Procédures légères

7 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit des injections de vecteurs-médicaments et des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tué par une dose létale d'anesthésique pour prélever sang et organes et mesurer la distribution des composés. Le projet, mené par une société, prévoit d'utiliser environ 1 200 souris par an pour valider ses candidats-médicaments. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune modélisation prédictive ne remplace le modèle murin et le présente comme "l'idéal" et le plus facile à mettre en place.

Objectifs

Plusieurs stratégies sont en cours d’exploration pour faciliter le passage et l'adressage de biomolécules vers les tissus et organes cibles. Parmi ces stratégies, on trouve le développement de molécules-vecteurs qui améliorent la biodisponibilité et le passage d’agents thérapeutiques, notamment à travers la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) du cerveau. Ainsi, grâce à la reconnaissance spécifique d’un partenaire ou d’un récepteur (protéine), le complexe vecteur-médicament pourra reconnaître sa cible et franchir cette barrière pour agir dans le parenchyme nerveux. Le réseau sanguin irrigant étroitement la totalité de l’organisme, ce principe de délivrance pharmacologique peut s’appliquer à tout type de tissu ou organe périphérique. Notre société développe de peptides vecteurs (peptides, fragments d’anticorps), conjugués avec différentes classes de molécules (agents d'imagerie, drogues thérapeutiques, siRNA) et proposés comme potentiels candidat-médicaments VHH. Dans notre cas, des peptides, drogues, ou dernièrement de petits ARN interférents (siRNA), dont la finalité sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de certaines protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Les études sur sujets sains permettent notamment de mieux comprendre et appréhender leurs disfonctionnements, sans que pour autant elles n’aient à court termes d’effets sur la santé et le bien-être animal. Dans ce projet (procédure 1) nous proposons d’étudier à différents temps d’incubation, la biodistribution de nos vecteurs conjugués (VHH) et/ou leurs efficacités, par mesure des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. L'assurance de l'innocuité de nos conjugués VHH par des études d'immunogénicité, nous amène à doser certaines protéines plasmatiques et, rapporté à une gamme de référence (procédure 2), à quantifier et identifier toute apparition d'une inflammation.

Bénéfices attendus

Parmi les avantages de nos procédures, on retrouve la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (posologies), qui seront de fait dans ce projet, revues à la baisse par rapport aux autres thérapies plus lourdes, actuellement utilisées (3R : raffinement). Egalement, qui dit doses moindres, dit, risques de toxicités moindres pour les animaux. Le potentiel de ciblage thérapeutique et l'innocuité de nos Vecteurs médicaments constituent en soit les principaux objectifs de nos recherches, dont les conséquences, par le bénéfice thérapeutique, peuvent jouer un rôle considérable dans le milieu médical et surtout, à terme, sur le quotidien des patients.

Procédures

Au cours des 2 procédures, nous allons manipuler les animaux en vigile, au cours des administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) et des prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement codal ≤50 µl). Puis, dans un deuxième temps; en post-mortem, pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. -Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou bolus répétés. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. -De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois, sur un temps intermédiare : L'animal sera placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes 20 microlitres de sang. Nb : Seuls les temps longs nécessitent un prélèvement intermédiaire. Par la suite, les prélèvements (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié en post-mortem : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg); Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm) environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.

Impact sur les animaux

Les composé VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité avérée. En cas de souffrances, choc, ou effets indésirables en cours de cinétique (les animaux sont quotidiennement suivits et annotés), une procédure spéciale d'euthanasie à forte dose d'anesthésiques est prévue (cf. 5.6.1). Pour notre 2ème procédure, les quantités de LPS administrées sont largement inférieures au quantitiés rapportées comme toxiques voire létales dans la bibliographie et ces tests communs et standardisés restent significativements en dessous de la DL50, de 10mg/kg.

Devenir

A l'issue de la procédure (fin cinétique d'incubation des vecteurs médicaments ou de cinétique d'endotoxémie) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg); Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm)

Remplacement

Pour mener à bien notre modèle préclinique, nous envisageons après validation in vitro de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, indispensable pour l’étude de ces mécanismes (3R : remplacement). Actuellement, le modèle murin ne peut pas encore être remplacé par des modélisations prédictives ou autres alternatives de remplacement. Seul le modèle animal mammalien et proche de l'homme permets de prendre en compte les mécanismes physiologiques pour prédire du comportement d'un médicament, d'un modèle thérapeutique et de son efficacité. Dans ce contexte, le modèle murin, ici la souris, reste l'idéal et surtout, le plus facile à mettre en pace pour ce genre de procédures.

Réduction

Procédure : Le nombre d’animaux ou groupe expérimental nécessaire à l’obtention d’une significativité statistique (Réduction, règle des 3Rs) se fera sur de petits groupes (n=4 à raison de 1200 souris/an en procédure 1 et 240 souris/an en procédure 2), suffisant pour appréhender un effet des conjugués sur les souris. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec.

Raffinement

Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclisée (12h/12h), insonorisée, ventilée, sous température et hygrométrie contrôlée, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage, litières et raffinements (dômes, tunels). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires.

Choix des espèces

Toutes études de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos VHH ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des conjugués développés. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 1200 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations (Article R. 214-105, code rural et pêche maritime) et cahier des charges.

20 chiens Beagle vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants et réutilisés à l'issue. Ils reçoivent chaque jour pendant trois mois un extrait végétal par voie orale et subissent des prélèvements de sang à la veine jugulaire à cinq reprises, pour en tester la tolérance et l'effet sur le comportement. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance et prévoit de replacer les chiens dans leur environnement d'étude à la fin. Sur le remplacement, il indique que le chien est l'espèce visée par le produit et qu'il n'existe donc pas d'alternative.

Objectifs

La plante constitue une solution de santé curative et/ou préventive pour les maladies multi-factorielles en raison de la nature multimoléculaire des bioactifs dont elle est composée. Parmi les plantes d’intérêt, une est traditionnellement utilisée pour ses propriétés sédative ou antispasmodique. Bien que des recherches récentes aient étudié les effets bénéfiques d'un des composants majeurs de cette plante, peu ou pas d’études ont exploré directement le potentiel anti-antioxydant et anxiolytique de l’extrait standardisé de la feuille de cette plante chez le chien. Cet extrait contient les principaux constituants biochimiques de cette plante (acides phénoliques incluant l’ensemble des dérivés cinnamiques, flavonoïdes, triterpènes) dont l’action combinée et/ou synergique pourrait lui conférer des effets bénéfiques supérieurs à ceux susceptibles d’être exercés par le composant actif majeur. Ces effets restent globalement, jusqu’à présent, inconnus et peu ou pas explorés notamment chez les carnivores domestiques. Les données relatives à l’action calmante ou anxiolytique de l’extrait standardisé chez le chien restent limitées à ce jour. L'objectif de ce projet sera d'abord d’évaluer la tolérance hémato-biochimique de notre extrait botanique standardisé et de son traceur chez le Chien Beagle sain. Seront également étudiés les effets de cet extrait et de son traceur sur le comportement (à l’aide de grille de scoring) et le statut oxydant. Notre principale hypothèse est que la richesse et la diversité moléculaire de l'extrait botanique étudié (flavonoïdes, acides phénols, dérivés cinnamiques, etc.) et surtout la potentielle action synergique et/ou additive de ses molécules bioactives pourrait lui conférer une action comportementale plus marquée, en impliquant certains mécanismes, comme une action inhibitrice de l’activité de la GABA-T plaquettaire (reflet de la GABA-T centrale, augmentation de la concentration sanguine du GABA). Le traceur testé correspond à un des constituants actifs majeurs de l'extrait végétal étudié. Il appartient au groupe chimique des acides phénols ; il possède des propriétés anti-oxydante, anti-inflammatoire, sédative et organo-protectrice (hépatique et rénal). Dans ce projet, il sera incorporé dans l’aliment à une dose 300 fois inférieure à la dose maximale de sécurité recommandée par l’EFSA.

Bénéfices attendus

Les travaux conduits dans le cadre de ce projet devraient permettre de mettre en évidence d'abord l'acceptabilité de l'extrait botanique étudié et ses effets sur le comportement et le statut oxydant chez le Chien Beagle sain. Le design adopté permettrait de déterminer si l’extrait botanique testé exerce une action supérieure à celle conférée par son traceur. L’hypothèse testée est basée sur la potentielle nécessaire synergie d’action des principes actifs présents dans le totum de l’extrait végéal. La validation des effets de l'extrait botanique étudié permettrait d'envisager son utilisation comme alternative aux traitements chimiques allopathiques dans le cas d'altération du bien-être et/ou du comportement.

Procédures

Aucune nuisance n'est attendue de l'extrait standardisé testé, les données concernant les doses maximales à ne pas dépasser chez le Chien sont disponibles et publiées par l'EFSA. Dans tous les cas, toute souffrance ou toute altération de l'état général, l’animal sera mis en observation pour lui apporter d'éventuels soins. Si la souffrance, pour des raisons inconnues, persiste, il sera exclu de l'étude. Les chiens seront exposés à trois types d'intervention nutritionnelle pendant une durée de 3 mois : un lot de 5 chiens recevant le régime standard et une administration orale quotidienne de l'extrait végétal étudié ; un lot de 5 chiens recevant le régime standard et une administration orale quotidienne du traceur actif de l'extrait végétal étudié; et un lot de 5 chiens recevant le régime standard et une administration orale quotidienne d'un aliment complémentaire à visée comportementale. Un prélèvement sanguin de 8 ml au niveau de la veine jugulaire sera réalisé par une personne expérimentée sur tous le chiens pendant la durée du protocole (J0; J15 ; J30 ; J60 ; J90). L'acte de prélèvement dure 2 minutes environ (contention par un tiers, rasage et désinfection du site de prélèvement).

Impact sur les animaux

Aucune nuisance n'est attendue de l'extrait standardisé testé, les données concernant les doses maximales à ne pas dépasser chez le Chien sont disponibles et publiées par l'EFSA. Il n' y a pas risque de douleur ou de souffrance associé à l'acte de prélèvement sanguin. Cet acte dure 2 minutes environ (contention par un tiers, rasage et désinfection du site de prélèvement).

Devenir

Les animaux sont replacés dans leur environnement d'étude après chaque procédure. Le comportement des animaux est surveillé (par la SBEA) à la fin du projet pour s'assurer de leur bonne santé.

Remplacement

Le Chien est l'espèce cible des résultats du projet. Il n'y a donc pas d'alternative qui permettrait son remplacement.

Réduction

Nous utilisons 5 chiens par groupe afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélévement étant répété sur chaque chien, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.

Raffinement

L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (balade et moments en liberté , jeux...). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.

Choix des espèces

Les chiens sont des adultes de 2 ans, en bonne sant et n'ayant pas reçu de traitement antibiotique ou tout autre traitement pouvant modifier le comportement, depuis au moins 3 mois. Le Chien est l'espèce cible des résultats du projet. Il n'y a donc pas d'alternative qui permettrait son remplacement.

98 rats, dont 14 femelles gestantes et 84 ratons, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes sont exposées aux radiofréquences du téléphone portable de la gestation au sevrage, puis mères et descendants reçoivent une injection de BrdU et sont mis à mort deux heures après pour prélever le cerveau et mesurer la neurogenèse. Le porteur nomme les tests comportementaux imposés, réflexes néonataux, activité exploratoire en open-field et test de retournement, pour évaluer l'effet de l'exposition sur la maturation cérébrale. Sur le remplacement, il affirme que les approches in vitro et in silico ne peuvent pas répondre à la question sur un organisme en interaction avec son environnement et conclut à la nécessité du recours au rat.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact d’expositions aux champs électromagnétiques (CEM) des télécommunications (comme le téléphone portable) sur la neurogenèse. Ce projet sera réalisé sur 98 rats Sprague-Dawley (14 femelles gestantes et 84 ratons, en considérant que 6 ratons/portée seront obtenus) répartis en deux groupes expérimentaux, exposés ou non aux CEM (cf. ANNEXE 1). Une procédure est considérée dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des réponses aux questions scientifiques et aux préoccupations sociétales concernant les possibles effets neurobiologiques des expositions développementales aux champs électromagnétiques avec le minimum de rats pour le projet.

Procédures

Aucune intervention de type prélèvement sur animal vigile ou chirurgie n'est prévue. Deux heures avant leur mise à mort, les rats recevront une seule injection intrapéritonéale de BrdU (150 mg/kg pour les mères et 50 mg/kg pour les descendants à PND9, 21 et 44 dans un volume maximum injecté de 6 ml/kg pour les animaux traités à PND9 et de 10 ml/kg aux autres âges). Préalablement à leur sacrifice, le cas échéant (en cas d'atteinte de point limite nécessitant la mise à mort après l’âge de PND15), les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital (EXAGON, 400 mg/kg, ou traitement équivalent recommandé par le vétérinaire référent). Préalablement à leur mise à mort, les rats seront sédatés par inhalation d’isoflurane. Au bout de quelques minutes, l'anesthésie profonde sera vérifiée et les rats seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Nous n'attendons pas de nuisance ou d'effet indésirable sur les animaux suite à la réalisation de la procédure n°1 de ce projet. Néanmoins, des signes critiques et les actions correctives qui seront menées en conséquence sont envisagés afin d’être en mesure de pallier toute manifestation inopinée de souffrance des animaux hébergés dans notre animalerie même si sa cause n’est pas prévisible et est indépendante des actions de la procédure n°1.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort aux temps de sacrifices définis pour effectuer des prélèvements biologiques post-mortem qui permettront de réaliser des analyses biochimiques et de biomarqueurs cérébraux.

Remplacement

Pour ce qui est du remplacement, les approches cliniques, in vitro et in silico, par leurs limitations éthiques et techniques, ne peuvent pas répondre au questionnement concernant l’impact des expositions aux CEM-RF sur le positionnement et la morphologie des nouveaux neurones sur un organisme en interaction sensorielle avec son environnement et doué de thermorégulation, nécessitant de fait le recours aux études in vivo.

Réduction

Au plan de la réduction, plusieurs paramètres biologiques seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés. Les coupes de cerveau qui seront réalisées ex vivo seront exploitées pour l’analyse de plusieurs marqueurs (marquage du BrdU, marqueurs neurotrophiques, de l’inflammation et du stress oxydant) fortement questionnés dans les effets in vivo des CEM. Les variables quantitatives (marqueurs ex vivo, poids, …), seront analysées par 4-ways ANOVA ou 3-ways ANOVA suivi d’un test post-hoc avec la correction de Bonferroni, en fonction de paramètres inter-sujet (sexe, niveau de champs électromagnétique, âge) et intra-sujet (le temps pour les variables mesurées plusieurs fois chez un même rat (poids, tranches de 5 minutes pour l’activité locomotrice,…)). Les variables de rang (mesure du délai de retournement dans le « surface righting » sur un maximum de 60 secondes, …) seront analysées par le test du log Rank.

Raffinement

Concernant le raffinement, chaque animal sera observé quotidiennement et pesé tous les 2 jours. Des feuilles d’observation permettront de consigner les signes anormaux concernant l’apparence, le comportement, les signes cliniques, etc. En période périnatale, une attention particulière sera portée au bien-être des mères et de leur portée et à la nidification. L’état de santé des animaux sera suivi à l’aide d’une grille de scores (cf. ANNEXE 2) qui indiquera l’action à mener de prise en charge de la douleur. De plus, les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être. Pendant la période périnatale, les rates seront hébergées seules puis avec leur portée. A partir du sevrage, tous les rats seront hébergés par sexe par groupe à plusieurs par cage pour leur socialisation. Un fond sonore musical sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, et éventuellement des bâtons en bois à ronger, seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Une sédation par inhalation d’isoflurane sera pratiquée préalablement à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Le rat est un animal de référence pour les études de toxicologie. En particulier, ses systèmes neurobiologiques et physiologiques ont été largement étudiés en laboratoire. Il existe une documentation très complète dans le domaine, dans la littérature et les ouvrages spécialisés. L’UMR PériTox possède une expertise en recherche en toxicologie expérimentale. Ces recherches ont été effectuées majoritairement chez le rat. Dans un souci de comparer nos résultats avec les résultats obtenus précédemment concernant les effets des CEM sur les fonctions cérébrales, nous avons choisi la même espèce. De plus, le personnel qui sera en charge des expérimentations est formé et possède une expérience reconnue pour l’entretien et l’observation des rats. Les femelles gestantes arriveront à l’animalerie au jour gestationnel (G) 3 et seront exposées à partir de G8 aux CEM-RF jusqu’au sevrage de la descendance, au jour postnatal (PND) 21, soit approximativement durant 35 jours. Elles seront sacrifiées à PND21 pour évaluer les effets de l’exposition sur leur neurogenèse. Les effets de l’exposition sur la mise en place de la fonction cérébrale seront évalués sur la descendance au stade néonatal (réflexes néonataux évalués de PND3 à 10), au stade juvénile et à l’adolescence (activité exploratoire évaluée dans l’open-field respectivement entre PND17 et 19, et entre PND41 et 43). Les femelles gestantes recevront une injection de BrdU à PND21 et la descendance aux stades néonatal (PND9), juvénile (PND21) et adolescent (PND44), et seront mis à mort 2h après pour examiner la neurogenèse. Cette analyse permettra d’identifier le stade développemental le plus sensible aux expositions aux CEM-RF et les effets à court/long terme et transitoire/permanent sur la neurogenèse et la fonction cérébrale tout au long de la maturation cérébrale.

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures classées légères. Soumis à un régime hypercalorique de type "cafétéria" pendant plusieurs mois, ils reçoivent chaque jour de la spiruline par gavage, puis passent des tests de reconnaissance d'objets et de mémoire spatiale. Le porteur teste l'hypothèse que la spiruline limiterait les déficits cognitifs liés à l'obésité et annonce comme bénéfice l'ouverture de pistes cliniques. Il affirme que l'évaluation des capacités cognitives ne peut se faire que sur l'animal entier.

Objectifs

L'obésité est une maladie complexe, multifactorielle, qui affecte plus d'un tiers de la population mondiale. Elle est devenue la première maladie « inflammatoire » non infectieuse et concerne aussi bien l'enfant et l'adolescent que l'adulte dans les pays industrialisés et les pays en voie de développement. L'Organisation Mondiale de la Santé définit l'obésité comme une surcharge pondérale par excès de masse grasse qui a des conséquences néfastes pour la santé, dans ses trois dimensions, somatique, psychique et sociale. Selon les dernières estimations de l'OMS, 1,6 milliards d'adultes de plus de 15 ans seraient en surpoids, et 400 millions seraient obèses. En France, selon la dernière enquête épidémiologique on estime que 31,9% des français de plus de 18 ans sont en surpoids, et 14,5% sont obèses. Outre les conséquences sociales et psychologiques qu'engendre cette pathologie, elle représente un risque majeur de développement des maladies cardiovasculaires et d’altération des fonctions cognitives. Au cours des dernières décennies, de nombreux efforts ont été consacrés à l'étude de différentes espèces végétales en raison de leurs activités pharmacologiques puissantes, de leurs effets secondaires moindres et de leur coût relativement faible. En particulier, la spiruline (Spirulina platensis) une algue microscopique suscite un intérêt important et un certain nombre de travaux indique qu’elle pourrait avoir un effet anti-obésogène. Le projet a pour objectif d’étudier l'impact de la spiruline à la fois sur l'installation de l'obésité induite par un régime hypercalorique et sur les perturbations cognitives de cette obésité. En effet, de nombreuses études montrent que l’obésité affecte les capacités d’apprentissage et de mémoire dépendantes de l’hippocampe chez les animaux et l’homme. Plus spécifiquement nous étudierons les effets de l’obésité induite par un régime « cafétéria » sur la reconnaissance d’objets et la mémoire spatiale dans une tâche d’exploration d’objets, ainsi que les effets de la prise de spiruline pendant le régime cafétéria sur ces mêmes processus mnésiques. L'hypothèse du projet est que la prise de spiruline empêche également l’installation des déficits cognitifs induits par l’obésité.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont d’apporter des connaissances fondamentales sur les effets de la spiruline sur l’obésité, et d’ouvrir des pistes cliniques de traitement préventif de l’obésité. En effet, les hypothèses du projet sont que la spiruline empêche l’installation des mécanismes physiologiques de l’obésité (prise de poids) et contrecarre les effets délétères de l’obésité sur la cognition et la mémoire.

Procédures

Les rats seront soumis à une procédure de gavage pour administrer la spiruline. L'intervention pour le gavage dure de 5 à 7 s. Le gavage aura lieu une fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (2 mois + la durée des tests comportementaux c'est -à-dire au total 3 mois environ).

Impact sur les animaux

L'effet indésirable principal est lié à la réalisation du gavage pour l'administration de la spiruline. L’expérimentateur maitrise la technique de gavage chez les rats car elle la pratique depuis plusieurs années. Si des difficultés surviennent dans la mise en œuvre de cette technique, ce qui peut se manifester par une résistance à l’insertion de la canule d’administration, des traces de sang sur la canule, un comportement anormal (halètement), l’opération de gavage sera suspendue pendant plusieurs jours. Un autre effet indésirable potentiel sur la physiologie est la prise de poids liée au régime hypercalorique. Cependant, il est à noter que bien que le régime cafétéria induise une hyperphagie et aboutit à une prise de poids plus rapide que les animaux contrôles, le poids des animaux en surpoids reste dans une gamme de poids "normale" pour ces animaux. La courbe de poids provenant d'études réalisées par l’expérimentateur et d’autres études (en annexe 3) montre qu'après 3 mois de régime cafétéria, les animaux pèsent aux alentours de 350-400 g. Ainsi cette prise de poids, si elle est rapide ne sera pas, dans l’absolu, d'une ampleur telle qu’elle aurait un effet délétère sur la motricité par exemple. Cependant, l’expérimentateur sera vigilant sur l’état général de l’animal qui sera vérifié quotidiennement selon la grille de score approuvée par la SBEA.

Devenir

A l'issue les animaux seront mis-à-mort afin de prélever le cerveau pour mesurer les marqueurs du stress oxydant et des défenses anti-oxydantes.

Remplacement

Ce projet repose sur un modèle rongeur de l’obésité qui permet une induction rapide de l’obésité et qui permet de tester les effets de traitements potentiellement efficaces contre l’obésité. L’évaluation des capacités cognitives et mnésiques ne peut se faire que chez l’animal entier, et non avec des études in vitro ou de la modélisation.

Réduction

Le régime cafétéria induit une obésité chez tous les animaux. Le nombre d’animaux minimum nécessaires pour les tâches de reconnaissance est de 8 par groupe. Ce nombre permet d’obtenir des données qui peuvent être analysées statistiquement soit par des test paramétriques (dans le cas d’une distribution normale des données) ou non paramétriques.

Raffinement

Les régimes alimentaires seront contrôlés mais la nourriture sera fournie ad libitum. Dès leur arrivée, chaque animal sera quotidiennement manipulé par l’expérimentateur afin de diminuer leur stress pendant toute la durée de l’étude. Les tests comportementaux impliquent une exploration libre de l’environnement et reposent sur l’attrait de la nouveauté et la réaction naturelle et spontanée de l’animal à la détection de la nouveauté. Il n’y a donc pas de contrainte pouvant induire un mal être. L’état général des animaux sera observé. Il est par exemple possible que, dans une cage, les animaux dominants blessent les animaux dominés. Ces critères seront évalués selon une grille de score, adaptée de Morton et Griffiths 1985, approuvée par la SBEA, ce qui permet de s’assurer du bien-être animal pendant et en dehors des temps d’expérience. Cette grille repose sur des critères liés à l’apparence des animaux, à leur prise alimentaire/poids corporel, à certains signes cliniques (fréquence respiratoire) ainsi qu’à leur comportement général (activité, vocalisation) et permet d’évaluer si l’animal est dans un état normal ou en souffrance. Le score obtenu dicte les dispositions éventuelles à considérer pour l’animal : De 0 à 4 : Etat normal ; De 4 à 9 : observation quotidienne, analgésie envisagée (buprénorphine 0,05 mg/kg ; s.c. 0,1 ml/10g) ; ≥ 10 : souffrance sévère avérée, arrêt de l'expérimentation par mise à mort de l'animal. Les animaux seront observés à chaque pesée bi-hebdomadaire. Les méthodes d’arrêt des souffrances se font de concert avec les zootechniciens de l’animalerie et sont reportées pour chaque animale sur une feuille de soins disponibles à l’animalerie.

Choix des espèces

Du fait de l'existence de modèles bien connu d'obésité innée ou acquise par l'exposition à des régimes hypercaloriques, le rat est une espèce particulièrement pertinente pour la réalisation du projet. En particuler le modèle d'obésité induite par un régime cafétéria est un modèle pertinent de l'obésité chez l'homme. Ce seront des rats adultes. L'étude considère l'obésité induite par un régime hypercalorique chez l'adulte.

8 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées légères malgré leur nombre. Elles subissent un stress de séparation maternelle, une exposition aux micro et nanoplastiques ou une infection intestinale à Cryptosporidium en période périnatale, puis jusqu'à 28 gavages et des injections sous-cutanées, pour étudier la rupture de tolérance alimentaire. Le porteur qualifie de modérées la diarrhée et la colite attendues, tout en classant l'ensemble en gravité légère. Il affirme que l'étude nécessite un "organisme intégré" qu'aucun modèle in vitro ne remplace.

Objectifs

Les objectifs de ce projet de recherche sont: 1- de caractériser si et comment des événements adverses en période périnatale (stress de séparation maternel (SSM), exposition aux micronano plastiques (MNPL) ou infection a Cryptosporidium parvum (CP)) ont des conséquences à long terme sur la tolérance orale (TO). La tolérance orale est l'absence de réponse immuniatire à un antigène du non soi (aliment par exemple) lorsque celui est administré par voie orale et non systémique. 2- identifier des marqueurs communs aux trois modèles prédictifs d'une rupture de la TO.

Bénéfices attendus

Ce Projet a pour but d’identifier des biomarqueurs de prédisposition aux ruptures de TO à partir de 3 modèles d’Evenements Adverses Perinataux i.e. un stress social, une exposition aux MNPL ou une infection intestinale. L’identification des mécanismes impliqués dans la rupture de TO devrait fournir des pistes pour le développement de stratégies préventives. Dans le projet, 2 stratégies préventives de rupture de TO seront testées, l’enrichissement de l’environnement et l’introduction tardive des potentiels allergènes alimentaires. Ce projet devrait permettre d’identifier des marqueurs précoces de prédiction de la perte de TO, et de fournir des preuves scientifiques pour 2 stratégies préventives.

Procédures

Gavages: les animaux subiront entre 1 et 28 gavages / animaux vigiles. Injection sous cutanées: les animaux subiront entre 1 et 2 injections sous cutanées / animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effet indésirables attendus sur les animaux sont légers. Ces protocoles sont standards et ont été largement utilisés par la responsable de projet. La diarrhée et la colite attendue dans le protocole de challenge alimentaire sont modérés.

Devenir

Dans le but d'étudier les réponses humorales, cellulaires et intestinales les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures.

Remplacement

La règle des 3R sera strictement respectée. Ce travail a pour but d’analyser les conséquences de 3 différents modèles d'effets adverses (infection ou facteurs environnementaux) survenus en période néonatale sur la TO. Cette étude nécessite donc de travailler sur un organisme intégré. L'étude de la tolérance orale ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires.

Réduction

Du point de vue statistique, nous répéterons les expériences trois fois, et nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemple Infection, exposition aux MNPL ou stress de l’animal) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences).

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, des frisures de papier kraft seront rajoutés comme enrichissement aux animaux. . Selon la durée de l’étude, un deuxième enrichissement pourra être introduit dans l’environnement, tel que des aspen Brick, des tunnels en polycarbonate ou des igloos. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure (SBEA). Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’expérimentation afin de détecter l’apparition d’éventuels comportements atypiques tels que : • altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de s’alimenter…), • vocalisation, tremblements …, • une perte de poids élevé (mais

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur un modèle murin car il existe une grande diversité d’outils chez cette espèce permettant l’étude de la réponse immunitaire et de la barrière intestinale. Nous travaillerons sur la lignée C3H/HeN car cette lignée est particulièrement sociable et les femelles portent une grande attention à leur descendance ce qui limite le cannibalisme des petits suite à leur manipulation par les expérimentateurs. La souris est un modèle préclinique largement utilisé pour les études des origines développementales de la santé et des maladies. Nos résultats pourront donc être plus facilement comparés avec la littérature existante. Les différents modèles de fragilisation (SSM, exposition aux MNPL ou CP) seront appliqués en période périnatale (voir procédures expérimentales). La réponse immunitaire et la barrière intestinale seront observées à PND15 et PND21. Les protocoles de Tolérance orale et Challenge alimentaire (voir procédure expérimentales) seront commencés à PND15 et les animaux euthanasiés à PND42 et PND36 respectivement.

60 agneaux vont être utilisés dans des procédures classées légères, puis renvoyés dans le cheptel pour être engraissés et abattus pour la consommation. Ils sont infestés par voie orale par deux vers parasites, Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis, puis subissent prélèvements rectaux, prises de sang à la jugulaire et pesées répétées, l'objectif étant de tester l'autopesée pour repérer les animaux parasités. Le porteur indique que l'infestation peut provoquer anémie et perte de poids et prévoit de sortir de l'essai les agneaux dont l'hématocrite chute. Il affirme qu'on ne peut pas remplacer le mouton pour reproduire le cycle parasitaire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel de l’auto-pesée pour détecter les animaux parasités par les strongles gastro-intestinaux (SGI) qui présenteraient des trajectoires de gains de poids quotidien déficitaires par rapport à des individus témoins non infestés.

Bénéfices attendus

Les nématodes parasites du tube digestif, dont les strongles gastro-intestinaux (SGI), sont une contrainte majeure pour l’élevage des ovins et caprins en système pâturant en raison des pertes de production et de la mortalité qu’ils occasionnent. Plus précisément, ils peuvent entrainer une réduction significative de l’ingéré se traduisant par des pertes de gain de poids moyen quotidien (GMQ). Leur contrôle repose actuellement sur l’emploi systématique de molécules à activité anthelminthique (AH). Toutefois, l’utilisation intensive de ces molécules pendant des décennies a conduit à l’émergence de résistances voire de multirésistance (résistance à plusieurs familles d’AH en même temps) chez certaines populations de parasites. De plus, l’écotoxicité d’une classe particulière d’AH, les lactones macrocycliques, est maintenant bien documentée et acceptée de tous, laboratoires producteurs compris. Dès lors, il nous faut repenser complètement notre approche du contrôle de ces parasites. Une lutte intégrée combinant une utilisation rationnelle et prudente des AH avec des méthodes non chimiques (conduite du pâturage, sélection génétique d’animaux résistants, alicaments…) est actuellement proposée pour permettre un contrôle durable des SGI et une moindre diffusion de la résistance aux AH. L’utilisation rationnelle des AH consiste à n’appliquer un traitement AH qu’aux seuls animaux qui en ont vraiment besoin (traitement ciblé sélectif). En effet, dans un troupeau ovin, le parasitisme par les SGI est réparti de façon très hétérogène entre les individus : certains hébergent peu voire très peu de parasites et n’en souffrent pas ou très peu quand d’autres en hébergent beaucoup. Afin de freiner la diffusion de la résistance aux AH dans les élevages, il faut donc pouvoir identifier les individus qui nécessitent un traitement. Un outil permettant de contrôler régulièrement le poids et l’embonpoint des animaux serait alors d’une grande utilité pour développer une stratégie de traitement ciblé sélectif.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 actes expérimentaux : (Infestation expérimentale per os, prélèvement rectal pour analyse coprologique et prélèvement sanguin par ponction à la veine jugulaire es pesées). Les agneaux sont pesés deux fois par semaine, à heure fixe. Une cage d'autopesée sera également installée dans le lot afin de collecter des données de pesée plus régulières des agneaux (jusqu'à plusieurs fois par jour). - Coprologie : Des prélèvements individuels sont réalisés sur tous les animaux de l’essai à la mise en lots (J0) puis à J21, J28 et J35 pour vérifier la bonne installation des vers puis suivre l’évolution des excrétions. La méthode utilisée pour les coprologies individuelles est la méthode de flottation au chlorure de sodium en lame de McMaster avec une sensibilité de 15 oeufs par gramme de matières fécales. - Hématocrite et indice FAMACHA : Des prises de sang individuelles sur tubes EDTA seront réalisées sur tous les animaux de l’essai, animaux infestés et animaux témoins non infestés, à la mise en lots (J0), puis à J14, J21, J28 et J35. Les prises de sang sont accompagnées d’une notation FAMACHA (intensité de la coloration des muqueuses oculaires, indicateur de l’anémie). Si la valeur d’hématocrite s’avère inférieure à 20% ou si l’examen de la coloration des muqueuses (FAMACHA) conclu à une anémie sévère, l’animal est traité et sorti de l’essai. Toutefois, ce cas de figure est peu probable car la dose utilisée est à la fois suffisante pour diminuer l’ingéré mais insuffisante pour mettre en danger la vie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dus à l’infestation des agneaux par Haemonchus contortus et Trichostrongylus colubriformis sont : - L’anémie qui peut apparaitre autour du 21eme jour suite à l’infestation, une fois que les nématodes seront adultes et infectants. - La perte d’appétit qui peut engendrer une perte de poids des animaux à partir du 21eme jour après infestation. Le rationnement des agneaux à 800g de concentrés par jour peut accentuer les effets de la perte de poids des agneaux. En cas de signes de maladie (fièvre > 40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé, anorexie, perte de poids > à 15%…), ou d’impact sur l’état général des animaux (prostration, cachexie, alopécie…), une intervention vétérinaire aura lieu et un traitement adapté (antidouleurs, antiinflammatoires, antibiotiques) sera mis en place (l’animal sortira du protocole si nécessaire). Les nématodes intestinaux utilisés dans ce protocole seront inoculés à une dose suffisamment importante pour obtenir les réponses souhaitées mais suffisamment faible pour ne pas engendrer de signes cliniques. Les animaux seront observés quotidiennement afin d'évaluer toute altération de l'état général (anorexie, prostration). Tout animal présentant une altération générale fera l'objet d'un examen clinique (température, hématocrite, coproscopie). Tout animal ayant un hématocrite inférieur à 15% ou excrétant plus de 50 000 oeufs/g de fèces sera vermifugé et sorti du protocole.

Devenir

Les agneaux retournent dans le cheptel à la fin de la procédure. Ils seront par la suite engraissés pour la consommation.

Remplacement

On ne peut pas remplacer l’hôte (le mouton) pour la réalisation du cycle parasitaire et l’étude de l'impact de l’infestation sur le gain de poids des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus dans l’expérimentation a été limité au maximum pour avoir un effectif garantissant l’interprétation des données.

Raffinement

Les agneaux sont hébergés sur une litière paillée et en lots de manière à pouvoir exprimer leurs comportements sociaux. Petit à petit, ils vont s’habituer à être manipulés et les prélèvements seront réalisés par du personnel expérimenté.

Choix des espèces

L’espèce ovine est l’espèce cible (application potentielle en élevage). Il n'existe pas d'autre espèce modèle ni de système alternatif à cette étude car ce caractère résulte de phénomènes biologiques, physiologiques, génétiques complexes.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères, dont 240 génétiquement modifiées pour être dépourvues d'un récepteur du cerveau. Chaque animal reçoit une injection dans le ventre puis passe une imagerie PET/CT sous anesthésie, pour évaluer l'entrée dans le cerveau de petits anticorps issus de lama. Elles sont ensuite tuées par dislocation cervicale ou au dioxyde de carbone. Le porteur affirme, en s'appuyant sur des travaux de collaborateurs, une douleur "non supérieure à celle produite par l'introduction d'une aiguille", et conclut que le recours à l'animal est "inévitable".

Objectifs

Les anticorps constituent des outils thérapeutiques à fort potentiel. Dans le cas des maladies du cerveau, leur développement est malheureusement limité du fait des barrières physiologiques qui protègent l'organe. Ces barrières, notamment la barrière hémato-encéphalique, limitent le passage de molécules du sang vers les tissus cérébraux, et inversement. Franchir ces obstacles permettrait aux biomolécules d'intérêt thérapeutique (protéines tels que des anticorps ou peptides (d'atteindre leurs cibles et d'offrir aux patients de nouvelles approches thérapeutiques. Des anticorps de lama, qui ont la caractéristique d'^tre de petite taille (appelés nanobodies) et spécifiques des récepteurs de messagers chimiques dans le cerveau (le glutamate et l'acide gamma-aminobutyrique, dit GABA) ont été produits au laboratoire. Ils reconnaissent différentes cibles potentielles dans le cadre de plusieurs maladies du cerveau. Nous avons observé que certains de ces petits anticorps sont capables d'entrer dans le cerveau et donc de franchir ces barrières physiologiques. Toutefois, la majorité de ces nanobodies n'a pas été testée in vivo. De ce fait, nous ne savons pas si cette capacité à pénétrer le tissu cérébral est propre à ces quelques nanobodies, ou commune à nombre d'entre eux. Les objectifs de ce projet sont 1) de comprendre leur mécanisme d'entrée dans le cerveau et 2) d'utiliser un des ces petits anticorps comme transporteur pour apporter au niveau cérébral d'autres nanobodies thérapeutiques. Ce projet sera mené conformément à l'application de la règle des 3R.

Bénéfices attendus

Ce projet enrichira nos connaissances sur l'entrée des petits anticorps (nanobodies) dans le cerveau. Il nous permettra également d'évaluer leur utilisation pour administrer des nanobodies thérapeutiques dans cet organe. En perspective, notre nanobody vecteur pourrait servir d'outil pour administrer différentes protéines thérapeutiques ou diagnostiques dans le cerveau.

Procédures

Au cours de la procédure expérimentale, les animaux seront soumis à : - Une injection unique de nanobody par voie intrapéritonéale (durée 2-3 secondes, injection sur la droite de l’abdomen afin d’éviter une injection dans le caecum) à la concentration de 10 mg/kg, soit de 100 à 300µl en fonction de la concentration des nanobodies. Ces injections seront réalisées par du personnel compétent et qualifié. - Une analyse par imagerie PET/CT (30 minutes maximum) sera réalisée à l’aide de nanobodies radiomarqués. De très nombreuses expériences permettent de démontrer que ces radio-traceurs n’influent aucunement sur le bien-être des souris. - L’analyse sera réalisée sous anesthésie gazeuse de la souris (4% isoflurane) avant installation dans le lit de l’imageur PET/CT. La souris sera maintenue endormie avec 2% d’isoflurane pendant le temps de l’imagerie, qui n’excède pas 30 minutes. Le lit de l’imageur est chauffé à 37°C et les yeux de la souris sont protégés avec de l’Ocrygel. - Durant la phase de réveil, la souris sera transférée dans une cage placée sous une lampe chauffante où elle sera surveillée jusqu’à son complet réveil. La souris sera ensuite replacée dans sa cage initiale. - Plusieurs temps d’analyses seront étudiés pour suivre le passage de barrière hémato-encéphalique par les nanobodies : ainsi chaque souris du projet sera analysée par PET/CT à 1h, 4h, 24h, 72h. Toutefois, ces temps pourront être modifiés en fonction des premiers tests. Les animaux seront sacrifiés à la fin de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

De précédentes données obtenues via des études sur des souris par des collaborateurs ont montré qu’un traitement aigu avec les nanobodies dirigés contre le récepteur mGluX n’engendrait pas de signe de toxicité ni de souffrance chez l’animal*. *Douleur non supérieure à celle produite par l’introduction d’ une aiguille.

Devenir

Mise à mort par dislocation cervicale ou insufflation progressive de CO2.

Remplacement

Remplacement : Le remplacement de l’animal n’est pas possible pour cette étude. Des données préliminaires montrent une importante accumulation des petits anticorps dans une région où la barrière physiologique cérébrale (barrière hémato-encéphalique), qui est la principale barrière s’opposant à la pénétration des molécules dans le cerveau, est modifiée. Nos données in vitro suggèrent que les anticorps de petite taille (nanobodies) déclenchent un mécanisme particulier faisant intervenir de manière indispensable leur cible mGluX pour passer la barrière physiologique. Un modèle isolé de barrière hémato-encéphalique ne permet pas de représenter exhaustivement les potentielles voies d’entrée dans le cerveau et toute la complexité de cet organe. De plus, il n’existe aucun modèle de la région particulière qui semble impliquée dans le passage des nanobodies. Ainsi, étudier le passage de ces nanobodies in vitro ne pourrait apporter de preuves irréfutables confirmant ou infirmant leur propriété de pénétration dans le cerveau. Le recours à l’animal est donc inévitable.

Réduction

Réduction : l’étude sera réalisée sur un total de 480 souris (240 souris sauvages et 240 souris déficientes en récepteur mGluX ( appelées mGluX KO)). Nos résultats préliminaires ne permettent pas de prédire leur efficacité d’entrée. Le nombre d’animaux utilisés pour pouvoir tester l’ensemble des petits anticorps thérapeutiques que nous voulons tester a été réduit au minimum pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue statistique.

Raffinement

Raffinement : cette étude impliquera l’utilisation d’une lignée de souris génétiquement modifiées, déficientes en récepteur mGluX, dont le phénotype n’est pas dommageable. Tous les animaux de cette étude seront placés dans un milieu enrichi, avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté, sous surveillance quotidienne. Les données obtenues par nos précédents collaborateurs suite à un traitement aigu avec les petites molécules dirigées contre mGluX ne montrent pas de signe de souffrance supérieure à celle engendrée par l’introduction d’une aiguille. L’observation d’anomalies chez les animaux dans le cadre de leur suivi quotidien sera reportée sur une fiche de suivi clinique (Annexe I), mise en place par la SBEA. Cette grille de scoring ne nécessite pas de personnalisation particulière car elle tient compte de tous les éventuels points critiques de notre expérience. Les points limites retenus seront donc : - Une perte de poids > 20% du poids initial ; - L’infection au site d’injection ; - L’état général des souris à leur réveil après l’anesthésie à l’isoflurane. Nous surveillerons plus précisément leurs comportements tels que l’hypo ou hyperactivité ; le mode de déplacement ou leur respiration (annexe 1).

Choix des espèces

Les anticorps de petite taille (nanobodies) utilisés dans le cadre de ce projet reconnaissent des cibles (récepteurs) murines. Le choix de l'espèce Mus musculus et du caractère sauvage de la souche de souris utilisée nommée mGluX WT permettra d'évaluer le passage des molécules via une barrière hémato-encéphalique intègre. Les souris mGluX KO seront elles, utiles pour évaluer le rôle crucial que jouerait le récepteur mGluX dans ce transport. Les souris seront traitées à partir de 5 semaines d'âge correspondant à l'âge adulte auquel la formation de la barrière hémato-encéphalique est complètement achevée. Les souris seront acceuillies à l'âge de 4 semaines et seront hébergées pendant une semaine avant le début de l'étude, pour permettre leur bonne acclimation.

40 brebis vont être utilisées dans des procédures classées légères, sans être tuées à l'issue. Chacune subit des prélèvements de sang à la jugulaire, jusqu'à 400 à 450 millilitres une fois toutes les trois semaines, pendant deux ans et demi, pour tester in vitro l'hémocompatibilité d'une pompe cardiaque. Le porteur indique que les brebis seront réhabilitées, replacées ou adoptées par une association en fin de projet si leur bilan sanitaire le permet. Il affirme avoir choisi l'ovin pour sa "docilité", l'accès facile aux veines et une coagulation proche de celle de l'humain.

Objectifs

Le projet a pour objectif d'utiliser du sang frais prélevé chez des brebis, afin d’évaluer et d’améliorer les interactions entre le tissu sanguin et la pompe cardiaque dévelopée par notre partenaire. Cette dernière est un dispositif médical appelé “assistance circulatoire gauche”, ou “LVAD”, destiné aux personnes souffrant d’insuffisance cardiaque grave. Il s’agit d’une pompe mécanique implantée chirurgicalement dans le corps et destinée à pallier un cœur défaillant. Le LVAD développé a pour ambition de recréer fidèlement les phases de remplissage et d’éjection du cœur natif sans pour autant exposer le sang aux dommages causés par les pompes actuellement commercialisées. Afin d’évaluer cet aspect sur des prototypes avancés de LVAD en cours de développement, puis dans le cadre de leur évaluation pré-clinique, il est nécessaire d’utiliser du sang frais prélevé dans des conditions permettant de préserver toutes ses caractéristiques biologiques.

Bénéfices attendus

Il est essentiel de caractériser les interactions des pompes LVAD avec le sang afin d’évaluer et de prévenir les risques d’hémolyse (destruction des globules rouges), de formation de thrombus dans la pompe (caillot), ou de dégradation de protéines sanguines essentielles. Les essais d’hémocompatibilité in vitro permettent de caractériser ces aspects dans des conditions contrôlées. Cependant, la qualité et la fraicheur du sang utilisé sont essentielles dans la réalisation de ces tests. Il est donc nécessaire de prélever le sang par ponction veineuse afin de minimiser les risques d’activation et de contamination extérieure. La norme en vigueur recommande l’utilisation de sang bovin, porcin, ou ovin pour la réalisation de tests d’hémocompatibilité sur des pompes cardiaques car le tissu sanguin de ces animaux est très similaire à celui des humains. De plus l’utilisation des gros animaux permet d’obtenir de grandes quantités de sang (quelques centaines de ml) sans préjudice pour l’animal. Dans ce projet des ovins ont été choisis pour leur docilité, l’accès facile aux veines jugulaires et des mécanismes de l’arrêt de l’écoulement du sang comparables à ceux observés chez l’humain.

Procédures

Un prélèvement sanguin par ponction veineuse au niveau de la veine jugulaire de moins de 10% du volume total (environ 400-450 mL) jusqu’à un maximum d’une fois toutes les 3 semaines pendant 2 ans et demi, pourvu qu’aucun point limite n’ait été atteint.

Impact sur les animaux

Les brebis pourront ressentir un peu de fatigue à la suite du prélèvement sanguin, comme tout un chacun à la suite d'un don de sang. Alimentation et abreuvement seront disponibles à volonté pour tous les animaux prélevées. Dans le cadre de ce projet le prélèvement de sang se limitera à 10% du volume sanguin total, et 3 semaines minimum de repos seront respectées entre chaque prélèvement. L'état des muqueuses des animaux ainsi que leurs numérations de formules sanguines seront controlées régulièrement afin de dépister toute survenue éventuelle d'anémie

Devenir

Toutes les brebis seront réhabilitées/replacées ou adoptées (par une association de protection animale qui gère la réhabilitation des animaux de laboratoire), dans la mesure où leur bilan sanitaire nous y autorisera, en fin de procédure.

Remplacement

L'étude des interactions biologiques entre le LVAD CorWave et le sang est réalisé in vitro mais nécessite d’avoir recours à du sang frais prélevé chez des animaux vivants. Bien que la pompe CorWave soit développée en amont à partir de simulations numériques et de tests hydrauliques in vitro de pointe, ces derniers ne permettent pas dans l'état actuel des connaissances d’évaluer les interactions biologiques complexes avec le sang.

Réduction

Les dispositifs LVAD sont conçus pour pomper 5L de sang dans un organisme humain. Le nombre d'animaux impliqués dans le projet sera réduit au minimum grâce à l'utilisation de systèmes de test in vitro des dispositifs LVAD exploitant de faibles quantités de sang. Les tests in vitro de ces dispositifs réduisent les volumes de sang nécessaires à quelques centaines de millilitres par dispositif testé, réduisant ainsi la fréquence et le volume des prélèvements sanguins à effectuer. Un volume de 2 L permet ainsi de comparer 4 designs de pompe différents en une semaine.

Raffinement

L’étude de l’hémocompatibilité du LVAD in vitro à partir de sang prélevé par ponction veineuse permet de réduire le recours à des études d’implantation in vivo de classe « sévère » ou « sans réveil ». L’utilisation d’ovins se limite ainsi dans ce projet à une procédure expérimentale de classe « légère » qui ne devrait pas avoir d’incidence sur l’état général des animaux. Aucune souffrance ou stress significatif n’est attendu dans ce projet. Des ovins ont été choisis pour leur docilité, l’accès facile aux veines jugulaires et une hémostase comparable à celle de l’Homme. Les animaux seront hébergés en troupeau et placés au maximum en situation d'éco-paturage en extérieur. Ils ne seront isolés que le temps du prélèvement sanguin.

Choix des espèces

L’utilisation des gros animaux permet d’obtenir de grandes quantités de sang (quelques centaines de mL) sans prejudice pour l’animal. Les normes en vigueur recommandent donc l’utilisation de sang bovin, porcin, ou ovin. Des brebis adultes seront utilisées afin de pouvoir prélever le volume de sang nécessaire sans affecter la santé de animaux.