Procédures légères
Traitement debout par un Champ Electrique Pulsé à Haute Fréquence des zones habituelles des sarcoïdes équins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Trois juments vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrées au troupeau de chevaux de travaux pratiques. Elles reçoivent, sous sédation, des impulsions électriques destinées à mettre au point un traitement des sarcoïdes équins sans anesthésie générale, sans injection de cisplatine à ce stade. Le porteur indique que le nouveau protocole, à tension réduite, ne devrait pas provoquer la douleur observée avec la méthode actuelle, ce qu'il dit avoir vérifié sur les bras des concepteurs de l'appareil. Il justifie le recours au cheval par l'intérêt d'éviter l'anesthésie générale et ses risques au réveil.
Objectifs
L’électrochimiothérapie (ECT) est une technique largement utilisée pour le traitement des sarcoïdes chez les chevaux. La procédure est habituellement realisée obligatoirement sous anesthesie générale car les impulsions électriques délivrées par le générateur au travers d’electrodes au contact de la tumeur sont à très haute tension. Préalablement aux impulsions électriques, des injections intra-tumorales d’agent cytotoxique (cisplatine par exemple) sont realisées. Les impulsions électriques provoquent la perméabilisation des cellules tumorales et permettent une meilleure pénétration des agents cytotoxiques. Le projet a comme objectif l’essai des applications des champs électriques pulsés (ou impulsions électriques) sur un cheval debout, tout d'abord sans administration de cisplatine. Une fois démontré que l’électroporation ne génère pas une réaction douloureuse pour le cheval ni dangereuse pour le cheval et les opérateurs, nous voudrions passer par la suite à la réalisation de séances d’ECT debout, sans l’obligation de devoir soumettre le cheval à une anesthésie générale, comme c’est le cas actuellement. Le fait d’éviter l’anesthésie générale et surtout le réveil évite une grande partie des risques de mortalité et d’accidents associés à cette procédure.
Bénéfices attendus
Les sarcoïdes sont des tumeurs bénignes très fréquentes chez les chevaux et nous recevons beaucoup de cas en consultations pendant toute l’année. Le traitement le plus efficace, et qui surtout évite le risque de récidives (très fréquent avec ce type de tumeur), est l’électrochimiothérapie (ECT). Nous proposons ce traitement quasiment pour tous les cas de sarcoïdes. Certains propriétaires acceptent ce traitement sans problèmes, alors que d’autres refusent de traiter leur cheval principalement pour une raison financière (chaque séance coute environ 900 euros, et il faut réaliser au moins 3 séances pour avoir un bon résultat) ou pour des inquiétudes liées aux risques d'une anesthésie générale. Si les sarcoïdes ne sont pas traités, ils vont la plupart du temps augmenter en taille et être gênants pour le cheval. Dans le pire des cas, si la localisation et la taille sont incompatibles avec la vie du cheval, l’euthanasie est conseillée. Ce protocole électrique amélioré de l’ECT (train d’impulsion plus court et à 800 Volts au lieu de 1 300) aurait plusieurs impacts très positifs : 1. Le cheval pourrait être juste sédaté au lieu de subir une anesthésie générale lourde, 2. La nécrose liée au champ électrique seul serait minimisée, 3. La durée du traitement et les soins liés à l’anesthésie seraient très réduits, 4. Le coût pour les propriétaires serait divisé par 4, rendant plus accessible ce traitement et incitant les propriétaires à traiter ces tumeurs à des stades plus précoces qu’actuellement.
Procédures
1. Une séance d'électrostimulation sous sédation avec maximum 3 localisations testées par jument, 30 min par jument; 2. Administration d'AINS par voie intraveineuse, une intraveineuse à J1; 3. Administration d'AINS par voie orale, maximum 2 fois par jour pendant 3 jours puis une fois par jour pendant 3 jours; 4. Examen clinique par un vétérinaire pendant 1 semaine, 10 min/jour; 5. Hébergement en box pendant une semaine avant retour au pré.
Impact sur les animaux
Les impulsions électriques du nouveau protocole sont délivrées à une fréquence autour de 1 MHz contre 5 kHz actuellement, et sont surtout multipolaires ; c’est cette combinaison qui réduit drastiquement la stimulation des axones des cellules nerveuses par rapport aux impulsions unipolaires délivrées actuellement en médecine vétérinaire et en médecine humaine. De plus, la tension a été réduite de 1 300 V à 800 V, ce qui fait que l’intensité de la douleur associée à la réaction nerveuse et musculaire (spasmes et contractions généralisés du corps du cheval) que nous observons avec le protocole actuel, ne seront plus présentes. Le cheval ne va pas sentir de douleur mais une légère sensation très localisée (voire aucune sensation). Tous les protocoles électriques ont été testés sur les bras et jambes des trois concepteurs du générateur du projet afin de vérifier l’absence de douleur. À l’issue de ce projet, lorsque les chevaux seront traités avec injection préalable de cisplatine, un œdème de la zone traitée peut être attendu le jour du traitement, qui peut durer quelques jours après la seance. Nous l’avons aussi avec le protocole actuel et cela correspond à l’inflammation créée par le cisplatine et l’électroporation. Quelques jours après le traitement la zone traitée peut devenir exsudative et montrer une légère nécrose, due à l’action cytotoxique du cisplatine dans les cellules tumorales, résultat que nous rechercherons avec le cisplatine parce qu’il indique un bon fonctionnement. Des anti-inflammatoires sont toujours donnés au cheval avant et après la séance, pendant plusieurs jours. Le propriétaire est toujours prévenu de cet effet indésirable.
Devenir
La procédure n'impactant pas la qualité de vie des animaux, ils pourront retourner dans le cheptel des chevaux de TP de l'ENVT.
Remplacement
Des essais in-vitro, sur des cellules tumorales ainsi que des cellules saines, ont été menés au préalable afin de démontrer l’efficacité du nouveau protocole avec une mortalité accrue des cellules tumorales et une survie plus élevée des cellules saines qu’avec le protocole d’ECT actuel. Parmi les protocoles électriques les plus efficaces, a été retenu celui dont la sensation ressentie a été la plus faible sur les bras et jambes des concepteurs du générateur. Le millier d’essai in vitro a donc permis de déterminer les valeurs optimales des impulsions (champ électrique, intensité, durée, fréquence), et il n’est donc pas question de faire des tests sur les chevaux en faisant varier des paramètres, d'où une réduction du nombre d'animaux pour ce projet. Il est maintenant nécessaire d’évaluer l’absence ou la faible réaction du cheval sous sédation avec ce nouveau protocole, avant d’envisager par la suite d’évaluer son efficacité sur des tumeurs solides.
Réduction
Nous voudrions tester le nouveau protocole avec 3 juments, afin d’évaluer les différents réactions subjectives que chaque cheval peut avoir par rapport à sa perception de la douleur. Nous n’avons pas besoin d’autres animaux en plus pour pouvoir valider le projet.
Raffinement
Nous allons noter, documenter et filmer toutes les différentes phases du protocole sur chaque jument, afin de suivre au mieux l’évolution du projet. Chaque jument est sedatée par voie intraveineuse, pour réduire encore plus la sensibilité pendant l’électroporation. Des anti-inflammatoires et antidouleurs sont administrés avant la séance (Jour 0) par voie intraveineuse. Le jour après (Jour 1) nous utilisons la même dose d’anti-inflammatoires par voie intraveineuse. Le Jour 2 des anti-inflammatoires sont donnés 2 fois par jour par voie orale. En fonction de la réaction locale (œdème plus ou moins marqué), nous déciderons de la prolongation ou non du traitement anti-inflammatoire oral. Les juments seront observées pendant 1 semaine après la seance, plusieurs fois par jour. Ces juments sont hébergées en groupe au pré au sein d'un Centre Equestre. Elles pourront être séparées du groupe pour les essais mais seront alors placées dans des boxs au sein de la clinique équine, lieu dans lequel elles sont habituées à être logées lors des séances de Travaux Pratiques.
Choix des espèces
Le nouveau protocole a pour vocation d'être utilisé par la suite en médecine équine. De plus, le cheval représente l’espèce la plus indiquée dans ce cas parce que le fait de pouvoir éviter l’anesthesie générale avec cette espèce réduit considérablement les risques de fractures, d'œdème pulmonaire, d’arrêt cardiaque, qui peuvent se passer pendant le réveil. Adultes car la plupart des sarcoïdes sont présents sur des chevaux adultes et non sur des poulains ou nouveau-nés.
Comparaison des caracteristiques pharmacocinetiques d’une molecule innovante administree par les voies intraveineuse, intraperitoneale et orale chez la souris NMRI
- Recherche fondamentale
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris reçoit une injection intraveineuse, intrapéritonéale ou un gavage d'un candidat médicament contre le glioblastome, avant d'être mise à mort pour prélever le liquide céphalorachidien, l'urine, le sang et les organes. Le porteur indique avoir utilisé au préalable des modèles cellulaires 2D et 3D pour cadrer les doses. L'objet du projet est de mesurer la façon dont la molécule se distribue et s'élimine dans l'organisme selon la voie d'administration.
Objectifs
Depuis plusieurs années, nous développons une molécule innovante pour le traitement d'une forme très agressive et incurable de cancer du cerveau, le glioblastome. Son efficacité anti tumorale a été mise en évidence dans des souris chez lesquelles nous avions greffé des cellules cancéreuses provenant de patients. La demande actuelle a pour objectif d'identifier les caractéristiques pharmacocinétiques de ce candidat médicament dans le modèle murin selon différents modes d'administration.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer la manière dont le candidat médicament se distribue dans l'organisme, la vitesse à laquelle il est éliminé ainsi que le mode d'administration le mieux adapté. Ces caractéristiques sont importantes pour optimiser le traitement contre ce type de tumeur cérébrale chez l'humain.
Procédures
Chaque souris aura à subir une injection intrapéritonéale, intraveineuse ou un gavage selon le mode d'administration du candidat médicament. Ces gestes ne durent pas plus qu'une dizaine de secondes. Au terme de l'incubation, chaque souris recevra une dose d'anesthésique par voie intrapéritonéale d'une dizaine de secondes.
Impact sur les animaux
La molécule innovante a fait l'objet d'études préalables de toxicité aïgue et chronique. A la dose utilisée, aucun effet indésirable n'a été observé. Les animaux auront toutefois à subir la nuisance des injections intrapéritonéales, intraveineuses et du gavage au cours desquelles le composé à l'étude sera administré.
Devenir
La procédure comporte le prélèvement du liquide céphalorachidien, de l'urine, du sang et des organes. Les animaux seront donc mis à mort.
Remplacement
Au cours du développement du projet, nous avons utilisé des modèles cellulaires in vitro 2D et 3D pour optimiser la concentration efficace et déterminer la gamme de toxicité du principe actif.
Réduction
Le design expérimental en pharmacocinétique est variable. Nous avons choisi de limiter le nombre d'animaux nécessaire à l'étude en adoptant comme comparateur un groupe unique de souris à t=0. Cela a permis de réduire de moitié le nombre d'individus.
Raffinement
Pendant le temps de la procédure expérimentale (48h), les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur. Nous apporterons un soin particulier lors de l'acclimatation à habituer les animaux à la présence de l'expérimenteur et à être manipulés (contention). Ainsi le niveau de stress sera diminué lors de la procédure qui durera 48h.
Choix des espèces
A ce stade du développement pré-clinique du médicament, la souris est le modèle de référence le plus proche de l'humain pour obtenir les résultats nécessaires La pathologie visée affecte les adultes. Aussi nous utiliserons des souris adultes
Évaluation d’une thérapie peptidique chez le rat R-DMDdel52, modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
174 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue par injection létale, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils développent une perte de masse musculaire, une faiblesse croissante et une atteinte cardiorespiratoire, jusqu'à une mise à mort dite compassionnelle entre six et treize mois, et reçoivent jusqu'à plusieurs dizaines d'injections d'une protéine testée. Le porteur décrit un comportement de "freezing" et une surveillance rapprochée, et affirme n'attendre aucune toxicité du traitement. Il retient le rat plutôt que la souris car son modèle "mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle".
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare causée par des mutations dans le gène de la dystrophine porté par le chromosome X. La myopathie est rapidement invalidante. Le déficit en dystrophine induit une perte progressive de force dans les muscles, menant à la perte de l'ambulation à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles de la ventilation et du muscle cardiaque entraine une insuffisance cardiorespiratoire fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune thérapie curative. Cependant, l'utilisation des glucocorticoïdes, traitement de référence largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte d'ambulation et le décès d'environ 2 à 8 ans, avec le désavantage de provoquer un grand nombre d’effets secondaires qui dégradent la qualité de vie des patients. Depuis 5 ans, on assiste à une accélération de propositions d'autorisation de mise sur le marché (composés pharmacologiques, vecteurs de thérapie génique) et on dénombre une cinquantaine d'essais cliniques en cours (clinicaltrials.gov). Sur le plan mécanistique, l'absence de dystrophine dans les cellules cardiaques et les cellules des muscles squelettiques induit d'abord une dysfonction, puis une fragilité et enfin une rupture des membranes cellulaires lors des cycles de contraction/relâchement de ces muscles. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique, l'accumulation de matière fibreuse et une formation de vaisseaux sanguins inappropriée. Cette combinaison empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle. Dans ce contexte, notre objectif scientifique est de proposer une alternative aux traitements existants incluant les glucocorticoïdes en apportant la preuve de principe préclinique de l'efficacité d'une thérapie innovante. En se basant sur une étude précédente réalisée chez la souris, l'hypothèse est qu'une forme non oxydable d'une protéine X serait capable de ralentir la progression de la DMD, en luttant contre l'inflammation et le stress oxydatif impliqués dans la pathologie. L’efficacité de la protéine X sera testée sur les rats DMD seule ou en association avec un traitement aux glucocorticoides.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice du traitement avec la protéine X sur le modèle original et pertinent du rat DMD récemment développé. La protéine X est un nouvel acteur dans la gestion de la progression de la DMD grâce à son nouveau mécanisme d'action. Cette protéine X permet de rééquilibrer la balance vers la regénération aux dépens de l’inflammation dans les muscles dystrophiques. Plus particulièrement, la protéine X devrait améliorer la contribution des cellules souches du muscle à la réparation musculaire. Ce traitement devrait donc permettre de bénéficier simultanément de différentes propriétés thérapeutiques sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. En cas de bénéfice évident chez les rats, les données précliniques robustes produites seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. A long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. La diminution de la dégénération musculaire, aussi bien au niveau des muscles squelettiques qu’au niveau du cœur, retarderait la progression de la maladie et pourrait même prévenir la perte de l’ambulation et l'insuffisance respiratoire ou cardiaque fatale. Cette thérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant ou en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires.
Procédures
Les animaux reçoivent la protéine X par une injection hebdomadaire par voie intrapéritonéale et pour certains lots une injection sous-cutanée ou les deux. Cela correspond à un nombre d'injections compris entre 9 et 18 (9 semaines de traitement, essai préclinique à court terme) et 22-48-69-138 (22 semaines, 48 semaines ou 69 semaines - essai préclinique à long terme). Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbital, 1 fois en procédure 2 ou 4 fois en 17 mois selon les procédures. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus une analgésie. L'évaluation fonctionnelle privilégie les méthodes non invasives. La mesure de force nécessite une anesthésie injectable, réalisée 1 fois avant la mise à mort pour les animaux des deux procédures d'essai clinique à court et long terme. Il n'y a pas de chirurgie prévue.
Impact sur les animaux
Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme, principal acteur de la ventilation de repos, est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Ces défaillances combinées conduisent à la nécessité d'une mise à mort compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvement chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques sont bien connus ce qui permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. L'essai préclinique à court terme de ce projet inclue des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables. L'essai préclinique à long terme de ce projet inclue des animaux au-delà de 6 mois. Nous porterons une attention particulière à ces animaux avec une surveillance quotidienne et une prise de poids hebdomadaire jusqu’à l’âge de 6 mois puis tous les deux-trois jours. En ce qui concerne le traitement, Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection de la protéine X. En effet, il est reconnu que la thérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité.
Devenir
À l'issue des trois procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer à l'échelle microscopique l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés (muscles des membres, diaphragme, cœur). Bien que non attendue, il est également essentiel de prélever les organes sentinels d'une éventuelle toxicité (reins, foie, rate, poumons) et de les soumettre à une expertise anatomopathologique. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par une injection létale de pentobarbital.
Remplacement
Des études antérieures ont montré qu'une version modifiée de la protéine X favorise la régénération sans exacerber l'inflammation en induisant l'expansion des cellules souches musculaires et en mobilisant les macrophages, favorisant ainsi la guérison des tissus. De manière très intéressante, un criblage cellulaire de plus de 5 000 médicaments cliniques et composés médicamenteux a mis en évidence que plus de 50 % des composés qui inhibent les activités pro-inflammatoires de la proténe X étaient des glucocorticoïdes. Ces résultats soulignent l'importance de cibler des isoformes redox spécifiques de cette protéine aussi bien dans des conditions physiologiques que pathologiques. Sur ces bases mécanistiques très robustes, ce projet vise à trouver la réponse à une question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelations constante à savoir quels sont les effets bénéfiques sur l'éventail de mécanismes pathogènes ouvert par le processus dystrophique peut-on attendre d'un traitement précoce, court ou long, sur un modèle animal de dystrophie musculaire de Duchenne.
Réduction
Les expériences déjà menées sur les rats DMD traités avec différents candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique) ont montré que traiter 5-7 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Le problème majeur avec cette lignée est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique (essentiellement), les données de 5-7 animaux arrivés au terme de la procédure puissent être traitées. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6-8 animaux selon le genotype sauvage ou DMD et ce grace à des analayses à l'aide d'un t test non paramétrique de Mann-Whitney entre deux groupes ou un ANOVA entre plusieurs groupes. L'effet âge étant évalué par un test de Friedman par mesures répétées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées et monitorées. La température des locaux est maintenue dans la fenêtre 22 ± 2 °C. Pour le bien-être des rats, ils sont stabulés dans des cages XL ayant une surface de 2080 cm2 et une hauteur de 23 cm sur une moitié de la surface, soit 5 cm de plus que la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début (3-4 semaines, animaux de 100g puis ce nombre est progressivement réduit jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g (animaux sauvages au-delà de 5 mois, les rats DMD non traités n'atteignent jamais cette masse corporelle). L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. Nous prêterons attention aux points suivants: - perte de mobilité par atrophie des muscles des pattes, - prostration due à une anomalie cognitive ou à la douleur, - lordose excessive liée à l'atrophie des muscles dorsaux comme chez les patients, - arrêt du toilettage entrainant la dégradation du pelage, - vocalise anormale (hors contention) ou grimaces faciales, la cause de la douleur est recherchée et des antalgiques pourront être prescrits, notamment sur les animaux DMD en fin de vie, nous pourrons utiliser un anti-inflammatoire ou un opioïde après consultation du vétérinaire référent. La survenue de l'un des points ci-dessus associé à une perte de poids sur une semaine dépassant 20% du poids maximal atteint par l’animal et non compensée par la mise à disposition de nourriture humide et d’hydrogel en fond de cage (difficulté à ronger les croquettes sèches, dysphagie possible liée à la dégradation des muscles masticateurs), entrainera la mise à mort compassionnelle de l'animal concerné.
Choix des espèces
Le rat, une espèce de mammifère phylogénétiquement proche de l'homme, constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris myopathe, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin de la myopathie de Duchenne. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle sur le chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).
Impact de la croissance sur l’élimination de différents polluants industriels et agricoles chez le jeune mouton contaminé
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
5 jeunes moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des polluants industriels et agricoles par cathéter, puis subissent une dizaine de prélèvements de sang étalés sur cent jours et le port de couches pour recueillir leurs fèces. Le porteur affirme que la dose reste sous le seuil de toxicité et ne retient que le stress de la contention et des prélèvements. Il présente l'étude in vivo comme un préalable à des modèles informatiques censés à terme remplacer une partie de l'expérimentation.
Objectifs
Certains territoires métropolitains ou Antillais sont durablement contaminés par des polluants persistants. Sur ces territoires, la production de denrées alimentaire comme l’élevage, pose un risque sanitaire pour la population. Afin de proposer des stratégies d'élevage (conditions et temps d'attente) permettant une diminution de la concentration de polluants dans la viande, c'est à dire une décontamination des animaux permettant la production de denrées saines en zone contaminée, de nouveaux modèles informatiques sont aujourd’hui développés pour prédire les temps de décontamination nécessaires. Ces modèles sont des modèles toxicocinétiques à compartiments basés sur la physiologie (modèle PBPK). Ces modèles permettront également à moyen terme de remplacer une partie de l’expérimentation animale par une prédiction in silico (par informatique). En attendant, le paramétrage de ces modèles nécessite l’obtention de données telle que la capacité de l’animal à éliminer la molécule ou encore la distribution de la molécule dans l’organisme. La présente demande vise à obtenir ces données de paramétrage chez l’agneau pour différents polluants et à les comparer aux données de la littérature obtenues chez le mouton adulte afin de mieux comprendre l’effet âge dans le comportement des molécules au sein de l’organisme et ainsi affiner le modèle.
Bénéfices attendus
Ces résultats permettront l'acquisition de connaissances sur l'élimination de polluants chez l'ovin en croissance, ce qui permettra d'obtenir des paramètres nécessaires pour développer un modèle toxicocinétique à compartiments basé sur la physiologie (PBPK), simulant le transfert de ces polluants chez cet animal. Ce modèle prédira le temps minimal de décontamination des animaux d'élevage dans l’objectif de garantir la production de denrées animales saines dans des territoires contaminés.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d'interventions : 1- La pose de cathéter et l'injection des polluants sur animaux vigiles. 2- Le prélèvements de sang sur animaux vigiles les jours 1, 3, 7, 15, 29, 44, 57, 71, 84 et 100. 3- La pose de couches en tissu et la récolte de fèces toutes les 4 heures durant 24 h le premier jour puis durant douze heures les jours 3, 7, 15, 29, 44, 57, 71, 84 et 100.
Impact sur les animaux
Les quatre nuisances et stress identifiés sont : Le stress lié 1°) à la manipulation et la contention lors des différents prélèvements et 2°) à la douleur (celle d’une piqûre par une aiguille) suite à la pose de cathéter sur animal vigile ou ponction par aiguilles pour les prélèvements sanguins. 3°) Le stress lié à la perte de volume sanguin lors des prélèvements. 4°) Le stress lié à l’utilisation de couches en tissu positionnées entre le bassin et les jarrets pour le prélèvement des fèces. En revanche, la dose de contaminant employée est calculée pour être largement en deçà des seuils de toxicité. Elle n'entrainera donc pas d'effet toxique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort. Cela permettra de prélever différents tissus afin de les analyser et d'obtenir des données sur les concentrations des différentes molécules étudiées et d'avoir ainsi des données sur la distribution de ces molécules au sein de le l'organisme du jeune ovin en croissance.
Remplacement
La contamination (et décontamination) des ovins par les polluants est un champ d’étude qui est encore peu renseigné aujourd’hui et dont l’approche est rendue complexe en raison des spécificités de la physiologie des ruminants et des pratiques d’élevage mises en œuvre. Ces interactions « ruminants-polluants » doivent être abordées in vivo dans la mesure où (i) nous ne connaissons pas les paramètres toxicocinétiques des molécules indiquées chez l'ovin en croissance (ii) nous ne disposons pas de modèle in vitro ou ex-vivo ou in silico validé chez l'ovin en croissance et (iii) il n’existe pas à ce jour de modèle mathématique adéquat permettant de simuler le devenir des contaminants dans l’organisme chez ce type d'animal. Cependant, les résultats de ce projet permettront de collecter des données pour la création d’un modèle de transfert de chlordécone chez les ruminants en croissance, ce qui permettra à termes de remplacer l’utilisation d’animaux dans ce type d’étude.
Réduction
Nous réduirons le nombre d'animaux en expérimentation sur la base de (i) la répétabilité des mesures analytiques dans le domaine de l'analyse des polluants, (ii) l'expérience antérieure de l'équipe de recherche en terme d'écart type résiduels prévisibles pour les petits ruminants, et (iii) la prédictibilité du modèle basé sur la physiologie (modèle PBPK) précédemment développé chez l'ovin adulte. Cinq animaux (répétition) peuvent donc être considérés comme un nombre minimum mais néanmoins suffisant.
Raffinement
Nous limiterons les interventions sur les animaux à des prises de sang (au début par cathéter puis par aiguilles+vacutainer) de volumes limité et des poses ponctuelles de couches pour la récupération de fèces sur des périodes de 24h. Les animaux, ayant un comportement social, seront hébergés en groupe de 2 ou 3 par boxes, dans une même pièce. Ils pourront donc se voir, se sentir et s'entendre. Des filets de foin seront positionnés dans les boxes pour favoriser la recherche de nourriture et enrichir le milieu. . Les animaux seront habitués à la présence quotidienne des expérimentateurs pour développer une relation sociale routinière avec l’homme, et entrainés progressivement au port des couches.
Choix des espèces
Ce projet concerne uniquement l’espèce ovine (jeune ovin en croissance), pour laquelle aucune information n’est disponible en termes de devenir de la chlordécone et autres polluants dans l’organisme en croissance. Cependant cette espèce, très présente aux Antilles est largement consommée par la population locale d'où l'intérêt de l'étudier. Nous pouvons également noter qu'un modèle basé sur la physiologie (modèle PBPK) a déjà été développé chez l'ovin adulte, il est donc intéressant et opportun de l'étendre à l'ovin en croissance. De plus l'ovin, espèce compatible avec les structures d'hébergement prévus, pourra plus généralement servir d'espèce modèle pour recueillir les données toxicocinétiques concernant les molécules étudiées chez le jeune ruminant en croissance. Dans le cadre de cette expérimentation, afin de s’assurer du bien-être des animaux, les ovins seront en effet hébergés dans des conditions respectant les recommandations indiquées dans la directive 2010/63/UE. Le projet met en œuvre des animaux en croissance, fraichement sevrés. Ils auront tous le même âge et leur poids sera compris entre 25 kg +/- 2kg.
Optimisation des modèles de maladies neurodégénératives chez la souris par implantation intracérébrale d’organoïdes cérébraux
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tuées à l'issue et 60 reproductrices réutilisées pour d'autres projets ou le maintien de la lignée. Un organoïde cérébral de 1 à 2 mm leur est greffé dans le cerveau sous anesthésie, parfois suivi d'une injection d'une molécule candidate. Le porteur indique des effets possibles pendant environ une semaine, stress, douleur, œdème, hémorragie ou comportement anormal, ainsi qu'un risque de prolifération des cellules injectées. Les retombées thérapeutiques sont renvoyées au long terme, et il affirme qu'un tissu complet reste accessible uniquement via l'animal.
Objectifs
Les recherches dans le champ du vieillissement du cerveau humain et des maladies neurodégénératives sont largement menées chez des souris génétiquement modifiées qui surexpriment des protéines pathologiques associées à ces maladies. De ce fait, il est difficile d’étudier ces pathologies au plus proche du contexte physiologique ainsi que les mécanismes qui mènent à leur propagation. Le projet s’intéresse à mettre au point un nouveau modèle murin permettant l’étude du vieillissement et des maladies associées. Les souris recevront une greffe d’organoïdes cérébraux dans le cerveau. Ces organoïdes, aussi appelés « minibrain », sont des structures en trois dimensions de cellules cérébrales obtenues in-vitro. La greffe de ces organoïdes chez la souris permettra d’évaluer de multiples mécanismes, comme la vascularisation ou la mise en place des projections axonales, mais aussi leur colonisation par les cellules gliales et l’interconnexion neuronale entre elles et les tissus cérébraux de l’hôte. En conditions pathologiques, suite à la greffe d’organoïdes provenant de cellules génétiquement modifiés, les conditions d’initiation de la pathologie étudiée seront plus proches de celles retrouvées chez les patients. Il sera alors possible d’étudier l’évolution, la prolifération et la colonisation de la pathologie au sein d’un organisme modèle et d’évaluer la transmission des signaux nerveux entre la greffe et le tissu hôte des souris. Enfin, une dernière partie s’intéressera à valider et repositionner notre modèle avec les traitements déjà utilisés chez les modèles transgéniques et qui permettent d’endiguer la propagation et/ou avoir des effets bénéfiques sur les déficits observés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra dans un premier temps d’étoffer les connaissances scientifiques sur plusieurs aspects, tout d’abord techniques, sur l’implantation d’un organoïde chez la souris mais aussi fondamentales, sur les mécanismes prolifératifs des maladies neurodégénératives ainsi que la mise en place des processus neuronaux et gliaux. Un nouveau modèle murin sera alors accessible à la communauté scientifique pour étudier toutes sortes de mécanismes cérébraux. Ce projet vise aussi à repositionner notre modèle par rapport au modèles transgéniques en évaluant les effets de différentes stratégies thérapeutiques déjà éprouvées chez les animaux transgéniques. Ce nouveau modèle pourrait permettre à plus long terme la mise en place de traitements, préventifs ou palliatifs, pour lutter contre les maladies neurodégénératives.
Procédures
En fonction de la procédure les animaux recevront au maximum une intervention chirurgicale pour réaliser la greffe de l’organoïde dans le cerveau des rongeurs. Cet acte chirurgical sera effectué sous anesthésie et analgésie, qui durera environ une trentaine de minutes. Une injection permettant l’administration d’une molécule candidate pour un traitement sera réalisée elle aussi sous anesthésie (30 minutes), un mois après. D’autres animaux pourront recevoir, toujours sous anesthésie (30 minutes), une injection contenant les cellules des organoïdes dissociées suivi d’une autre injection un mois plus tard contenant une molécule candidate pour un traitement.
Impact sur les animaux
Les animaux participant à cette étude pourraient présenter des effets indésirables suite à la greffe dans la cavité cérébrale d’un organoïde dont la taille est comprise entre 1 et 2mm de diamètre. Dans la semaine qui suit cette procédure, les animaux pourraient être affectés de différentes manières par des effets indésirables : un stress et/ou une douleur accrus, un œdème ou une hémorragie ou encore un comportement anormal. La durée probable de ces effets indésirables est estimée à une semaine. Un autre effet indésirable possible est la prolifération des cellules injectées dans les temps plus tardifs.
Devenir
A l’exception des animaux reproducteurs qui n’auront reçu aucune chirurgie ni injection (élevage et production des animaux pour les autres procédures), les animaux entrant dans les procédures seront euthanasiés. Il sera ainsi possible de rechercher et scorer les mécanismes permettant à l’organoïde et au tissu cérébral de l’hôte de cohabiter, ainsi que les effets pathologiques liés à la présence d’un organoïde porteur d’une mutation retrouvée dans les maladies neurodégénératives. Les animaux reproducteurs seront réutilisés, toujours en tant qu’animaux reproducteurs pour d’autres projets ou le maintien de la lignée dans l’animalerie.
Remplacement
De nombreuses caractérisations du développement et de la prolifération des maladies neurodégénératives ont déjà été faites au niveau cellulaire et sur des modèles animaux transgéniques. Nous souhaitons mettre en place dans ce projet un nouveau modèle animal, le plus complet possible, qui permettrait de suivre le développement de ces pathologies. Pour suivre et évaluer la dissémination des marqueurs physiopathologiques, nous avons besoin d’un tissu complet disposant de tous les types cellulaires interagissant ensemble. Tous ces paramètres sont accessibles uniquement via un modèle animal.
Réduction
Dans la littérature spécialisée, les essais « pilotes » se font sur des groupes de 5 à 15 souris immunodéficientes. Chaque expérience peut être répétée au moins 2 fois, si besoin, pour obtenir des données statistiquement exploitables. Pour établir un nouveau modèle biologique et acquérir une expertise technique pour effectuer le geste chirurgical pour effectuer la greffe, nous envisageons d’utiliser des groupes de 5 animaux lorsqu’il s’agit de mettre au point les conditions optimales pour réaliser la greffe et des groupes de 10 animaux pour les études des pathologies ou des traitements. Ce nombre d’animaux par groupes nous permettra de considérer l’étude comme statistiquement significatives. Pour une expérience donnée, si les résultats statistiques se montrent significatifs après une répétition, la seconde et dernière répétition ne sera pas effectuée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes de 5, dans un environnement approprié à leur statut immunodéficitaire (litière et nourriture stérilisées, eau sur filtre antibactérien d’exclusion 0,22 µm, cages avec couvercle filtrant dans un local isolé) à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies autant que nécessaire. Les animaux seront examinés quotidiennement par les zootechniciens, sous la supervision du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Un environnement enrichi sera fourni aux animaux, selon nos procédures standards (tubes de carton, boules de coton…). De plus, une première expérience sera destinée à apporter un raffinement technique sur l’implantation d’organoïdes cérébraux chez la souris en passant d’une opération chirurgicale à une injection intracérébrale. Des mesures spécifiques sont prises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales : surveillance accrue, soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur, …). Mise en place egalement de points limites adaptés et d’un arbre décisionnel en fonction des observations faites pour l’application des points limites .
Choix des espèces
Le modèle murin (souris) est le modèle de référence dans le domaine des maladies neurodégénératives. Il s’agit du modèle le plus utilisé et le plus étudié dans la communauté scientifique et une bibliographie riche et abondante y est associée. Pour réaliser notre projet, nous nous appuierons sur les différentes données déjà publiées, comme l’évolution des pathologies pour les animaux génétiquement modifiés, afin de comparer ces données aux résultats que nous obtiendrons avec notre nouveau modèle. Ces données nous permettent de faire reposer ce projet sur des bases bibliographiques solides qui ne sont pas à répéter, ce qui va aussi dans la logique d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, le laboratoire dispose des compétences techniques pour effectuer les greffes d’organoïdes chez la souris ce qui permettra une diminution du nombre d’animaux utilisés. Age/poids des souris : 6 à 8 semaines et de 20 à 25g. Il s’agit d’après la littérature scientifique du stade optimal pour réaliser les greffes d’organoïdes chez les souris immunodéprimées.
Modélisation de la maladie de Stargardt chez un rongeur diurne
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
48 Psammomys obesus, rongeurs diurnes, vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des rétines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Leur gène est inactivé par CRISPR-Cas9 dans un œil pour reproduire une dégénérescence maculaire, puis leur vision est suivie par imagerie sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique que la perte de photorécepteurs ne touche qu'un œil et n'attend aucun autre effet indésirable. Il justifie ce rongeur, dont la rétine compte 40 % de cônes, par l'échec des modèles souris à reproduire cette maladie.
Objectifs
Ce projet a pour but de créer et caractériser un nouveau modèle animal de la maladie de Stargardt, dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente, touchant des personnes jeunes et provoquant un handicap visuel lourd dû à la perte de la rétine centrale, appelée macula. Le gène impliqué a été identifié, mais son inactivation chez la souris n'entraine aucune des lésions rencontrées chez les patients. Le rongeur diurne Psammomys obesus présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, ayant une structure rétinienne ressemblant à celle de la macula humaine. La technologie « CRISPR-Cas9 » sera utilisée pour bloquer l'expression du gène à l'origine de la maladie dans les yeux des Psammomys. Un suivi ophtalmologique longitudinal sera ensuite effectué, avec des techniques d'imagerie non invasives (tomographie par cohérence optique, fond d'œil, angiographie). Il sera suivi d’analyses cellulaires et moléculaires post-mortem. Nous espérons ainsi obtenir le premier modèle fidèle de la maladie de Stargardt, et ainsi ouvrir la voie à des approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La suppression du gène Abca4 dans l’œil de Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme la macula humaine, devrait permettre l’obtention d’un modèle animal de la maladie de Stargardt récapitulant les atteintes affectant les patients, et donc de déterminer les mécanismes conduisant à la perte des cônes dans cette maladie et ainsi d'ouvrir des perspectives thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Une anesthésie gazeuse sera utilisée afin d’obtenir l’immobilité des animaux au moment des examens ophtalmologiques (imagerie OCT et fond d’œil). La durée d'anesthésie sera de 10-15 minutes pour chacun des points du suivi longitudinal. Ce suivi comprendra au moins 3 points (1, 2 et 4 semaines après injection) avec la possibilité de un à deux points supplémentaires (2 et 3 mois après injection), selon l'évolution des symptômes.
Impact sur les animaux
L’inactivation du gène à l’origine de la maladie humaine devrait entrainer une perte localisée des photorécepteurs de la rétine. Cette perte ne concernera qu’un seul des deux yeux de l’animal. Aucun effet indésirable n’est attendu à l’issue des procédures expérimentales, basées sur de l’imagerie sans contact et pratiquée au cours d’une anesthésie de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque étape de cette procédure, les animaux retournent dans leur établissement d'origine. Ils y seront euthanasiés après la dernière étape pour prélèvements des rétines afin d'effectuer des analyses moléculaires et cellulaires complémentaires.
Remplacement
Nous cherchons à modéliser une maladie complexe - maladie de Stargardt, forme de dégénérescence maculaire précoce. Pour ce faire, il est nécessaire de pouvoir disposer d'une rétine dont la structure est proche de celle de l'homme (le modèle souris a montré ses limites pour cette maladie, le rat ne semble pas mieux adapté avec seulement 1% de cônes, contre 3% chez la souris et 40% chez Psammomys obesus), avec des interactions maintenues avec l'épithélium pigmentaire sur une durée d'un mois ou plus. Aucun modèle in vitro disponible à l’heure actuelle ne permet de reproduire ces conditions.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, l’approche Crispr-Cas9 a été validée par analyse génomique puis sur des cellules. Chaque animal sera son propre contrôle. Avec la précision de l’imagerie OCT, 12 animaux par condition (traitement, sexe) ceci permettra de valider les résultats avec une puissance statistique satisfaisante (>90%) même en cas d’un amincissement rétinienne de l’ordre de 10%, en nous basant sur la variabilité inter-animal observée chez le rat. Au cours de la maladie de Stargardt, une réaction inflammatoire est observée. Afin de vérifier si une inhibition précoce de cette inflammation permettrait de limiter les atteintes rétiniennes, la moitié des animaux sera placée sous traitement anti-inflammatoire dès l’inactivation du gène. Ceci fait donc un total de 48 animaux (24 mâles, 24 femelles).
Raffinement
OCT et fond d’œil sont des méthodes d’imagerie non invasives. Elles sont réalisées sous anesthésie chez les animaux uniquement afin d’obtenir leur immobilité sur le temps d’observation. Chez l’homme, elles sont réalisées avec des équipements comparables sans anesthésie ou analgésie. Une anesthésie gazeuse est préférée à une anesthésie par injection intra-péritonéale, car la durée d’anesthésie peut être maintenue au minimum nécessaire, avec un réveil rapide. Les deux examens seront effectués de manière bilatérale sur la même anesthésie. Comme le réflexe de clignement est absent sous anesthésie, la cornée sera maintenue hydratée grâce à du gel ophtalmique pendant toute la durée de perte de connaissance. Les animaux seront placés sur un coussin chauffant afin de maintenir leur température corporelle. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet.
Choix des espèces
Les études sur modèles murins n’ont pas permis de reproduire les symptômes de la maladie de Stargardt. La souris, rongeur nocturne avec seulement 3% de photorécepteurs cônes (3% des photorécepteurs). Nous utiliserons ici un modèle rongeur diurne, Psammomys obesus, dont la rétine est enrichie en cônes (40% des photorécepteurs), ce qui rapproche sa structure de la macula humaine. Le gène à l’origine de la maladie de Stargardt sera inactivé à partir du 15ème jour postnatal, car c’est à ce stade (équivalent à 7-12 ans) que la maladie se déclare chez l’homme. Les examens ophtalmologiques commenceront une semaine après. Ils seront répétés une puis deux semaines plus tard, puis si nécessaire de mois en mois jusqu’à stabilisation des atteintes rétiniennes.
Production d’anticorps polyclonaux murins
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par prélèvement cardiaque sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent cinq injections sous-cutanées d'antigènes pour leur faire produire des anticorps dirigés contre des protéines de microsporidies, parasites de l'abeille et de l'humain. Le porteur signale de rares lésions aux points d'injection et un pelage terne, et présente les anticorps comme des outils "indispensables" et leur usage comme une "nécessité". Il affirme ne recourir aux souris que faute d'anticorps disponibles dans le commerce.
Objectifs
Le projet s'inscrit dans l'étude des interactions hôtes-parasites. Nous étudions les microsporidies, parasites intracellulaires obligatoires apparentés aux champignons, au travers notamment de la mise en place du dialogue moléculaire entre les parasites et leurs hôtes. Plusieurs modèles microsporidiens sont étudiés: 1- l'espèce Nosema ceranae, parasite de l'abeille. 2- l'espèce Anncaliia algerae parasite de l'homme et de l'anophèle. 3- les espèces du genre Encephalitozoon, parasites des mammifères. Dans le cadre de ces études sur les relations hôtes-parasites, nous nous intéressons particulièrement aux mécanismes d'invasion. Pour cela, nous avons besoin de caractériser les protéines microsporidiennes impliquées dans ces mécanismes et les protéines de l'hôte qui sont ciblées par le parasite. Les anticorps sont des outils indispensables pour localiser ces protéines à l'échelle cellulaire, et/ou les co-purifier avec leurs partenaires d'interaction. Nous ciblons plus spécifiquement les protéines parasitaires constituant l'appareil invasif des microsporidies, ainsi que les protéines de surface de la spore (stade de résistance et de dissémination). Ces protéines sont susceptibles d'interragir avec des protéines de la membrane plasmique des cellules hôtes. L'identification des protéines cibles de l'hôte pourra permettre une meilleur compréhension des mécanismes d'invasion, et ainsi permettre d'envisager un bloquage du processus d'invasion. Pour ces analyses, l'utilisation des anticorps est une nécéssité. Ce sont des sondes de choix en raison de leur spécificité et de leur affinité.
Bénéfices attendus
Les résultats du projet devraient permettre une meilleure compréhension des mécanismes d'invasion très originaux utilisés par les microsporidies pour infecter leur hôte. Ceci peut permettre d'élaborer ensuite des solutions prophylaxiques et/ou thérapeutiques pour bloquer ou limiter l'infection des hôtes par le parasite. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait en effet permettre d'élaborer de nouvelles approches thérapeutiques afin de lutter contre les microsporidioses, plus particulièrement chez l'abeille, pour laquelle aucune molécule efficace n'est actuellement autorisée.
Procédures
Manipulation des animaux lors de la mise en boîte à induction pour la réalisation de l'anesthésie gazeuse. Injection sous cutanée sur animaux endormis. Ces 2 interventions prennent en moyenne 10 minutes, par animaux. Les animaux seront soumis à 5 injections sur la durée du projet. Anesthésie gazeuse, puis prélèvement cardiaque sur animaux endormis, avant euthanasie de ces derniers. Ces interventions prennent en moyenne 10 minutes par animaux.
Impact sur les animaux
Des lésions aux sites d'injections peuvent apparaître dans de très rare cas sur les animaux. Certains animaux peuvent avoir une modification de leur activité, et de leur aspect physique (pelage terne ou hirsute).
Devenir
A l'issue de l'expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés
Remplacement
Pour pouvoir réaliser des expériences d'immunolocalisation et/ou immunoprécipitation, nous avons besoin de sondes ayant une forte spécificité et une bonne affinité envers nos protéines cibles. Les anticorps permettent de répondre à ces exigences. Nous réalisons cette production en ayant recours à des animaux uniquement si il n'existe pas d'anticorps spécifiques à nos protéines d'interêts disponibles dans le commerce. Nous ciblons en général des protéines spécifiques des agents pathogènes étudiés pour lesquelles aucun anticorps n'est disponible.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux, il est prévu d'immuniser un seul animal par antigène étudié. Si les sérums des animaux immunisés ne sont pas spécifiques de l'antigène étudié, une purification des immunoglobulines sera réalisée. Une deuxième série d'immunisation contre le même antigène sera envisagée si les anticorps ne détectent pas l'antigène même après purification. Si des anticorps produits chez un deuxième animal venaient également à ne pas répondre à l'antigène, l'étude portant sur cet antigène sera définitivement abandonnée.
Raffinement
Afin de limiter les stress des animaux, ceux ci seront acclimatés deux semaines dans l'animalerie avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 par cage avec un enrichissement de leur environnement. La technique d'immunisation par injection sous cutanée sera réalisée sous anesthésie gazeuse légère en boîte à induction au moyen d'air médical et d'isoflurane afin de limiter le stress de l'animal. Une surveillance des animaux, aspect externe, comportement, sera réalisée quotidiennement. Les animaux présentant une modification de comportement ou d'aspect physique seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance. Pour cela, des points limites ont été définis selon plusieurs critères : 1- activité, diminution marquée de la motricité spontanée, des activités de toilettage, ou motrice après stimulation. 2- aspect physique modifié, poil hirsute, pelage terne, prostration, vocalisation. 3- apparition de lésions importantes aux sites d'injections.
Choix des espèces
Deux raisons principales nous ont amené à choisir la souris pour cette production d'anticorps. 1- les anticorps polyclonaux que nous envisageons de produire seront utilisés à des fins de recherche exclusivement pour des expériences d'immunolocalisation ou d'immunoprécipitation nécessitant de faibles volumes de sera. 2- les antigènes proviennent d'espèces éloignées phylogénétiquement de la souris ( parasites eucaryotes unicellulaires) Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines. 2 semaines d'acclimatation à l'animalerie sont prévues avant de manipuler les animaux. Cela nous permet de travailler sur des souris jeunes adultes ( 8 à 10 semaines) qui ont une réponse immune suffisamment développée et pas encore (trop) affectées par des challenges immuns. De plus, la robustesse de la réponse immune diminue avec l'âge après le début de l'âge adulte.
Suivi de la biodistribution et de la toxicité de liposomes chez la souris gestante
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue avec leurs fœtus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection de liposomes dans la veine de la queue sous anesthésie, suivie d'une imagerie, le porteur signalant que le protocole peut provoquer des fausses couches chez la femelle gestante. Mères et fœtus sont ensuite tués pour doser les nanoparticules dans leurs tissus. Le projet vise à cibler le placenta pour des médicaments de la grossesse, les explants de placenta humain étant jugés insuffisants.
Objectifs
Le développement de médicaments lors de la grossesse est complexe car il faut à la fois éviter le passage des médicaments du côté du bébé et les concentrer au niveau du placenta pour limiter les effets secondaires chez la Mère. Ainsi ce projet s’articule autour du développement de nanomédicaments, les liposomes qui sont fabriqués pour aller spécifiquement dans le placenta.
Bénéfices attendus
Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques disponibles pour la femme enceinte.
Procédures
Anesthésie sous isoflurane (5 min) (4% induction, 1.2% entretien dans un mélange oxygène/air 70/30), injection dans la veine (1min) de la queue, imagerie (5min) et ceci représente une durée totale d’environ 11 min.
Impact sur les animaux
La souris gestante étant plus fragile que la souris non gestante, les différentes étapes du protocole pourraient entraîner des fausses couches.
Devenir
A la fin de la procédure les souris et les fœtus seront mis à mort dans le but de prélever les tissus et de procéder à une quantification ex vivo des nanoparticules aussi bien chez la mère que chez le fœtus.
Remplacement
Des tests sur explants isolés de placenta humain ont permis de sélectionner les formulations les plus intéressantes, toutefois la complexité des échanges materno-fœtaux et l’avancée de nos études nécessitent l’évaluation des formulations optimisées chez la souris gestante.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés in fine dans cette étude, parmi 5 formulations mises au point et 8 peptides identifiés seul 1 formulation et 3 peptides après étude in vitro sur lignée cellulaire et ex vivo sur explant placentaire soit une réduction d’un nombre de souris de 1480 souris. De plus, nous utilisons une technique d’imagerie optique qui permet de faire plusieurs mesures sur un même animal et qui évite de sacrifier l'animal à chaque temps de cinétique et donc in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce cas pour une formulation et un peptide associé nous utilisons 20 souris (lot A et B) et non120 si nous voulions obtenir les données cinétiques pour 8 temps post injection .
Raffinement
L’administration dans la veine caudale sera réalisée sous anesthésie locale. En effet une crème EMLA comme anesthésique local à base de lidocaïne et de prilocaïne sera appliquée sur la zone d’injection afin de réduire la douleur de l’animal. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane (4% induction, 1.2% entretien dans un mélange oxygène/air 70/30). La souris est placée sur un tapis thermostaté pendant l’imagerie. De plus elle sera placée dans une cage thermostatée et oxygénée le temps du réveil et de la récupération post examen d’imagerie. Des points limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien être tout le long de l’étude ont été établis. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînerait l'euthanasie anticipée de l'animal.
Choix des espèces
Nous souhaitons évaluer la biodistribution de Liposomes, nanomédicaments, après injection intraveineuse. La souris est le modèle le plus approprié par sa physiologie proche de l’homme (taux d’homologie 90%) ainsi que la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Souris swiss adultes gestantes entre J12.5 et J15.5 de gestation. Cette chronologie de gestation est choisie car c’est le moment où le placenta est le mieux développé et c’est un moment encore assez éloigné pour ne pas risquer un accouchement prématuré.
Optimisation du traitement de l’hémophilie en augmentant la synthèse de protéine hFIX par térapie génique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie, des souris hémophiles, reçoit des candidats de thérapie génique injectés dans la veine de la queue, suivis de cinq prélèvements sanguins et de tests de coagulation, avant mise à mort par dislocation cervicale et analyse du foie. Le porteur teste quinze candidats sur des souris saines pour n'en retenir que trois, afin de limiter le recours aux souris malades. Il affirme que les cellules en culture ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme complet".
Objectifs
Dans ce projet, nous avons mis au point différents candidats de traitement de l'hémophilie (maladie due à un déficit de la protéine hFIX, entrainant des difficultés de cicatrisation et donc de saignement important, lors de blessures). Ce traitement permet de relancer l’expression et la synthèse de la protéine hFIX ce qui améliorera la cicatrisation des patients. Différents candidats ont été testé sur des cellules en cultures ; ils permettent tous de produire la protéine hFIX. Nous avons besoin de tester nos 15 meilleurs candidats sur des souris saines, dans un premier temps, afin de s’assurer que ces traitements fonctionnent également sur un organisme entier, sans entrainer de réponse immunitaire. Cette étape permettra de sélectionner les 3 meilleurs candidats et donc de limiter l’utilisation de souris hémophiles. Ces deux premières étapes donneront une réponse rapide quant à l’efficacité de nos traitements car nous étudierons les souris 1 mois seulement après administration du traitement. Dans un troisième temps, le meilleur candidat sera injecté dans des souris hémophile pour étudier sa capacité à traiter la maladie sur une durée de 6 mois.
Bénéfices attendus
Pour les patients : Amélioration du traitement de l'hémophilie par thérapie génique / Réduction des doses injectées / Diminution ds effets secondaires. Pour la recherche : Technologie applicable à tous traitement par thérapie génique. Pour les industrie pharmaceutiques : Réduction des doses injectées / Réductions des couts de production.
Procédures
Injection du traitement dans a veine de la queue / Frequence 1X / Durée 30 secondes. Prélevement sanguin / Fréquence J1, J7, J14, J21, J28 / Nombre 5X / Durée 30 secondes. Test de formation des caillots / Fréquence 1 à 2X / Nombre 1 à 2X / Durée 30 minutes. Sacrifice (dislocation cervicale) / Fréquence 1X / Durée 10 secondes.
Impact sur les animaux
Traitement injecté : aucun effet secondaire n'est attendu suite à l'injection du traitement. Traitement des souris hémophile : diminution des problèmes liés à la maladie (réduction du temps de saignement suite aux bagares etc.) Injection : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure d'aiguille. Prise de sang : Stress lié à la contention + douleur liée à la piqure. Test de formation des caillots : Stress lié à la manipulation + douleur liée à la piqure. Eutanasie : Stress lié à la manipulation. Souris hémophile : pas de douleur quotidienne lié à la maladie / Douleurs liées aux saignements lors de bagarres, etc.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude car nous devons réaliser des analyses sur différents organes, notamment le foie.
Remplacement
Afin de limiter au maximum le nombre de souris utilisé, nous avons réalisé un premier tri parmi nos traitements candidats sur des cellules en culture. L'utilisation de cellules nous a permis de réaliser un premier tri rapide en nous basant sur du oui/non (le traitement est-il capable de faire créer par les cellules du foie la protéine hFIX manquante chez les patients hémophiles). Néanmoins, cette approche est limitante car elle ne représente pas la complexité d'un organisme complet (avec cette approche nous faisons produire la protéine hFIX par le foie puis elle est ensuite envoyé dans les vaisseaux sanguins pour approvisionner tous les autres tissus et organes) et ses possibles réponses immunitaires contre le traitement. C'est pourquoi nous devons travailler sur des souris pour mieux caractériser nos traitements.
Réduction
Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 258 souris). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la première étape n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes. De même, si le nombre de candidats efficace est inférieur à ce dont nous avons prévu, moins de souris seront utilisées. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (210 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.
Raffinement
Les souris seront maintenues en élevage en nombre réduit par cage afin de limiter les bagarres entre souris, pouvant entrainer des blessures et saignement (4 souris par cages). Les souris seront observées régulièrement : les souris dominantes seront isolées, les souris blessées seront soignées (plaies désinfectées et cautérisées) pour éviter les hémorragies. Si une hémorragie ne peut pas être stoppée, la souris sera euthanasiée afin d'éviter des souffrances inutiles. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisée.
Choix des espèces
De nombreux animaux hémophiles existent (souris, mouton, chien, etc.) ces animaux présentent une similarité avec la maladie de l'hémophilie humaines, avec une activité de coagulation réduite et des hémorragies spontanées dans les tissus des coussinets plantaires et des hémorragies sous-cutanées. Dans ce projet, nous souhaitons tester nos traitements sur des souris ce qui permettra de faciliter la génération des animaux (6/10 petits par portée pour des souris contre 1 pour les moutons), de faciliter l'élevage des animaux (en cage plutôt que dans un champs), de réduire les couts de gestion, etc. Les souris hémophiles sont viables, fertiles et de taille normale. Nous utiliserons des souris mâles adultes car c'est une maladie qui touche uniquement les males (souris ou humains). Les souris seront injectées entre 6 et 8 semaines de vie, ce qui correspond à un âge adulte pour la souris, et nous permettra de comparer avec l’âge des adultes que nous souhaitons traiter.
COGALIM: Effet d’une modification du régime alimentaire sur le microbiote intestinal et les capacités cognitives chez un primate omnivore
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
126 microcèbes, primates, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 42 d'entre eux tués sous anesthésie pour prélever leur cerveau et 84 gardés vivants puis remis dans la population captive. Pendant cinq mois, leur régime alimentaire est modifié et ils subissent des prélèvements sanguins réguliers, des mesures métaboliques et des tests cognitifs. Le projet teste une hypothèse évolutive reliant alimentation, microbiote intestinal et taille du cerveau humain. Le porteur affirme que le microbiote est "difficilement reproductible in vitro" et justifie le recours à un primate omnivore.
Objectifs
Le projet COGALIM vise à valider l'hypothèse selon laquelle un changement dans la composition du régime alimentaire modifie le budget énergétique d'un primate omnivore, notamment par le biais de modifications du microbiote intestinal, et que cela pourrait entrainer un compromis énergétique affectant les fonctions cérébrales et les capacités cognitives. En effet, les primates omnivores sont contraints d’adapter leur régime alimentaire en fonction des ressources saisonnières disponibles et de leurs besoins intrinsèques. Ceci peut impacter le budget énergétique, notamment en modifiant le coût de la digestion. Cette dernière fonction est d’ailleurs au cœur d’une théorie évolutive expliquant l’augmentation de la taille du cerveau chez l’Homme, notamment par l'adaptation à un régime omnivore avec des aliments denses en énergie, peu fibreux et cuits. Des premiers travaux chez un primate omnivore ont montré que ni la taille du repas, ni sa composition n’avaient d’influence significative à très court-terme (3 jours) sur le coût de la digestion. Néanmoins, si des mesures sont toujours en cours, des analyses complémentaires sont nécessaires pour évaluer l'impact physiologique de modifications du régime alimentaire (Objectif 1) ainsi que pour évaluer la digestibilité apparente des différents régimes testés (Objectif 2) et leur impact sur la flore microbienne (Objectif 3). En plus de suivre le degré d'adaptabilité du microbiote intestinal, nous chercherons à évaluer l’impact d’une modification importante du régime alimentaire sur les processus centraux de la régulation du métabolisme et des capacités cognitives (Objectif 4).
Bénéfices attendus
Nos résultats permettront d’évaluer la flexibilité énergétique d’un primate omnivore face aux variations de son régime alimentaire et de mieux formaliser les relations entre alimentation, métabolisme et fonction cérébrale. Les résultats de ce projet permettront également d'étayer les hypothèses sur l'origine de l'évolution de la taille du cerveau chez les homininés, et éventuellement de confirmer ou non un rôle d'une modification du mode d'alimentatation.
Procédures
Une partie des animaux (N=6) sera soumise à une modification du régime alimentaire pour 3 jours seulement; l'autre partie (N=120) sera exposée à ces différents régimes pour 5 mois et sera exposée à des prélèvements sanguins réguliers (toutes les 2 semaines), des mesures de leur taux métaboliques, de leur composition corporelle et de leurs capacités cognitives.
Impact sur les animaux
Les possibles effets indésirables attendus résident surtout dans la durée d'exposition aux différents régimes alimentaires testés, et potentiellement sur la répétition des prélèvements sanguins. Néanmoins, nous avons basé nos compositions de régimes alimentaires sur des études déjà réalisées sur le long-terme (5-6 mois), et chez des modèles primates. Le suivi des paramètres sanguins (glycémie et acides gras circulants) ainsi que des indices comportementaux au quotidien (signes de prostration, absence d’alimentation, symptômes apparents de gêne ou de douleur, agressivité, sur-léchage, etc) permettront de s'assurer du maintien du bien-être des animaux. A cet égard, le microcèbe se caractérise par une très grande flexibilité métabolique; nous faisons l'hypothèse que les changements de régime alimentaire ne devraient pas affecter sur le long-terme l'état de santé des animaux. Par ailleurs, dans le cas où la fréquence des prélèvements sanguins serait trop importante et entrainerait des troubles comportementaux, nous pourrons la diminuer à une fois par mois; néanmoins, nous précisons que les volumes et fréquences prévues sont très en deça des recommandations.
Devenir
A l'issue de l'unique procédure de ce projet qui sera appliquée sur une durée de 5 mois, 84 animaux seront maintenus en vie et retourneront dans la population captive et pourront éventuellement être réutilisés pour d'autres projets en fonction de la compatibilité des procédures. Les 42 autres animaux seront seront euthanasiés dans le but de réaliser des prélèvements de tissus fixés, en particulier pour évaluer par marquage immunohistochimique les effets des régimes alimentaires sur certains processus cérébraux (formation de nouvelles cellules nerveuses par exemple).
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des animaux par des méthodes alternatives compte-tenu de la nature des processus explorés. En effet, l'adaptation du mircobiote à un changement de régime alimentaire est un processus difficilement reproductible in vitro. Par ailleurs, l'étude de l'impact d'éventuels changements du microbiote intestinal sur les fonctions cérébrales et les capacités cognitives ne peut malheureusement pas être réalisée à l'aide de méthodes alternatives. Enfin, le recours à une espèce primate omnivore se justifie par l'objectif de tester l'hypothèse de l'effet d'une modification du régime alimentaire sur la fonction cognitive, et éventuellement de son rôle dans l'évolution de la taillle du cerveau humain.
Réduction
Afin de répondre à l’exigence de réduction du nombre d’animaux mais assurer tout de même un pouvoir statistique suffisant pour les effets attendus (notamment compte-tenu de la variabilité interindividuelle des capacités cognitives), la majorité des mesures sera réalisée sur 10 animaux adultes par sexe et par groupe expérimental, sauf pour les groupes CTL et régimes gras (3 mâles de plus dans chaque groupe). Néanmoins, le nombre d'animaux sacrifiés en fin de projet (afin de réaliser des analyses immunohistochimiques du cerveau) a été réduit à 3 par condition expérimentale (N=42 au total), ce qui permettra tout de même de déceler des effets entre les groupes expérimentaux, notamment pour les processus comme la neurogenèse.
Raffinement
Le but de cette étude étant de caractériser l'impact du régime alimentaire sur la fonction de digestion et les capacités cognitives, une grande attention sera portée au maintien des conditions optimales pour le bien-être des animaux en essayant d’être le moins intrusif possible et donc d'oberver les animaux dans les conditons les plus physiologiquers possibles. Dans cette optique, les animaux seront maintenus en groupe (et non isolés comme il est souvent le cas dans les protocoles de suivi du régime alimentaire) et dans leurs pièces d'animalerie respectives pour réduire le stress. Les animaux bénéficieront donc d'un environnement familier et enrichi selon les pratiques habituelles de l'animalerie. L'ensemble des gestes appliqués dans le cadre de ce projet a été raffiné au cours des dernières années afin de limiter le stress et le mal-être des animaux, en étant notamment pratiquées par des opérateurs expérimentés. Tous les animaux seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer du bien-être des animaux utilisés. Pour cela, des indicateurs comme le poids de l’animal, la prostration, l’absence d’alimentation, des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, etc) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, etc) sont particulièrement suivis. En particulier, chez cette espèce saisonnière, les variations de poids peuvent aller jusqu’à 10% en une semaine. Une perte de poids sera considérée comme pathologique à partir du moment où ce seuil sera dépassé. Dans ce cas, en accord avec la SBEA, l'animal est retiré de l'expérience et on s'assure qu'il récupère correctement (reprise de poids); si tel n'est pas le cas, on procède à l'euthanasie après concertation avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Outre sa proximité phylogénétique avec l’Homme, l'espèce utilisée dans ce projet est un modèle particulièrement adapté pour l’étude des mécanismes impliqués dans la gestion énergétique et les capacités cognitives. En effet, cette espèce est capable d'ajuster son métabolisme en fonction de la disponibilité alimentaire, comme c'est le cas dans son milieu naturel (variation en qualité et quantiité du régime alimentaire au cours de l'année). Par ailleurs, de nombreux dispositifs expérimentaux (comparables à ceux utilisés chez les rongeurs) ont été adaptés à cette espèce afin d'en évaluer les capacités cognitifives. Cette espèce étant un primate omnivore, les résultats de ce projet pourraient donc permettre d'améliorer notre compréhension des processus qui pourraient expliquer le rôle de la digestion dans l'expansion de la taille du cerveau au cours de l'évolution humaine.
Robustesse des poissons: une composante clé de la vulnérabilité de leurs populations et de la durabilité en aquaculture
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
6 000 bars vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des biométries sous anesthésie, des jeûnes, des tests d'effort en tunnel de nage et une exposition volontaire à des canicules et à des épisodes d'hypoxie pendant quatorze jours, une partie subissant des prélèvements de sang et des biopsies de branchies. Les poissons sont ensuite tués pour peser leurs organes, l'analyse génétique de l'héritabilité exigeant selon le porteur un grand nombre d'individus. Le projet vise la sélection génomique de souches robustes pour l'aquaculture, et le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer l'espèce".
Objectifs
Ce projet étudiera la robustesse individuelle des poissons en tant que déterminant de la vulnérabilité des populations et de la durabilité de l’aquaculture face aux changements climatiques en cours. La robustesse est mesurée comme la capacité d’un animal à grandir et à se reproduire dans les conditions environnementales de son habitat, ainsi que sa capacité à résister à des événements climatiques extrêmes. Ce projet est une étude de cas sur la robustesse d’une espèce de poisson importante pour la pêche et l’aquaculture, le bar européen Dicentrarchus labrax. L’espèce compte trois populations génétiquement distinctes, dans l’Atlantique, la Méditerranée occidentale et la Méditerranée orientale. La robustesse des individus issus de chaque population sera caractérisée pendant l’élevage sur plusieurs années sous trois régimes thermiques saisonniers qui reflètent les aires de répartition des trois populations. La robustesse sera évaluée en termes de croissance et des performances comportementales et physiologiques, saisies à des températures différentes pendant l’élevage. La résilience des individus et des populations face aux événements climatiques extrêmes estivaux, vague de chaleur et épisode d’hypoxie, sera aussi évaluée.
Bénéfices attendus
Les données seront intégrées avec des données de génomique pour révéler la composante héritable de la robustesse. L’ensemble de ces données seront ensuite utilisées pour développer des modèles pour prédire le destin des populations du bar Européen dans des climats futurs, pour mieux préserver les stocks de poissons. Les résultats soutiendront l'aquaculture durable, en permettant la mise en place de programmes de sélection de populations robustes.
Procédures
La totalité des n = 6000 poissons seront soumis à des biométries sous anesthésie et des intervalles de jeune alimentaire. Parmi ces 6000, n = 2756 vont aussi subir d’autres procédures. Un nombre de 774 individus vont subir des analyses de performance comportementale de sévérité légère ; n = 288 seront placés en groupes de 8 dans des aquariums pour 4 jours, n = 486 seront placés en groupes de 6 dans des aquariums pour quelques heures. Un nombre de 432 poissons seront testés pour leur performance physiologique, un protocole de sévérité modérée car il implique être confiné individuellement pour quelques heures dans un tunnel de nage, pour subir un test d’effort. Un nombre de 1550 individus seront placés dans des bassins en groupes de 45 individus pour plusieurs semaines, pour être exposés à des stress environnementaux (canicule ou hypoxie) sur une duree de 14 jours (ou servir de témoins). Basée sur les connaissances de la physiologie de l’espèce le protocole est de sévérité modérée, car les conditions sont calculées pour engendrer des réponses de stress sublétales en restant bien éloigné de tout risque pour la survie des animaux. Finalement, parmi les n = 1550 individus soumis à ces stress, n = 432 vont subir un échantillonnage de leur sang et une biopsie de leurs branchies, sous anesthésie. Un protocole non-létal mis a point sur les poissons et de sévérité modérée.
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables devraient être limités, toutes les procédures sont d'une sévérité légère ou modérée et sont maîtrisées sur cette espèce. Les conditions d'élevage en captivité, et d'experimentation comportementale et physiologique, ont été optimisées pour cette espèce. La perte d'accès à la nourriture, pendant les phases de jeûne, représente une nuisance mineure et transitoire, les poissons prédateurs sont adaptés à des alternances de festins et de famines. Les tests de performance impliquent un confinement mais sont de courte durée. Les expositions aux stress environnementaux représentent des nuisances transitoires d’une sévérité modérée, cette espèce étant souvent exposée à de telles conditions estivales dans leur environnement naturel (lagunes et estuaires). Le protocole d’échantillonnage du sang, et biopsie des branchies, a été mis à point pour les poissons et ne devrait pas représenter une nuisance majeure.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de leur procédure, pour pouvoir évaluer la taille de leurs organes. Pour les évaluations de la robustesse individuelle des poissons, l’approche génomique et l’analyse génétique de l’héritabilité et des corrélations génétiques nécessitent de travailler sur un nombre relativement important d’individus pour des questions de méthodologie statistique appliquée à ces disciplines.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer l’espèce Dicentrarchus labrax pour ces recherches qui impliquent la mesure de la robustesse in-vivo des individus d’une espèce de poisson d’importance pour la pêche et la pisciculture.
Réduction
Pour les évaluations de la robustesse individuelle des poissons, l’approche génomique et l’analyse génétique de l’héritabilité et des corrélations génétiques nécessitent de travailler sur un nombre relativement important d’individus pour des questions de méthodologie statistique appliquée à ces disciplines. Typiquement, un nombre de 500 à 1000 poissons par population et par condition environnementale est recommandé pour avoir une précision suffisante des estimations d’héritabilité et de corrélations génétiques. Dans ce cas, il y a 3 populations et 3 conditions, soit un nombre recommandé compris entre 4500 et 9000, d’où le choix de 6000 poissons. Pour les évaluations de la robustesse des populations, en termes des performances comportementales et physiologiques, et de la résilience des populations face aux événements extrêmes, le nombre d’individus est le minimum nécessaire pour pouvoir établir des moyennes populationnelles des traits, et faire des comparaisons statistiquements valides de ces moyennes entre populations et régimes thermiques.
Raffinement
Tout sera mis en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. L’objectif majeur des protocoles est de limiter au maximum les nuisances ou effets indésirables pendant les procédures, pour obtenir des mesures valides et fiables de la robustesse des individus qui ne soient pas influencées par un état préalable de souffrance, stress ou agitation. Pendant le marquage et les biométries lors des mesures de croissance et de tolérance au jeûne, une procédure d'anesthésie sera appliqué qui est optimisée pour cette espèce. En dehors des mesures biométriques, les poissons seront conservés à des densités optimales, dans des bassins isolés des perturbations. De manière générale, l'alimentation sera conduite ‘ad-libitum’. Les phases de jeûne, avec une durée de 3 semaines, amènent à une perte de masse des poissons mais des expériences précédentes indiquent qu’ils ne posent aucun risque pour leur santé. Les acquisitions comportementales seront faites par vidéo dans des dispositifs utilisés au préalable chez cette espèce et en minimisant les perturbations. Les procédures en tunnel de nage sont bien établies chez les poissons. Pour limiter au maximum la souffrance et le stress des poissons pendant les manipulations, ils sont capturés et transférés dans les tunnels de nage sans exposition à l’air, puis une période de récupération et d'acclimatation d’une durée minimale de 4h est réalisée. Les poissons sont à l’abri de nuisances visuelles et sonores pendant la récupération et les expériences. Les expositions aux événements extrêmes (vague de chaleur ou hypoxie) auront lieu dans une salle dédiée et avec des effectifs d’animaux réduits, dans des bassins isolés des perturbations. Basée sur les connaissances de la physiologie de cette espèce, la gravité des événements extrêmes est calculée pour engendrer des réponses de stress sous-létales en restant bien éloigné de tout risque pour la survie des animaux. Le protocole d’échantillonnage du sang et biopsie des branchies, sous anesthésie, a été mis à point pour cette espèce.
Choix des espèces
Dicentrarchus labrax (bar en Atlantique, loup en Méditerranée) est une espèce de poisson marin côtier, importante pour la pêche et la pisciculture. Comprendre sa variation intraspécifique de robustesse, et les bases génomiques de cette variation, permettra de mieux prédire la capacité de l'espèce à persister face aux changements globaux en cours. Cette compréhension permettra aussi de mettre en place des programmes de sélection génomique de souches tolérantes pour la mariculture en cage dans les zones côtières. Les animaux seront étudiés d'un stade juvénile jusqu’à la maturation sexuelle. Un objectif principal du projet est d'étudier la robustesse de chaque individu, mesurée comme la capacité à grandir dans leurs conditions environnementales actuelles.
Evaluation de la propriété analgésique de la mycolactone dans un modèle incisionnel plantaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une incision plantaire sous anesthésie, puis une douleur post-opératoire volontairement laissée sans analgésique chez les groupes témoins, le porteur indiquant qu'un traitement "irait à l'encontre de l'étude". Des tests plantaires répétés jusqu'à sept fois évaluent la sensibilité, et les pattes sont prélevées à la mise à mort, 48 heures au plus après l'incision. Le projet teste la mycolactone, toxine bactérienne, comme analgésique local, et le porteur affirme ne pas pouvoir se passer d'animaux.
Objectifs
Notre équipe travaille sur les propriétés anti-douleurs de la mycolactone, toxine produite par la mycobactérie M. ulcerans. En effet, les personnes atteintes d’une infection à M. ulcerans présentent de vastes ulcérations cutanées qui ne sont pas douloureuses. Dans ce contexte, nous avons démontré grâce à des tests cellulaires que la mycolactone induisait une diminution de la sensibilité locale pendant plus de 24h après son inoculation. Cela nous a également permis de disséquer son mécanisme d’action. Jusqu’à maintenant, l’activité analgésique (anti-douleur) de la mycolactone n’avait été évaluée au laboratoire que chez des souris ne présentant pas de douleur. Cela a d’ores et déjà permis de démontrer que la mycolactone présente des propriétés anti-douleur supérieures à la morphine. Dans ce contexte, notre objectif est de déterminer si la mycolactone pourrait être utilisée comme analgésique local (en raison de sa faible diffusion après inoculation) dans des modèles de « douleur ». Compte tenu de son effet durable (entre 24 et 48 h après une injection unique en sous cutanée) et de sa faible diffusion dans l’organisme, la mycolactone pourrait présenter un intérêt pour traiter les douleurs post opératoires. Ainsi nous proposons d’évaluer l’effet analgésique de la mycolactone dans un modèle pertinent de douleur post-opératoire.
Bénéfices attendus
Nos résultats antérieurs ont montré que la mycolactone présentait des propriétés anti-douleur lorsqu’elle était administrée par injection en sous cutanée chez des souris naïves (chez lesquelles aucune douleur n’a été induite). Compte tenu de ces résultats, il nous semble judicieux d’évaluer les propriétés analgésiques de la mycolactone dans le traitement des douleurs post opératoires. Ce projet se justifie puisque l’arsenal thérapeutique contre les douleurs reste limité.
Procédures
Les animaux seront répartis en 4 groupes de 180 animaux chacun (soit 720 animaux au total) : - avec incision traité par la mycolactone - sans incision - avec incision non traité - avec incision traité par un anesthésique de référence (buprénorphine). Incision plantaire, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse. La durée de la procédure est d’environ 5 à 10 minutes. Les animaux concernés sont au nombre de 540. Les 180 animaux restants subiront toute la procédure (anesthésie, désinfection de la patte) mais sans l’incision. Traitement par instillation de la mycolactone sur la plaie avant la suture, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse pendant la procédure d’incision. L’instillation ne dure que quelques secondes avant de suturer la plaie. Les animaux concernés sont au nombre de 180. Traitement par injection de la buprénorphine en intrapéritonéale, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse juste après la procédure d’incision. L’injection en intrapéritonéale ne dure que quelques secondes. Les animaux concernés sont au nombre de 180. Acclimatation au test plantaire, 5 jours consécutifs pendant 15 minutes à chaque fois. Tous les animaux sont concernés par cette procédure soit 720 animaux. Tests plantaires à T-1 avant incision, puis après incision et traitement par mycolactone ou buprénorphine : 2h, 4h, 6h, 24h, 30h et 48h, soit au maximum 7 fois. Le test plantaire dure environ 20 minutes. Tous les animaux sont concernés par cette procédure soit 720 animaux. Chronogramme des procédures : J-5 : acclimatation au test plantaire 15 min J-4 : acclimatation au test plantaire 15 min J-3 : acclimatation au test plantaire 15 min J-2 : acclimatation au test plantaire 15 min J-1 : acclimatation au test plantaire 15 min T-1 : test plantaire pré-incision T0 : incision + instillation de la mycolactone sur la plaie avant suture ou injection de la buprénorphine (groupe test ou groupe témoin incisé traité) T2h : test plantaire T4h : test plantaire T6h : test plantaire T24h : test plantaire T30h : test plantaire T48h : test plantaire puis sacrifice et récupération des pattes
Impact sur les animaux
Suite à l’incision, il est attendu une douleur modérée, tout particulièrement chez les animaux non traités. Plusieurs indicateurs seront suivis : - L’induction d’une sensibilité accrue que nous détecterons lors des tests plantaires par un temps de réaction réduit par rapport aux souris non incisées. Les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si, 2h suite à l’incision, aucun effet analgésique n’est observé de la part de la mycolactone. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse (lorsque le temps de réaction des souris ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité). - Une perte de poids est attendue mais ne devra pas excéder 5% en 24h ou 10% sur la durée totale de l’expérience (48h), sinon, les souris concernées seront euthanasiées. - L’induction d’une modification de la démarche (telle qu’un boitement). Si un animal présente une absence totale d’utilisation de sa patte, il sera euthanasié. - Un changement du comportement les 24 premières heures. Il est à noter que les animaux seront mis à mort maximum 48h après l’incision. De plus, malgré nos précautions, une surinfection de l’incision n’est pas à exclure. A l’apparition des signes de surinfection, les animaux seront mis à mort. Le comportement sera analysé selon une grille d’évaluation des scores. Son utilisation nous fournira un score qui sera décisionnel : - Pas d’action nécessaire. - Douleur légère, l’animal sera surveillé plus régulièrement pour vérifier l’évolution de son état. - Douleur modérée, l’animal sera surveillé plus régulièrement pour vérifier l’évolution de son état et un enrichissement supplémentaire sera apporté. - Douleur sévère, le point limite sera considéré comme atteint et l’animal sera euthanasié. Les souris seront systématiquement euthanasiées si elles présentent une infection de la patte. La douleur sévère ne sera pas atteinte. Si des animaux atteignent ce stade, ils seront immédiatement mis à mort. Nous n’utiliserons pas d’analgésiques (en dehors de la mycolactone pour le groupe test et de la buprénorphine pour le groupe témoin) car ceux-ci iraient à l’encontre de l’étude. Le but étant de provoquer une douleur post opératoire et de vérifier l’efficacité de la mycolactone dans le traitement de cette douleur. Une observation biquotidienne des souris sera réalisée.
Devenir
A la suite du dernier test plantaire, tous les animaux seront sacrifiés et les pattes seront récupérées pour des études histologiques.
Remplacement
Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. En effet, la phase réalisée chez les animaux permettra de valider l’effet de la mycolactone dans le traitement de douleurs post opératoires dans un système biologique complexe où de nombreux facteurs peuvent intervenir (disponibilité du composé, dégradation, capacité du composé à atteindre sa cible...). De plus cette phase est obligatoire pour le développement d’analgésiques destinés à la santé humaine et animale.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est suffisant pour que les résultats soient statistiquement significatifs sans pour autant exagérer ce nombre. Afin de valider des différences statistiques, les groupes seront composés de 6 souris. Si l’analyse des résultats montre l’absence d’effet analgésique de la part de la dose/formulation de mycolactone utilisée, ou souligne des effets secondaires (non rapportés à ce jour dans nos travaux précédents), les expériences ne se poursuivront pas pour cette dose/formulation. Cependant, si les résultats montrent un effet analgésique sans effet indésirable, alors l’expérience sera répétée une seconde fois indépendamment pour accroître la qualité de nos résultats. Il est nécessaire de répéter les résultats (formulations/doses retenues) dans une deuxième expérience indépendante. Ce préalable est indispensable pour la poursuite de notre étude, qui vise à réaliser une étude dans un modèle animal plus complexe.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l'ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors du protocole expérimental, un anesthésique gazeux (isoflurane) sera utilisé. La procédure d’incision sera d’abord pratiquée sur des cadavres pour s’entrainer à maitriser et calibrer l’incision avant de démarrer le protocole sur animaux vivants. Cet entrainement permettra de réaliser la procédure efficacement et rapidement pour éviter toute souffrance ou stress inutile aux animaux et diminuer le temps d’anesthésie générale. La dose de mycolactone appliqué sera plafonnée à une certaine dose, quelle que soit la formulation, car nos travaux précédents montrent qu’au-delà de cette dose il y a un risque de lésions tissulaires et d’inflammation. Lors de chaque expérience, les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si à 2h aucun effet analgésique n’est observé de la part de la dose/formulation de mycolactone testée. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse, c’est-à-dire lorsque le temps de réaction au test plantaire des souris ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité. De plus, pour le groupe de souris ayant reçu la buprénorphine, les tests de ce groupe seront arrêtés une fois que l’effet de la buprénorphine aura disparu (soit environ 6h selon la bibliographie). C’est-à-dire lorsque leur temps de réaction au test plantaire sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et, est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
De nombreuses études visant à identifier de nouveaux analgésiques utilisent « l’espèce souris ». Dans notre contexte, cette espèce nous semble très pertinente puisque son utilisation nous a permis de disséquer la propriété anti-douleur de la mycolactone. De plus, de très nombreux outils pour cette espèce sont disponibles (pour analyser les propriétés analgésiques et les effets secondaires indésirables). Les animaux utilisés pour ce protocole devront, à l’initiation de l’expérimentation être âgés de 8 semaines (maturation immunitaire et maturation du système nerveux).