Procédures légères

14 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis rejoindront le troupeau de l'élevage. Leur régime est modifié pour provoquer une sub-acidose du rumen, un inconfort digestif, pendant que des prélèvements par sondage gastro-oesophagien sont réalisés quatre fois et qu'un bolus de mesure du pH est posé dans le rumen. L'objectif déclaré est de tester si l'analyse de l'air exhalé peut détecter ce trouble digestif sur le terrain. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ce désordre et qu'il est "indispensable" de recourir aux bovins.

Objectifs

L'objectif principal du projet est faire la preuve de concept qu’une analyse volatolomique de l’air exhalé par le ruminant peut être un indicateur non-invasif de santé du rumen en discriminant deux situations alimentaires contrastées en termes de densité énergétique : une ration basée sur des fourrages représentant une alimentation non intensive Vs une ration basée sur des céréales caractéristique d’une alimentation intensive. L'objectif secondaire est d'identifier parmi d’autres matrices non invasives, et plus simples à prélever que l’air exhalé, la ou les combinaisons de matrices qui permettent de discriminer simplement sur le terrain l’état de santé digestive des animaux soumis aux situations nutritionnelles précitées. Les quatre autres matrices envisagées en complément de l’air exhalé sont : fèces, urine, lait, poils (contenant de la sueur).

Bénéfices attendus

Description de nouveaux indicateurs non invasifs et rapidement utilisables sur le terrain pour évaluer le bon fonctionnement du rumen sur le terrain. Il est attendu de faire la preuve de concept que la mesure du volatolome grâce à un appareil portable peut etre développée sur le terrain pour evaluer le bon fonctionnement du rumen d'animaux laitiers.

Procédures

Les animaux seront soumis à une modification de régime alimentaire susceptible d'entraîner l'apparition d'un inconfort digestif et une diminution possible des performances zootechniques. L'objectif du projet étant de monitorer les modifications du volatolome de différentes matrices en lien avec les paramètres fermentaires du rumen. Les prélèvements par sondage gastro-oesophagien seront réalisés 4 fois par animal sur la période expérimentale de 10 semaines. La pose des bolus ruminaux de suivi du pH interviendra dès le premier jour de l'expérimentation. Enfin, nous réaliserons des prélèvements de poils (sueur), d'air exhalé, d'urine et de fèces 4 fois sur l'ensemble de la période expérimentale.

Impact sur les animaux

La sub-acidose est un désordre digestif fréquent chez les bovins en production laitière, entraînant un baisse du pH ruminal.

Devenir

Les procédures étant classées "légères", il n'est attendu aucune gêne, stress ou souffrance résiduelle chez l'animal à la fin de l'expérimentation. Les animaux pourront donc rejoindre le reste du troupeau de l'établissement utilisateur et retrouver les conditions de logement, d'alimentation et de vie classique du troupeau laitier.

Remplacement

La sub-acidose est un désordre digestif fréquent chez les bovins en production laitière. Aucun modèle in vitro / in silico n’est actuellement disponible permettant de reproduire de façon fiable et précise ce désordre. L’évaluation de solutions de détection de ce désordre dans le volatolome doit se faire chez l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux recrutés (14 vaches laitières), d'après notre expérience concernant la variabilité individuelle des paramètres fermentaires du rumen, est le minimum pour obtenir des résultats statistiques fiables. Cet effectif a été validé par la réalisation d'un test de puissance. Les données zootechnique (production et composition du lait, ingestion, NEC, poids vif, etc…) seront analysées à l’aide de modèles mixtes avec mesures répétées. Les données volatolomique seront analysées selon des analyses déjà reportées pour d'autres bases de données métabolomiques : analyses multivariées et univariés seront utilisées pour étudier l’effet du régime alimentaire au cours du temps . Les analyses multivariées permettront en particulier d’explorer les composés organiques volatiles comme biomarqueurs candidats du régime alimentaire et du fonctionnement ruminal.

Raffinement

Les conditions de logement des animaux en stabulation libre répond aux exigences réglementaires et va même au-delà grâce à des équipements pemettant un confort optimum des vaches (matelas, brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Le recours a des procédures faiblement invasives, mises en oeuvre par du personnel formé et habitué à ces prélèvements, assure que ceux-ci se feront dans les meilleures conditions possibles pour les animaux. Cet essai a également pour but d'évaluer l'intérêt de la mesure de paramètres non invasifs qui pourraient être considérés comme marqueurs de la sub acidose. De ce point de vue le projet est également respectueux de la règle des 3R puisque la mesure d'indicateurs non invasifs pourrait à terme remplacer les mesures susceptibles d'altérer le bien-être de l'animal.

Choix des espèces

Les troubles digestifs chez la vache laitière, tels que la sub-acidose ruminale, sont des désordres courants avec des répercussions économiques importantes en élevage (perte de production, frais vétérinaires...). Le recours à des bovins est indispensable pour étudier le volatolome des différentes matrices susceptibles d'être utilisées pour la détection précoce de ce type de troubles. La sub-acidose n’est pas une pathologie mais un désordre digestif fréquent chez les bovins, laitiers notamment, en production. Nous aurons donc recours à des vaches laitières en lactation.

56 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumis pendant trois mois à un régime obésogène, ils reçoivent un gavage quotidien, quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, des tests de tolérance au glucose et le test du labyrinthe en croix surélevé, pour mesurer les effets d'un extrait végétal sur le poids et le comportement. Le porteur présente cette étude comme une étape avant de passer à l'espèce cible, le chien, et affirme que le rat permet d'analyser des organes non prélevables chez le chien. Sur le remplacement, il conclut à l'absence de méthodes in silico et in vitro capables de répondre aux questions posées.

Objectifs

Les plantes fournissent un ensemble important de composés bioactifs qui forment la base de nombreux produits thérapeutiques. Parmi ces plantes, une est traditionnellement utilisée pour ses propriétés sédatives, anti-spasmodiques et anti-inflammatoires et son extrait sera utilisé pour notre étude. L'objectif est d'étudier les effets de la supplémentation en extrait végétal standardisé sur la prise de poids et le comportement chez le rat. Les résultats obtenus nous permettront d'appronfondir ceux réalisés chez le modèle cible, le chien qui ont été menés il y a quelques mois. Notre hypothèse est que la supplémentation en extrait botanique standardisé de la plante étudiée mettrait en jeu des mécanismes multiples (anti-inflammatoire, métabolique, antioxydante, augmentation de la diversité microbienne, réduction du comportement hyperphagique, action calmante) grâce à l'action combinée de ses composants bioactifs dont l'action serait supérieure à celle exercée par le traceur actif seul. Notre premier objectif est d'étudier les effets de notre extrait et de son traceur sur le profil métabolique des rats soumis à un régime obésogène (hyperlipidique/hyperglucidique) par leur suivi clinique et biologique (analyse du microbiote intesinal, des paramètres biochimiques comme les cytokines ou encore métaboliques comme le taux de cholestérol ou de lipides sériques). Notre second objectif sera d'analyser l'effet sédatif de notre extrait végétal standardisé en comparaison à son traceur actif en utilisant le test du labyrinthe en croix surélevé et en dosant un neurotransmetteur dont le rôle principal consiste en une régulation dite « inhibitrice » de l'activité cérébrale, l'acide gamma-aminobutyrique (GABA).

Bénéfices attendus

Les protocoles mis en oeuvre dans le cadre de ce projet devraient permettre de déterminer si l’extrait végétal standardisé testé (comparativement à son traceur) est apte à prévenir l’inflammation et les perturbations métaboliques associées à l'obésité. Notre hypothèse principale est que l’action synergique des composants majeurs (acides phénoliques, flavonoïdes, anthocyanes) de l’extrait végétal standardisé étudié

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions. Pendant 3 mois, 48 rats suivront un régime obésogène (hyperlipidique/hyperlipidique) et la totalité des rats (soit 56 rats) auront 4 prélèvements sanguins sur une période de 3 mois ( à 0, 4, 8 et 12 semaines) d'une durée de 20 min environ par rat ( anesthésie (10 min) + prélèvement sanguin (5 min) + réveil (5 min)) ; 4 tests de 5 minutes dans un labyrinthe en croix surélevé ( à 0, 4, 8 et 12 semaines); 3 tests de tolérance au glucose d'une durée de 2h (prélèvements d'une goutte de sang d'une durée d'1 min à différents temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes); à 0, 6 et 12 semaines); des recueils de selles d'une durée de 10 minutes environ (4 fois, à 0, 4, 8 et 12 semaines) ; et seront gavés oralement quotidiennement pendant 3 mois (chaque gavage durera environ 2 à 5 minutes), puis seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

L'exposition des rats au régime obésogène peut induire des troubles métaboliques, les traitements du projet viseront à les prévenir/réduire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Le remplacement des rats n’est pas possible pour répondre aux questions du projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in-silico et in-vitro). Les rats sont utilisés afin de valider les effets de l'extrait végétal étudié avant de passer sur l'espèce cible : le chien ; pour limiter le nombre d'expérimentations sur celui-ci. L'utilisation du rat nous permet aussi d'étudier des organes, non prélevables chez le chien.

Réduction

Nous utilisons 8 rats par groupes afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement étant répété sur chaque rat, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.

Raffinement

L'exposition des rats au régime hyperlipidique/hyperglucidique peut induire des troubles métaboliques, les traitements du projet viseront à les prévenir/réduire. L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus. Nous utilisons des points limites adaptés et des critères d'arrêt de souffrance détaillés à chaque procédure.

Choix des espèces

Les rats sont acclimatés à l'âge de 6 semaines avant de commencer l'étude à 8 semaines (cycle de 12h jour/nuit). Cela permet d'éviter des résultats faussés par le stress induit lors du changement d'environnement. L'exposition des rats Wistar à un régime obésogène (hyperlipidique/hyperglucidique) permettra d'étudier la capacité de l'extrait végétal standardisé testé à prévenir le développement de troubles métaboliques associés à l'obésité. Les effets de cet extrait végétal ne peuvent être étudiés de manière pertinente sur des modèles in silico et in vitro. Nous utilisons le rat afin de compléter notre étude faite sur l'espèce cible (chien) et ainsi valider les effets de notre extrait végétal standardisé sur le comportement du rat tout en poussant les analyses sur des organes spécifiques (comme l'étude de la réactivité intestinale qui requiert l'analyse de l'intestin en chambre d'organes isolés ou encore le dosage d'un neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central, non prélevables chez le chien.

22 bovins, des vaches en lactation, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, puis réutilisés dans d'autres essais ou gardés pour le renouvellement du troupeau. Elles subissent une restriction alimentaire de six semaines et quatre prises de sang à la queue, pour étudier l'effet d'un déficit d'énergie sur la stabilité du lait à la chaleur. Le porteur décrit une restriction sans sensation de faim, les vaches étant nourries à satiété avec un fourrage peu nutritif. Le projet vise à résoudre un problème industriel de floculation des laits lors des traitements de conservation.

Objectifs

Les laits de consommation subissent des traitements thermiques de type UHT pour permettre leur conservation dans le temps ou des ultrafiltrations pour concentrer certains éléments d’intérêt. Certains laits, pour des raisons mal déterminées, ne supportent pas ces traitements et floculent, soit immédiatement, soit lors de leur conservation en briques. Une meilleure compréhension des causes de la variabilité des instabilités du lait entre systèmes pourrait aider à cibler des leviers par lesquels les problèmes d’instabilité des laits pourraient être limités au niveau des élevages. En particulier, la stabilité des laits pourrait évoluer en fonction de la quantité d’énergie apportée aux vaches laitières. une restriction alimentaire pouvant provoquer une ouverture des jonctions serrées au niveau de la mamelle et une fuite des minéraux solubles vers le sang ce qui déstabiliserait la micelle de caséine du lait. L'objectif du projet sera de caractériser finement les effets d’une restriction alimentaire similaire à celle que l’on peut suspecter en été dans des systèmes relativement herbagers ou à celle vécue durant l'été 2022 sur la stabilité thermique des laits.

Bénéfices attendus

Nous allons mieux connaître les mécanismes de la stabilité thermique des laits afin de résoudre les problèmes sur le terrain. Nous pourrons valoriser ce travail auprès des éleveurs et de l'interprofession laitière. Nous participerons à l'identification de biomarqueurs de stabilité thermique dans le lait afin d'aider les éleveurs à mieux gérer ce problème et à le détecter en amont.

Procédures

Un lot de vaches aura une restriction des apports énergétiques et azotés pendant 6 semaines. Les vaches laitières auront une prise de sang à la queue toutes les 2 semaines pendant 8 semaines, soit 4 prises de sang.

Impact sur les animaux

La diminution des apports alimentaires se fera grâce à l'apport d'un fourrage pauvre en nutriments mais très encombrant dans le rumen des vaches laitières. Du coup, les vaches seront alimentées à satiété tout en ayant un apport restreint en énergie et en azote. Cela évitera toute sensation de mal être liée à cette restriction des apports énergétiques et azotés. Les prises de sang seront réalisées à la queue, partie de l'animal peu douloureuse et ces prises de sang à la queue sont moins stressantes qu'à la jugulaire. Les vaches seront bloquées au cornadis comme au moment de l'alimentation, donc aucun stress lié à ce blocage car elles sont habituées (pratique quotidienne).

Devenir

Les animaux n’ayant subi aucune intervention invasive, ni traitement susceptible d’avoir des effets importants sur leur santé et/ou survie seront conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable des installations expérimentales. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci est effectivement possible .

Remplacement

L'expérimentation concerne directement la qualité du lait. Il est donc impossible de se passer des vaches laitières qui produisent ce lait.

Réduction

Le nombre de vaches laitières a été calculé pour pouvoir mettre en évidence des différences entre les traitements. Compte tenu du schéma expérimental en continu, il est difficile de diminuer le nombre de vaches laitières.

Raffinement

L'expérimentation est basée sur le lait. Les seuls actes invasifs sont des prises de sang (4 au cours des 8 semaines d'expérimentation). Leur nombre est vraiment faible. Ces prises de sang seront réalisées à la queue, partie de l'animal peu douloureuse. Les vaches seront bloquées au cornadis comme au moment de l'alimentation, donc aucun stress lié à ce blocage. Les vaches seront maintenues dans leur environnement d’élevage habituel qui est parfaitement adapté à leurs besoins comportementaux, environnementaux, sanitaires, et elles ne seront jamais en isolement social. Les prélèvements et la surveillance des animaux se feront par des personnes compétentes et habilitées.

Choix des espèces

Vache laitière de race Prim’ Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches laitières seront des vaches adultes en milieu de lactation (vêlages compris entre fin septembre et début décembre). Au cours de l’expérimentation, ces vaches seront à différents stades de gestation.

90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Une inflammation cérébrale est provoquée chez le raton entre le premier et le cinquième jour de vie, puis les animaux passent à l'adolescence une série de tests comportementaux, activité spontanée, activité locomotrice et mémoire de travail, avant d'être tués pour prélever le cerveau. Le porteur présente l'isolement de deux heures comme "indispensable" pour mesurer l'activité de chaque individu. Le modèle reproduit les lésions cérébrales du grand prématuré, avec l'espoir de tester à terme des thérapies cellulaires.

Objectifs

Lorsque le cerveau est en développement et qu'il subit un stress inflammatoire des lésions peuvent apparaître. Cela peut être délétère pour son développement. La conception de thérapies est donc une priorité. Chez le rat, l’injection d’une protéine entre les jours 1 et 5 induit une inflammation du cerveau à un stade du développement cérébral correspondant au 3° trimestre de grossesse chez l’homme. Le modèle constitue donc un outil efficace de compréhension des processus inflammatoires affectant le cerveau du prématuré et permet d’évaluer de nouvelles stratégies protectrices. Ce modèle a été mis au point dans le cadre d’une collaboration par un autre établissement utilisateur. Dans ce projet nous allons caractériser le comportement des ratons à l’adolescence. Nous étudierons l’activité spontanée des animaux, leur activité locomotrice ainsi que leur mémoire de travail. L’objectif sera de déterminer l’impact des lésions cérébrales sur le comportement des rats. A la fin de ce projet les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir analyser leurs cerveaux en IRM.

Bénéfices attendus

La prématurité est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Les lésions cérébrales sont majoritairement la conséquence de la présence d’une inflammation, qui peut être induite par différentes causes, par exemple une infection, pendant la fin de la grossesse et dans les jours suivant la naissance. Ce stress inflammatoire périnatal, subi par une grande majorité des enfants prématurés, atteint les cellules cérébrales qui sont encore en développement, et donc particulièrement vulnérables. Les lésions cérébrales induisent des handicaps moteurs, des déficits cognitifs et des troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte. Malheureusement, aucune thérapie spécifique de ces lésions n’existe à ce jour. L’amélioration du pronostic de cette pathologie repose donc sur la découverte de nouvelles stratégies. Ce projet vise à tester les effets potentiellement thérapeutiques des cellules capables d’agir sur la réparation et la régénération des tissus, dans les lésions cérébrales induites par la neuro-inflammation. Pour cela, nous utiliserons un modèle de neuro-inflammation chez le raton. Ce modèle reproduit la pathologie humaine de l’enfant prématuré. Nous pourrons ensuite dans ce projet tester l’effet d’administration des cellules sur le comportement des animaux. Cela permettra à long terme d’améliorer les futures thérapies pour ces lésions cérébrales.

Procédures

Les tests comportementaux auront les durées suivantes : -Activité spontanée des animaux durée du test : 2h - Activité locomotrice durée du test : 30 minutes - Test de la mémoire de travail : 5 minutes Les animaux seront anesthésiés avec des anesthésiques (durée de l’injection moins d’une minute) avant d’être perfusés par voie intracardiaque avec une solution tampon afin de prélever leurs cerveaux pour réaliser des analyses IRM (durée 30 minutes).

Impact sur les animaux

Pour connaitre l’activité spontanée des animaux, ils seront isolés pour une période de 2h. Cet isolement permet de connaitre la valeur de chaque individu et est indispensable pour pouvoir conclure sur ce paramètre.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses IRM.

Remplacement

Le remplacement total des analyses in vivo par des stratégies in vitro n’est pas envisageable actuellement, car les mécanismes impliqués dans les lésions cérébrales mettent en jeu l’interaction de plusieurs types cellulaires au cours du développement cérébral qu’il est impossible de reproduire en culture. Il est donc indispensable d’associer, aux études in vitro, des études chez l’animal soumis à un stress inflammatoire qui reproduit ces lésions.

Réduction

Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 15 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. En fonction de la répartition des données nous utiliserons un test statistique paramétrique ou non paramétrique pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (Lésions cérébrales, contrôles, Lésions cérébrales+ traitement) : activité exploratoire, locomotrice, mémorisation.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort des animaux et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupération, d’au minimum une semaine, entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Au vu de la littérature, le rat est une espèce très utilisée pour la réalisation des modèles de neuro-inflammation et de lésions cérébrales. L’étude au sein de laquelle ce projet est intégré regroupe par ailleurs d’autres modèles animaux (2 modèles chez le rongeur et deux modèles chez le mouton). L’inflammation du cerveau sera induite chez le raton entre le jour 1 et le jour 5, stade correspondant au 3ème trimestre de grossesse chez l’homme, soit la période de naissance prématurée. Les animaux seront ensuite testés autour du 40 ème jour de vie afin d’analyser les effets comportementaux des lésions et les effets du traitement.

6 vaches laitières vont être utilisées, gardées vivantes et réutilisées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent six prélèvements de fèces, de lait, d'urine et de sang au cours de l'essai, pour tester l'effet d'une levure vivante ajoutée à une ration pauvre en protéines sur la production laitière et les émissions de méthane. Le porteur met en avant un "gain économique" et une réduction de l'empreinte environnementale. Il justifie un effectif de deux vaches par groupe par un plan expérimental croisé où chaque animal est son propre témoin.

Objectifs

L'objectif de ce travail est d’étudier l’effet de la supplémentation de la levure vivante Actisaf sur les performances de production laitière, la physiologie (digestibilité, métabolisme azoté, fermentations ruminales), la prédiction des émissions de méthane par les acides gras du lait chez la vache laitière

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont multiples : 1) tester l’effet de levure vivante sur les performances zootechniques, 2) comprendre si la levure vivante ajoutée dans une ration pauvre en protéines permet les même performances qu’une ration riche et par conséquent assurer un gain économique en réduisant l’empreinte environnementale, 3) comprendre l’effet de la levure vivante sur le métabolisme, fermentation ruminales et statut immunitaire avec des rations contrastées

Procédures

Prélèvements de fèces, de lait, d'urine et de sang à raison de 6 prélèvements par vache sur la totalité de l'essai

Impact sur les animaux

Même si toutes les précautions seront prises durant l’essai pour atténuer les effets indésirables sur les vaches, il se peut que les animaux soient dans un état d’inconfort lors de leurs contentions pour des prélèvements de sang par exemple.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie à l'issue de chaque procédure. Durant la procédure expérimentale, il n’y aura pas d’intervention qui nécessite l’arrêt de l’utilisation des vaches après la fin de l’essai. Les vaches continueront à être hébergées dans les même conditions (bâtiment, aliment, soin), surveillées par des personnes dédiés (chercheurs et techniciens) et aussi par des vétérinaires si besoin. Les prélèvements durant l’essai n’engendrent pas une dégradation de l’état général des animaux, ni leur bien-être. Notre procédure est de classe légère et par conséquent permet la réutilisation des animaux après la fin de l’essai.

Remplacement

La digestibilité varie selon les rations et aussi d’un animal à un autre ayant même potentiel de production. Sa mesure nécessite l’utilisation des animaux dans des cages métaboliques pour obtenir des résultats pertinents. Néanmoins, elle peut aussi être prédite par des équations issues de la bibliographie, mais cette estimation nécessite une importante quantité de données pour valider la robustesse du modèle. Dans le cas présent, nous utiliserons la méthode de prélèvement ponctuel de fecès ainsi que la méthode indirecte de mesure de digestibilité (iNDF) in vitro avec incubation des échantillons fécaux et d’aliment. Poiur cette procédure, nous ne pouvons remplacer complètement l'animal mais on substituons une partie du protocole in vivo en in vitro.

Réduction

Nous utilisons un plan expérimental en carré latin qui nous permet de réduire le nombre d’animaux à utiliser dans notre projet. Le nombre d’animaux a été déterminé en utilisant un logiciel statistique et en se basant sur les données bibliographiques. L’essai sera mené en un design expérimental en cross-over. Ainsi, toutes les vaches reçoivent les 3 traitements successivement. L’avantage de l’essai croisé est d’être, à effet identique, plus puissant que l’essai en parallèle. La prise du sujet comme son propre témoin diminue la variabilité de la mesure de l’effet traitement. L’évaluation de l’écart type faite dans le calcul du nombre d’animaux nécessaire (n) tient compte de ce principe. Pour l’étude de performances, d'après le calcul d’effectifs et compte-tenu de la variance connue à ce jour, animaux par groupe permettent de détecter une différence significative (critère continu gaussien) avec un risque de 1ere espèce (faux positifs) de 5% et un risque de 2eme espèce (faux négatifs) de 20% en ce qui concerne les paramètres zootechniques principalement ciblés pendant cette étude. Nous avons donc choisi d’évaluer 2 vaches par groupe Cet effectif est en accord avec les études récentes portant sur les performances zootechiques des vaches ayant reçu des levures vivantes soit en modifiant la teneur en azote dégradables, la teneur en amidon ou la dose.

Raffinement

Pour le raffinement du protocole, nous nous sommes contraints à réduire le nombre d’échantillons à prélever et par conséquent réduire le nombre de manipulation sur les animaux qui pourrait engendrer du stress. Les prélèvements d’échantillons de fèces et d’urine se feront au même moment pour réduire au maximum la manipulation et contention des animaux. Les animaux seront surveillés en permanence pour contrôler leur comportement et chaque risque de souffrance ou de détresse. Des critères physiologiques comme la production laitière, l’état de la mamelle, l’ingestion, le poids et la note d’état corporel serviront comme critères de prise de décision. Des critères d’évaluation allant de 0 à 3 pour chaque critère seront établis avec 0 (état normal) et 3 (changement très important par rapport à la normale). Dans le cas d’un changement important, le recours à l’avis d’un vétérinaire sera pris en compte.

Choix des espèces

La vache est considérée comme une productrice de gaz à effet de serre et donc un modèle pertinent pour notre étude. De plus, à nos connaissances, il n’y a pas d’étude sur les effets de l’ajout de levures vivantes dans des rations pauvre en protéines sur les paramètres zootechniques et environnementaux. L’évaluation des ingestions, de l’efficacité et de la digestibilité n’est possible qu’avec des mesures quotidiennes des quantités ingérées. Dans ce projet, les animaux seront inclus à partir de 45 jours de lactation (variable selon l’adaptation des vaches au auges) car l'objectif étant de tester l'effet du probiotique Actisaf Sc 47 durant cette période.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une greffe de cellules dans la patte sous anesthésie, puis un suivi hebdomadaire de la tumeur et de la prise de poids, avant la mise à mort pour analyser les tumeurs. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer une douleur modérée et que les mesures sur animal vigile causent un stress léger. Il présente le projet comme un moyen de déterminer l'origine cellulaire d'un cancer pédiatrique et affirme que le modèle murin est "nécessaire" pour tenir compte des facteurs physiologiques absents des études in vitro.

Objectifs

Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant l’âge de 15 ans. Malgré des essais cliniques internationaux, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de mieux comprendre leurs particularités moléculaires pour développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet a pour objectif de déterminer si des cancers du muscle fréquemment observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non pas seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules neuronales. Cette question est importante, car la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. Il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés chez les patients atteints par ces cancers du muscle dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Il faut maintenant vérifier que les cellules neuronales transformées donnent des tumeurs dans les muscles. Ce projet permettra de fournir de nouvelles pistes pour comprendre l’origine de ces cancers et améliorer leur traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer si un type de cellules embryonnaires peut être l’origine de certains cancers pédiatriques afin d'améliorer leur prise en charge thérapeutique.

Procédures

Injection anti-douleur / analgésie avant la greffe (Nombre : 1 fois maxi - Durée : 30 s). Anesthésie lors de la greffe (Nombre : 1 fois au moment de la greffe tumorale - Durée : 5 min) Pesée en début de procédure puis 1 fois par semaine (Nombre : 8 fois maxi - Durée : 30 s). Mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte controlatérale avant la greffe puis 1 fois par semaine (Nombre : 8 fois maxi - Durée : 1 min).

Impact sur les animaux

Avant l’implantation intra-musculaire (IM), l’injection en sous-cutanée d’un anti-douleur engendre une douleur légère. L’implantation IM sous anesthésie quant à elle entraine une douleur légère. Le suivi de la prise tumorale va engendrer un stress léger lors de la mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte car ces mesures sont réalisées sur animaux vigiles. Le développement de tumeurs peut engendrer une douleur modérée. L’administration de doxycycline dans l’eau de boisson n’est pas connue pour entrainer de nuisances. En effet, la consommation de l'eau de boisson des souris sera évaluée (moyenne sur 3 jours pendant l'acclimatation) puis après l'ajout de la doxycycline pour évaluer si la consommation d'eau des animaux est réduite.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort si aucune prise tumorale n’est observée ou si un point limite est atteient ou pour effectuer des analyses sur les tumeurs.

Remplacement

Des analyses d'expressions de gènes ont montré que certains rhabdomyosarcomes partageaient des similitudes avec les cellules neuronales. Le modèle animal est le seul permettant de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d'intervenir dans le potentiel tumorigénique de ces lignées cellulaires embryonnaires. Des études in vitro précedemment réalisées ne permettent pas de répondre aux objectifs.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les mutations d’intérêt. D’après les données de la littérature et notre expérience, le taux de prise de greffe sera de minimum 50%. Ces données ont été prises en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.

Raffinement

Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage. Une période d’acclimatation sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d’antidouleur, d'anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer.

Choix des espèces

L’utilisation de ce modèle souris est nécessaire pour étudier le potentiel tumoral des cellules embryonnaires modifiées car ces dernières sont issues du même modèle murin, permettant de s’affranchir du risque de rejet de greffe par le système immunitaire. Les rhabdomyosarcomes sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquelles un sexe-ratio Mâle/Femelle légèrement supérieur à 1 a été rapporté. Toutefois, très variable selon les études, l’âge et la localisation des tumeurs primaires. Par conséquent, nous utiliserons des souris mâles et femelles dans cette procédure afin de ne pas introduire de biais lié au sexe. Les greffes seront réalisées sur des souris de 6 semaines pour une réalisation optimale de l’expérience. En effet à cet âge, d'après la littérature, la prise de greffe est optimale.