plus utilisées soient connues et maîtrisées. Les rats seront âgés de 8-12 semaines et pèseront entre 200 et 350 g en fonction du sexe, poids qui permettront une contention aisée pour des stagiaires qui se forment à l'expérimentation animale. Pour les souris, elles seront agées de 6 à 8 semaines et pèseront entre 25 et 35 g pour permettre une contention aisée.
Effet de l’exposition prénatale de nicotine et de cocaïne sur le développement spinal embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes sont exposées à la nicotine dans l'eau de boisson ou à la cocaïne par injection pendant la gestation, ce qui peut entraîner un défaut d'alimentation ou une anorexie, avant d'être tuées pour prélever les embryons. Le porteur étudie l'effet de ces expositions prénatales sur le développement de la moelle épinière et les troubles moteurs observés chez l'enfant. Il affirme que les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier cette exposition prénatale et qu'un modèle mammifère est "nécessaire".
Objectifs
La consommation de nicotine ou de cocaïne chez la femme enceinte conduit à des troubles moteurs chez l'enfant. La nicotine et la cocaïne traversent la barrière placentaire et engendrent des anomalies du développement du système nerveux, à l’origine des troubles moteurs observés chez l’enfant, mais qui restent encore aujourd'hui très mal connus. De nombreuses études effectuées chez la souris montrent que l'activation des récepteurs nicotiniques (AChR) par l’acétylcholine (ACh) de l’embryon est nécessaire au développement correct des réseaux moteurs de la moelle épinière et plus particulièrement au développement des neurones spinaux (migration, synaptogenèse, développement des propriétés électrophysiologiques). Il a été montré par ailleurs que la cocaïne pouvait agir directement sur les AChR en les inhibant. Nous faisons ici l’hypothèse que la nicotine en activant de façon anormale les AChR et la cocaïne en les inhibant, engendre des erreurs de développement dans les réseaux spinaux qui seraient à l’origine des troubles moteurs observés après la naissance. Pour tester ces hypothèses, nous utiliserons un protocole d'exposition prénatale à la nicotine et à la cocaïne de souris transgéniques gestantes permettant de localiser et étudier le développement de certains neurones spinaux impliqués dans la locomotion. Nous analyserons les effets de l'exposition prénatale de nicotine et de cocaïne à deux stades du développement au 12ème et au 14éme jour embryonnaire. Ces deux périodes de traitement doivent nous permettre d'analyser les effets de l'exposition prénatale aux toxines sur la migration et la synaptogenèse des neurones spinaux. Des enregistrements électrophysiologiques et des techniques d'immunohistochimie seront utilisés pour analyser l'activité et le développement des neurones spinaux chez les embryons exposés, comparés à des groupes contrôles. Notre projet doit permettre de mettre en lumière les mécanismes cellulaires du développement spinal à l'origine des altérations motrices dues à l'exposition à la nicotine et à la cocaïne pendant la grossesse.
Bénéfices attendus
Nos travaux doivent permettre de mieux connaitre et mieux comprendre les effets délétères de la nicotine et de la cocaïne sur le développement du foetus et à terme permettre d'adapter et d'améliorer la prise en charge des enfants exposés à ces drogues.
Procédures
Des groupes de souris gestantes seront exposés à la nicotine. Des groupes seront traités avec la nicotine pendant la gestation jusqu'au 12ème ou jusqu'au 14ème jour embryonnaire. La nicotine sera administrèe par l'eau de boisson (200microgramme/L + 1 pour cent saccharine). La quantité de boisson qui sera bue par chacun des animaux sera monitorée. En parallèle un groupe de souris gestantes "contrôle" n'aura pas de nicotine dans l'eau de boisson (1 pour cent saccharine). Des groupes de souris gestantes seront exposés à la cocaïne. Des groupes seront traités avec de la cocaïne pendant 4 ou 6 jours pendant la gestation entre le 9ème et le 12ème jour ou entre 9ème et le 14ème jour de gestation. La cocaïne sera administrèe par injection sous-cutanée (40 mg/Kg/jour dans un liquide physiologique 0.9 pour cent NaCl). En parallèle un groupe de souris gestantes "contrôle" recevra des injections quotidiennes sans cocaïne (liquide physiologique 0.9 pour cent NaCl). 384 animaux au total suivront l'ensemble de ces procédures.
Impact sur les animaux
L'administration chronique de nicotine dans l'eau de boisson peut entrainer un défaut d'alimentation et de prise d'eau. L'administration chronique de cocaïne peut entrainer des anorexies. Le niveau d'eau dans les biberons sera surveillé afin de détecter un éventuel défaut de prise d'eau. Dans le cas d'un risque de déshydratation, le traitement sera interrompu. La prise de poids des femelles gestantes sera surveillée. En cas de perte de poids anormale, un régime spécifique, déjà utilisé pour d'autres études de ce type, sera donné aux animaux (BioServ #F1258SP).
Devenir
Les femelles gestantes sont euthanasiées avant le prélèvement des embryons.
Remplacement
Des simulations informatiques seront réalisées afin de remplacer/compléter certaines expériences. Cela permet de réduire le nombre d'animaux utilisés pour certaines étapes du projet. Des modèles de culture de neurones spinaux existent et permettent de tester les effets de la nicotine ou de la cocaïne sur les récepteurs nicotiniques. Cependant ces modèles in vitro restent complémentaires aux approchent in vivo car ils ne permettent pas d'étudier l'exposition prénatale de ces molécules sur le développement de l'embryon.
Réduction
Plusieurs expériences seront menées sur une même portée. Notre projet est basé sur des méthodes variées qui permettent d'utiliser au maximum tous les embryons d'une même portée. Cela permettra de réduire le nombre de femelles gestantes utilisées. Des tests statistiques seront réalisés afin de vérifier les effets de la nicotine et de la cocaïne sur l'activité et le développement des neurones des moelles épinières embryonnaires. Nous prévoyons des portées de 8 à 12 embryons en moyenne provenant de 6 portées différentes par condition expérimentale afin que des tests non-paramétriques fiables puissent être effectués (Test Mann et Whitney ou Wilcoxon). Les mâles utilisés comme reproducteurs pourront être proposés pour d’autres études lorsque ceci est possible.
Raffinement
Les souris seront élevées avec un enrichissement et en cages collectives. Les mâles ne seront isolés que pendant la période de reproduction et les femelles isolées uniquement pendant la période de gestation. Seuls des personnels qualifiés contrôleront les points limites généraux et pourront euthanasier les animaux en cas de nécessité. Toute anomalie ou souffrance évidente sera signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites ci-dessous : - perte de poids supérieure à 20 pour cent sur 3 jours - automutilation - développement de plaies ou d'infections - poil mal entretenu ou aspect général anormal - changement de comportement (particulièrement la prostration) - activité cardio-respiratoire ralentie ou accélérée - En cas de blessure, les plaies seront nettoyées et désinfectées au diaseptyl. - En cas de perte de poids, l'animal peut être réhydraté si besoin par injection IP ou sous-cutané de saline (10ml/kg) ou saline-glucose (v/v, 10ml/kg). On peut également déposer des miettes humides issues de la nourriture habituelle directement dans la cage. - En cas de douleur évidente une injection sous-cutanée de Métacam est réalisée (5 à 10 mg/kg), renouvelée 1 fois par jour pendant 3 jours maximum. - En cas de non amélioration, le responsable du projet sera averti et prendra la décision si nécessaire de mise à mort de l'animal par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Ce projet a pour but d'analyser les effets de certaines drogues sur le développement in utéro de la moelle épinière. L'utilisation d'un modèle de mammifère est ainsi nécessaire dans ce projet. Le choix d'un modèle murin a été motivé par la possibilité d'utiliser des lignées transgéniques comme les lignées transgéniques GAD67-eGFP et Hb9-eGFP qui permet de localiser les neurones GABAergiques et les Motoneurones respectivement dans le tissu nerveux.
Travaux Pratiques de Pharmacologie sur souris et rats.
- Enseignement supérieur
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit deux à trois injections intrapéritonéales de substances médicamenteuses au fil de deux séances de travaux pratiques, puis des tests comportementaux, avant d'être tué par dislocation cervicale. Ces séances servent à initier des étudiants de troisième année de pharmacie aux méthodes de l'expérimentation animale, non à produire des connaissances. Le porteur justifie la mise à mort par le fait qu'il n'y a "pas lieu de les garder".
Objectifs
Les séances de travaux pratiques en pharmacologie sont menées chaque année auprès des étudiants en Pharmacie de 3°année (tronc commun, environ 130 étudiants/promotion). L’objectif est d’initier et de sensibiliser les étudiants aux méthodes de découverte et de caractérisation de médicaments en utilisant des modèles animaux, au cours de deux séances de pharmacologie comportementale chez la souris. C’est à cette unique occasion que les étudiants en Pharmacie abordent les grandes notions relatives aux techniques d’expérimentation animale.
Bénéfices attendus
Il y a plusieurs bénéfices pédagogiques au maintien de ces séances de travaux pratiques. Les séances des 3° années illustrent les cours de Pharmacologie générale. Elles permettent aux étudiants d’apprendre à objectiver et comprendre les grandes propriétés pharmacologiques observées avec des classes thérapeutiques majeures telles que les benzodiazépines et les neuroleptiques. Ces séances nous permettent aussi d’aborder d’un point de vue pratique les principales notions d’éthique liées à l’expérimentation animale. Nous pensons qu’il est important que tous les étudiants en Pharmacie soient sensibilisés au cours de leurs études aux questions et enjeux de l’expérimentation animale en santé et en recherche scientifique
Procédures
Les souris reçoivent 1 injection intra-péritonéale lors de la séance 1 de travaux pratiques et entre 1 et 2 injections lors de la séance 2 (donc entre 2 et 3 injections ip). Les injections sont réalisées sur animaux vigiles. Ensuite les souris sont soumises à des tests comportementaux non invasifs.
Impact sur les animaux
Les animaux sont exposés pendant les séances (2h) à un environnement qui est plus bruyant que leur environnement habituel. Les souris reçoivent entre une et deux injections intra-péritonéales de substances médicamenteuses diluées dans du sérum physiologique par séance. Elles sont utilisées pour deux séances de TP.
Devenir
Les souris sont gardées en vie entre les 2 séances de travaux pratiques et elles sont euthanasiées par dislocation cervicale à la fin de la procédure expérimentale car il n’y a pas lieu de les garder.
Remplacement
Nous sommes engagés dans un projet d’innovation pédagogique en collaboration pour numériser les données expérimentales que nous collectons afin de développer des programmes de simulation. Les expériences simulées sont ensuite utilisables par l’ensemble des Universités participant au projet, ce qui permet une mutualisation des séances numériques disponibles. Nous utilisons la plateforme de simulation ExaVir. Nous avons déjà des TP opérationnels utilisant le duodenum de rat qui sont utilisés chaque année dans le cadre des TP présentés ici, ce qui nous a permis de diminuer le nombre de rat nécessaire (projet Lauréat d’un Fond d’Initiative Pédagogique 2018, 20 000€). Nous travaillons maintenant à collecter les données comportementales chez la souris. En parallèle, nous constituons une vidéothèque regroupant les résultats expérimentaux des principales observations menées. Certaines de ces vidéos sont déjà présentables à nos étudiants dans le cadre des TP (induction de catalepsie chez le rat par inhibition des voies dopaminergiques centrales).
Réduction
Nous sommes engagés depuis 2015 dans une forte réduction du nombre d’animaux utilisés lors de nos séances (annexe 1, suivi de l’évolution du nombre d’animaux utilisés). Nous avons réduit en i) réutilisant les animaux entre les séances, ii) mutualisant les lots d’animaux pour l’ensemble du groupe d’étudiants, iii) allégeant les parties expérimentales et iv) en réduisant le nombre de séances.
Raffinement
Les animaux restent en salle de TP sur la plus courte période possible (2h) pour limiter leur exposition au bruit. Avant la fin de la journée, l’effet des molécules testées s’est estompé (effet sédatif des benzodiazépines et des neuroleptiques). Nous veillons à ne pas modifier la composition initiale des cages d’hébergement pour ne pas causer un stress supplémentaire aux animaux.
Choix des espèces
Nous utilisons les animaux les plus accessibles pour les travaux pratiques, la plupart des tests comportementaux que nous utilisons ont été mis au point chez les rongeurs (souris principalement ou rat). Souris et rats de 6 semaines, nous travaillons sur des animaux jeunes adultes sans chercher à cibler une population particulière en terme d’âge.