Procédures légères
Evaluation de l’innocuité et de l’effet protecteur d’un vaccin à base de vésicules de membranes externes d’Entérobactéries dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une primo-vaccination et deux rappels de nanoparticules bactériennes par des voies variées, puis une infection par gavage avec un pathogène, avec des prélèvements de sang à la lancette et de fèces jusqu'à l'euthanasie par dislocation cervicale. Le porteur indique que les endotoxines des nanoparticules peuvent provoquer un choc septique et que l'infection entraîne perte de poids et diarrhée pendant deux à trois semaines. Il revendique un recours "irremplaçable" à l'animal, le vaccin étant destiné aux animaux réservoirs pour limiter des E. coli zoonotiques.
Objectifs
Escherichia coli est une bactérie qui colonise le tube digestif de l’Homme et des animaux à sang chaud dès la naissance. Certains sous-groupes d’E. coli sont pathogènes et ont pour réservoir principal les animaux. Ces E. coli pathogènes causent des maladies zoonotiques. Une des manières de prévenir ces maladies humaines est de limiter la colonisation des E. coli pathogènes présents au niveau du réservoir animal. La vaccination est l'un des moyens mis en œuvre pour limiter cette colonisation. Notre projet a pour objectif de tester un nouveau type de vaccin à base de nanoparticules bactériennes. Les nanoparticules sont reconnues par les cellules immunitaires, induisent une réponse immunitaire et ont des propriétés auto-adjuvantes, les rendant attractives pour une application vaccinale. De plus, les nanoparticules sont spontanément produites par les bactéries, leur coût de production est donc très compétitif. Enfin, elles peuvent présenter des antigènes dans leur conformation native. Notre objectif est de développer un vaccin dérivé de nanoparticules exprimant des antigènes spécifiques des E. coli pathogènes d’intérêt. Nous souhaitons obtenir la preuve de concept de l’innocuité et de l’efficacité de notre vaccin chez un modèle murin. Nous voulons confirmer que notre vaccin permet d’induire une réponse immunitaire suffisante pour diminuer le portage d’un pathogène spécifique de la souris. Les objectifs de notre projet seront d’évaluer (i) l’innocuité, (ii) la réponse immunitaire induite et (iii) la protection conférée contre une infection à une bactérie pathogène spécifique suite à l’administration de notre vaccin chez la souris.
Bénéfices attendus
Le but final de ce projet est d’utiliser les nanoparticules comme vaccin chez l’animal réservoir afin de diminuer le portage des E. coli pathogènes. Les tests effectués sur les souris nous servirons de preuve de concept. Le but de cette preuve de concept est de s’assurer de l’innocuité de notre vaccin et qu’il confère un effet protecteur aux souris contre le pathogène spécifique. Si cela est le cas, ces tests nous permettront alors de déterminer la dose/poids optimale et la meilleure voie d’administration du vaccin permettant de développer une réponse immunitaire adaptée et spécifique contre notre antigène d’intérêt. Toutes ces informations sont cruciales pour tester par la suite notre vaccin chez le réservoir animal. A plus long terme, notre stratégie vaccinale que nous testons ici sera développée avec d’autres antigènes présentés afin de cibler d’autres bactéries pathogènes, des virus, etc.
Procédures
Les souris recevront une primo-vaccination et deux rappels avec des doses différentes de nanoparticules (pour chaque lot 1, 2 et 3) ou avec une solution physiologique témoin (pour le lot 4 contrôle). Trois voies d’administration des nanoparticules ou de la solution physiologique témoin seront testées parmi les suivantes : la voie intra-péritonéale ou le gavage oral ou la voie intra-nasale ou la voie intra-musculaire ou la voie sous-cutanée. Il y aura deux semaines d’intervalle entre chaque vaccination (J0, J14 et J28). Deux semaines après la dernière vaccination (J42), les lots 1, 2 et 3 resteront inchangés. Le lot 4 sera divisé en deux afin de constituer un lot non vacciné et infecté (lot 4) et un lot non vacciné et non infecté (lot 5). Toutes les souris des lots 1, 2 et 3 et du lot 4 seront infectées une seule fois par gavage oral avec la solution physiologique témoin contenant le pathogène spécifique à l’aide d’une sonde de gavage. Différentes concentrations du pathogène spécifique seront testées afin d’étudier l’efficacité de note vaccin contre une faible et une forte concentration du pathogène. La solution physiologique témoin sera administrée une seule fois par gavage oral avec une sonde de gavage au lot 5 constituant le lot non vacciné et non infecté. Deux semaines après l’infection (J56), tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Pour chaque lot de souris, un prélèvement de sang à la veine mandibulaire sera effectué à différents stades de l’expérimentation : le jour précédant la première vaccination (J-1), puis 1 fois/semaine à partir de la première vaccination. 100µL de sang seront prélevés sur chaque animal avec une lancette. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie gazeuse avec de l’isoflurane à 2L d’air/minute. Après infection avec le pathogène spécifique (J42), des prélèvements de fèces seront réalisés 3 fois/semaine le matin jusqu’au jour de l’euthanasie (J56). Les prélèvements seront effectués à l'anus grâce à une contention.
Impact sur les animaux
Bien que les nanoparticules ne se répliquent pas et ne peuvent donc pas générer une infection chez les souris, la présence d’endotoxine à leur surface pourrait avoir des effets indésirables sur les souris et engendrer, dans le pire des cas, un choc septique dans les 48h qui suivent l’administration des nanoparticules. Ces effets indésirables seront évalués par l’observation quotidienne et par des pesées 3 fois/semaine des souris ainsi que par la détermination des signes cliniques (état général des animaux, poids, poil, prostration, comportement, yeux, température du corps). De plus, l’évaluation de l’effet protecteur du vaccin se fera via une infection avec un pathogène spécifique des souris. Chez la lignée de souris choisie, l’infection avec ce pathogène spécifique n'induit pas de pathologie aigüe mais une légère maladie caractérisée par une perte de poids modeste et transitoire ainsi qu'une légère diarrhée due à une inflammation minime au niveau de l’intestin. Les symptômes décrits peuvent durer 2 à 3 semaines. Après, l’élimination du pathogène se fait spontanément. Si aucun effet protecteur n’est obtenu, il conviendra de changer certains paramètres tels que l’administration des nanoparticules ainsi que leur dose, ce qui est déjà envisagé dans les procédures décrites.
Devenir
A la fin de la procédure n°1, tous les animaux seront gardés en vie afin qu'ils soient dirigés vers la procédure n°2, si les signes cliniques observés ne sont pas jugés trop sévères. A l'issue de la procédure n°2, tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale dans le but de faire des prélèvements d’organes et d’observer l’effet du vaccin et de l’infection au pathogène spécifique sur les souris.
Remplacement
Le recours à l’animal est irremplaçable car le vaccin candidat est destiné aux animaux et aucun autre modèle (notamment in vitro) ne permet d’évaluer l’innocuité de notre vaccin sur l’organisme, la réponse immunitaire induite ainsi que son effet protecteur contre une pathologie induite par un pathogène spécifique de la souris.
Réduction
Dans le cadre de la réduction de l'utilisation d'animaux de laboratoire, le nombre d'animaux a été limité au maximum : 3 lots de 5 animaux + 1 lot de 10 animaux contrôle par paramètre. Les paramètres testés seront la dose de nanoparticules, la voie d’administration des nanoparticules et la concentration du pathogène spécifique des souris. Nous testons tous les paramètres indispensables nécessaires au développement d’un vaccin. Les nombre de lots d’animaux sont multipliés par trois car nous effectuerons les expérimentations trois fois afin obtenir un résultat statistiquement interprétable.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées au nombre de 5 par cage, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 2 fois par mois. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement. Tout animal présentant des signes de douleur, souffrance ou angoisse sera euthanasié. Également, lors de l’injection des nanoparticules par voie intra-nasale (procédure n°1) ainsi que lors des prélèvements de sang, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse avec de l’isoflurane à 2L d’air/minute afin d’éviter tout stress. Enfin, aucun analgésique ne sera utilisé puisque qu’aucune chirurgie n’est prévue lors des procédures.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude de l’établissement de la colonisation intestinale. Dans le cadre de notre projet, l’infection intestinale réalisée chez la souris reflète la colonisation intestinale rencontrée chez les animaux réservoir. Les souris seront âgées de 5 à 8 semaines en début de projet. Dans la littérature, les souris soumises à une infection intestinale sont classiquement âgées de 6 à 8 semaines, âge auquel elles sont considérées adultes. Nous prenons une marge d’une semaine pour permettre l’acclimatation.
Entrainement / formation et nouvelles techniques d’imagerie
- Formation professionnelle
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles servent à entraîner de nouveaux personnels aux gestes de contention, d'injection intraveineuse et de prélèvement sanguin, ainsi qu'à caler des séquences d'imagerie, avant d'être tuées en fin de semestre pour un apprentissage de l'anatomie. Le projet ne vise pas à produire des connaissances mais à former des manipulateurs et valider des protocoles. Le porteur affirme que la mise en situation réelle reste nécessaire malgré l'existence de simulateurs et de fantômes.
Objectifs
Notre laboratoire a pour activité principale l’imagerie du petit animal qui peut être réalisée après injection de produits radioactifs. Il accueille régulièrement de nouveaux arrivants que nous devons former à notre activité afin que leurs gestes soient maitrisés. Cette maitrise est indispensable pour le bien-être animal mais également à la prévention de tout accident lié à la manipulation de radioactivité. La mise en place de nouvelles séquences d’imagerie peut également requérir des tests à réaliser chez l’animal, ce projet nous permettra de les réaliser. Les objectifs de ce projet sont donc multiples : 1- Permettre aux nouveaux arrivants de maitriser les techniques de manipulation et contention des animaux. 2- Permettre la formation à l’administration de composés en particulier par voie intraveineuse (la maitrise de cette technique étant indispensable pour obtenir une imagerie pertinente scientifiquement, ce qui constitue le cœur de notre activité). 3- Permettre la formation aux prélèvements sanguins qui peuvent être réalisés au cours de nos travaux. 4- Former au déroulé de l’imagerie in vivo (scanner, imagerie nucléaire (après injection d’un traceur radioactif) et IRM) mais surtout mettre en place de nouvelles procédures d’imagerie (en particulier de nouvelles séquence d’IRM).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de former les nouveaux arrivants en particulier au geste délicat de l’injection intraveineuse à la veine de la queue qui doit impérativement être maitrisé pour une bonne pertinence des imageries réalisées dans nos projets. Ce projet permettra également en amont de nouvelles études de valider nos protocoles d’imagerie. Nous pourrons ainsi diminuer le nombre d’animaux résidus utilisés dans nos projets (moins d’animaux supplémentaires à prévoir pour palier à une maîtrise approximative des gestes techniques).
Procédures
les animaux subiront les actes suivant (au maximum 1 acte par semaine): * Préhension / contention : le transfert des souris d’une cage à l’autre ainsi que les techniques de contention de base. Durée : quelques minutes * Administration d’un produit neutre (eau ou sérum physiologique) par différentes voies : intraveineuse, orale, intrapéritonéale et sous-cutanée sous anesthésie lorsque cela est possible. Durée : quelques minutes * prélèvement sanguin sous anesthésie isoflurane. Cette technique ne sera pas répétée plus de 3 fois à une semaine d’intervalle sur chaque animal. Durée : quelques minutes * Test d’imagerie in vivo avec ou sans injection sous anesthésie isoflurane. L’imagerie se déroulera au maximum sur 1h30.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans ce projet ne devraient pas être soumis à une quelconque douleur supérieure à celle de la piqure d’une aiguille. L’encadrement strict des manipulations (pas plus d’une manipulation par semaine, pas plus de 3 piqures au même site) ainsi que la supervision par un personnel maitrisant les techniques permettra de s’assurer du bien-être des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de semestre au maximum afin de former à l’anatomie des souris, réaliser des prélèvements d’organes et les suivis sanitaires de notre EU.
Remplacement
Si la plupart des gestes peuvent être expliqués sur « simulateurs » et la plupart des techniques d’imagerie testées sur phantoms (tubes en plastique remplis d’eau), la mise en situation réelle est nécessaire pour valider la maitrise des gestes.
Réduction
La réutilisation des animaux pour plusieurs manipulations permet de réduire le nombre d’animaux total utilisés. L’effectif des animaux utilisés sera réduit à son maximum en fonction du programme d’études du semestre afin de s’adapter aux besoins du laboratoire. Le maximum de n=24 souris par semestre pourra donc être réduit si une souche de souris n’est pas prévue d’être utilisée ou si le nombre de personnes à former est réduit. De plus les animaux utilisés dans ce projet permettront de réduire le nombre d’animaux total utilisés pour nos autres études. En effet, la validation des techniques d’imagerie en amont de nos études ainsi que l’entrainement aux différentes techniques comme l’injection intraveineuse permet de mieux maitriser les risques et ainsi 1) d’éviter de multiplier les études identiques qui pourraient échouer du fait d’un problème de manque de maitrise technique et 2) réduire les animaux en surplus qui pourraient être inclus à nos études du fait d’une maitrise technique insuffisante.
Raffinement
L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. En effet les animaux seront placés sous anesthésie sur un lit chauffant et aucune douleur n’est attendue. De plus, la majorité des autres procédures (injection intraveineuse / prélèvements) est réalisée sous anesthésie sur plaque chauffante réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Une attention particulière sera également portée à la phase de réveil post-anesthésie. Enfin, un délai d’une semaine est imposé entre chaque acte réalisé sur l’animal afin d’éviter tout effet cumulatif des procédures et préserver le bien-être animal.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux les plus utilisés dans nos domaines de recherche (oncologie, cardiologie et pneumologie). Les rongeurs sont un modèle de choix en imagerie car leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Les animaux seront commandés à l’âge de 5-6 semaines et seront utilisés jusqu’à l’âge de 7-8 mois (ou lorsque leur taille ne leur permettra plus de les placer dans les lits d’imagerie). L’âge des animaux a été choisi pour que la taille des animaux corresponde à celle utilisée dans nos autres projets et que cette dernière soit compatible avec nos lits d’imagerie (qui ne peuvent accueillir des souris trop grosses) sur toute la période d’hébergement soit 6 mois environ.
Cycle de remplacement des dents pharyngiennes chez le cichlidé Astatoreochromis alluaudi
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
80 poissons cichlidés Astatoreochromis vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson est anesthésié et reçoit une injection intrapéritonéale de marqueur, puis est conservé un temps variable avant d'être tué par surdose d'anesthésique pour prélever ses mâchoires. Le projet mesure la durée du cycle de remplacement des dents pharyngiennes de cette espèce. Le porteur indique que des approches numériques existent mais restent limitées aux mammifères, et affirme devoir poursuivre des études in vivo pour développer un modèle adapté.
Objectifs
Le but du projet est de déterminer la durée du cyle de remplacement des dents pharyngiennes chez le cichlidé Astatoreochromis afin de mieux comprendre la plasticité dentaire et élaborer des modèles de plasticité dentaire. En moins de 200 000 ans, une grande variété de morphologies dentaires s’est mise en place chez les espèces cichlidés des grands lacs africains à la suite de radiations adaptatives parallèles. L’Astatoreochromis alluaudi est une espèce de cichlidé du lac Victoria et des cours d’eau environnant ; malachophage non obligatoire il possède un profil alimentaire varié. Sa mâchoire pharyngienne inférieure est particulièrement plastique et change en fonction de son alimentation. En particulier, une modification du régime alimentaire provoque des changements morphologiques au niveau des dents pharyngiennes. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. De ce fait, l'Astatoreochromis alluaudi est une espèce absolument unique pour la réalisation de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet aura des implications importantes pour notre compréhension du rôle du développement dans la dynamique des radiations évolutives post-crises. Il permettra également de mieux exploiter les fossiles d'espèces qui ont vécu au moment de la transition Permien-Trias qui représente un des épisodes majeurs d'extinction massive d'espèces et de mettre en évidence certains des mécanismes sous-jacent aux phénomènes d'extinctions massives tel que nous vivons actuellement.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés individuellement par balnéation et recevront une unique injection intrapéritonéale. L'intervention durera une dizaine de minutes en incluant l'anesthésie, l'injection et le reveil. Les animaux seront ensuite conservés pour des durées variables puis mis à mort par surdose d'anesthésique en balnéation afin de prélever leurs machoires pour analyse.
Impact sur les animaux
Faibles. Le projet implique de réaliser, en début de protocole, des injections péritonéales qui peuvent présenter dans de rares cas des séquelles. Une vigilance particulière sera donc apportée lors de la récupération des animaux après ces injections. Pour le reste du projet, les animaux sont conservés en groupe sociaux et nourris suivant un régime alimentaire équivalent à celui qu'ils adoptent dans le milieu naturel.
Devenir
L'analyse de la forme des dents nécessite de prélever les mâchoires des animaux et de réaliser des coupes qui seront analysées au microscope. Ceci nécessite donc la mise à mort de l'ensemble des animaux utilisés dans le projet.
Remplacement
Des approches in silico existent pour l'étude de la topologie dentaire malheureusement elles ne sont adaptées qu'aux mammifères. Nous souhaitons développer des modèles numériques équivalent mais qui soient adaptés aux espèces que nous étudions. Pour développer ces modèles, il est nécessaire de poursuivre des études in vivo pour fournir les données nécessaires à leur élaboration. Une fois établis, ces modèles pourront être utiliser pour étudier la topologie dentaire d'autres espèces de vertébrés.
Réduction
L’organisation du projet en 3 procédures distinctes permet de réduire le nombre d’animaux utilisés sur l’ensemble du projet. La première procédure permet de définir avec précision la dose de calcéine nécessaire à un marquage efficace. La seconde procédure permet d'évaluer la durée du cycle de remplacement dentaire avec un pas de temps important (2 semaines). Elle permet de fournir une durée approximative du cycle qui sera utilisée dans la troisième procédure pour évaluer avec une meilleure précision la durée du cycle (précision à 2 jours). Cette organisation permet de limiter le nombre d'animaux utilisés à 80 (20 pour la première procédure et 30 chaque pour les deux suivantes). Un approche statisitique sera utilisée pour mettre en évidence d'éventuelles différences de longueur de cycle entre les dents positionnées au centre et celles positionnées en périphérie de la machoire.
Raffinement
La dose minimale nécessaire au marquage des dents va être déterminée dans la première partie du protocole et sera utilisé dans le reste de l'étude. L'injection intra-péritonéale en début de protocole sera réalisés sous anesthésie et les poissons seront placés dans des bacs de réveil et surveillé lors de leur sortie d'anesthésie. Par ailleurs, les Astatoreochromis sont maintenus en groupes sociaux dans des bacs qui leur permettent d'exprimer leurs comportements naturels. Afin de favoriser le bien-être des animaux, les aquariums disposent d'un substrat (sable) qui permettent aux animaux d'exprimer leur comportement fouisseur. De même, afin de limiter les possibilités d'agression par les individus dominants de nombreuses cachettes (gouttières renversées, pots en terre) sont mises à disposition des animaux. Ils disposent d'une alimentation variée proche de celle de leur milieu naturel. Les animaux sont observés quotidiennement et les animaux malades ou stressés sont isolés et placés dans un environnement différent. Après l'injection péritonéale, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation au site de l'injection. Les signes de déséquilibres homéostatiques seront observés après l'injection(hydropisie, écailles hérissées), ainsi que les signes pouvant indiquer une atteinte de la vessie natatoire (flottabilité positive ou négative). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou d'atteinte à la vessie natatoire seront mis à mort par une surdose d'anesthésique en balnéation (Tricaine 0,2 % tamponnée à pH 7).
Choix des espèces
En moins de 200 000 ans, une grande variété de morphologies dentaires s’est mise en place chez les espèces cichlidés des grands lacs africains à la suite de radiations adaptatives parallèles. L’Astatoreochromis alluaudi est une espèce de cichlidé du lac Victoria et des cours d’eau environnant ; malachophage non obligatoire il possède un profil alimentaire varié. Sa mâchoire pharyngienne inférieure est particulièrement plastique et change en fonction de son alimentation. En particulier, une modification du régime alimentaire provoque des changements morphologiques au niveau des dents pharyngiennes. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. De ce fait, l'Astatoreochromis alluaudi est une espèce absolument unique pour la réalisation de ce projet. Les animaux utilisés seront des juvéniles de moins d'un an.
Développement de nouveaux radiotraceurs de la neuroinflammation par imagerie en tomographie par émission de positons chez le rat
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Équipés sous anesthésie de cathéters veineux et artériels, des rats reçoivent des radiotraceurs, des médicaments ou des inhibiteurs d'enzymes et passent des séances d'imagerie TEP d'une heure, avant d'être tués par exsanguination sous anesthésie profonde pour l'analyse de leur cerveau. 900 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue de chaque procédure, et certains reçoivent leurs injections éveillés, immobilisés quelques minutes dans un tube de contention. Une partie d'entre eux sont des rats transgéniques suivis à différents stades d'une maladie d'Alzheimer, ou des rats injectés d'un vecteur viral, sur lesquels l'équipe veut valider de nouveaux traceurs de la neuroinflammation. Le porteur indique que les rats auront "entre 4 semaines et 6 mois", puis que les rats transgéniques et leurs témoins seront utilisés "à l'âge de 6, 12 et 18 mois".
Objectifs
La tomographie par émission de positons (TEP) est une technique d’imagerie médicale non invasive utilisée à l’hôpital pour le diagnostic qui utilise essentiellement le fluorodésoxyglucose marqué au fluor-18. Le développement de nouveaux radiotraceurs plus spécifiques donne accès à une imagerie moléculaire de hautes sensibilité et spécificité pour le diagnostic et la thérapie et pour une meilleure compréhension des maladies, notamment celles du système nerveux central. L’objectif de ce projet est de caractériser et de valider chez le rongeur de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie TEP en évaluant leur interaction avec des cibles impliquées dans différentes maladies neurodégénératives associées à la neuroinflammation Trois types de caractérisations seront effectuées au cours du projet : - les caractérisations pharmacologiques in vitro aident au choix du radiotraceur et permettent d’optimiser sa structure chimique ; - les caractérisations ex vivo permettent d’étudier la biodistribution tissulaire du radiotraceur et ses métabolites. Lors de cette étape, nous développerons de nouvelles méthodes analytiques originales pour localiser et quantifier les nouveaux radiotraceurs et leurs principaux métabolites dans le cerveau, en amont des étapes de radiomarquage pour maximiser le transfert en clinique et diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Cette première étape de validation nécessitant des animaux est limitante et cruciale dans la sélection des meilleurs candidats ; - l’évaluation préclinique in vivo nécessite ensuite l’administration du radiotraceur chez l’animal afin d’étudier son métabolisme et sa pharmacocinétique plasmatique ainsi que sa spécificité et sélectivité pour la cible d’intérêt par imagerie TEP et de déterminer les paramètres pharmacocinétiques caractéristiques de cette interaction. Cette étape in vivo est indispensable et nous permet d’obtenir les données nécessaires pour l’utilisation ultérieure du radiotraceur chez l’homme (transversalité).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie de la neuroinflammation associée à différentes maladies neurodégénératives à travers des cibles cérébrales impliqués dans le métabolisme des stéroïdes du cerveau comme le cholestérol. En effet, la modification de ces cibles pharmacologiques a été associée à des pathologies comme les maladies d’Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, la sclérose en plaques ou encore l’épilepsie. A court terme, la sélection et la validation de nouveaux radiotraceurs évalués en préclinique (sur les animaux) permettront de tester des molécules plus spécifiques chez l’homme dans des protocoles de recherche. A long terme, le développement et l’utilisation en routine clinique de traceursspécifiques de la neuroinflammation pourraient permettre le diagnostic, le suivi et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques dans des maladies neurodégénératives pour lesquelles il n’existe que très peu ou pas de traitement efficace, en particulier dans la maladie d’Alzheimer. Ces marqueurs permettront également d’optimiser les traitements en matière de dose et de limitation des effets toxiques potentiels. Cela implique l’étude et la compréhension de l’action des traitements et de leur devenir dans l’organisme.
Procédures
Dans ce projet, les interventions sur les animaux seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane afin de limiter au maximum douleur, souffrance et angoisse. Elles comprennent la pose de cathéters veineux/artériels (environ 15 min) pour les prélèvements sanguins, les injections de produits (durée
Impact sur les animaux
Les radiotraceurs développés dans ce projet seront administrés à doses extrêmement faibles, ce qui limite voire élimine tout risque de toxicité. Concernant les autres molécules utilisée, les doses chez l’animal sont généralement connues dans la littérature, notamment chez les rongeurs, en terme d’efficacité et d’effet secondaires. Ainsi aux doses prévues dans cette étude, aucune toxicité n’est attendue. Cependant, des effets indésirables ou nuisances possibles comme du stress, changement de comportement, douleur éventuelle peuvent provenir des manipulations (en particulier lors de l’injection d’une durée maximale de 5 min ou lors de la phase de réveil d’une durée maximale de 60 min avant l’euthanasie) oudes pathologies induites (animaux AD en particulier).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter le cerveau (et autres organes) pour des analyses ex vivo (radio-HPLC, spectrométrie de masse, immunohistochimie, autoradiographie…).
Remplacement
Nous mettons en œuvre de nombreuses approches in vitro pour les premières caractérisations des radiotraceurs et la sélection des meilleurs candidats. Ces expériences sur membranes, homogénats tissulaires, cellules, protéines recombinantes nous permettent d’estimer leur affinité et leur sélectivité pour une cible d’intérêt et de détecter leurs principaux métabolites et les enzymes responsables de ces biotransformations. Cette étape nous permet aussi de modifier éventuellement la structure des composés pour les rendre plus stables in vivo en diminuant le niveau de métabolisme. En parallèle, des études in silico peuvent également être mises en œuvre pour sélectionner les composés les plus enclins à interagir avec une cible d’intérêt (récepteur/enzyme). Cependant l’étude in vivo sur les rongeurs s’avère indispensable par la suite car les approches in vitro ne sont pas suffisamment quantitativement prédictives de l’affinité/spécificité in vivo et du taux de métabolisme in vivo. L’extrapolation in vitro-in vivo nécessite la mise en place de modèles mathématiques complexes qui ne sont pas adaptés à tous les paramètres pharmacologiques. Par ailleurs, les paramètres d’absorption, de distribution et de pharmacocinétique du radiotraceur dans le sang et les organes doivent être mesurés dans l’organisme de l’animal. Cette étape préclinique est essentielle à l’évaluation du meilleur candidat pour un passage chez l’homme (transversalité).
Réduction
Dans cette étude, le nombre d’animaux prévu a été déterminé d’après des études antérieures réalisées au laboratoire et des articles bibliographiques. Pour les études de biodistribution et de métabolisme, des groupes de 120 animaux ont été prévus, correspondant à l’analyse de 3 animaux/temps (nombre minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs,). Pour les études d’imagerie, les groupes de 6 animaux permettent d’obtenir des résultats significatifs compte tenu des variations interindividuelles observées chez le rat. L’ensemble des études in vitro permettant de caractériser pharmacologiquement les radiotraceurs et de ne sélectionner que quelques candidats présentant des propriétés adéquates pour l’imagerie nous permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux. Parmi ces propriétés, nous vérifierons par des méthodes alternatives que la molécule peut entrer dans le cerveau, présente une haute affinité et sélectivité pour sa cible, peut être radiomarquée avec des isotopes compatibles avec l’imagerie et que son métabolisme n’est pas incompatible avec son développement. Nous développerons par ailleurs des méthodes analytiques de quantification des radiotraceurs et de leurs métabolites, les plus sensibles possibles pour utiliser des volumes de sang ou de tissus les plus faibles possibles et réduire ainsi le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés aux conditions d’hébergement pendant au moins 7 jours avant le début des expérimentations et seront entraînés à la manipulation avant le début du protocole ce qui permet de diminuer l’état de stress et d’améliorer leur bien-être. Ils seront hébergés par paire dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Lors de toutes les expériences in vivo et/ou ex vivo, biodistribution, métabolisme et imagerie, les animaux seront anesthésiés. Dans certains cas particuliers, afin d’éviter toute influence de l’anesthésique sur le métabolisme d’un radiotraceur ou une pollution du signal par l’anesthésique, les injections pourront être réalisées sur animaux vigiles placés dans un tube de contention. Dans ce cas, les animaux seront entraînés à la manipulation de manière à limiter la douleur et le stress le jour de l’expérimentation. Les animaux seront étroitement suivis tout au long de l’étude par du personnel expérimenté, permettant l’application des critères d’arrêt en amont afin d’empêcher toute souffrance animale. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.
Choix des espèces
Les rongeurs et en particulier le rat font partie des modèles animaux les plus décrits dans la littérature pour les études de biodistribution, de métabolisme et d’imagerie cérébrale. Il existe par ailleurs de nombreux modèles de maladies neurodégénératives décrits chez le rat (Alzheimer, Sclérose en plaques, Huntington, …) qui nous permettent de tester les meilleurs candidats sélectionnés sur des animaux pathologiques/génétiquement modifiés et d’étudier les modifications de leur interaction avec la cible d’intérêt. Les animaux utilisés dans ce projet auront entre 4 semaines et 6 mois selon les modèles de rats (sains ou pathologiques) et les procédures. Pour les études de métabolisme, des rats jeunes seront utilisés (environ 40 jours). En effet, une diminution du métabolisme avec l’âge a été observée et décrite dans la littérature. Pour les études d’imagerie, le cerveau doit être assez développé. Les rats transgéniques et contrôles seront utilisés à l’âge de 6, 12 et 18 mois afin d’investiguer la capacité des traceurs à détecter leur cible à un stade précoce (6 mois), moyen (12 mois) ou tardif (18 mois) du développement de la maladie d’Alzheimer. Pour le modèle de rat injecté par un vecteur viral l’imagerie sera réalisée entre 5 et 10 semaines après l’injection du vecteur afin de vérifier l’absence de vecteur viral et l’expression du récepteur humain. L’injection du vecteur viral étant réalisée à l’âge de 8 semaines, les rats auront entre 13 et 18 semaines lors de l’examen d’imagerie.
Evaluation in vivo de nouveaux composés sur l’hypertension intraoculaire dans un modèle de glaucome chez le lapin
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur injecte dans un œil, puis dans l'autre une semaine plus tard, une solution salée concentrée qui fait monter la pression intraoculaire pendant près de quatre heures, pour tester des molécules candidates contre le glaucome. Le porteur mesure la pression au tonomètre et pose un cathéter dans l'artère de l'oreille pour des prises de sang, et affirme que la hausse de pression 'ne devrait pas' provoquer de douleur. Il décrit l'œil du lapin comme le 'modèle de référence' et conclut qu'aucune méthode in vitro ne peut le remplacer.
Objectifs
L'objectif du projet est de tester chez le lapin les effets de nos molécules sur une hypertension intraoculaire transitoire provoquée par une injection dans l'oeil d'une solution saline hypertonique.
Bénéfices attendus
La cause principale du glaucome (diminution irréversible du champ visuel, 2ème cause de cécité) est une augmentation de la pression intraoculaire à l’origine de la destruction des cellules du nerf optique. Les traitements existants (bêta-bloquants, analogues des prostaglandines…) ont une efficacité limitée et peuvent présenter des effets indésirables. Ainsi, le bénéfice attendu de ce projet est le développement d’une nouvelle classe thérapeutique pour traiter le glaucome qui touche plus de 800 000 personnes en France.
Procédures
Les lapins vont recevoir sous anesthésie locale une injection d'une solution saline concentrée dans un seul oeil qui va être à l'origine d'une augmentation de la pression dans le globe oculaire. Cette augmentation de pression intraoculaire va durer moins de 4 heures. Plusieurs mesures de la pression intraoculaire à l'aide d'un tonomètre vétérinaire vont être effectuées : 5 avant l'injection et 6 durant les 4 heures suivant l'injection. Ces mesures sont non invasives et indolores. Le lapin recevra avant l'injection intraoculaire une administration (par gavage, par application locale sous forme de collyre, par injection intrapéritonéale) des molécules à tester. Après une semaine de récupération, une autre session pourra être réalisée en utilisant le 2ème oeil. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à des fins de pharmacocinétique. Un cathéter sera mis en place au niveau de l'artère centrale de l'oreille. Sur une durée de 24 heures maximum, pas plus de 8 prélèvements de 1 mL seront effectués.
Impact sur les animaux
Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -Le stress lié à la contention et à la réalisation des mesures de pression intraoculaire (geste non invasif et non douloureux) : pour limiter cet effet, les animaux auront une période d’habituation à la préhension, manipulation des yeux et des mesures de pression -L’augmentation de la pression intraoculaire : selon la technique utilisée, l’augmentation de la pression devrait être modérée (aux alentours de 40 mmHg) et ne devrait pas générer de douleur. Cependant, nous avons mis en place un protocole de suivi et d’identification de points limites permettant de mettre en place un traitement en cas d’apparition de douleurs ou d'anomalies oculaires.
Devenir
Après que chaque œil a fait l’objet d’une injection intraoculaire de solution saline hypertonique, les animaux sont mis à mort. En effet la procédure ne peut pas être répétée plusieurs fois sur un même œil. De plus au sein du laboratoire ces lapins ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.
Remplacement
L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de nouvelles molécules sur la pression intraoculaire. Cette taille de l'oeil permet une injection intravitréenne reproductible et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. De plus il n’existe pas actuellement de méthode alternative.
Réduction
L'amplitude et variabilité des réponses obtenues sur le(s) paramètre(s) d'intérêt selon des résultats précédemment publiés indiquent un effectif compris entre 5 et 8 lapins par groupe expérimental comme étant raisonnable et suffisant pour effectuer une analyse statistique pertinente des données. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, l'expérimentation sera réalisée sur un oeil puis sur l'autre oeil du même lapin à une semaine d'intervalle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés individuellement à leur arrivée jusqu’au jour de l'expérimentation. Pour le bien-être des animaux et limiter le stress inhérent à cette espèce, nous veillons à mettre à disposition dans les cages d’hébergement une balle en plastique, une buchette à ronger et une hutte en polycarbonate rouge dans laquelle le lapin peut venir se réfugier s’il ressent le besoin de s’isoler. Du foin est mis à disposition de manière journalière ce qui permet de créer un contact régulier avec le lapin et de le familiariser avec l'expérimentateur. Sans traitement particulier, les animaux ne doivent pas présenter de signes de douleur à ce stade expérimental. Toutefois, le personnel zootechnicien est sensibilisé pour communiquer directement à l’expérimentateur tout comportement « suspect » d’un animal anxieux, soit observé durant la période d’acclimatation (un animal qui tape systématiquement fortement du pied lors d’une entrée dans la pièce ou lorsque l’on s’approche près de sa cage), soit le jour même de l’expérimentation au moment de sa manipulation pour la sortie (comportement excessif de fuite, vocalisation…). Une semaine avant l'injection intravitréenne, des mesures journalières de pression intraoculaire à l'aide d'un tonomètre seront effectuées afin de familiariser l'animal avec le dispositif et l'expérimentateur. Les mesures de la pression intraoculaire sont effectuées à l'aide d'un tonomètre "à rebond" qui n'engendre aucune souffrance chez l'animal. Chaque mesure de la pression intraoculaire sera associée à une récompense (friandise "mini treats" goût fruité, Plexx, Hollande). La souffrance liée à l'injection intravitréenne d'une solution saline hypertonique va être limitée par l'administration sous forme de gouttes d'un anesthésique local chez un lapin au préalable sédaté.
Choix des espèces
Les modèles in vitro modélisant la chambre oculaire et la physiopathologie des hypertensions oculaires ne permettent pas de tester les efficacités des molécules thérapeutiques. L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de molécules sur la pression intraoculaire. Cette taille de l'oeil permet une injection intravitréenne reproductible et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. L'expérimentation sera réalisée sur des lapins adultes. Le glaucome est une pathologie apparaissant avec l'âge, il n'y a aucune raison de travailler sur des individus en cours de développement.
Validation de l’utilisation et de l’implantation de capteurs d’identification individuelle et télémétriques pour le suivi de la température corporelle du poussin à l’adulte
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
70 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dix tués à l'issue pour distribuer leurs tissus et soixante gardés vivants comme reproducteurs. Dès le lendemain de leur naissance, une puce télémétrique leur est implantée sous anesthésie, à différents emplacements testés, pour mesurer leur température à distance et la comparer à la mesure rectale. Le porteur signale que l'implant peut provoquer une inflammation locale, des infections et des coups de bec entre animaux sur la zone d'implantation. Il présente la mesure à distance comme plus 'éthique' que la voie rectale, et affirme qu'aucune méthode hors animal vivant ne permet ce suivi.
Objectifs
Dans les études physiopathologiques chez les animaux, le premier signe clinique mesurable est la température. Afin de bien connaitre ce paramètre en fonction de l'espèce animale, il est nécessaire de collecter des données zootechniques sur des sujets sains pendant une longue période. Chez la volaille, les données sont manquantes. Le premier objectif du projet sera de définir la meilleure zone d’implantation d’une puce télémétrique chez le poulet, parmi plusieurs zones préselectionnées. Ces mêmes puces sont déjà utilisées chez les rongeurs et ce système s’est avéré efficace pour suivre la température corporelle. Le second objectif sera d’obtenir un nombre conséquent de mesures qui valideront l’utilisation de ce système en expérimentation. En expérimentation, cela permettra d’augmenter le nombre de données chez les volailles, en ajoutant la température, paramètre peu exploiter aujourd’hui.
Bénéfices attendus
Il est attendu du projet qu’une zone d’implantation de puce télémétrique soit sélectionnée ce qui permettrait de disposer d'un moyen d'obtenir des mesures fiables de la température corporelle des poules au cours du temps. L’injection induira une légére douleur locale et la puce ne causerait pas de gêne importante à l’animal. Ainsi, il est attendu que les animaux soient moins importunés par cette méthode (mesure de température à distance) comparativement aux mesures rectales, ce qui serait plus éthique.
Procédures
L’anesthésie de l’animal et la pose d’une puce télémétrique sera effectuée une fois et durera environ 5 minutes. Après cela, seule une mesure de la température avec le matérial adéquat sera effectuée. La mesure rectale de température est la référence et la zone d'implantation retenue sera dépendante de la pré-expérimentation (en sous-cutanée ailaire, en intra-péritonéal (dans la cavité thoraco-abdominale) et en intramusculaire au niveau du bréchet. L’animal pourra être maintenu en place s’il bouge trop pour que la mesure puisse être effectué, mais n’aura pas besoin d’être soumis à une contention.
Impact sur les animaux
Il est possible que les animaux ressentent une gêne au niveau de la zone d’implantation de la puce télémétrique (légère inflammation) et se « piquent » entre eux (c’est-à-dire se donnent des coups de becs), par exemple s’ils remarquent la zone d’implantation de la puce sur un autre animal dans les 24-48h. Une infection au niveau du site d’implatation pourrait éventuellement être observée.
Devenir
Les 10 poussins de l'étude pilotes seront euthanasiés et les tissus distribués et optimisés par la communauté scientifique. Les 60 autres poussins de l'étude seront gardés en vie et introduit au sain de l'élevage pour faire de futurs reproducteurs.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car la mesure de température d’une autre manière qu’in vivo est impossible. Nous avons besoin d’animaux vivants pour évaluer s’il est possible de mesurer la température au cours du temps. Ces puces ont été utlisées avec succès sur modèle rongeur.
Réduction
Une étude pilote est réalisée sur 10 animaux pour choisir le meilleur emplacement de la puce télémétrique et limiter le nombre de possibilités de localisation pour la seconde partie du projet. Pour cette seconde partie, le nombre d’animaux utilisés (60 animaux) pour obtenir un nombre de mâles et femelles est basé sur l’expérience des animaliers et la littérature. Pas d’analyses statistiques sur l’étude pilote, car l’un des objectifs est de valider le positionnement de la puce chez le poussin. Cependant, les données obtenues sur cette étude pilote pourront rentrer dans la banque de données télémétriques obtenues dans la seconde étude. Il pourrait être envisagé, sur la seconde étude, en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des utilisateurs, de faire une étude statistique simple basée sur un test non paramétrique pour déterminer un éventuel effet sexe.
Raffinement
Pour l’étude pilote, comme il n’y a pas de restriction concernant leur statut sanitaire, les poussins seront hébergés au sol sur paille dans des conditions environnementales contrôlées, et disposeront d’un enrichissement social et comportemental (petites rondelles en inox suspendues ce qui permet aux animaux de piquer, de se percher). Pour la seconde étude en élevage à statut sanitaire EOPS (Exempt d’organismes pathogènes spécifiés), les animaux seront hébergés hors-sol en cage dans des conditions environnementales contrôlées, chauffées, avec un accès à un perchoir, un nid, de la paille broyée.
Choix des espèces
Trop peu de données zootechniques sur la température chez les volailles saines comme malades sont recensées alors que pourtant, la température est un paramètre important en expérimentation animale dans le cadre des modèles infectieux. Utiliser ces puces télémétriques en expérimentation animale permettrait à la fois d’identifier les animaux et d’obtenir des données pertinentes pour les études, tout en raffinant nos pratiques. Les puces seront implantées 1 jour après la naissance. En expérimentation animale pour l’étude des maladies infectieuses aviaires, il est fréquent que les protocoles commencent à la naissance (1 jour) et ne dépassent pas 35 jours d’âge. Ce choix a été effectué pour se rapprocher le plus possible des conditions expérimentales.
Etude de l’ARN non codant Cyrano au cours de la neurogenèse
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La plupart subissent, nouveau-nées, une électroporation du cerveau sous anesthésie, d'autres des injections, avant d'être tuées entre deux et vingt et un jours de vie pour prélever leur cerveau. Le projet vise à comprendre le rôle d'un ARN non codant dans la formation des neurones après la naissance, comme base d'un futur travail sur les tumeurs cérébrales. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit la différenciation complète des cellules souches neurales du cerveau.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent la balance entre renouvellement des cellules souches neurales et leur engagement dans la différenciation en neurone, dans le cerveau des souris juste après la naissance. Nous étudierons plus précisément la fonction de certaines molécules d’ARNs non codantes. Pour cela des animaux non altérés génétiquement seront utilisés pour étudier l’impact de la surexpression ou de l’inhibition de ces molécules en utilisant une technique permettant d’intégrer des petites molécules d’ADN dans les cellules souches neurales, directement dans le cerveau des nouveau-nés. En parallèle, nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés de façon non dommageable permettant d’éliminer la fonction des molécules d’ARN non codantes qui nous intéressent de façon ciblée dans les cellules souches neurales du cerveau postnatal par la même technique. Nous étudierons dans le cerveau de ces souris, la division cellulaire des cellules souches ainsi que leur devenir en neurones. Ces expériences permettront de déterminer le rôle de ces molécules d’ARN au cours de la neurogenèse postnatale.
Bénéfices attendus
Des centaines de milliers d'ARN non codants ont été identifiés chez les mammifères en particulier chez l’homme. Ces ARN forment un groupe de molécules impliquées dans une variété de mécanismes essentiels pour la cellule. Compte tenu de ces caractéristiques il a été montré que l'expression aberrante de certains ARN non codants est fortement liée à l’apparition et à la progression des tumeurs cancéreuses. Chez l’homme et la souris, les molécules d’ARN qui nous intéressent dans ce projet sont associées à des tumeurs du cerveau, les gliomes, qui constituent la tumeur primaire la plus fréquente et la plus meurtrière du système nerveux central. Il a été montré récemment que des gliomes apparaissent suite à des anomalies génétiques qui surviennent dans certaines cellules souches neurales, en particulier des anomalies concernant les molécules d’ARN non codantes que nous étudions dans ce projet. L’étude menée dans ce projet permettra à court terme de connaitre le rôle de ces ARN non codants dans la physiologie normale de ces cellules souches. Ces connaissances constitueront la base d’un projet futur pour évaluer à plus long terme le rôle de ces molécules dans l’induction et la progression tumorale dans un modèle de gliome chez la souris. Nous pensons donc que l’étude de la fonction physiologique de ces ARN dans les cellules souches neurales sera bénéfique pour la compréhension future du développement de certains types de gliomes chez l’homme
Procédures
Intervention: 1) electroporation du cerveau: geste réalisé sous anesthésie générale. Durée de l'acte: 1 minute maximum, effectué sur 864 animaux nouveau-nés, 1 seule fois par animal. 2) Injection intrapéritonéale, durée moins de 1minute, effectuée 1 fois sur 192 animaux nouveau-nés et 2 fois sur 60 animaux nouveau-nés. 3) Toracotomie dans le cadre d'une euthanasie par perfusion intracardiaque. Geste réalisé sous anesthésie générale sub-létale (surdosée) après une pré-médication avec un analgésique morphinique. Durée: 5 minutes, 1 seule fois car conduit à la mort de l'animal, sur 556 animaux.
Impact sur les animaux
Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 21 jours après. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’année et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur l'état de santé et le bien être des animaux. Concernant l’injection par voie intrapéritonéale, l’acte entraine probablement un stress des animaux au moment de la contention et de l’introduction de l’aiguille dans l’abdomen mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits par l'introduction de l’aiguille sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux. La lignée transgénique que nous utilisons dans ce projet est une lignée conditionnelle qui induit la mutation de l’ARN Cyrano seulement dans quelques cellules du cerveau après la naissance, ce qui n’entraine aucun effet dommageable sur l’animal
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever leur cerveau en vue de leur analyse
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour ce projet. En effet nous étudions l’impact physiologique des ARN non codant sur la biologie des cellules souches neurales. Il n’existe pas de système cellulaire in vitro qui reproduisent l’intégralité de la différenciation des cellules souches neurales en différents sous-types neuronaux qu’elles produisent in vivo dans le cerveau. De plus la prolifération et la différenciation de ces cellules souches sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux présents au niveau de niches cellulaires qui entourent ces cellules. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. La seule alternative in vitro consiste à cultiver des cellules souches fraichement prélevées sur des animaux. Mais même dans ce cas, les méthodes de culture existantes ne reproduisent pas exactement le devenir des cellules souches en termes de type de types cellulaires. Peu de neurones sont générés dans ces conditions au profit des cellules gliales, et le système ne permet pas non plus d’obtenir les différentes sous-populations neuronales produites en condition physiologique dans le cerveau antérieur.
Réduction
Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des cellules souches directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques, en particulier pour des approches de gain de fonction. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routione depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et nous pouvons estimer au plus juste le nombre d’animaux suffisants à utiliser pour avoir des résultats reproductibles et tenant compte du taux d’échec des expériences réalisées par la suite sur les échantillons biologiques. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir de mêmes portées, sans distinction de sexe, afin d’optimiser le nombre de nouveaux-nés utilisés par portée et donc de réduire le nombre de portée par expérience. Pour les analyses histochimiques, le nombre d’animaux nécessaires à l’étude a été réduit grâce au fait que chaque cerveau prélevé servira à l’analyse de plusieurs marqueurs. Grâce aux formations suivies en biostatistique sur des petits échantillons et à l’expérience acquise de l’analyse statistique de résultats obtenus en utilisant ces méthodes dans d’autres projets qui ont déjà obtenu une autorisation, le nombre d’animaux pour ce projet a pu être réduit au strict nécessaire.
Raffinement
Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. 6 personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation post-expérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises.
Choix des espèces
La souris est le modèle mammifère utilisé par la communauté scientifique pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la neurogenèse postnatale et adulte et qui sont conservés chez l’homme. De plus il permet des manipulations génétiques, soit par l’utilisation d’animaux transgéniques soit par modification ciblée de l’information génique des cellules souches neurales in vivo dans le cerveau. Les animaux seront utilisés au stade post-natal P0/P1 pour 2 raisons : -le projet concerne l’étude de la neurogenèse postnatale qui est la période la plus active en termes de renouvellement des neurones -les cellules souches ne sont accessibles par électroporation qu’aux stades P0-P1 Les animaux seront sacrifiés à différents temps après électroporation, du jour 1 (P1) au jour 21 (P21) après la naissance parce qu'ils correspondent aux différentes étapes du processus de neurogenèse par lesquelles une cellule souche doit passer avant de devenir un neurone mature .
Etude physiologique des effets de la mutation de la protéine d’adhésion de la cellule endothéliale dans le rein
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système urogénital
20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardées vivantes pour de futures expériences. Ces souris porteuses d'une mutation sont placées dans des cages métaboliques pendant vingt-quatre heures pour recueillir leur urine, puis maintenues dans des tubes de contention sous une lampe chauffante pour mesurer leur pression artérielle, une méthode présentée comme non invasive. Le projet cherche à savoir si la mutation d'une protéine des vaisseaux perturbe le rein, dans l'optique de la néphropathie diabétique. Le porteur affirme que des organoïdes ne permettraient pas d'observer les effets de la mutation en conditions physiologiques.
Objectifs
Les cellules endothéliales tapissent les vaisseaux sanguins. Elles sont essentielles pour permettre le maintien et la formation des vaisseaux sanguins. Pour cela elles doivent être jointives entre elles grâce à une protéine : la VE cadhérine. Les cellules endothéliales sont par conséquent indispensables pour le bon fonctionnement des organes richement vascularisées comme le rein. De nombreuses études ont démontré que la dysfonction endothéliale était un marqueur pronostique validé pour la survenue des pathologies comme les néphropathies Les néphropathies sont des affections rénales qui touchent plusieurs millions de personnes dans le monde. Elles peuvent être causées par des troubles fonctionnels tels que le diabète, l’hypertension ou à des défauts de la filtration. Notre équipe a démontré qu’une mutation dans une protéine d’adhésion des cellules endothéliales pourrait être une cible potentielle pour la néphropathie diabétique. Comment cette mutation peut jouer un rôle dans ces pathologies ? Nous voulons déterminer si cette mutation affecte les effets physiologiques du rein.Nous allons donc déterminer si la composition de l’urine et si la pression artérielle sont anormales chez les souris mutées, signe de la néphropathie diabétique.
Bénéfices attendus
Suite à ce projet, nous pourrons valider ou non si la proteine d'intérêt exprimée par les cellules endothéliales pourrait être une nouvelle cible thérapeutique pour traiter les néphropathies.
Procédures
20 souris seront mises dans les cages métaboliques, collecte de l’urine au bout de 24h pour étudier le fonctionnement rénal. Expérience répétée 3 fois. Ces 20 souris seront utilisées pour la mesure de la pression artérielle. Ces 20 souris placées dans des tubes de contention pendant la mesure de la pression sous une lampe chauffante. Méthode non invasive. Expérience répétée 1 fois par jour à la même heure pendant 15 jours (week-end inclus) 30 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux pourraient être essentiellement lié au stress que pourrait générer l’acclimatation des animaux aux cages métaboliques ou aux tubes de contention pour la mesure de la pression artérielle.
Devenir
Les souris participant à la pression artérielle ou l’analyse de l’urine via les cages métaboliques seront gardées vivantes après l’expérience pour de futures expériences
Remplacement
L’utilisation de ce modèle est requis pour voir les effets de la mutation in vivo au niveau fonctionnel et phénotypique des organes L’utilisation d’organoïdes ne nous permettrait pas de voir les effets de la mutation en condition physiologique et pathologique.
Réduction
Les groupes ont été calculés pour faire les validations statistiques nécessaires pour répondre à l'objectif scientfique du projet.
Raffinement
Pour l’étude du fonctionnement rénal, les souris seront placées dans des cages métaboliques pendant 24h. Les cages métaboliques sont des cages conçus pour récupérer le fèces et l’urine de la souris sans interférer dans la vie de l’animal notamment dans l’accès à l’eau et la nourriture. Pour réduire leur stress, les souris seront entrainées pendant une semaine à être placées dans ces cages une fois par jour pendant 30 minutes. L’expérience sera répétée trois fois avec un intervalle de trois jours pour laisser les souris récupérer. Pour la prise de la pression artérielle, les souris seront également entrainées à être placées dans les tubes de contention sous une lampe chauffante avec la mise en place du brassard pour la prise de mesure pendant une semaine chaque jour pendant 40 minutes. L’expérience sera répétée une fois par jour pendant 15 jours pour diminuer la variabilité entre les mesures sur une même souris. La prise de la mesure durera 30 minutes par souris. Toutes les souris impliquées dans les procédures classées légères, seront surveillées avant, pendant et après les expériences. Les signes de douleurs seront évalués par une grille de score.
Choix des espèces
Nous avons choisi un modèle murin porteur de la mutation sur la protéine d'intérêt pour nous permettre d’étudier les impacts de cette mutation sur le fonctionnement du rein et sur la pression artérielle. les souris seront âgées de 8-12 semaines car c’est à cet âge-là que des dysfonctionnements du rein ont été observés. Les souris utilisées pour ces procédures seront des souris âgées de 8-12 semaines car c’est à cet âge-là que des modifications rénales ont été observées par nos collaborateurs.
Rôle des récepteurs PIR-A et PIR-B dans la pathogénèse de la DMLA et de l’Uvéite dans des modèles expérimentaux murins
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur provoque une uvéite ou une inflammation sous la rétine par injections et photocoagulation au laser sous anesthésie, avec un suivi par imagerie de l'œil, pour étudier deux récepteurs immunitaires dans la DMLA et l'uvéite. Le porteur qualifie l'atteinte visuelle de légère au motif que la vision ne serait pas 'indispensable à la souris pour se déplacer'. Il affirme que ces mécanismes d'inflammation ne peuvent être étudiés que dans un 'organisme entier'.
Objectifs
La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est une maladie de la rétine provoquée par une dégénérescence progressive de la macula, partie centrale de la rétine. Il existe deux formes de DMLA : atrophique et exsudative. Les traitements existants permettent seulement de ralentir l’évolution de la formation et la croissance de nouveaux vaisseaux et donc uniquement la forme humide de la pathologie alors qu’aucun traitement n’est disponible pour la forme sèche de la DMLA. Les uvéites sont des maladies inflammatoires oculaires d’étiologie diverse, principalement auto-immune, pouvant être très invalidantes voire cécitantes, généralement traitées par des corticoïdes responsables de nombreux effets secondaires au long cours. Les causes précises de ces maladies ne sont pas connues et les mécanismes peu compris. Cependant, dans ces 2 pathologies, un processus inflammatoire est présent, caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Notre projet vise à étudier le rôle de 2 récepteurs surexprimés sur les macrophages activés qui infiltrent la rétine au cours de ces pathologies oculaires : les « paired Ig-like receptors » PIR-A et PIR-B.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'évaluer le rôle des récepteurs PIR-A et PIR-B comme potentiels cibles thérapeutiques chez l’Homme dans le traitement de l’inflammation liée à l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine.
Procédures
Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis aux interventions suivantes afin modéliser une uvéite expérimentale ou une inflammation sous-rétinienne. Toutes les injections (1 injection par animal) sont rapides (moins d’une minute). La photocoagulation laser dure moins de 5 minutes par animal sous anesthésie générale. Les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie, il n’y a donc pas de douleur attendue). Le suivi de l’évolution de l’inflammation est réalisé sous anesthésie générale par des actes non invasifs (donc pas de douleur ou de détresse) : imagerie rétinienne (fond d’œil – 5 min - quotidiennement 5 fois par semaine pendant 3 semaines, soit 15 examens au maximum) et OCT (tomographie en cohérence optique – 5 min - 1 fois par semaine pendant 3 semaines, soit un maximum de 3 examens par animal). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie de l’animal par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Il n’y a pas de procédure chirurgicale engagée dans ce projet. La totalité des procédures sont de gravité légère. Les modèles expérimentaux n’entraînent seulement qu’un phénotype léger : nuisance visuelle mais vision non indispensable à la souris pour se déplacer. Aucune douleur perceptible n’est à prévoir. Les nuisances attendues sont celles de l’introduction d’une aiguille pour les injections (qui sont réalisées sous anesthésie).
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’études des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Dans nos études nous nous intéressons aux mécanismes d’inflammation sous-rétinienne qui impliquent l’interaction de nombreux types cellulaires qui ne peut être étudié qu’au sein d’un organisme entier et ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.
Réduction
Les souris PIRA et PIRB KO seront étudiées en comparaison avec des souris sauvages dans des modèles d’inflammation sous-rétinienne. Nous devons induire plusieurs expériences (5 expériences/groupe expérimental) en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot (sévérité de l’inflammation plus ou moins importante). Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 10 animaux défini par groupe est le minimum requis pour l'application de tests statistiques de significativité fiables et l'obtention de résultats interprétables et fiables.
Raffinement
Les animaux auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation et seront hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Pour éviter toute souffrance ou détresse animale, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lorsque nécessaire. Nous avons fixé des points limites appropriés au-delà desquels des mesures sont prises pour minimiser ou arrêter le processus faisant souffrir ou stresser l’animal. Tout signe d’inconfort, de détresse, ou de comportement anormal fera l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lors de chaque manipulation, un gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant les anesthésies.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour la l’inflammation liée à l‘accumulation de cellules immunitaires dans l’espace sous-rétinien. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence rétinienne sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développée les modèles PIRA et PIRB. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale, âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel l’animal est susceptible de développer la maladie.
Système Nerveux Central- Tests sur les maladies neurodégénératives
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 860
1 276 souris et rats vont être utilisés dans des procédures pouvant atteindre un niveau de souffrance sévère, la plupart tués à l'issue et 120 rats réutilisés pour d'autres études. Des substances neurotoxiques leur sont injectées ou données dans l'alimentation pour provoquer une mort neuronale et des symptômes de maladie de Parkinson, Huntington, Alzheimer, sclérose en plaques ou AVC, suivies de chirurgies dans le cerveau et de tests comportementaux moteurs et mnésiques. Le porteur indique que ces modèles provoquent tremblements, déficits moteurs et parfois agressivité, et teste des substances censées améliorer les symptômes. Il reconnaît l'existence de cultures de neurones et de tranches cérébrales, mais conclut à la nécessité de modèles animaux plus complexes.
Objectifs
Le projet consiste à décrire les tests réalisés pour induire des effets neurotoxiques conduisant à la mort neuronale et à des symptômes moteurs ou non-moteurs chez l'animal
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurologiques. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer ou la sclérose en plaques. Des médicaments permettent de limiter les symptômes moteurs (L-Dopa) dans le cas de la maladie de Parkinson ou les troubles de la mémoire (Donepezil) dans le cas de la maladie d'Alzheimer. Les corticoïdes sont utilisés en première intention pour diminuer les poussées observées chez les patients atteints de sclérose en plaque. Les immuno-modulateurs et/ou immuno-suppresseurs permettent de limiter la fréquence des poussées. Pour les accidents vasculaires cérébraux, le caillot formé au niveau de l'artère cérébrale peut être dissout par l'administration d'Altéplase dans les premières heures suivant l'apparition des symptômes. Néanmoins, il n'existe pas de traitements neuroprotecteurs ou régénérateurs suite à un AVC. Les substances tests qui seront administrées dans le cadre de chacune de ces procédures seront étudiées soit pour leur capacité à améliorer les symptômes dans ces modèles, soit pour leur capacité à traiter la maladie.
Procédures
Les modèles de maladie de Parkinson et de Huntington sont induits par l’administration unique ou sur 5 jours (intrapéritonéale) d’une substance réactive ; chaque administration dure environ 1 à 2 secondes. Des tests comportementaux moteurs (durée max =60 minutes et entre 1 et 3 tests sur 1 à 5 jours) peuvent être réalisés avant euthanasie des animaux et prélèvement d'organes. Pour mimer la sclérose en plaque, les animaux sont nourris avec des aliments contenants la substance réactive sur une durée de 5 semaines. Des tests comportementaux moteurs peuvent être réalisés pendant ces 5 semaines (maximum de 3 tests sur 1 heure, 1 fois par semaine). A la fin des expériences, des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Certains modèles Parkinsoniens, des modèles de mort cellulaire ou d'accident vasculaire nécessitent une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Cette intervention dure entre 30 et 60 minutes. Les animaux sont ensuite évalués dans différents tests moteurs (durée maximum = 3 heures par jour, 1 à 2 séries de tests par semaine sur 4 à 5 semaines) ou non-moteurs (tests mnésiques réalisés quotidiennement pendant environ 1 h sur 4 à 5 semaines). Des prélèvements d'organes peuvent être réalisés après euthanasie des animaux. Pour chaque modèle, les animaux recevront une substance test de manière aigue ou de manière chronique au cours de l’expérience. Classiquement, les administrations par bolus durent de l’ordre de la seconde, mais des administrations par infusion peuvent durer jusqu’à plusieurs heures (1 à 2 heures) et seront dans ce cas réalisées via un cathéter implanté sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude (1 à 2 prélèvements avec au minimum une semaine d'intervalle, chaque prélèvement dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les modèles utilisés pour mimer certains aspects de la maladie de Parkinson peuvent induire des tremblements au niveau de la mâchoire ou des déficits moteurs légers à modérés. Les tremblements peuvent être également observés au niveau des membres inférieurs ou supérieurs de manière temporaire. Pour le modèle de sclérose en plaque, les déficits moteurs sont relativement légers. Dans les modèles de la maladie d'Alzheimer, les déficits attendus sont plutôt d’ordre mnésique. Dans certains modèles, les animaux peuvent être plus agressifs (ce comportement diminue dans le temps, environ 3 semaines après lésion). Le modèle d'accident vasculaire entraîne des déficits moteurs clairs (difficulté à marcher, à coordonner les mouvements). Pour tous ces modèles sur animal vivant, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées.
Devenir
Les rats ayant subi une procédure légère peuvent être réutilisés pour une nouvelle procédure. Une partie des rats ayant subi une procédure modérée peuvent être ré-utilisés pour une seconde étude (cas d'animaux lésés à la 6-OHDA par exemple). Pour les autres modèles, les animaux seront euthanasiés à la fin des expériences.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontré sur des modèles plus complexes (modèles animaux), permettant l'évaluation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux, par exemple.
Réduction
Dans ce projet, des modèles cellulaires sont utilisés pour pouvoir séléctionner les meilleurs candidats médicaments et pouvoir limiter les nombre d'animaux à tester sur des modèles plus complexes. Dans le cas des études chez l'animal vivant, les substances à tester ont déjà subi une phase de sélection afin de réduire le nombre d'animaux vivants testés.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Les rongeurs sont administrés avec une substance anti-inflammatoire le jour de la chirurgie et pendant 48 heures pour toutes les procédures incluant une chirurgie, à l'exception du modèle d'ischémie cérébrale. Une substance analgésique locale est également appliquée sur le crâne de l'animal pour limiter la douleur. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de l'oeil. Lors de la chirurgie, la surface du cerveau peut être endommagée lorsque le crâne est percé et induire une hémorragie. Si l'hémorragie ne cesse pas après l'application de tampons absorbants, l'animal sera euthanasié. Les animaux vont être pesés suite à la chirurgie pour évaluer leur récupération. Un rongeur montrant une perte de poids supérieure à 15%, le poil hérissé ou encore le manque de toilettage sera euthanasié. La chirurgie peut entrainer le gonflement de l'abdomen, lié à un ralentissement du transit intestinal/constipation. De l'huile naturelle (huile de maïs par exemple) peut être administrée pendant plusieurs jours, une à 2 fois par jour, pour limiter la douleur chez l'animal et éviter l'occlusion intestinale. Dans la plupart des modèles de neurodégénerescence, l'évaluation comportementale peut être complétée par des marquages histologique au niveau cérébral afin de raffiner le modèle. L'apparition d'effets secondaires liés à l'administration d'une substance d'essai peut être constaté ou potentialisé suite à l'administration de la substance réactive (exemple de crise épileptique spontanée induite par une substance). Les animaux seront immédiatement anesthésiés/euthanasiés pour raisons éthiques suite à l'observation de ce type de symptômes. Dans certains cas de modèles Parkinsoniens, les mouvements involontaire au niveau de la gueule de l'animal peuvent conduire à des mordillements de la patte controlatérale à la lésion et à une plaie. Cette dernière sera désinfectée avec une solution antiseptique si besoin. Les animaux peuvent perdre du poids pendant la période d'intoxication d'une substance réactive. Si la perte de poids est trop importante (supérieure à 15 %), l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Des tests de neurotoxicité ont été développés chez le rongeur et sont largement décrits dans la littérature comme méthodes prédictives pour évaluer l'efficacité de nouvelles substances pharmacologiques. Ces tests pharmacologiques sur rongeurs sont réalisés en amont des essais cliniques afin de sélectionner les candidats médicaments les plus efficaces et donc les plus prometteurs pour lutter contre les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période post-sevrage jusqu'à l'âge adulte.
Intérêt d’une thérapie matricielle pour contrer les dommages cérébraux et les déficits cognitifs induits par la radiothérapie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
220 rats sains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Leur cerveau entier est irradié, puis pendant six mois ils reçoivent chaque semaine une injection intraveineuse d'une molécule dite RGTA, avec quatre IRM et quatre batteries de tests comportementaux mesurant la fatigue, la locomotion, l'anxiété et la mémoire. Le porteur indique que l'irradiation provoque fatigue, perte de poids, sécrétions oculaires et érythèmes, qu'il présente comme transitoires. Il affirme qu'il est 'indispensable' de recourir à l'animal pour analyser ces phénomènes, en vue d'un éventuel passage chez l'humain.
Objectifs
Bien que la radiothérapie soit un traitement de référence pour traiter les tumeurs cérébrales, celle-ci peut induire des déficits cognitifs sévères qui altèrent grandement la qualité de vie des patients. L'irradiation cérébrale permet de contrôler la tumeur mais conduit également à des lésions du tissu cérébral sain qui aboutissent à un déclin cognitif, notamment des atteintes mnésiques. Actuellement,, il n’existe aucune prise en charge thérapeutique pour prévenir et/ou réparer les lésions cérébrales induites par la radiothérapie. Ainsi, ce projet vise à évaluer dans un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat adulte, l’intérêt d’une thérapie matricielle utilisant une molécule dénommée RGTA® (ReGeneraTing Agent). Les effets neuroprotecteurs et pro-cognitifs de cette molécule ont déjà été montrés dans différents modèles animaux de pathologies cérébrales. L’objectif de ce projet est double : 1/ mieux comprendre les mécanismes-clés des déficits cognitifs induits par la radiothérapie cérébrale et 2/ les limiter par une nouvelle thérapie matricielle. L’intérêt de la thérapie RGTA® pour contrer les lésions cérébrales et les déficits cognitifs induits par la RT cérébrale sera évalué dans un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat sain (non porteur de tumeurs cérébrales). Ce modèle animal a été développé au laboratoire et est bien caractérisé que ce soit en termes de décours temporel des altérations comportementales (fatigue/locomotion/cognition) ou des atteintes du tissu cérébral.
Bénéfices attendus
Cette étude préclinique doit permettre de 1/ de mieux comprendre les mécanismes responsables des troubles cognitifs observés après l'irradiation cérébrale et 2/ d’apporter des preuves expérimentales robustes pour évaluer l'intérêt du RGTA® en tant qu'agent neuroprotecteur, régénérateur et pro-cognitif dans le contexte des lésions cérébrales induites par la RT. A la fin du projet, les résultats seront accessibles sous la forme d’articles scientifiques. De plus, des biobanques de tissus cérébraux et de sang seront établies lors de ce projet et seront mises à disposition de la communauté scientifique. A long terme, une transposition à la clinique pourrait être envisagée pour atténuer le déclin cognitif des patients traités par RT et améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes procédures comme une irradiation de l’ensemble du cerveau qui durera 10 minutes. Les rats seront ensuite traités chaque semaine, pendant une durée de 6 mois, par la thérapie matricielle ou par son excipent (sérum physiologique), administrés par voie intraveineuse et durera au maximum 5 minutes par animal. Pour évaluer les effets du traitement, des IRM cérébrales d'une durée maximale de 45 minutes par animal seront réalisées et répétées 4 fois pendant l'étude. L'ensemble des animaux réaliseront également plusieurs tests comportementaux pour évaluer la fatigue, l'activité locomotrice, l'anxiété, la mémoire à court-terme et la mémoire à long-terme. Chaque animal réalisera 4 fois cette batterie de tests comportementaux (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois après irradiation cérébrale). L’ensemble des tests comportementaux seront échelonnés sur 2 semaines avec 1 seul test par jour et la durée de chaque test comportemental sera comprise entre 10 et 20 minutes.
Impact sur les animaux
A la suite de l'irradiation cérébrale, les animaux seront fatigués, présenteront une perte de poids et pourront présenter des signes de dégradation de leur état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, érythèmes cutanés sur la tête). Il est important de noter que ces effets indésirables sont transitoires et réversibles. De plus, l’ensemble de ces effets indésirables sont également retrouvés chez les patients traités par radiothérapie et le but de ce projet est d'évaluer l'intérêt du traitement RGTA® pour atténuer et réduire ces effets secondaires.
Devenir
A la fin de l'étude (6 mois après irradiation cérébrale), les animaux des différentes procédures seront mis à mort afin de mener des études post mortem sur le sang et le tissu cérébral.
Remplacement
Bien que des alternatives non-animales seront utilisées dans ce projet, il est indispensable d’avoir recours à l’expérimentation sur des animaux pour permettre une analyse intégrée des phénomènes complexes induits par l’irradiation cérébrale et d’évaluer l’intérêt de la thérapie matricielle utilisée dans ce projet. Ce projet permettra d'obtenir des preuves expérimentales suffisamment robustes pour in fine tester ce traitement chez l’Homme.
Réduction
Grâce à l'utilisation au préalable de tests statistiques appropriés et à l'utilisation de techniques d'investigation non invasives (imagerie IRM et tests comportementaux), le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une puissance des résultats sera réduit au minimum. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est estimé à 220 rats répartis en 4 groupes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en animalerie conventionnelle aux normes requises. Le personnel participant au projet est formé aux procédures en expérimentation animale. Des inspections du bien-être des animaux seront réalisées quotidiennement. De plus, toutes les mesures visant à réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux seront entreprises, notamment en appliquant une anesthésie et une analgésie appropriées. Concernant les effets indésirables liés à l’irradiation cérébrale qui peuvent affecter de façon transitoire l’état général des animaux, des mesures sont déjà mises en place dans l’équipe et connues par les personnes impliquées dans ce projet. De plus, une échelle d’évaluation de l’état général des animaux (score défini par plusieurs items visuels) a été mise en place dans l’équipe sur ce modèle animal pour surveiller finement l’état général des animaux. Enfin, des points limites spécifiques et de critères d'arrêt de souffrance seront utilisés afin de réduire toute souffrance ou douleur chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat possède un cerveau dont la taille est supérieure à la souris et qui est compatible avec les appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée ainsi qu’une imagerie IRM de haute résolution. D’autre part, plusieurs tests comportementaux visant à évaluer les déficits moteurs et cognitifs sont bien décrits chez le rat. Enfin, le modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat utilisé dans ce projet a été developpé par le laboratoire de recherche qui l'a d'ailleurs déjà très bien caractérisé en termes de dommages cérébraux et de modifications comportementales jusqu’à 6 mois après irradiation encéphalique. Ainsi, le laboratoire de recherche maîtise très bien ce modèle animal que ce soit dans le décours temporel de sa physiopathologie mais aussi en termes de prise en charge du bien-être animal. Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 5 mois (poids d’environ 350 g) lors de leur arrivée à l’animalerie. L’irradiation cérébrale sera réalisée sur des animaux âgés de 6 mois mais les rats arriveront à l’animalerie 1 mois avant afin de les acclimater dans leur nouvel environnement, de les habituer aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux. L’âge de 6 mois a été retenu puisqu’il correspond à l’âge adulte mature chez le rat et est équivalent à l’âge de 18 ans chez l’Homme. A ce stade de développement chez le rat, la substance blanche est complètement mature, ce qui représente un critère très important pour modéliser les atteintes cérébrales observées chez le patient adulte traité par radiothérapie.
Essai d’une thérapie cellulaire chez le rat avec des précurseurs de photorécepteurs édités génétiquement
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
295 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent sous anesthésie une injection sous-rétinienne de photorécepteurs issus de cellules souches humaines, puis des examens d'imagerie, des électrorétinogrammes et des tests comportementaux de la vision. La mise à mort permet des analyses de la rétine. Le porteur affirme que l'évaluation d'une récupération visuelle ne peut se faire qu'in vivo et décrit une piste thérapeutique pour des cécités aujourd'hui irréversibles.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’un canal ionique. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines, appelées cellules iPS. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une perte visuelle provoquée par une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules modifiées après transplantation. L’utilisation de cellules rendus artificiellement sensible à la lumière vise à contourner les difficultés rencontrées par différents groupes, et rapportées dans différentes études, d’obtenir une restauration fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire humaine de ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont obtenu un certain succès en termes de survie et d’intégration dans le tissus-hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d’édition du génome qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante. Les bénéfices attendus sont donc une restauration au moins partielle de la vue chez les animaux modèles aveugles. Ces résultats pourraient permettre à terme de proposer à des patients souffrant de cécité irréversible une thérapie visant à rendre au moins partiellement la vue ; les seuls traitement disponibles à l’heure actuelle permettent au mieux un ralentissement de la perte visuelle avant la cécité complète.
Procédures
Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection intraoculaire (sous la rétine) de cellules en suspension (2 groupes pour deux types de cellules différentes), ou de solution tampon (1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisé une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.
Devenir
A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (survie cellulaire ; différenciation et intégration aux tissus de l’hôte ; réponse à la lumière des cellules transplantées ; reconnexion avec les autres types cellulaire ).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 295 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30% (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.
Raffinement
Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec éléments d’enrichissement pour toute la durée du protocole ; nourriture et abreuvement à volonté. Les procédures prévoient une surveillance de leur état physique général (et particulièrement du système oculaire). Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue pour certains examens (imagerie, ERG) les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant ces différents actes. Le geste chirurgical, qui peut générer une nuisance ou une douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique puis un anti-inflammatoire non stéroïdien à durée d’action longue. Les signes de comportement anormal, signe de possible souffrance, seront également surveillés. Les points limites adaptés sont définis de manière adaptée aux procédures mises en œuvres et inclus une surveillance de l’état physique et comportemental de l’animal. L’observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal selon les méthodes adaptées et réglementaires.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.