Procédures légères

300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de gravité légère à modérée. Ce sont d'anciens reproducteurs réformés, sur lesquels des techniciens s'entraînent à prélever environ 60 mL de sang à l'artère de l'oreille sur animal vigile maintenu en contention, puis un prélèvement intracardiaque sous anesthésie sans réveil qui met fin à l'animal. Le projet ne vise pas la recherche mais la formation aux gestes techniques pour un projet de production de sérum. Le porteur justifie le recours aux lapins par l'impossibilité d'éviter "un minimum de pratiques" après la formation théorique et le tutorat.

Objectifs

Il s’agit d’un renouvellement de projet. Le projet de formation des techniciens animaliers à certains gestes techniques vise à assurer un complément à la formation pratique de base lors de la prise de poste, afin d’assurer le niveau de maîtrise technique requis par la réglementation de la protection animale et par les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF). Cette formation aux gestes techniques est précédée par une première période de tutorat, avec atteinte progressive d’acquis techniques préalables en matière d’approche, de contention et de réalisation des gestes techniques simples (telles les injections sous-cutanées). Arrivé à un tel stade, la technicité des gestes qui font l’objet du présent projet requiert un minimum de pratique en situation de formation avant de poursuivre et affiner par la pratique en conditions réelle sous tutorat. Le projet inclus des gestes techniques sur lapin dans le cadre du projet autorisé.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d'amener les techniciens à acquérir le niveau de maîtrise requis pour les gestes techniques sur le lapin dans le cadre du projet autorisé. La maîtrise technique permet en effet : - de minimiser le risque de douleurs et de stress sur les phases de prélèvements, donc de contribuer à l'objectif de raffinement - de minimiser le risque de pertes de sérum, donc de contribuer à l'objectif de réduction - de répondre aux exigences de qualification au poste exigées par les bonnes pratiques de fabrication (pharmaceutiques)

Procédures

l s'agit de prélèvements sanguins au niveau de l'artère à l'oreille (volume prélevé d'environ 60 mL) sur des animaux vigiles sur lesquels une contention est assurée pendant toute la durée du prélèvement; ainsi que des prélèvements par voie intra-cardiaques sur des animaux préalablement anesthésiés avec une solution constituée par un mélange de xylazine et de kétamine. (anesthésie sans réveil). La durée totale d'utilisation effective d'un lapin est généralement de 5 minutes avec un une limite de 10 minutes avant l'anesthésie sans réveil.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques sur le lapin dans le cadre du projet autorisé sont des prélèvements sanguins à l'artère au niveau de l'oreille. Aucune complication ou réaction secondaire n’est observée à la suite de ce prélèvement. Outre l'attention apportée aux gestes techniques, une attention toute particulière est également portée sur la durée de la contention qui est une source notable de stress dans l'espèce concernée. La contention de l'animal est assuré par une boîte adaptée pendant toute la phase de prélèvement. Les manipulations et les gestes techniques sont effectués sous le tutorat d'un technicien formé et confirmé. Comme décrit par ailleurs, les animaux sont euthanasiés en fin de séance de formation, et donc non réutilisés. Ceci permet d'éviter toute complication éventuelle plus tardive.

Devenir

L'ensemble des animaux qui intègre ce projet sont utilisés pour la formation du geste technique du prélèvement intra-cardiaque qui se termine toujours par la mort de l'animal.

Remplacement

Toutes les alternatives et étapes préalables au recours à des animaux ont été mises en œuvre : formation préliminaire sous tutorat, démonstrations mais il n’est pas possible d’éviter un minimum de pratiques pour les actes techniques décrits dans le présent projet. Une partie des actes techniques décrits dans la demande de projet précédente ont cependant pu être retirés du présent projet.

Réduction

Le nombre d’animaux requis est fonction du nombre d’actes techniques justifiant le recours à l’animal, qui est en réduction ainsi que du nombre de techniciens en prise de poste, qui est variable au cours du temps et non prévisible de façon précise. Le nombre d’animaux mentionné dans la présente demande d’autorisation représente un maximum, et ajusté au strict minimum nécessaire. Tous les animaux utilisés à des fins de formation à des gestes techniques spécifiques sont des animaux anciens reproducteurs réformés pour cause de limite d'âge. Aucune utilisation d’animaux élevés à des fins d’utilisation scientifiques n’est prévue.

Raffinement

L’étape d’utilisation d’animaux à des fins de formation à des actes techniques justifiant le recours à l’animal, est soumise au succès des étapes préalables de formation théorique et pratique, qui incluent une formation préliminaire sous tutorat. Le tuteur est obligatoirement présent et, outre son rôle de formateur, est garant du respect de l’animal utilisé (des points limites sont établis). Selon la difficulté du geste et le niveau d’habilité de la personne formée, le tuteur décide ou non de débuter la formation sous anesthésie sans réveil (il s’agit exclusivement d’animaux anciens reproducteurs destinés à l’euthanasie). Les points limites définis sont : - Un temps de contention limité à maximum de 10 minutes en boîte à contention. - Un arrêt du geste technique en cas de difficulté de réalisation après 3 échecs successifs sur animal vigile (en particulier les administrations intra-veineuses et les prises de sang). - Un arrêt des actes sous anesthésie après maximum de 10 minutes afin d’éviter tout risque de réveil ou d’analgésie insuffisante. - Un arrêt d’utilisation immédiat, sous décision et responsabilité du tuteur pour toute observation, pour tout autre évènement ou observation incompatible avec le classement en procédure légère (en se référant à l’Annexe VIII de la directive 201/63/EU). Par ailleurs, seuls les animaux anciens reproducteurs en parfait état général seront utilisés à des fins de formation. En outre, les animaux présentant un comportement incompatible avec une utilisation en formation (stress excessif) seront également écartés.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est celle avec laquelle le technicien en formation sera amené à travailler. L'ensemble des animaux utilisé dans le cadre de ce projet sont des anciens reproducteurs réformés.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité légère à modérée. Rendues obèses par un régime à 60 % de graisses, hébergées seules, elles reçoivent chaque jour un composé par voie orale, des pesées quotidiennes, des prélèvements sanguins à la queue et un test de tolérance au glucose après jeûne, pour évaluer un candidat anti-obésité. Le porteur indique viser un dossier d'autorisation de mise sur le marché et affirme qu'"il n'existe aucune méthode de substitution". Il précise que cette étude reprend un essai précédent gâché par une panne de climatisation ayant fait monter l'animalerie à 38 °C et tué une partie des souris.

Objectifs

L'étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement d'un composé d'intérêt thérapeutique (sous trois doses), destinés à l'amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Cette étude est un avenant à un dossier qui a déjà été accepté. Vers la fin de l'étude, suite à un problème technique au sein de notre animalerie, lié à un dysfonctionnement de la centrale de traitement d'air pendant la nuit, la pièce d'hébergement est montée jusqu'à 38°C. Cet événement est arrivé 2 à 4 jours avant la fin de l'étude selon les bras expérimentaux. Le métabolisme de la souris est très sensible aux changements de température. Ainsi, même si un nombre limité d'animaux sont morts par cette hausse accidentelle de température, le stress engendré si près du jour de prélèvement par l'étude nous a empêché de réaliser une étude statistique robuste. Pour remettre le contexte de l'étude, l'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré qu'un de ces composés induit une perte de poids corporel associée à une diminution de la prise alimentaire chez des souris obèses. L'objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l'impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris rendues obèses par un régime hyperlipidique (60% de l'énergie issue des graisses) pendant 10 semaines avant démarrage du traitement. Les traitements seront administrés par voie orale pendant les 4 semaines suivantes, pendant lesquelles les animaux seront soumis au même régime enrichi en graisse. Au cours du traitement, les paramètres suivants seront mesurés : poids corporel et prise alimentaire, composition corporelle, glycémie à jeun, tolérance au glucose. Le traitement sera administré à trois doses différentes afin d'obtenir une dose-réponse. Par ailleurs, afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°C).

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - obésité des animaux de part leur phénotype - un hébergement individuel sur toute l'étude - une administration orale quotidienne à partir de D-11 - une pesée quotidienne de D-18 à D-1 - un prélèvement sanguin à la queue à D-3 et D29 - une prise alimentaire et une pesée trois fois par semaine à partir de D1 - une mise à jeûn de 4h - une analyse de leur composition corporelle à D29 - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) à D29 [Mise à jeun pendant 8h, Prélèvements sanguins (1 goutte) 30min avant et à 0, 5, 20 et 60min aprés administration du glucose] De plus, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance.

Impact sur les animaux

La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°). Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins à D-3 et D29, une administration quotidienne per os à partir de D-11, un test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h), une analyse de la composition corporelle et une mise à jeûn de 4h avant euthanasie sont prévus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète de ce composé.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), test de tolérance au glucose (glycémie et aire sous la courbe), glycémie à jeun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas) et les poids des différents organes. De plus, les résultats obtenus dans la précédente étude nous a permis de réduire le nombre d'animaux au composé le plus prometteur.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos et de matériels de nidification. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux, lors de l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés (Procédure 1 : Euthasol en surdose/Procédure 2 : mélange de kétamine/xylazine) avant la dislocation cervicale. Les animaux de la procédure 1 seront euthanasiés par surdose d’anesthésique puis par dislocation cervicale. Ceux de la procédure 2 seront ensuite anesthésiés par l'administration d'un mélange de kétamine/Xylazine et euthanasiés par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

18 202 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures classées en gravité légère à modérée. Les souriceaux de deux à cinq jours sont placés dans des jarres contenant des puces et se vident de leur sang en quelques minutes, sans anesthésie car elle perturberait les insectes, pour maintenir et infecter des colonies de puces destinées à l'étude de la transmission de la peste. Le porteur décrit cette mise à mort comme une douleur "sévère mais très transitoire", alors que les procédures sont déclarées en gravité seulement légère à modérée. Sur le remplacement, il indique qu'un nourrissage artificiel existe mais exige de la peau de souris et davantage d'animaux, et reconnaît chercher une méthode évitant les animaux vigiles sans certitude d'y parvenir.

Objectifs

La peste est une maladie mortelle transmise par les puces (un insecte hématophage strict) et causée par la bactérie Yersinia pestis. Cette maladie qui sévit toujours à travers le monde a ré-émergé dans des régions où elle avait disparu pendant plusieurs décennies. Ce problème de santé publique international est aggravé par l'émergence de souches multi-résistantes aux antibiotiques, l'absence de vaccin commercialisé et l’émergence de puces résistantes aux insecticides. En somme, notre arsenal anti-peste se réduit et il serait incapable d’éliminer un réservoir majeur de la maladie que sont les puces. Il nous faut donc développer de nouvelles stratégies anti-peste. L’une d’entre d’elles ciblerait la transmission du bacille par les puces. Pour cela, il nous en faut mieux comprendre les mécanismes, car ils sont peu documentés. Dans ces circonstances, l’objectif général de notre projet (d’une durée de 5 ans) est un déchiffrement des mécanismes physiologiques et moléculaires expliquant la dynamique de la transmission peste par les puces. Plus particulièrement, le projet à 6 objectifs scientifiques impliquant des animaux : 1. Caractériser la physiologie et le taux reproduction de différentes souches de puces 2. Mettre au point un protocole permettant d’étudier les capacités vectorielles de différentes souches d’intérêt, afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant les conclusions scientifiques. 3. Comparer les compétences et capacités vectorielles des différentes souches de puces à l’aide du protocole développé au point 3. 4. Elucider les mécanismes expliquant des différences de comportement vis-à-vis d’une infection et du comportement alimentaire de différente souches de puces. 5. Mettre point de nouvelles méthodes d’étude d’infection des puces par Yersinia pestis dont une a pour but d’éviter la souffrance animale. 6. Elucider les mécanismes moléculaires d’infection de la puce par Y. pestis en partie à l’aide d’une nouvelle méthode qui requière beaucoup moins d’animaux que la méthode usuelle.

Bénéfices attendus

Le projet permettra une meilleure compréhension 1) de la physiologie des puces, 2) de la capacité des puces mécanismes moléculaires utilisées par Y. pestis pour une infection transmissible par les puces. Elle permettra également peut être de comprendre pourquoi des puces seraient plus résistantes ou non à une infection par Y. pestis. Dans son ensemble, il permettra d’entrevoir le développement de nouvelles stratégies de lutte anti-peste, en ciblant les puces

Procédures

Aucune intervention n'est prévue sur les animaux

Impact sur les animaux

Dans le cadre des élevages, les souriceaux subissent une souffrance transitoire car ils sont inconscients et exsangues en quelques minutes. Dans le cadre des nourrissages autres que celui de l’élevage, le souriceau ressent au maximum une légère gêne mais aucune douleur sévère est apparente. Ceci est lié au fait que la plupart des piqures de puce sont indolores.

Devenir

Tous les animaux restant en vie seront sacrifiés

Remplacement

Aucun système in vitro ne mime la puce ou s'en rapproche. Il est possible de nourrir des puces à l’aide d’un système artificiel. Ce dernier requiert une peau de souris adulte recouvert par 5 ml de sang hépariné fraichement collecté. Ce système artificiel est utilisé pour infecter ponctuellement des puces, mais il ne permet pas de nourrir l’ensemble des colonies de puces nécessaires au projet. L’utilisation de souriceaux présente l’avantage de nécessiter un nombre plus restreint d’animaux par rapport au nourrissage artificiel (1 souriceau contre 5 souris adultes). De plus, elle réduit la manipulation des insectes et donc, le risque de fuite d’insectes infectés ou non. Cependant, dans ce projet, nous cherchons à mettre en place une méthode qui permettrait de ne plus utiliser des animaux vigils pour étudier les mécanismes utilisés par Y. pestis pour infecter les puces. Mais, il n’est pas certain que nous y arriverons.

Réduction

Pour maintenir les colonies de puces infectées ou saines, il faut les nourrir au moins deux à trois fois par semaine en fonction de la souche considérée. Le nourrissage de puces saines se faisant toute l’année, il faut au minimum 104 à 156 souriceaux par colonie saine par an. Le nombre de colonies saines requis pour le projet est réduit au maximum (15 et 3 en moyenne en fonction de la souche) afin d'assurer la mise en oeuvre du projet. Par ailleurs, pour nos projets visant à mettre au point de nouvelle méthode et élucider les mécanismes d’infection, la colonie qui nécessite le moins d’animaux pour son élevage a été choisi. Pour élucider les mécanismes d’infection, nous faisons en partie appel à une nouvelle méthode d’analyse. Celle-ci identifie un gène de Y. pestis requis pour l’infection de la puce en utilisant nettement moins de souriceau que des méthodes usuelles. Il faut en effet, 6 vs 16 souriceaux par mutant (contrôle inclus). De plus, elle permet de tester des mutants en batterie, réduisant encore plus le nombre d’animaux à utiliser puisque le même groupe contrôle est utilisé pour un nombre plus importants de mutant à tester. Bien éthiquement avantageuse, cette méthode peut identifier des mutants dépourvus de gènes qui ne sont pas impacter dans le processus infectieux per se. C’est pourquoi, les mutants identifiés par cette méthode doivent toujours être confirmés par des méthodes plus anciennes. Avec cette ancienne méthode, le nourrissage des puces infectées doit se faire sur une période variant de 1 à 4 semaines en fonction de la question posée, et pour obtenir des résultats exploitables. De plus, les expériences doivent être également menées au minimum trois fois afin de ne pas compromettre la puissance des tests statistiques. C’est pourquoi, nous ne pouvons pas utiliser moins de 6-9 (2 à 3 nourrissages pendant 1 semaine x 3 expériences) et 24-36 animaux (8-12 nourrissages pendant 4 semaines x 3 expériences) par colonie de puces infectées. Néanmoins, pour la plupart des études menées, les puces qui nécessitent le moins d’animaux pour étudier l’infection ont été choisies. Enfin, il convient de mentionner que l'utilisation de souriceau permet de réduire le nombre d'animaux à utiliser par rapport à un système de nourrissage artificiel (1 souriceau contre 5 souris adultes).

Raffinement

En pratique, pour maintenir les colonies saines, le souriceau âgé de 2 à 5 jours est placé dans une jarre contenant une colonie de puces saines. Cette approche induit une douleur sévère, mais très transitoire ; l’animal est exsangue en quelques minutes. Il n’est pas possible d’utiliser d’anesthésiques ou d'analgésiques car cela affecteraient les colonies puces et donc, empêcheraient la réalisation du projet. Dans le cas de maintien de colonies de puces infectées, un souriceau âgé de 2 à 5 jours est placé dans une capsule (sans contention) pendant une heure. L’animal reçoit quelques piqûres lors de cette manipulation, ce qui ne semble pas induire de douleur sévère. Cependant, si l’animal présente une agitation anormale, une douleur et/ou crie, il sera récupéré et sacrifié immédiatement.

Choix des espèces

Nos souches de puce sont des puces de rongeur; elles se nourrissent sur des souris.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 730 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent une chirurgie du cerveau pour rendre des neurones fluorescents, l'insertion d'une micro-caméra intracérébrale, des castrations ou ovariectomies, puis des tests d'agression territoriale, de comportement sexuel et maternel, avant mise à mort par surdose d'anesthésiques. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire et un stress chez les animaux servant d'intrus lors des confrontations, qu'il décrit comme bref et sans effet à long terme. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne reproduit ces comportements et retient la souris pour la sensibilité de son système olfactif.

Objectifs

Le but de ce projet est de mieux comprendre comment certains neurones du cerveau régulent les comportements socio-sexuels (comportement sexuel, agression, comportements parentaux). Nous savons que les neurones qui fabriquent l’enzyme appelée « Aromatase » qui produit l’estradiol (hormone sexuelle) sont impliqués dans différents comportements socio-sexuels. La question est de savoir comment cet ensemble de neurones régule différents comportements. L’hypothèse est qu’il existe des sous populations de neurones exprimant l’Aromatase qui seraient différentes et respectivement impliquées dans des comportements distincts. Pour caractériser ces sous populations, nous allons rendre les neurones Aromatase fluorescents et les filmer, directement dans le cerveau, pendant des comportements socio-sexuels. Nous pourrons ainsi voir quand ces neurones s’activent et si ce sont les mêmes qui s’activent, ou pas, pendant des comportements différents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra donc d’identifier des sous populations de neurones Aromatase importantes pour les comportements socio-sexuels. Nombre de pathologies humaines sont caractérisées par une altération des comportements sociaux et, bien que fondamentales, les données récoltées permettront de mieux comprendre les mécanismes les régulant afin de pouvoir développer de nouvelle stratégies de traitement.

Procédures

Les mâles étudiés reçoivent une chirurgie (30 à 45 min) pour rendre les neurones Aromatase fluorescents via une injection intracérébrale. Ils sont ensuite hébergés individuellement (2 semaines) jusqu’au jour où les comportements sont observés et les neurones filmés. Le matin, la micro camera est insérée dans le cerveau pour filmer les neurones aromatase (30 min). Après un minimum d’1h de repos pour l’animal, 3 comportements sont étudiés : l’agression territoriale (face à un intrus mâle, 5 min), le comportement envers un nouveau-né (5 min) et le comportement sexuel (de 30 min à 2h). Entre chaque comportement, un intervalle de 2h est respecté. Ces animaux sont ensuite injectés en intrapéritonéal avec de l’héparine puis un cocktail d’anesthésiants permettant l’euthanasie. Les femelles étudiées doivent être ovariectomisées (30 min)et supplémentées en estradiol (pose d’un implant sous cutané = 2 min, pendant la même intervention). Afin qu’elles soient sexuellement matures, 3 sessions de comportement sexuel sont réalisées, avec 1 semaine d’intervalle entre chaque session. Pour développer leur comportement maternel, elles devront cohabiter avec des mères pendant 1 semaine. Elles reçoivent ensuite une chirurgie (30 à 45 min) pour rendre les neurones Aromatase fluorescents via une injection intracérébrale. Elles sont ensuite hébergées en groupe (2 semaines) jusqu’au jour où les comportements sont observés et les neurones filmés. Le matin, la micro camera est insérée dans le cerveau pour filmer les neurones aromatase (30 min). 1 injection de progestérone est réalisée afin d’induire la réceptivité sexuelle de la femelle. 4h plus tard, 2 comportements sont étudiés : le comportement maternel (5 min) et le comportement sexuel (de 30 min à 2h). Entre chaque comportement, un intervalle de 2h est respecté. Ces animaux sont ensuite injectés en intrapéritonéal avec de l’héparine puis un cocktail d’anesthésiants permettant l’euthanasie. Certains (certaines) mâles (femelles) non étudiés mais nécessaires pour l’observation des comportements des mâles étudiés, sont castrés (ovariectomisées) (30 min). Les animaux sont ensuite hébergés en groupe jusqu’au jour où les comportements seront observés (agression territoriale uniquement = 5 min d’interaction par session). Les animaux sont réutilisés pour différentes sessions de comportement, ils ne sont donc pas euthanasiés à la fin des comportements.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l'injection des rapporteurs calciques peut induire une douleur post opératoire de palier 2 pendant 2-3 jours. Les castrations et ovariectomies peuvent induire une douleur de palier 1 pendant 2-3 jours post-opératoire. Pour toutes les chirurgies, une récupération totale est attendue après une semaine. Les paradigmes comportementaux d'agression induiront nécessairement un état de stress, temporaire, chez les individus agressés. Il s'agira cependant d'un stress non chronique et d'une durée limitée (10 min maximum d'exposition au stresseur par comportement), n'induisant pas d'effet à long terme. En tout la durée cumulée d'exposition au stresseur sera de 40 min (4 comportements de 10 min avec 1 jour d'interval entre chaque).

Devenir

A l'issu de chaque procédure, les animaux expérimentaux seront euthanasiés par overdose de Ketamine/médétomidine (300/3 mg/kg). Les animaux stimuli seront euthanasiés par automate à CO2, par le personnel animalier.

Remplacement

Aucune étude comportementale ne peut être réalisée par des approches in vitro ou de modélisation : ce projet étudie les régulations entre plusieurs fonctions physiologiques et ou comportementales (olfaction et comportement) qui sont impossibles à reproduire par des méthodes alternatives. De plus, l'activité neuronale est dépendante de l'interconnectivité de ces neurones, elle ne peut donc être réalisée que sur un animal entier.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observées dans la littérature, en tenant compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, l'efficacité des injections et de la mise en place des implants. La taille des échantillons a été obtenue à l'aide d'un test de puissance calculée grâce à un logiciel spécialisé (G* Power). Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaire, nous avons également fait le choix de réutiliser les mêmes animaux pour l'étude de plusieurs comportements.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux avec enrichissement (abri cartonné ainsi que matériel de nidification) avec accès à de la nourriture et boisson ad libitum. Des protocoles d’administration d’analgésiques sont prévus en cas de souffrance de l’animal. Une stratégie d'analgésie est mise en place pour la prise en charge de la douleur per et post-opératoire : un AINS permettant une couverture analgésique de 24h est administré avant l’opération et poursuivi pendant 2 à 3 jours post-opératoire. Une analgésie locale est effectuée au niveau du site d’incision, en plus de l'anesthésie/analgésie générale. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux sont maintenus sur un matelas chauffant et leur température est monitorée afin d'éviter une hypothermie. Un gel ophtalmique est appliqué pour protéger les yeux du desséchement. La fréquence respiratoire est également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal reçoit une dose d’antisédan et la procédure est intérrompue.

Choix des espèces

Nous étudions le rôle de populations neuronales dans les comportements socio-sexuels à médiation olfactive. La souris est une espèce sociale, présentant de façon innée, des comportements socio-sexuels bien décrits, majoritairement régulés par des signaux olfactifs. Les souris sont un modèle expérimental de référence en physiologie de l'olfaction de par l'extrême sensibilité de leur système olfactif. De plus, cette espèce permet des approches génétiques fonctionnelle (génération d'animaux mutants par exemple) qui ne sont pas ou que peu possibles sur d'autres espèces. Les animaux seront tous adultes (8 semaines) au début des expériences

3100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 1200 reçoivent une injection d'une molécule candidate, 1900 subissent des prélèvements de liquides biologiques et des tests de mémoire et de vision, pour étudier le rôle de l'inflammation dans la maladie d'Alzheimer, l'œil servant de "fenêtre" d'observation du cerveau. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer une cataracte passagère, une douleur ou une désorientation spatiale, ces animaux étant alors mis à mort. Il affirme le recours au modèle animal "indispensable" et présente les co-cultures in vitro comme non optimales et à valider in vivo.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de caractériser le rôle du système du complément, partie intégrante de la réaction inflammatoire, dans les démences vasculaires des maladies neurodégénératives liées à l'âge du système nerveux central. La finalité de ce projet est d'identifer des cibles thérapeutiques inflammatoires pour réduire a-les atteintes vasculaires cérébrales/occulaires et b-les dépôts neurotoxiques dans le cerveau des personnes atteintes de maladies neurodégénératives, type Alzheimer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples : 1- la caractérisation du rôle joué par l'activation de l'inflammation dans la mise en place et la progression de la maladie d'Alzheimer; 2- d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le système du complément pour traiter la maladie d'Alzheimer; et 3- de se servir de l'oeil comme fenêtre d'étude du cerveau et voir si il peut ainsi servir de diagnostic cérébral précose de la maladie d'Alzheimer, étant donné que cette pathologie apparait dans l'oeil avant le cerveau.

Procédures

Dans un premier temps, deux procédures seront appliquées pour l'injection de la molécule thérapeutique candidate (Nombre de souris=1200). puis, ces souris seront gardées en vie pendant au moins 1 mois pour évaluer le ou les effet(s) thérapeutique(s) de la molécule injectée et ce par la réalisation de prélèvements des liquides biologiques et de tests cognitifs (vision/mémoire, Nombre de souris=1900). Ces types d'intervention réalisés sur animaux vigiles sont rapides : 1- prélèvements liquides biologiques (5min/animal) , 2-injection (15-20min/animal), et 4-tests cognitifs (analyse de la mémoire (10min/animal) et de la vision (20min/animal).

Impact sur les animaux

Les molécules inflammatoires sont naturellement produites par l'organisme et n'entrainent pas d'effet toxique ou mortelle lors de leur injection ou suppression . Aucun effet indésirable spécifique n'est attendu sur les animaux pour les prélèvements de liquides biologiques et les tests cognitifs. Ces techniques sont couramment utilisées en thérapeutique humaine. L'injection peut entrainer une cataracte passagère, non débilitante et ne laisse aucune séquelle ou effets secondaires délétères, une douleur post-chirurgicale ou un comportement altéré de la souris (désorientation spatiale), dans ce cas les animaux seront observés et sacrifiés le cas échaéant si ils présentent des signes de mal être ou de douleurs.

Devenir

Suite à l'injection de la molécule thérapeutique testée (procédures "dites modérées ") les animaux seront gardés en vie afin de réaliser des tests cognitifs (visuelles et mémoires) et d'évaluer ainsi l'effet thérapeutique de la molécule médicament. Puis, en parallèle des prélèvements sanguins seront effectués et ce pour réaliser une cinétique d'analyse de la mise en place et de la progression de la pathologie. Enfin, suite à ces tests et prélèvements, les animaux seront toutes sacrifiées afin de prélèver les tissus cibles de la pathologie pour en faire leur analyse.

Remplacement

La perte d'une fonction cognitive reflète l’altération d’un organe – le cerveau ou la rétine – dont ni les causes ni les conséquences ne sont réductibles à des processus investigables in vitro. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour disposer d’un modèle de la pathologie capable de reproduire les signes diagnostiques et cliniques de la maladie, tous définis par des paramètres physiologiques et fonctionnels. Bien qu'il existe des sytèmes de co-culture de cellules in vitro, ces systèmes ne sont pas optimaux et les résultats obtenus doivent être validés in vivo. De plus, l'expérimentation in vivo en association avec l'utilisation de souris invalidées, pour l'expression d'un gène codant pour une protéine à potentiel thérapeutique, permet de mieux caractériser le rôle de cette dernière dans la pathogenèse de la maladie étudiée, données difficilement obtenues par des expériences in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot, fixé à 10, a été calculé de façon à optimiser la significativité des comparaisons statistiques. Outre le cerveau, d’autres organes (rétine, foie) seront prélévés et analysés, de manière à obtenir des données additionnelles sans utilisation d’animaux supplémentaires. Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux, des expériences de mise en co-culture de cellules issues des tissus prélevés des différents groupes expérimentaux seront réalisées et devraient ainsi valider les expériences in vivo.

Raffinement

Un suivi quotidien est assuré avec un hébergement des souris en cage collective (5/cage) avec des nids végétaux. Pour chaque animal, les procédures prises séparément sont courtes (

Choix des espèces

La souris a été choisie en raison de l’existence de souris transgéniques dont les gènes d’intérêt ont été modifiés, et ce afin de servir de modèle à la maladie d'Alzheimer. C'est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de fortes ressemblances avec celui de l'homme. Des souris agées de 1, 3, 6, 9 et 12-16 mois seront utilisées. Ces stades ont été précédemment caractérisés comme les stades présentant une évolution incontournable de la maladie d'Alzheimer dans ce modèle murin.

240 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Les oiseaux reçoivent par voie orale le parasite de la coccidiose puis sont pesés et saignés avant leur mise à mort, pour tester si un extrait d'algue ajouté à l'aliment limite l'infection et améliore les "performances zootechniques". Le porteur relie le projet à la réduction des anticoccidiens et antibiotiques réclamée par les plans publics et les consommateurs, et vise une supplémentation utilisable en élevage industriel. Il indique avoir présélectionné l'extrait le plus prometteur par des tests in vitro et revendique une étape de validation sur animaux vivants.

Objectifs

Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques (>1,5 milliards d’euros/an dans le monde). Ces maladies sont provoquées par des parasites à développement intracellulaire obligatoire, Eimeria qui appartiennent au phylum des apicomplexes. La prophylaxie repose sur l’utilisation d’anticoccidiens et sur la vaccination. Le coût élevé des vaccins, l’apparition de résistances aux anticoccidiens et la demande des consommateurs pour limiter l’utilisation des anticoccidiens et des antibiotiques nécessitent le développement de nouveaux moyens de lutte plus naturels. Ce type de demande au niveau national et Européen a été à l’origine du plan Eco-antibio mis en place par le ministère en charge de l’agriculture (2012-2017) qui se poursuit par un nouveau plan Ecoantibio 2 (plan national de réduction des risques d'antibiorésistance en médecine vétérinaire 2017-2021) dont le premier axe est de « Développer les mesures de prévention des maladies infectieuses et faciliter le recours aux traitements alternatifs ». Dans ce cadre, le test d’un supplément d’algue validé in vitro sera testé in vivo à l’homéostasie et lors de l’infection par Eimeria. Les paramètres zootechniques, parasitaires, microbiologiques et inflammatoires seront étudiés dans la perspective d’une amélioration de l’état des animaux.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est que : - Les animaux supplémentés présentent une amélioration de leurs performances zootechniques et de leur santé à l’homéostasie. - Les animaux supplémentés résistent mieux à l’infection (effet anticoccidien) et présentent par conséquent de meilleure performances zootechniques (indice de conversion optimal), moins de lésions, moins d’inflammation. S’il y a un bénéfice de cette supplémentation sur les animaux à l’homéostasie et lors de l’infection, c’est une supplémentation qui pourra être envisagée en situation de terrain puis en élevage. Si les algues ne présentent pas d’effet, les animaux supplémentés devraient présenter des charges parasitaires et des paramètres lésionnels similaires à ceux du groupe contrôle.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite. L’objectif de créer une infection expérimentale per os (0.5ml à l’aide d’une seringue munie d’un embout en silicone (4mm de diamètre ; 2cm de long) ou pipette avec cône de 0.5ml) pour étudier l’effet de la supplémentation en algues à l’homéostasie et lors de l’infection par Eimeria. Les animaux contrôles recevront 0.5ml d’eau. L’inoculation est réalisée au fond de la cavité buccale de l’animal et n’est pas invasive comme le serait un gavage dans lequel l’embout serait inséré jusqu’à l’oesophage. L’inoculation est de courte durée (20s maximum). Aucune douleur n'est attendue suite au gavage. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Elle est effectuée par du personnel expérimenté. Tous les animaux seront régulièrement pesés au cours de l’expérimentation (7, 14, 21, 28 et 35j d’âge) et les animaux qui seront euthanasiés subiront un prélèvement de sang juste avant leur mise à mort. 5ml de sang seront prélevés . L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite. Cependant, une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. L’effet attendu de la supplémentation est d’améliorer l’état des animaux comme par exemple de limiter la perte de poids causée par l’infection et les conséquences négatives de l’infection (lésions, inflammation), diminuer l’excrétion parasitaire. Dans le cas peu probable que l’état des animaux supplémentés et infectés soit pire que les animaux contrôles, l’observation des animaux (2 fois par jour) permettra de déterminer si ceux-ci atteignent le point limite (plumes ébouriffée, prostration, yeux mi-clos, …). Dans ce cas, les animaux seront euthanasiés avant la fin de l’expérimentation.

Devenir

euthanasie des animaux pour prélévements

Remplacement

Dans le but de réduction et remplacement, des expérimentations préliminaires in vitro par des tests d’invasion et développement parasitaires ont permis de sélectionner l’extrait d’algue le plus prometteur. Cependant, l’étude des paramètres zootechniques, parasitaires, inflammatoires, biochimiques, d’analyse du microbiote et du métabolome intestinal nécessitent une étape de validation in vivo.

Réduction

Les effectifs sont basés sur les études du laboratoire portant sur les scores lésionnels lors de supplémentation et pour lesquelles il faut en moyenne 14 animaux / groupe entre deux groupes pour avoir une différence significative avec une puissance de 93% avec un seuil alpha de 0.05 pour un test non paramétrique Wilcoxon Mann Whitney. Ces effectifs sont suffisants pour atteindre une saturation de la diversité du microbiote via des courbes de raréfaction dans des conditions d’élevage similaires et permettront donc les analyses microbiotes prévues.

Raffinement

Les poulets seront hébergés dans des conditions environnementales contrôlées, ils disposeront d’un enrichissement social et comportemental (dans les cages : petites rondelles en inox suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans et un tapis avec des mailles serrées pour soulager les pattes).

Choix des espèces

Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. Des poulets de chair mâles et femelles de type conventionnel Ross 308 seront utilisés dans l’étude pour être dans les conditions les plus proches de celles des élevages industriels, et auront un statut sanitaire exempts d'organismes pathogènes spécifiés (EOPS). Les animaux seront utilisés dès l’éclosion et seront ou non supplémentés dès le début de vie de l’animal pour évaluer l’effet de la supplémentation alimentaire en extraits d’algues sur la croissance de l’animal, ses performances zootechniques, le développement de leur microbiote et de leur système immunitaire. Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à environ 2 semaines d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire.