Procédures légères

60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, celles au génotype jugé fiable et d'intérêt gardées comme reproductrices, les autres tuées. Très jeunes, elles subissent une épilation, une biopsie de la pulpe d'un doigt et une amputation de phalange, gestes que le porteur reconnaît "stressants et potentiellement douloureux". Le projet vise à comparer ces méthodes de génotypage pour retenir la moins invasive. Il relève du raffinement des pratiques d'identification des souris génétiquement modifiées, que le porteur emploie dans "la quasi totalité" de ses projets.

Objectifs

Une condition essentielle à l'utilisation de souris transgéniques est la possibilité de les génotyper, c'est-à-dire de distinguer les souris porteuses de la mutation génétique à étudier. La plupart des souris issues de l'élevage d'animaux mutants doivent donc être génotypées avant d'être utilisées pour toute expérience de recherche. Bien que nous suivions les recommandations sur la technique d'amputation des phalanges comme méthode d'identification et de caractérisation génétique chez les rongeurs éditées par le CNREEA (Comité national de réflexion éthique sur l'expérimentation animale) en 2021, nous cherchons encore à affiner les méthodes que nous utilisons en allant vers des méthodes non invasives et moins douloureuses.

Bénéfices attendus

A l'issue de ce projet, nous souhaitons pouvoir valider une méthode de génotypage et d'identification la moins invasive possible et la plus fiable également. Ceci passera notamment par un classement de douleur des méthodes testées pour pouvoir choisir la méthode la moins impactante pour nos souris. Nous envisageons de partager les résultats de ce projet par une communication interne à notre réseau professional mais aussi à l'ensemble de la communauté française avec une présentation en congrès national, voire une publication dans une revue dédiée.

Procédures

Les animaux de la 1re partie de l'étude feront l'objet de 3 prélèvements :épilation d'une touffe de poils, biopsie de la pulpe d'un doigt, biopsie d'une phalange distale. Il y aura un prélèvement par jour uniquement, 3 jours d'affilée. Chaque prélèvement dure moins de 10 secondes. Les animaux de la 2e partie de l'étude feront l'objet d'un seul des 3 prélèvements ci-dessus (1 type de prélèvement par groupe).

Impact sur les animaux

Les animaux feront l'objets de prélèvements stressants et potentiellement douloureux: épilation d'une touffe de poils, biopsie de la pulpe d'un doigt, biopsie d'une phalange distale. mentionnés ci-dessus. Nous surveillerons justement l'apparition de signes de douleur (léchage du lieu de prélèvement ou perte de prise alimentaire par exemple) afin de traiter ces douleurs si elles apparaissent et de sélectionner les méthodes les moins impactantes pour l'animal dans le futur.

Devenir

A l'issue de ce projet, les animaux seront gardés en vie en tant que reproducteurs dans notre animalerie d'élevage s'ils ont un génotype fiable et d'intérêt. Les autres seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet vise à raffiner les méthodes d'identification et de génotypage des souris génétiquement modifiées, nous ne pouvons ainsi pas réaliser ce projet autrement qu'en utilisant des souris. Cependant, des tests préliminaires ont été faits sur des animaux préalablement euthanasiés (d'autres projets) pour valider la quantité de poils nécessaire pour le génotypage en utilisant ces derniers, permettant ainsi de n'utiliser des animaux vivants pour ce projet que lorsque nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été calculé par une bio statisticienne qui se chargera également de l'évaluation statistique de chaque étape. De plus, selon les résultats de la 1re partie de l'étude, des groupes de la 2e procédure pourraient ne pas être réalisés (notamment si le génotype n'est pas fiable).

Raffinement

L'objectif de ce projet est justement de raffiner les méthodes actuelles en cherchant à aller vers des techniques moins voire non-invasives et ainsi pouvoir abandonner la biopsie de phalange distale pour le génotypage et l'identification. En pratique, les animaux feront l'objet d'un suivi très précis de la douleur et des anti-douleurs seront utilisés lorsque nécessaire. Les animaux manipulés étant très jeunes, nous veillerons en particulier à éviter tout rejet maternal après les procédures ainsi qu'à un bon allaitement des souriceaux par leur mère.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont utilisées à l'ICS dans la quasi totalité de nos projets (ayant chacun leur justification scientifique). L’utilisation de ces souris nécessite de pouvoir identifier les individus et de les caractériser d’un point de vue génétique, raison pour laquelle nous utilisons la souris dans ce projet de raffinement des méthodes de génotypage et d'identification. Conformément aux recommandations émises par la CNR2EA de février 2021, l’identification sera réalisée entre les 7ème et 10ème jours de vie.

3 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont infectées par le parasite du paludisme Plasmodium berghei, suivies par prélèvements sanguins répétés et traitées par gavage ou injection, puis tuées. Une partie est aussi utilisée pour des repas sanguins de moustiques et des exsanguinations. Le projet teste des candidats antipaludiques, dont des extraits d'Artemisia. Le porteur affirme que le recours à l'animal est justifié par la "nécessité" de tester ces composés dans un "organisme entier".

Objectifs

Le Paludisme (ou Malaria) est une maladie parasitaire qui reste un problème majeur de santé publique dans le monde. Elle sévit dans 87 pays au niveau de la ceinture intertropicale et concerne près de la moitié de la population mondiale. Le Paludisme est dû à un parasite eucaryote unicellulaire appelé Plasmodium dont 5 espèces infectent l’Homme, les 2 majoritaires étant Plasmodium falciparum et vivax. D’après le rapport de l’OMS 2021, il a été répertorié 241 millions de cas de paludisme en 2020 dont 82% en Afrique où en 2018, P. falciparum était responsable de 99,7% des cas, alors que 53% des cas en Asie du Sud-Est étaient dus à P. vivax. Le Paludisme a fait 627 000 morts en 2020, principalement des enfants de moins de 5 ans de par leur faible immunité face à la maladie et 95% en Afrique car P. falciparum est responsable de la quasi-totalité des cas graves. La mise en place de techniques préventives telles que la distribution de moustiquaires imprégnées à grande échelle mais aussi l’amélioration du diagnostic ainsi que la mise au point de traitements ont permis de diminuer l’incidence du paludisme au cours des années. Puis tout récemment, le 06 octobre 2021, un 1er vaccin, le RTS,S/AS01 (Mosquirix) a été approuvé par l’OMS pour les enfants de moins de 5 ans avec une efficacité d’environ 30% ce qui représente une 1ère étape en terme de vaccination mais ne suffira pas à contenir la maladie en l’état. Or, il faut faire face à l’apparition régulière de résistances aux différents traitements administrés dans toutes les zones où le paludisme sévit (chloroquine, sulfadoxine pyrimethamine, méfloquine, etc…). Les derniers traitements en date et recommandés par l’OMS sont des combinaisons thérapeutiques à base d’artémisinine (ART), ou ACTs. Mais des parasites résistants à l’ART et à ses partenaires sont apparus progressivement en Asie du Sud Est (Cambodge) depuis quelques années pouvant entraîner des échecs thérapeutiques avec ces traitements. Des parasites multi-résistants, dont à l’ART, ont récemment été mis en évidence au Rwanda et en Ouganda, ce qui est inquiétant quant à leur propagation en Afrique. Face à cette situation, il est urgent d’identifier des molécules innovantes et efficaces avec des modes d’action différents en ciblant de nouvelles cibles thérapeutiques. Puis, sur du plus court terme, d’évaluer l’efficacité des infusions à base d’Artemisia déjà largement utilisées, notamment en Afrique.

Bénéfices attendus

Des résultats antérieurs ont permis de sélectionner des produits inhibiteurs d’une enzyme parasitaire appelée SUB1 qui a été décrite comme une nouvelle cible thérapeutique. Parmi eux, certains ont également une efficacité sur le parasite Plasmodium falciparum cultivé in vitro aux stades spécifiques auxquels SUB1 joue un rôle essentiel ce qui prouve leur capacité à traverser les barrières physiques que sont les membranes cellulaires et donc leur possibilité d’atteindre leur cible pour pouvoir l’inhiber efficacement. L’objectif est maintenant de poursuivre l’optimisation, en collaboration avec nos collègues chimistes, afin de sélectionner au maximum une dizaine de composés intéressants de part ces premières étapes de validation biochimiques et biologiques et donc de les tester en conditions réelles dans un organisme entier. Ce projet nous permettra d’évaluer l’activité anti-parasitaire des inhibiteurs de SUB1 in vivo en vue de les qualifier, ou pas, comme susceptibles d’entrer dans les phases ultérieures d’évaluation pré-cliniques. Différents extraits de plantes Artemisia annua et afra ont été testés sur des parasites sensibles et résistants aux combinaisons thérapeutiques à base d’artémisinine (ART) venant de patients du Cambodge. Pour une concentration en ART équivalente, ces extraits de plantes sont tout aussi efficaces que l’ART synthétique. Une adaptation du protocole afin de se rapprocher des conditions réelles d’une prise de traitement sur 3 jours et d’un équivalent par infusion sur 7 jours a permis de constater que ça améliore l’effet thérapeutique voire permet d’éliminer complètement les parasites même résistants après 7 expositions consécutives. Il semblerait possible d’améliorer la demi-vie initialement courte de l’ART via des inhibiteurs de la métabolisation de celle-ci ou par d’autres composés présents dans Artemisia. L’évaluation d’extraits d’Artemisia apportera des réponses précieuses quant à leur efficacité thérapeutique et prophylactique in vivo chez des parasites sensibles ou résistants à l’artémisinine. Ces données participeront, avec nos travaux réalisés sur la culture ex vivo de parasites P.falciparum résistants et sensibles à l’ART, à mieux caractériser l’activité anti-parasitaire des d’infusions à base d’Artemisia.

Procédures

L’infection des souris avec des globules rouges murins infectés par une injection intra-péritonéale ou intraveineuse dure une dizaine de secondes. Le suivi de la parasitémie se fait par prélèvements sanguins à la queue à partir du 2ème jour après l’infection et tous les jours jusqu’à J7 ou J8 puis tous les 2/3 jours jusqu’à maximum J30. Le geste ne nécessite pas d’échauffement préalable des animaux et ne nécessite que quelques secondes. L’administration des traitements se fait soit par injection intra-péritonéale à l’aide d’une seringue à insuline (30G) ou gavage intra-gastrique à l’aide de canules de gavage adaptées car flexibles et nécessite une dizaine de secondes. En fonction des procédures le traitement est administré en une seule fois ou répété jusqu’à 3 fois par jour pendant 7 jours au maximum. L’anesthésie se fait par injection intrapéritonéale d’un mélange de Xylazine / Kétanime à l’aide d’une seringue à insuline 30G et ne dure que quelques secondes. Une fois anesthésiées les souris infectées vont soit subir une exsanquination totale soit être utilisées pour infecter des moustiques via un repas sanguin. Ces 2 interventions nécessitent quelques minutes. Les manipulations de bioluminescence nécessiteront l’injection en intra-péritonéale d’une solution de D-Luciférine à chacune des souris qui sont alors remises en cage pour 5 minutes suite auxquelles elles sont anesthésiées par 5 minutes d’exposition à l’isoflurane puis maintenues endormies le temps de l’acquisition des images de bio-luminescence (10 à 15 minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage et surveillées jusqu’à leur réveil complet. Cette procédure aura lieu à 3 reprises à plusieurs heures d’intervalle.

Impact sur les animaux

Les souris seront infectées par le parasite P. berghei via une injection intra-péritonéale ou intra-veineuse ce qui occasionnera une gêne légère due à l’injection. Les souris seront maintenues en vie jusqu’à l’apparition des premiers effets indésirables de la maladie qui apparaissent graduellement : poils hérissés, mobilité lente ou prostration, état flasque de la queue, perte de plus de 10% du poids initial, équivalent au score 1 de la grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort du SBEA. .

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Une fois infecté par P. berghei et même dans le cas où le traitement administré a été un succès, les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation et donc non réutilisés afin de ne pas apporter de biais expérimentaux car pour des raisons de reproductibilité, toutes nos expériences sont effectuées sur des animaux dont le poids est similaire et donc l’âge identique afin de standardiser la posologie des traitements administrés.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par la nécessité de tester des composés candidats médicaments (que se soient de nouveaux composés chimiques ou des extraits de plante) dans un organisme entier, première phase indispensable avant d’éventuels essais pré-cliniques, et notamment dans un premier temps chez les rongeurs, ayant à disposition le modèle P. berghei/souris. Ce modèle permettra d’illustrer la capacité des composés sélectionnés à atteindre leur(s) cible(s) et donc à franchir les différentes barrières physiologiques, mais aussi de tenir compte de la métabolisation des composés qui ne peut être abordée in vitro, et ainsi de mesurer leur efficacité in vivo. De plus, il n’existe pas de technique qui permet de réaliser l’ensemble du cycle de vie complexe du parasite in vitro : chez les espèces qui infectent les rongeurs, le cycle de multiplication de P. berghei dans les globules rouges ne peut pas être reproduit in vitro. Les parasites doivent donc être propagés dans le sang des animaux avec un suivi de la parasitémie pour nos expériences mais aussi afin d’éviter que soit atteinte la phase d’occurrence des complications. Il est à noter cependant que seuls les inhibiteurs de SUB1 et les extraits de plantes dûment testés in vitro sur la culture de P.falciparum et ayant montré une activité anti-parasitaire significative seront testés in vivo. Enfin, concernant la cytotoxicité : - La cytotoxicité des inhibiteurs de SUB1 sera au préalable évaluée sur différents types cellulaires in vitro ; - Les extraits d’Artemisia sont issus de pharmacopées traditionnelles et sont bus tous les jours par des millions de personnes depuis des siècles sans qu’aucune toxicité n’ait été observée.

Réduction

Une analyse statistique issue d’expériences réalisées par le groupe il y a plusieurs années et très similaires à celles que nous aurons besoin de réaliser dans le futur a permis d’établir qu’une taille d’échantillon de minimum 5 animaux par groupe permet de détecter les différences de parasitémies interprétables eu égard aux questions posées, ie effet anti-parasitaire observé significatif ou pas pour un tel groupe de souris infectées par P. berghei, comparativement aux contrôles positif et négatif et donc cohérent avec la problématique biologique. Nous utilisons le nombre minimal possible d’animaux pour nos expériences tout en gardant une marge de sécurité d’une ou 2 souris par groupe en cas de problèmes lors de l’expérimentation ou intrinsèque à l’animal. Nous estimons donc que des groupes expérimentaux de maximum 7 individus par condition testée permettent en toute circonstance une appréciation significative au sens statistique du terme. Notre expérience montre que ce nombre d'animaux génère des écart-types exploitables. Ceci permet aussi de réduire le nombre d'expériences à répliquer et par conséquent le nombre d'animaux utilisés. Puis la stratégie choisie est de tester une pré-sélection de composés chimiques et un nombre réduit d’extraits de plante selon des protocoles expérimentaux plus allégés et nécessitant donc moins d’animaux (groupe de 3 individus) pour ensuite ne sélectionner qu’un nombre réduit de 2 candidats "pre-leads" anti-SUB1 et 2 extraits d’Artemisia dont les effets thérapeutiques et prophylactiques seront caractérisés plus précisément. L’objectif de cette pré-sélection est donc de réduire le nombre de composés et extraits à caractériser de façon complète, étape nécessitant plus de conditions expérimentales et donc plus d’animaux. Le statut immunologique d’animaux naïfs, ie n’ayant jamais été infectés, versus d’autres ayant préalablement été infectés représenterait une variable expérimentale susceptible d’introduire un biais expérimental de nature à nuire à la reproductibilité des résultats d’une expérience à l’autre. En conséquence, une fois infectés par P. berghei, et même dans le cas où le traitement administré aura été un succès, ces animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation et donc non réutilisés.

Raffinement

1) Les souris sont hébergées dans des animaleries agréées. La température et la photo-périodicité de ces animaleries sont contrôlées. L’accès aux animaleries est strictement contrôlé et les animaux sont manipulés par des animaliers qualifiés et par des expérimentateurs formés. Les cages, contenant au maximum 7 individus, sont changées de façon hebdomadaire et y sont ajoutées en plus du biberon de boisson et la nourriture, des enrichissements de bien-être tels que des cotons, etc… 2) Pour les souris auxquelles sont inoculées Plasmodium berghei, la souche ANKA utilisée est adaptée aux rongeurs de laboratoire. Les souris infectées sont suivies régulièrement et les parasitémies déterminées. Les animaux sont mis à mort avant que n’apparaissent des symptômes graves de la maladie, liés à des parasitémies importantes, à l’origine de dommages systémiques (prostration, poils hérissés, perte de poids). 3) Pour éviter l’inconfort, notamment lors des repas sanguins des moustiques puis lors de l’acquisition d’imagerie de bio-luminescence, et la souffrance de l’animal lors de l’exsanguination afin de récolter le sang parasité pour en faire des cryo-stabilats, les animaux sont anesthésiés avec un mélange de Xylazine/Kétamine administrés par voie intra-péritonéale.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée pour ce projet est la souris (souches Swiss, BALB/C, NMRI Swiss, C57BL/6). Les hôtes naturels des parasites P. berghei sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’homme. La plupart des concepts, en particulier lors de la recherche de molécules anti-palustres préventives et/ou thérapeutiques ainsi que dans les 1ères phases de la validation d’un médicament, issus des modèles rongeurs se sont révélés exacts chez l’homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou suggérer la recherche chez l’homme n’est plus à faire. Les inoculations de parasites aux souris Swiss pour l’obtention des stabilats seront réalisées sur des jeunes adultes femelles de 3-4 semaines car elles ne sont pas immunocompétentes ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences de l’évaluation des effets prophylactique et thérapeutique in vivo seront réalisées respectivement sur des souris femelles adultes C57BL/6 âgées de 7-8 semaines et NMRI Swiss ou BALB/C de 6 semaines car nous souhaitons que le poids de départ de ces souris au début de l’expérience soit d’environ 20g, paramètre important pour l’administration des différents traitements testés.

3 000 lapins, 1 500 cobayes et 1 000 souris vont être utilisés sur cinq ans, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des injections de vaccins puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour des tests d'activité et d'identité exigés par la Pharmacopée avant commercialisation de vaccins destinés aux animaux de rente. Le porteur présente ces espèces comme "alternatives" à l'espèce cible et justifie leur usage par la "nécessité" réglementaire. Il affirme que ces tests in vivo ne sont "pas remplaçables" sans "un changement de la réglementation de tous les pays".

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’être en adéquation avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires pour la constitution du dossier d’AMM et pour la fabrication d’un lot commercial. Les tests ont pour but de garantir l’activité sérologique ou l'identité de vaccins ou de principes actifs destinés aux animaux de rente. Ils sont effectués sur espèces alternatives (lapins, souris, cobayes) pour limiter le recours à l'espèce cible (animaux de rente). Une équivalence entre les modèles animaux (espèce cible et espèce alternative) a été définie. Ceci permet d’utiliser les modèles rongeurs et d’éviter le recours aux espèces cibles afin de garantir une commercialisation de vaccins efficaces et sûrs.

Bénéfices attendus

Ces tests garantissent la sûreté, l’efficacité et la qualité du produit pour les animaux de rente. Ces tests permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins améliorant considérablement la qualité sanitaire des élevages et la sécurité alimentaire des consommateurs. Pour libérer le nombre nécessaire de doses de vaccins vétérinaires nous utiliserons, au maximum, 3000 lapins, 1500 cobayes et 1000 souris sur 5 ans. Le nombre utilisé varie d’année en année en fonction du nombre de lots de vaccins ou formules vaccinales à tester et des réglementations des différents pays destinataires. A titre d’exemple : - 1 lot de vaccin contrôlé sur 20 souris permet la vaccination de 70 000 bovins - 1 lot de vaccin contrôlé sur 5 à 7 cobayes permet la vaccination de 110 000 bovins ou 550 000 ovins/caprins ou 130 000 porcs - 1 lot de vaccin contrôlé sur 20 lapins permet la vaccination de 481 000 bovins ou 962 000 ovins/caprins - 1 lot de vaccin contrôlé sur 3 cobayes permet la vaccination de 525 000 bovins ou 1 300 000 ovins/caprins

Procédures

Quatre procédures sont prévues dans ce projet. Dans deux procédures tous les animaux (souris, lapins) seront soumis à deux types d’interventions : → Deux injections de vaccins par voie sous cutanée (30 secondes par animal) → Un prélèvement de sang terminal sous anesthésie (10 minutes par animal endormissement compris). Dans une troisième procédure tous les cobayes seront soumis à trois types d’interventions : → Un prélèvement de sang sous anesthésie (10 minutes par animal endormissement compris). → Deux injections de vaccins par voie sous cutanée (30 secondes par animal) → Un prélèvement de sang terminal sous anesthésie (10 minutes par animal endormissement compris). Enfin dans la dernière procédure les cobayes seront soumis à une seule injection par voie intra-dermique sous anesthésie (10 minutes par animal endormissement compris) et aucun prélèvement n’est réalisé.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les opérations conduites sur les animaux peuvent au plus générer un stress et une douleur légère à modérée de courte durée en fonction de l’occurrence des administrations et des examens individuels. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l'animal ne serait plus dans sa zone de confort.

Devenir

Les animaux ayant terminé une procédure ne peuvent pas intégrer une autre procédure comme exigé par leur statut d’animaux EOPS. Ainsi, en fin de procédure, ils seront mis à mort.

Remplacement

La nécessité d’utilisation des animaux provient de la réglementation en vigueur sur ces tests, en conformité avec la réglementation du pays destinataire. Elle permet de démontrer l’activité du vaccin ou de la formulation vaccinale. A ce jour, ces tests in vivo ne sont pas remplaçables par un modèle in vitro. La Pharmacopée Européenne et les réglementations des pays destinataires du produit demandent des tests sur animaux pour la mise sur le marché de lot commercial. Il n’est actuellement pas possible de les remplacer sans un changement de la réglementation de tous les pays.

Réduction

Le nombre, le statut et le sexe des animaux utilisés est décrit dans les réglementations des pays ou par la Pharmacopée. Le nombre d’animaux utilisés par lot est faible (compris entre 5 et 20 animaux maximum par lot). Les souris, cobayes et les lapins sont des espèces alternatives pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de l'espèce cible (animaux de rente).

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe et soignés quotidiennement dans des conditions conformes à la réglementation et dans une ambiance propice au bien-être des animaux. Tous les animaux passent par une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement d’au moins 3 jours pour les souris, d’au moins 14 jours pour les cobayes et d’au moins 21 jours pour les lapins avant le début du test. Les animaux ont accès à la nourriture et à l’eau à volonté et sont hébergés dans une ambiance musicale. Des enrichissements sont installés dans les hébergements (alimentaire et/ou objets de type huttes, tunnels, balles, hochets, plateforme de repos, repose pattes, palets de foin de Crau et lanières de nidification selon les espèces). Par ailleurs, ces procédures sont mises en œuvre depuis 2005 conformément à la version APAFIS précédente.

Choix des espèces

Les souris, les cobayes et les lapins sont des espèces alternatives pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de l'espèce cible (animaux de rente) En fonction des techniques utilisées, les lapins ont entre 3 et 6 mois d'âge, les cobayes pèsent entre 250g et 350g ou entre 350g et 450g et les souris entre 17 et 21 g ou âgées de 8 semaines le jour de l'injection (J0). Ce stade de développement correspond à celui requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et au dossier déposé aux autorités.

3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Souvent humanisées ou immunodéficientes, elles reçoivent des injections répétées et jusqu'à 5 à 10 prélèvements sanguins par semaine, puis un prélèvement terminal d'organes, pour valider des modèles inscrits au catalogue de la société genOway. Le porteur indique que les prélèvements et injections répétés peuvent causer des douleurs et que les études de toxicité peuvent dégrader l'état général des animaux, une crème anesthésiante étant appliquée par endroits. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour la pharmacocinétique et la toxicité, ces mécanismes ne pouvant selon lui être reproduits hors d'un animal.

Objectifs

Des modèles animaux génétiquement modifiés, exprimant des cibles thérapeutiques humaines ou reconstitués avec un système immunitaire humain sont développés pour la réalisation d’études précliniques transposables à l’homme et la sélection de nouveaux composés thérapeutiques innovants pour le cancer, les maladies infectieuses, les maladies inflammatoires. Leur validation avant commercialisation passe par l’évaluation de composés thérapeutiques commercialisé ou en développement pour montrer la pertinence des observations faites, comparé à ce qui est déjà décrit chez l’homme. Des études de preuves de concept sont réalisées dans ces modèles animaux pour démontrer leur pertinence et faire ensuite des criblages à plus large échelle, choisir la dose optimale du composé et/ou son schéma d’administration. Le projet décrit des études de pharmacocinétique évaluant la durée de vie d’un composé thérapeutique et sa vitesse d’élimination entre autres. La durée de vie d’un composé est un paramètre majeur de l’activité d’un nouveau traitement. Ce projet décrit aussi des études préliminaires de toxicité de nouveaux composés thérapeutiques dans des modèles animaux mimant des éventuels effets indésirables chez l’homme. Dans ces études, de nouveaux composés thérapeutiques ou des composés déjà connus seront administrés, des prélèvements de sang à différents temps après l’administration des composés seront réalisés pour mesurer la quantité de composé présente dans le sang ou détecter des facteurs liés à une éventuelle toxicité. Les souris recevront une ou plusieurs injections (maximum 3/semaine), ces dernières durant au maximum 1 minute chacune. Selon la voie d’injection les souris seront anesthésiées avant l’injection. Les prélèvements de sang seront au maximum de 5 à 10/semaine/souris suivis d’1 ou 2 semaines de repos sans prélèvement. Chaque prélèvement dure au maximum 1 minute. En fin d’études, les animaux seront euthanasiés pour analyser certains organes pouvant étudier la toxicité éventuelle du composé testé et sa durée de vie. La règle des 3R sera respectée en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire pour assurer les analyses souhaitées et la pertinence des informations scientifiques recherchées. Les procédures envisagées n’entraineront pas de souffrance aigue et longue. En cas de souffrance passagère, des analgésiques/anesthésiants locaux ou oraux seront administrés. L’environnement des animaux sera enrichi.

Bénéfices attendus

Le projet décrit ici vise à permettre la validation de nouveaux modèles animaux expérimentaux, rendus translationnels par l’humanisation de certaines cibles ou du système immunitaire des souris ou de facteurs impliqués dans la pharmacocinétique de composés thérapeutique. La validation de ces modèles permettra de les proposer dans le catalogue de genOway pour qu’ils soient à la disposition des équipes développant de nouveaux composés thérapeutiques. Cela permettra une évaluation translationnelle de leurs innovations thérapeutiques. Ces études d’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pourront aussi être conduites à genOway et sont décrites ici. Ces études permettront de faire avancer la recherche biolmédicale et de sélectionner les meilleurs candidats thérapeutiques pour de futurs développements cliniques.

Procédures

La nature des procédures inclues dans le projet nécessite des prélèvements sanguins multiples. Ces derniers peuvent être source de douleurs de courte durée, surtout s’ils sont répétés sur le même site de prélèvement. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. Un prélèvement sanguin tel que dure au maximum 1 minute. Les voies de prélèvements sanguins pourront être modifiées afin d’éviter une trop grande répétition au même site, tout apparition de dommages sur la peau ou de dommage de la veine, entrainera aussi un changement de site de prélèvements voire de voie. Enfin une crème anesthésiante pourra être appliqué avant les prélèvements pour limiter la douleur occasionnée. Dans certains cas, les administrations de composés pourront aussi être répétées et ces administrations répétées selon la voie choisie et si le site d’administration est conservé peuvent conduire à une souffrance passagère. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. La durée d’une injection n’excède jamais 1 minute. Dans la mesure du possible, le site d’administration sera changé entre 2 administrations et/ou l’application en local d’une crème anesthésiante sera réalisée afin de limiter lasouffrance animale. Dans le cas des études préliminaires de toxicité aigue ou chronique, la toxicité éventuelle des composés testés peut conduire à une dégradation de l’état général de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement, une perte de poids, une baisse ou une hausse de température. En cas de toxicité aigue, ces effets seront de courtes durée (24 à 72h). En cas de toxicité chronique, ces effets peuvent apparaitre plus tardivement et durer plus longtemps. Tous ces paramètres seront suivis quotidiennement pour ce type de procédures et les critères de points limites seront appliqués afin de veiller à ne pas laisser souffrir les animaux. Un analgésique par voie orale pourra être administré en cas de signes cliniques de souffrance avant l’atteinte des points limites.

Impact sur les animaux

La nature des procédures inclues dans le projet nécessite des prélèvements sanguins multiples. Ces derniers peuvent être source de douleurs, surtout s’ils sont répétés sur le même site de prélèvement. Les effets douloureux devraient limités à quelques minutes ou heures. Les voies de prélèvements sanguins pourront être modifiées afin d’éviter une trop grande répétition au même site, tout apparition de dommages sur la peau ou de dommage de la veine, entrainera aussi un changement de site de prélèvement voire de voie. Enfin une crème anesthésiante pourra être appliquée avant les prélèvements pour limiter la douleur occasionnée. Dans certains cas, les administrations de composés pourront aussi être répétées et ces administrations répétées selon la voie choisie et si le site d’administration est conservé peuvent conduire à une souffrance passagère. Les effets douloureux devraient être limités à quelques minutes ou heures. Dans la mesure du possible, le site d’administration sera changé entre 2 administrations et/ou l’application en local d’une crème anesthésiante sera réalisée afin de limiter la souffrance animale. Dans le cas des études préliminaires de toxicité aigue ou chronique, la toxicité éventuelle des composés testés peut conduire à une dégradation de l’état général de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement, une perte de poids, une baisse ou une hausse de température. En cas de toxicité aigue, ces effets seront de courtes durée (24 à 72h). En cas de toxicité chronique, ces effets peuvent apparaitre plus tardivement et durer plus longtemps. Tous ces paramètres seront suivis quotidiennement pour ce type de procédures et les critères de points limites seront appliqués afin de veiller à ne pas laisser souffrir les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de permettre des analyses sur les différents organes et compléter les observations faites sur le sang au cours de la procédure.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animales dans ce domaine car les études de pharmacocinétique et de toxicité préliminaire font intervenir des mécanismes physiologiques complexes qui ne peuvent être reproduits en dehors d’un être animal. Ces études doivent être conduites sur des animaux vivants afin de reproduire et prédire ce qu’il pourra se passer dans un être humain à qui sera administré les composés thérapeutiques ultérieurement.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par lot est calculé pour obtenir des résultats qui soient statistiquement interprétables. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité nécessaire mais sans excès de sérum afin de faire les mesures voulues. Cela doit permettre de prélever plusieurs fois le même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Le nombre de souris ne sera augmenté que quand les volumes nécessaires seront trop élevés d’un point de vue éthique pour être fait sur les mêmes animaux tout au long de l’étude. Enfin, dans la mesure du possible, à la place d’animaux non traités qui seraient en plus dans les études, nous réaliserons un prélèvement avant l’administration des composés d’intérêt afin d’avoir un niveau basal des paramètres mesurés et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés. En fin d’étude à la mise à mort des animaux, plusieurs organes pourront être prélevés pour faire diverses explorations et ainsi mutualiser l’utilisation des animaux pour explorer différents questions et paramètres au sein de la même expérience et ainsi limiter le nombre global d’animaux utilisés pour répondre à la question scientifique posée en évitant les répétitions trop nombreuses des expériences.

Raffinement

Dans le cadre des études décrites ici, les animaux seront surveillés quotidiennement. Une crème anesthésiante pourra être appliquée au site d’injection en cas d’injection répétées sans changement de site et dans la mesure du possible, les injections répétées seront faites en changeant régulièrement de site d’injection pour limiter la douleur. Cette même crème pourra être appliquée pour les prélèvements sanguins répétés. Là encore le site de prélèvement voire la voie pourront être modifiés dans la mesure du possible et en cas d’apparition de lésion cutanée et de dommages au niveau de la veine prélevée. En cas de lésion, des soins seront réalisés (désinfectant et cicatrisantcutané) et l’évolution sera surveillée avec application des points limites le cas échéant. Lors des études préliminaires de toxicité, un monitoring clinique régulier et fréquent avec l’établissement d’un score clinique et la mesure fréquente de la température et du poids de l’animal vise à détecter au plus tôt des manifestations cliniques de la toxicité éventuelle des composés testés. L’apparition de ces signes conduira à une surveillance accrue des animaux concernés. En cas de signe de souffrance, un analgésique pourra être administré dans l’eau de boisson. En cas d’atteinte de signes cliniques sévères (point limite) ou de la combinaison de 3 signes cliniques modérés, les animaux concernés seront mis à mort pour limiter leur souffrance.

Choix des espèces

LLe rongeur par sa taille et sa manipulation aisée, est un modèle de choix pour l’humanisation de certaines cibles thérapeutiques, l’humanisation du système immunitaire par reconstitution ou l’humanisation de facteurs intervenant dans la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de certains composés thérapeutiques. Aujourd’hui les conditions zootechniques et le niveau d’ingénierie génétique sont tels que la construction à façon de lignées profondément immunodéficientes ou présentant l’humanisation d’une ou plusieurs cibles thérapeutiques est possible. Ces animaux permettent des avancées majeures dans la compréhension des maladies humaines et de sélectionner des thérapies adaptées et performantes.Les souris humanisées pour certaines cibles thérapeutiques ou facteurs seront utilisées dans ces procédures dès l’âge de 6 semaines et jusqu’à un âge d’environ 16 semaines. En effet, il faut que les souris inclues dans ces études soient suffisamment matures notamment d’un point de vue du système immunitaire pour que les résultats observés soient pertinents. Les souris humanisées pour leur système immunitaire seront utilisées à un âge de 16 à 30 semaines, afin que la reconstitution du système immunitaire humain soit établie et stable, ce que nous avons précédemment établi pour la tranche d’âge citée ici. Les souris génétiquement modifiées pour les cibles ou facteurs humains seront utilisées dans ces procédures dès l’âge de 6 semaines et jusqu’à un âge d’environ 16 semaines. En effet, il faut que les souris inclues dans ces études soient suffisamment matures notamment d’un point de vue du système immunitaire pour que les résultats observés soient pertinents. Les souris BRGSF-HIS seront utilisées à un âge de 16 à 30 semaines, afin que la reconstitution du système immunitaire humain soit établie et stable, ce que nous avons précédemment établi pour la tranche d’âge citée ici.