Procédures légères

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent pendant huit semaines un régime riche en gras et en sucre pour induire un surpoids, sont mis à jeun, anesthésiés puis tués afin de prélever sang et organes pour des travaux pratiques d'étudiants. Le porteur qualifie l'expérience de peu douloureuse et affirme que la simulation n'est pas une alternative efficace pour la formation. Il revendique la "nécessité" de l'expérimentation animale en recherche.

Objectifs

Le projet consiste à faire prendre du poids à des rats en leur donnant plus de sucre et de gras qu'ils n'en ont besoin pour vivre, afin de mimer ce qu'on observe dans l'obésité chez l'homme. Le poids des rats est suivi chaque semaine le temps de l'expérimentation. Les effets du surpoids sur le métabolisme de ces rats seront étudiés par des étudiants grâce à des analyses biochimiques lors de leurs travaux pratiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet d'expérimentation animale sont multiples tant sur le plan de l'enseignement que de l'expérimentation en elle-même. Tout d'abord c'est le seul et unique projet impliquant ce type d'expérimentations lors des trois années de formationdes étudiants (80% des leurs autres TP ne font pas appel aux animaux/expérimentation animale). Les modèles animaux sont utilisés en recherche et sont pertinents pour étudier l'impact de l'alimentation sur la santé. On leur enseigne cet aspect là de la recherche et les analyses associées lors ce TP . De plus ils approfondissent et mettent en pratique des notions vues en cours. Les étudiants s'intéressent aux projets qui ont un sens et pour lesquels une problématique claire est annoncée (lien direct avec la santé humaine). Ils ne vont donc pas seulement faire des dosages mais verront les marqueurs dosés être modifiés et devront analyser cette variation et faire des recherches pour comprendre pourquoi ils évoluent. Nous avons choisi ce régime riche en graisses et en sucre (High fat High Sugar HFHS) car la thématique est abordée en cours (métabolisme des glucides, des lipides, stress oxydant, physiologie de la digestion, phyiologie cardiaque, physiologie hépatique...), et cette pratique n'est pas douloureuse pour les animaux. Ce projet d'expérimentation animale permettra de générer des tissus pour plusieurs années de travaux pratiques (réduction du nombre d'animaux utilisés). Pour résumer les étudiants bénéficieront d'une initiation à l’utilisation de modèle animaux pour tester les effets de l’alimentation sur la santé, à l'étude du métabolisme glucidique et lipidique (analyses associées), à la mise en place d’analyses à partir d’un protocole, à l'acquisition de compétences techniques (pipetage, préparation de tampons, de solutions à pH contrôlé ou non, mise pratique d’expériences à partir d’un protocole), à la mise en forme des résultats, à l'analyse des résultats, au traitement statistique, à la discussion critique des résultats et à la recherche bibliographique associée. Et grâce à une seule expérimentation peu douloureuse/invasive pour les animaux nous pourrons mettre en place ce TP pendant 4 années universitaire. Cette expérience animale ayant déjà été réalisée auparavant, nous savons que la prise de poids (bien que limitée) est significative chez les rats HFHS, et que les marqueurs proposés sont significativement modifiés grâce au régime HFHS.

Procédures

Les animaux seront alimentés avec une nourriture riche en gras et en sucres pendant 8 semaines. A la fin du protocole ils seront anesthésiés avant mise à mort pour prélèvement de sang et organes à la fin de l'étude.

Impact sur les animaux

Le régime riche en sucre et gras fera prendre du poids aux animaux et pourrait les rendre diabétiques (raremant sur une durée de 2 mois). La mise à jeun des animaux la veille du prélèvement pourrait être inconfortable pour les animaux. L'injection de l'anesthésique peut créer un stress pour les animaux.

Devenir

La veille de la fin de l'étude les animaux ne recoivent plus de nourriture. Le lendemain ils sont anesthésiés et mis à mort pour prélèvement de sang et des organes pour faire les travaux pratiques.

Remplacement

Les travaux pratiques ont été modifiés depuis quelques années. La plupart des TP nécessitant des animaux ont été remplacée soit par des modèles in vitro (exemple modélisation de la digestion in vitro, modèles cellulaires, analyse de données et bibliographie, enquêtes diététiques sur les étudiants eux-mêmes...). Les modèles animaux sont utilisés en recherche car nous connaissons leurs caractéristiques physiologiques et leur fonctionnement bien connu permet de mimer ce qui se passe chez l'homme. L'utilisation de l'expérimentation animale que nous pensons nécessaire en recherche, et qui donc doit être vue lors de la formation d'étudiants appliquée à la nutrition, a été réduit à une part minime. La modélisation quand elle est possible et concrète (impliquant des dosages biologiques) est intéressante; Par contre l'utilisation de la virtualisation et la simulation n'est pas une alternative efficace pour la formation des étudiants.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude permet de faire l'étude seulement une fois tous les 3-4 ans et d'optimiser l'analyse des résultats obtenus par les étudiants. Le nombre d'animaux est donc relativement important (24 rats au total) pour une expérimentation mais cette expérimentation au lieu de se dérouler chaque année, se déroule une fois tous les 3-4 ans. Ce qui diminue de ce fait le nombre d'animaux et engendre une optimisation d'utilisation des tissus récoltés.

Raffinement

les animaux traités par le régime HFHS ont un suivi pondéral régulier et un changement de litière adapté en fonction de leurs besoins Les animaux sont anesthésiés pour éviter toute douleur à la fin de l'étude avant la mise à mort.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés pour développer des modèles d'obésité/maladies métaboliques grâce aux régimes riches en en graisses et en sucres, sujets développés en cours et lors du TP en question. Les mâles sont utilisés car le statut hormonal peut faire varier la réponse au régime HFHS. La même chose aurait pu être faite sur des femelles. Les mâles sont souvent retrouvés dans les études publiées . Tous les marqueurs qui seront étudiés en travaux pratiques sont fréquemment dosés et étudiés lors de divers travaux publiés sur l'impact d'une alimentation trop grasse et sucrés en santé humaine. En tant qu'enseignants nous avons donc des sources fiables auxquelles nous référer pour construire nos TP et les étudiants eux pourront après formation faire une bibliographie pertinente pour analyser les données lors des TP. Le rat est une espèce utilisée en laboratoire pour la recherche fondamentale et aussi appliquée en industrie. La formation aux techniques utilisées en laboratoire de recherche (publique/privé) fait partie intégrante du cursus des étudiants.

432 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés à un champ électromagnétique de type 5G deux heures par jour pendant une à trois semaines, avec des mesures non invasives de température de la queue et de prise alimentaire, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie. Le porteur cherche des effets sur la thermorégulation à différents âges et déclare n'avoir observé aucun effet indésirable notable lors d'expositions antérieures. Les retombées annoncées, revoir la législation ou "rassurer la population", restent conditionnelles et lointaines.

Objectifs

Depuis novembre 2020, les opérateurs ont l’autorisation d’émettre des champs électromagnétiques (CEM) de type 5G. Pour cela, en France, 3 bandes réparties entre les 4 opérateurs en 2020 pourront être utilisées, dont deux le sont déjà pour la 4G : 700 MHz et 2,1 GHz, auxquelles viendra s’ajouter la bande de 3,5 GHz. Au 1er novembre 2020, 54 000 sites d’émission contenant parfois plusieurs antennes étaient installés en France, soit 30 000 de plus qu’il y a 5 ans. L’extension de l’exposition à ces rayonnements pose la question des effets sanitaires, notamment au regard de la jeune population, qui pourrait présenter une vulnérabilité plus grande aux CEM en raison de la taille, l’immaturité tant cérébrale, que métabolique, endocrinienne ou immunitaire des enfants. Cette vulnérabilité anatomique conduit à ce que les ondes pénètrent plus profondément dans l’organisme d’un enfant que dans celui d’un adulte, majorant ainsi l’exposition. Il est donc important de rechercher si les expositions pourraient produire des effets susceptibles de se répercuter (voire s’accentuer) à l’âge adulte. Dans ce contexte, nous voulons tester si une exposition de type 5G induit des modifications physiologiques. Pour cela, nous étudierons les fonctions physiologiques pour lesquelles nous avons observé des modifications lors d’exposition à 900 MHz : la température cutanée de la queue et la prise alimentaire. Ainsi, dans ces précédents travaux, après 5 semaines d’exposition aux CEM de 900 MHz, les animaux présentaient une vasoconstriction périphérique et une prise alimentaire augmentée qui sont des réponses typiques au froid. Afin d’étudier les effets d’une exposition de type 5G à une intensité de 1,5 V/m (intensité estimée sur les bases des données d’exposition 4G), nous analyserons ces 2 fonctions physiologiques lors d’une exposition à 3,5 GHz en les comparant avec les résultats issus d’un groupe non exposé (groupe contrôle) et d’un groupe exposé à 900 MHz (groupe contrôle positif) lors de différentes durées d’exposition (d’une à trois semaines), à différents âges (3, 8 et 13 semaines) chez des animaux mâles et femelles. Au maximum, 432 animaux seront étudiés, répartis dans 54 groupes constitués de 8 animaux chacun.

Bénéfices attendus

Une précédente étude menée au laboratoire PériTox avait été une des premières études françaises à montrer des effets des CEM de faible intensité sur la régulation thermique. Cette étude avait été citée dans les rapports « Radiofréquences et santé » (ANSES, 2013) et « Radio Frequency fields: Environmental Health Criteria Monograph » (OMS, 2015). Pour ce projet à court terme, nous souhaitons développer la même stratégie en communiquant les résultats à une très large échelle auprès de la communauté scientifique (congrès scientifiques nationaux et internationaux, publication dans des revues scientifiques généralistes) et d’agences mandatées par l’Etat pour réaliser des expertises sur les avancées récentes des travaux sur les effets des CEM. A long terme, si des effets sont observés, nous espérons qu’ils permettront de revoir la législation et d’abaisser les valeurs limites d’exposition de la population. Au contraire, si aucun effet n’est observé, les résultats pourront rassurer la population et notamment les différents collectifs et associations des personnes hypersensibles aux champs électromagnétiques.

Procédures

Les animaux seront exposés à un champ électromagnétique 2h par jour (2 sessions d'une heure) pendant 1, 2 ou 3 semaines selon les groupes d'animaux. Les différentes mesures effectuées seront réalisées en utilisant des techniques non invasives (comportement alimentaire en pesant l'alimentation et température cutanée en utilisant une caméra infrarouge). Il n'y aura donc aucune procédure chirurgicale. Un seul prélèvement sanguin sera réalisé à la fin de la procédure sous anesthésie générale avant la mise à mort. Il faut moins d'une minute pour prélever le sang nécessaire avant l'arrêt cardiaque. Une fois l'animal déclaré mort, différents organes d'intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

Dans le passé, nous avons exposé des rats à 900 MHz pendant 5 semaines afin d’étudier les effets sur différentes fonctions physiologiques. Durant l’exposition, aucun effet indésirable notable n’avait été observé (comportement, poids corporel, prise alimentaire).

Devenir

A l'issue de la procédure 1, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser un prélèvement sanguin intracardiaque qui induira la mort.

Remplacement

La fonction étudiée dans ce projet est la thermorégulation. Il existe des mannequins qui permettent d’étudier les échanges thermiques entre le corps et l’environnement mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les modifications de la régulation thermique. De plus, cette fonction est en étroite relation avec d’autres fonctions physiologiques (sommeil, fonction cardiovasculaire). Ces interactions ne peuvent être étudiées qu’à l’aide d’un modèle in vivo car il n’existe à ce jour pas de modèle in vitro capables de modéliser ces interactions.

Réduction

Le nombre de groupes se justifie afin d’étudier un maximum de paramètres pouvant influer sur les effets observés. Nous nous limitons à étudier 8 animaux par groupe. Ce nombre se justifie par de précédentes études menées dans le laboratoire : 4 animaux permettent d’observer une tendance à une diminution de la température de la queue sans atteindre le seuil de significativité alors qu’avec 8 animaux nous nous assurons d’observer une éventuelle diminution significative de la température de la queue. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel Statview. La normalité de la distribution des données sera vérifiée avec le test de Kolmogorov-Smirnov. Si les données suivent la loi normale, des tests paramétriques seront réalisés. L’analyse de variance (ANOVA) sera utilisée pour tester les effets des différents paramètres (âge, sexe, fréquence et durée d’exposition). Les différences entre les séries expérimentales seront également testées afin de s’assurer que tous les animaux d’un même groupe ont des réponses uniformes. Lorsque la valeur de F sera significative, un test de Fischer sera appliqué. S’il existe des interactions entre plusieurs facteurs, un test t des Student sera réalisé. Le seuil de significativité sera fixé à 0,05.

Raffinement

Pour assurer le raffinement des animaux dans ce projet, ils seront quotidiennement observés selon des critères bien précis qui permettront de déterminer un score. Selon la valeur du score, une action sera réalisée pour soulager au maximum l’animal. Pour diminuer le stress lié à l’hébergement individuel, différents enrichissements (cylindres en carton et lanières de papier kraft) seront présents dans chaque cage. Un fond sonore sera également présent afin de couvrir d’éventuels bruits extérieurs, brefs et bruyants, sources de stress pour les animaux. Les paramètres physiologiques étudiés in vivo seront mesurés sans contrainte pour l’animal : la température cutanée de la queue sera mesurée avec une caméra infrarouge et la prise alimentaire par une balance reliée à la mangeoire.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à une contrainte. - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude des systèmes neurophysiologiques (comme le sommeil) qui sont particulièrement bien référencés dans la littérature (Revel et al., 2009). - l’hébergement dans les chambres climatiques au sein du laboratoire sont adaptés depuis plusieurs années pour cette espèce. L’exposition sera évaluée chez des animaux ayant 3 âges différents. La population juvénile étant potentiellement plus sensible aux CEM, des animaux âgés de 3 semaines seront étudiés, âge minimum d’animaux sevrés. Afin d’évaluer les effets sur une population adolescente, des animaux âgés de 8 semaines seront étudiés, âge de la maturation sexuelle. Enfin des animaux adultes âgés de 13 semaines seront étudiés afin d’évaluer si les effets observés disparaissent à l’âge adulte.

780 rongeurs, 700 souris et 80 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués à l'issue et dix-huit réutilisés pour d'autres entraînements. Des stagiaires s'exercent à la contention, aux injections et aux prélèvements sur animaux vigiles, puis à la mise à mort par dislocation cervicale sur animaux anesthésiés. Le porteur indique qu'aucune limite n'est fixée au nombre de tentatives de gestes techniques par stagiaire, l'animal n'étant remplacé qu'en cas d'agitation. Il décrit cette mise à mort comme un apprentissage à "but pédagogique" et juge le recours aux animaux vivants "indispensable".

Objectifs

● Répondre à des besoins de formation sur l’expérimentation animale. De nombreuses entreprises privées ou institutions publiques nécessitent que leurs personnels soient formés à l’application ou à la conception de procédures/projets pour l’expérimentation animale pour être conforme à la réglementation en vigueur. Cette formation permet de répondre en partie à la demande locale e peut être réalisée dans le cadre de formation initiale ou continue. ● Pédagogique : de nombreux étudiants /doctorants de science, pharmacie ou médecine – de notre université - étudient dans le cadre de leur formation initiale les bases de l’expérimentation animale. Cette formation complémentaire s’inscrit dans la continuité de leur formation initiale et leur permet d’approfondir et valider leurs connaissances théoriques vis-à-vis de l’expérimentation animale. ● Scientifique : Proposer une formation qui permettra aux stagiaires de saisir les enjeux de l’expérimentation animale et de ces limites. Les travaux pratiques répondent à l'ensemble de ces trois points. Ils permettent d’apporter une réelle plus-value à la formation ainsi qu'aux stagiaires. Le stagiaire peut ainsi se familiariser avec les animaux tout en étant encadrer par des intervenants « experts » en expérimentation animale.

Bénéfices attendus

Les stagiaires à la suite de cette formation réglementaire, scientifique et pratique possèdent l’ensemble des pré-requis indispensables à l’application et/ou à la conception des procédures/projets en expérimentation animale. Cela se traduit in fine par des connaissances robustes sur la réglementation française liée à l’expérimentation animale ainsi que les aspects éthiques et scientifiques. La simulation APAFIS permet aux stagiaires d’acquérir des connaissances et expériences suffisantes afin de procéder à l’élaboration et écriture de leur propre formulaire. Les travaux pratiques quant à eux s’inscrivent dans la lignée de ces cours théoriques. La mise en situation est indispensable pour appliquer les aspects théoriques enseignés. Ces TPs sont suffisamment étoffés pour enseigner les techniques d’administration, de prélèvement et de mise à mort les plus couramment utilisés et sont parfaitement adaptés pour rappeler les notions théoriques (réglementation – 3R – points limites…). Ces TPs sont basés sur une démonstration puis l’application des gestes les plus fréquemment rencontrés lors de la manipulation des rongeurs. Sur les précédentes sessions, l’évaluation par les stagiaires nous a confortés sur les bénéfices de notre formation et notamment sur l'importance de préserver des séances de mise en pratiques.

Procédures

Lors des enseignements, les animaux (souris et rats) seront soumis à de la manipulation et contention par les encadrants et stagiaire (30 minutes). Cela n'engendre pas de douleurs physiques aux animaux. Aucune limite n'est fixée sur ces gestes. Cependant, en cas de stress des animaux (agressivité ou prostration), ils seront remplacés. Des injections et prélèvements sur animaux vigiles (30 minutes-1 heure) sont également prévues dans le cadre de ces enseignements. Lors de la démonstration, deux injections et un prélèvement peuvent être réalisés au maximum chez la souris. Les voies d'administration étudiées chez la souris vigile sont : la voie orale - gavage, l'injection intraveineuse caudale, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée. Les voies de prélèvement enseignées sont : la voie caudale et la voie mandibulaire. Seule la voie intrapéritonéale est enseignée sur le rat. Aucune limite de tentatives de geste technique est fixée pour le stagiaire sur souris vigile. Cependant, les volumes injectés et prélevés resteront en adéquation avec les limites d'usage. En cas d'agitation, l'animal sera remplacé. A noter, que les souris utilisées par les stagiaires pour la pratique en condition vigile seront automatiquement anesthésiées puis mises à mort. À la suite de cette anesthésie (

Impact sur les animaux

La première partie de l'enseignement pratique a pour but d'enseigner la contention et la manipulation et n'engendre pas de douleurs ou effets secondaires aux animaux. Les animaux sont utilisés avec parcimonie. Cependant, la manipulation par des stagiaires inexpérimentés peut induire un stress chez l'animal (agressivité - prostration). Dans ce cas, l’animal expérimenté est substitué. La deuxième partie des travaux pratiques est basée sur l'injection et le prélèvement sur animaux vigiles. La manipulation par les stagiaires sur souris vigile sera supervisée étroitement par un des encadrants (4 encadrants minimum pour 10 étudiants) qui pourra le cas-échéant accompagner le stagiaire dans le bon geste de contention puis d’injection et/ou de prélèvement. Dans le cas d'une mauvaise manipulation par le stagiaire, l’encadrant jugera du besoin de remplacer l’animal, de la mise en place de stratégie antalgique ou de la mise à mort de l'animal en fonction des critères définis. L’administration sera réalisée avec du sérum physiologique au volume adapté au poids de l’animal. Aucun effet pharmacologique n’est attendu. Un maximum de deux procédures d'administration et une procédure de prélèvement sera mis en œuvre par animal. La dernière partie de l'enseignement cible l’injection, le prélèvement et la mise à mort sur animaux anesthésiés. Une souris par étudiant et une souris par encadrant ; pour la démonstration de la mise à mort; seront utilisées pendant cette partie du TP. L'ensemble des animaux utilisé ayant reçu les anesthésiques ne seront pas gardés en vie. La mise à mort sera réalisée par dislocation cervicale par le stagiaire sous supervision d’un encadrant. Dans le cas d'une séance normale, aucun point limite ne sera atteint pendant lors des deux premières parties des enseignements. Les animaux seront alors replacés dans l'animalerie. Un suivi longitudinal des animaux est réalisé quotidiennement pour s'assurer de la récupération des animaux par du personnel qualifié. Cette évaluation est basée sur les grilles d'évaluation de la douleur et de points limites décrits dans l'annexe 1. En fonction des scores de douleurs, des stratégies analgésiques peuvent être mises en place. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort par dislocation cervicale.

Devenir

La mise à mort des animaux à la fin de la séance de TP est à but pédagogique afin d’inculquer aux stagiaires les bons gestes. Les souris et rats, non mis à mort seront réutilisés à des buts de formation et d’entrainement de la mise en pratique de ces gestes par le personnels et chercheurs du laboratoire en dehors de la formation de CESU. Dans le cadre du roulement de personnel actif, de nombreux étudiants et post-doc de notre laboratoire s'inscrivent au CESU de niveau A ou de niveau B. À la suite de la formation, ce personnel nécessite de continuer la formation pratique à l'expérimentation à l'aide d'un tuteur diplômé. Les animaux restants sont mis à profit afin qu'ils puissent s'exercer avant de débuter tout projet scientifique. Cet entrainement consiste à la répétition des gestes enseignés sur animaux vigiles. A l'issue, de cet entrainement, l'évaluation des scores de douleurs et points limites sont évalués par le tuteur basée sur l'annexe 1. Le suivi longitudinal quotidien des animaux est poursuivi (basée sur l'annexe 1 également). Les animaux sont mis à mort à la fin de l'apprentissage de ce personnel.

Remplacement

Cet enseignement/apprentissage est indispensable pour la mise en œuvre de futures expérimentations précliniques dans les meilleures conditions possibles. L’emploi d’animaux vis-à-vis des procédures enseignées ne peut être substitué par l’usage de mannequin notamment sur la pratique de gestes complexes tels que la réalisation d'injections ou prélèvement par voie rétro-orbitaire. Les stagiaires sont cependant sensibilisés pendant la formation théorique : 7h00 d’enseignement destiné aux méthodes in silico (ex : modèle pharmacocinétique), in vitro (modèle de tumoroides) ou in vivo chez des espèces alternatives (Drosophiles – Nématodes) et au respect des 3R. De plus, l'évaluation de ces TPs par les stagiaires convergent vers la nécessité les préserver.

Réduction

Ce projet à but pédagogique n’est pas basé sur l’obtention de résultats. Ainsi les méthodes statistiques requises habituellement ne peuvent s’exercer dans ce cas. Le nombre d’animaux est alors évalué en fonction du nombre de stagiaires inscrits à la formation. Ce nombre est donc prévu pour couvrir l’ensemble des TPs (TP1, TP2 et TP3) sur l’animal avec la prise en compte du nombre d’animaux mis à mort et du nombre d’animaux utilisés pour les exercices de contention – injection et prélèvement. L'objectif primaire de ces séances est de fournir une expérience pratique à la fois utile et en adéquation avec les points abordés lors des enseignements théoriques. Nous estimons que l'indépendance et la mise en situation des stagiaires sont des principes indispensables à ce type de formation. Pour cela, tout est mis en œuvre pour diminuer le nombre d'animaux. L'équipe pédagogique et encadrante (conforté par les résultats de satisfaction des séances de TPs par les stagiaires) a évalué qu'une souris par stagiaire était le minimum afin de pouvoir suivre la progression et conseiller les stagiaires individuellement à la pratique des gestes techniques et d'optimiser le temps de pratique pendant les séances. La réalisation de binôme ou trinôme pour l'expérimentation animale ne semble pas adapté du fait : les besoins des stagiaires ne sont pas les mêmes, certains gestes doivent être répétés plusieurs fois pour les "acquérir", ou ne peuvent être réalisés raisonnablement qu'une seule fois (prélèvement intracardiaque). Au-delà de ces considérations liées à l'enseignement, nous nous efforçons de maintenir les règles de distanciation sociale pendant ces séances. Le nombre de rat est adapté aux objectifs du TP1 et TP2 (manutention et injection intrapéritonéale) et au nombre de stagiaires. Pour terminer, les stagiaires se préinscrivent à minima, trois semaines avant le début de la formation, permettant de commander le plus petit nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Les animaux sont commandés et réceptionnés à minima 14 jours avant le début des séances de travaux pratiques. Lors des journées de TPs : Les animaux seront acclimatés dans la salle de TP, d’une à deux heures avant le début de la séance afin de diminuer leur stress. Dans cet optique, les animaux seront utilisés dans une ambiance sereine et calme favorisant la lumière naturelle dès que possible. Lors du TP1, aucune souffrance physique n'est infligée à l'animal. L'état de stress des animaux (agressivité/prostration) est évalué tout au long de la séance par les encadrants. Si l'animal apparait trop stressé, il sera remplacé. Les injections réalisées pendant le TP2 sont faites avec du sérum physiologique (par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, gavage, IV). Les volumes injectées maximales correspondent au volume optimal en fonction du poids de l'animal soit 1mL/100g de souris - 1 à 5 ml/kg de rat. Le choix des dimensions de l'aiguille doit correspondre à la voie d'administration étudiée, l'espèce et au poids de l'animal. Dans le cadre de mauvaise manipulation (injection ou prélèvement par le stagiaire), les encadrants jugeront du maintien de l’animal dans l’expérience, du remplacement ou de la mise à mort de l’animal en se référant à l'annexe 1. Lors du TP3, toute souffrance est évitée par l'anesthésie de l'animal avec des agents médicamenteux adaptés suivie de la mise à mort de l’animal à la fin de l'enseignement. Les animaux ne sont pas utilisés deux jours successifs pour éviter. En dehors des journées de TPs, les animaux sont monitorés quotidiennement par du personnel qualifié en fonction des scores et points limites établis en annexe 1. Les souris et rats sont hébergés sur des portoirs ventilés en groupe (adapté à la masse des animaux et surface de la cage), dans un environnement enrichi (copeaux, dôme, alimentation solide). L'eau et la nourriture sont en accès libres et illimités. Les locaux sont monitorés en permanence avec un suivi de l'hygrométrie et température. Une alternance jour/nuit de 12h est également mise en place.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont les principales espèces utilisées pour les études précliniques. Il existe une forte demande de formation vis-à-vis institutions privées ou publiques pour ces deux espèces. Ces espèces sont la base de l'enseignement pour l'expérimentation animale Afin de faciliter la contention, manipulation et injection par les stagiaires les animaux seront adultes. De plus, conventionnellement, l’expérimentation animale est réalisée chez des rongeurs adultes âgés de minimum 6 à 8 semaines.

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par gavage avec des spores de Clostridioides difficile, reçoivent des injections par voie rétro-orbitale sous anesthésie et, pour certaines, une inflammation intestinale provoquée par des molécules chimiques. Le porteur indique que l'infection cause une diarrhée légère et qu'une perte de poids supérieure à 20 % déclenche la mise à mort, sans que ce seuil soit forcément atteint. Il teste un microARN comme piste thérapeutique et qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" avant tout développement clinique.

Objectifs

Clostridioides difficile est une bactérie entéropathogène, première cause de diarrhée nosocomiale chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, 14 % de formes compliquées dont la plus connue est la colite pseudomembraneuse, marquée par 3 % de mortalité). Les infections à C. difficile sont caractérisées par un taux important de formes sévères résultant d’une réponse inflammatoire trop sévère. . Malgré des traitements antibiotiques généralement efficaces, les récidives des infections à C. difficile sont fréquentes (environ 20 %) et des résistances aux antibiotiques apparaissent. Les petits ARNs appelés microARNs (miRNAs) sont de plus en plus décrits comme régulateurs de la réponse immunitaire notamment de la réponse inflammatoire lors d’une infection bactérienne. Nous souhaitons évaluer la possibilité d’utiliser ces miRNAs comme outil thérapeutique permettant de contrôler cette réponse inflammatoire. Dans un précédent projet nous avons mis en évidence l'intérêt d’un miRNA comme outil thérapeutique permettant de diminuer la réponse inflammatoire dans un modèle de souris infectées par C. difficile. L'objectif de ce projet est de réaliser une étude pré-clinique chez la souris de l'efficacité de ce miRNA, préalable indispensable à la poursuite d’autres étapes de développement clinique de la molécule. Dans un premier temps, il sera réalisé une étude sur l’optimisation de l’efficacité du miRNA par diverses modifications chimiques. Puis il sera engagé une étude d’effet-dose d’un miRNA modifié choisi dans notre modèle d’infection par C. difficile et dans un modèle d’inflammation de l’intestin. Enfin, il sera réalisé une étude de pharmacocinétique, de biodistribution et de toxicité de ce miRNA modifié

Bénéfices attendus

La stratégie de lutte contre l'inflammation induite lors de l'infection par Clostridioides difficile avec un mIRNA pourrait permettre d'empêcher les formes sévères de la maladie.

Procédures

Le modèle d'infection des souris par la bactérie Clostrioides difficile nécessite un gavage orale par les spores de la bactérie d'une durée inférieure à 10 secondes. Certaines des procédures du projet impliqueront deux injections par voie rétro-orbital de molécule lors d'une légére anasthésie de quelques minutes. Les modèles d'inflammation de l'intestin par des molécules chimiques se feront soit par ajout de la molécule dans l"eau de boisson tout au long de la procédure soit par une injection par voie rectale lors d'une anésthesie d'une durée de 30 minutes environ.

Impact sur les animaux

L’infection de la souris par la bactérie Clostridioides difficile n’induit pas ou peu de signes cliniques : observation d’une diarrhée légère et spontanément résolutive 24 h après infection ne nécessitant pas de réhydratation. Les modèles d'inflammation chronique de l'intestin par des molécules chimiques induisent des diarrhées et des pertes de sang légères et parfois une perte de poids. Une perte de poids supérieur à 20% sera défini comme un point limite.

Devenir

Le prélevement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.

Remplacement

Plusieurs tests in vitro sur un modèle de cellules de l’intestin permettent de sélectionner les miRNAs présentant une activité anti inflammatoire intéressante. L'étape de vérification de leurs activités in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique de notre candidat anti-inflammatoire lors d'un processus infectieux et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité du processus infectieux dans son intégralité

Réduction

Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 250, tout en préservant la validité statistique de l'étude. Les groupes contrôles des animaux ont été mutualisés aussi souvent que possible.

Raffinement

Les animaux seront herbergés avec suffisament d'espace, par groupe de 6 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées quotidiennement et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée si nécessaire en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le modèle de souris est maintenant établi et est classiquement utilisé dans les protocoles d’étude de l’infection à Clostrioids difficile. En effet, à la suite à d'une antibiothérapie visant à altérer le microbiote digestif de barrière, l’administration de C. difficile par voie orale permet une implantation reproductible et maîtrisée de la bactérie au niveau du tube digestif et le développement de signes cliniques modérés de la pathologie. De meme le modèle souris est l'un des modèles d'inflammation chronique par des molécules chimiques les plus utilisés par la communauté scientifique. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité de travailler à la fois sur des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle d'infection par la bactérie.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour développer les plaques amyloïdes de la maladie d'Alzheimer dès l'âge de deux mois, elles sont réparties dans trois conditions d'hébergement plus ou moins enrichi, puis perfusées sous anesthésie profonde pour prélever leur cerveau. Le porteur déclare n'attendre aucun effet indésirable et présente l'usage de cette lignée comme "indispensable". L'étude porte sur l'effet de l'aménagement de la cage sur une pathologie que les souris sont programmées pour développer.

Objectifs

Effets d'un élevage en milieu enrichi sur le développement des marqueurs de la Maladie d'Alzheimer chez des souris 5xFAD modèle de la Maladie d'Alzheimer.

Bénéfices attendus

Si ce n'est d'empêcher; les effets d'un élevage en milieu enrichi chez les souris 5xFAD, en comparaison à d'autres souris 5xFAD élevées en milieu appauvri ou seulement socialement enrichi, devraient différer le développement de la maladie chez ces souris programmées pour développer génétiquement cette pathologie.

Procédures

A la fiin de la procédure, tous les animaux sont perfusés sous anesthésie profonde au mélange kétamine (150mg/kg) et xylazine (15mg/kg). Cette dose est 30 % supérieure à la dose utilisée habituellement, ce qui permet d'avoir une anesthésie beaucoup plus profonde. La durée de la perfusion est de l'ordre de 5 à 10 minutes.

Impact sur les animaux

Aucun

Devenir

A la fiin de la procédure, tous les animaux sont perfusés sous anesthésie profonde au mélange kétamine (150mg/kg) et xylazine (15mg/kg). Cette dose est 30 % supérieure à la dose utilisée habituellement, ce qui permet d'avoir une anesthésie beaucoup plus profonde. Le choix de la perfusion à l'aide d'une pompe péristaltique est justifié par la necessité de vider l'animal de son sang circulant, rincer au PBS et passer le produit de fixation pour procéder à des études immunohistochimique sur des tranches de cerveau.

Remplacement

Le but du projet étant d'étudier l'impact de l'enrichissement du microenvironnement de la souris 5xFAD sur la chronologie de développement des signes de la maladie d'Alzheimer, l'utilisation de la souris modèle de la maladie d'Alzheimer est indispensable.

Réduction

Uniquement 10 souris par lot et 3 situations expérimentales sont nécessaires (30 souris au total) pour effectuer des statistiques de comparaison.

Raffinement

La procédure 1 de ce projet qui consiste à étudier l'effet de 3 situations différentes d'enrichissement ne présente aucune souffrance animale. Tous les animaux utilisés sont hébergés à 5 souris par cage. Les cages sont enrichies : 1- cages (taille des cages : 35cm x 19cm, h = 14cm) enrichies par l'enrichissement de base utilisé à l'animalerie (un igloo rouge transparent), 2 -cages de Marlau (taille : 58 cmm x 40 cm x h : 32 cm) enrichies par l'enrichissement de bas utilisé à l'animalerie, 3 - cage de Marlau enrichies avec des des tunnels. La procédure 2 : les animaux sont perfusés sous anesthésie Kétamine (150mg/kg) et Xylazine (15mg/kg).

Choix des espèces

La Souris 5xFAD utilisée dans ce projet est un modèle précoce reconnu du développement de la Maladie d'Alzheimer. L'objet du projet est l'étude de l'effet de trois types d'enrichissement sur l'expression de la maladie d'Alzheimer. Du sevrage jusu'à l'âge de trois mois. Les souris 5xFAD développent les plaques amyloïdes (lésios caractériqtiques de la maladie d'Alzheimer) dès l'âge de 2 mois. Nous étudierons les effets de l'enrichissement à 3 mois.

90 cailles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère, pour créer cinq lignées transgéniques sur cinq ans. Le porteur étudie les forces mécaniques qui façonnent l'embryon de vertébré, en exploitant le développement externe de l'œuf de caille. Il juge un phénotype dommageable improbable mais prévoit de surveiller les générations F1 et F2, une perte de poids de 20 % constituant un point limite pouvant entraîner la mise à mort. Il affirme que l'étude d'embryons vivants est une "exigence absolue" et retient la caille pour sa petite taille et son cycle court.

Objectifs

L’objectif du projet est de comprendre comment signaux mécaniques et moléculaires interagissent pour permettre l’auto-organisation d’un embryon de vertébré. Pour ce faire nous proposons de créer plusieurs lignées de cailles transgénique exprimant des gènes rapporteurs de manière à étudier les processus qui sous-tendent le potentiel hautement régulé et auto-organisant de l’embryon de vertébré et le rôle de la mécanique dans ce contexte. En particulier, nous avons pour but de : 1. Sonder les propriétés mécaniques (viscosité, élasticité) de l’embryon précoce et identifier les processus cellulaires sous-jacents. 2. Perturber l’état mécanique des tissus embryonnaires et mesurer l’impact de ces perturbations sur l’expression génique et le destin cellulaire. 3. Dériver un modèle théorique et prédictif pour l’autorganisation de l’embryon et la régulation embryonnaire.

Bénéfices attendus

L’embryon de caille par son accessibilité et son développement externe, se prête remarquablement aux études dynamiques (par vidéo-microscopie) et aux perturbations mécaniques. Nous anticipons des bénéfices sur des concepts fondamentaux concernant la coopération entre signaux moléculaires et mécaniques qui sous-tendent l’auto-organisation des embryons d’amniotes (i.e. reptiles, oiseaux et mammifères, dont l’humain) qui ne sont pas atteignables chez d’autres espèces telles que la souris en raison du développement intra-utérin qui limite l’accessibilité de l’embryon. Notamment sur la manière les forces mécaniques modulent l’activité des facteurs de croissance par des processus de mécano-transduction et de rétroaction sur la génétique de manière auto-organisant. Au-delà de l’avancement de la connaissance du développement embryonnaire, ce projet aura des implications sur la compréhension des processus cancéreux et de régénération qui impliquent également forces mécaniques et redirection de destin cellulaire.

Procédures

Observation et manipulation des poussins (aspect, poids, taille, .....) pour l'évaluation de phénotype dommageable (quelques minutes, quotidiennement).

Impact sur les animaux

Ce projet implique la création de 5 lignées de cailles transgéniques en 5 ans. Les modifications génétiques proposées pour ces lignées ne sont pas susceptibles d’engendrer de phénotype dommageable et ne comportent, à priori, pas de risque pour les cailles impliquées dans ce projet. Cependant la survenue d’effet délétère est possible et sera surveillée pendant les générations F1 et F2, comme demandé dans le document de travail sur les animaux transgéniques complémentant la directive 2010/63/EU.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, car ils ne peuvent être ni réutilisés ni placés.

Remplacement

En raison de la nature des questions biologiques soulevées dans les études proposées, visant à comprendre les événements cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la formation d’un embryon in vivo, l'utilisation d'embryons vivants est une exigence absolue et ne peut donc pas être remplacée par d'autres méthodes non-animales.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour la génération d’une ligné transgénique est : En génération F1 : 6 cailles transgéniques hétérozygotes. En génération F2 : 12 cailles transgéniques issus des croisements (F1xWT) qui seront menées jusqu’à éclosion dans le but d’obtenir 6 males qui seront croisés chacun avec 4 femelles sauvages. Une seule lignée montrant l’expression la plus forte sera gardée et utilisée pour la génération d’individus en génération F3. Les animaux F1 et F2 seront suivis pour vérifier que la modification génétqiue n’a pas créé de phénotype dommageable. Évènement hautement improbable mais possible. Si les animaux ne montrent aucun phénotype dommageable, la procédure est terminée, le simple l’élevage de caille génétiquement modifiées passé la génération F2 ne constituant pas une procédure en soi. Les cailles sont utilisées dans ce projet pour produire des œufs et des lignées transgéniques, et ne peuvent pas être réutilisées dans un autre objectif.

Raffinement

Comme Indiqué ci-dessus, l’apparition d’un phénotype dommageable n’est pas souhaitée et peu probable. Cependant et comme indiqué dans le document de travail sur les animaux transgéniques complémentant la directive 2010/63/EU, nous évaluerons l’apparition d’un phénotype dommageable chez les animaux génétiquement modifiés en évaluant : -L’apparence générale : la morphologie de l’animal sera évaluée. Par exemple, la présence de tous les membres, en bonne proportion, des yeux, du bec à l’éclosion. -La taille et la croissance des individus. Les animaux adultes (>8semaines) pèsent en moyenne 360g pour les femelles et 311 g pour les males. Un écart de poids de -20% serait indicateur de souffrance et constituerait un point limite. -Le plumage : Apparence anormale de la morphologie et de l’implantation des plumes, à distinguer des problèmes de picage. -Le comportement : la posture, l’activité et l’interaction avec l’environnement seront vérifiés, (ex. acquisition de la marche après éclosion, nourrissage et abreuvement normaux qui pourraient être évocateur de l’affaiblissement de l’animal). -La présence de signe clinique évidents indicateurs d’une souffrance (ex. boiterie) Un taux de mortalité anormal. Une évaluation jugée anormale de l’un de ces critères, par comparaison avec des animaux contrôles d’un même groupe, serait révélatrice d’un phénotype dommageable qui constituerait un point limite et entrainerait la mise à mort de l’animal et la fin de la procédure concernant cette lignée/insertion.

Choix des espèces

La caille japonaise (Coturnix japonica). Les embryons d’oiseaux par leur accessibilité et leur développement externe, se prêtent remarquablement aux études dynamiques (par vidéo-microscopie) et aux perturbations mécaniques contrairement aux mammifères dont le développement intra-utérin limite la réalisation de telles approches. Sa petite taille et son temps de génération très court font de la caille un modèle génétique idéal parmi les oiseaux. -La procédure d’injection de particule lentivirale s’effectue sur des œufs fécondés mais non incubés. A ce stade il est possible de cibler de manière efficace les cellules précurseurs des cellules reproductrices et donc d’obtenir une transmission germinale. -La procédure de génération de lignée (évaluation de la présence de phénotype dommageable) s’étend sur 2 générations de l’éclosion jusqu’à la transmission dans les cellules reproductrices.

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère, par exposition chronique à des particules de sols volcaniques. Le porteur prévoit une mise à mort par décapitation sans anesthésie, expliquant que les anesthésiques et gaz d'euthanasie contiennent des métaux qui fausseraient ses analyses chimiques et isotopiques. Il reconnaît lui-même qu'une anesthésie serait "souhaitable" pour limiter la souffrance mais l'écarte pour préserver ses mesures. Il n'attend aucun effet indésirable notable en s'appuyant sur des études antérieures, et juge que seule une approche in vivo permet de quantifier la toxicité à l'échelle de l'organisme.

Objectifs

Majoritairement présents dans les pays en développement, les sols volcaniques représentent un réel danger pour la santé humaine. Une exposition prolongée pourrait favoriser le développement de certains cancers et autres dysfonctionnements physiologiques majeurs. Malgré ces dangers alarmants, les paramètres et les mécanismes de toxicité demeurent à ce jour mal connus, ne permettant pas de développer des actions durables pour préserver la santé humaine en domaine volcanique. En s’appuyant sur une recherche transdisciplinaire et co-construite avec des partenaires du LMV et du iGReD, mon objectif est d'étudier les risques liés à l’exposition chronique aux sols volcaniques. Ce projet est divisé en trois axes transversaux : -1. Caractériser les propriétés physico-chimiques des sols volcaniques afin d’évaluer leur degré de toxicité. -2. Comprendre les mécanismes d’actions induits à l’échelle de l’organisme. Cet axe sera basé sur un modèle expérimental murin couplé à des analyses chimiques, biochimiques et histologiques de pointe. Ces expériences sont fondamentales pour mieux cerner les fonctions biologiques les plus sujettes à la toxicité des particules volcaniques pouvant par la suite prédisposer à l’émergence de maladies en contexte volcanique comme les maladies repspiratoires, cardiovasculaires et hépatiques. -3. Quantifier les dérèglements du métallome (concentrations et isotopie des métaux) à l’échelle de l’organisme induits par l’exposition chronique aux sols volcaniques et développer de nouveaux biomarqueurs isotopiques. Ces nouveaux outils de diagnostic auront pour but de détecter et ainsi prévenir l’apparition des maladies associées au risque volcanique comme les pathologies hépatiques.

Bénéfices attendus

Toutes les données chimiques et isotopiques obtenues dans un premier temps sur les échantillons de sols volcaniques constitueront en premier lieu une base de données complète qui permettra d’identifier les sols les plus nocifs. A long-terme, cela permettra de concevoir une carte détaillée de l’aléa sanitaire d’origine volcanique. En parallèle, l'ensemble des données chimiques, biochimiques et histologiques obtenues sur les organes et fluides biologiques collectés uniquement aprés la mise à mort des souris, permettra d'identifier les fonctions biologiques et les mécanismes d'actions les plus sujets à cette toxicité volcanique et ce, à l'échelle de tout l'organisme. Les analyses isotopiques permettront quant à elles de développer de nouveaux biomarqueurs de diagnostic spécifiques à chaque réservoir dans le but de prévenir l'émergence de maladies associées à ce risque volcanique encore mal connu.

Procédures

Excepté la mise à mort par décapitation en fin de procédure expérimentale, les animaux ne subiront aucunes interventions comme des procédures chirurgicales invasives. Dans cette étude, nous préconisons une euthanisie par décapitation plutôt qu'une anesthésie par une surcharge d’agent chimique ou par asphyxie suivie d’une dislocation cervicale qui, nous sommes conscients, serait néanmoins souhaitable afin de limiter la souffrance animale. Néanmoins, comme énoncé précédemment (section 3.3.3), les anesthésiants chimiques (ex: le pentobarbital) et les gaz inhalés (ex: isoflurane, CO2), couramment utilisés pour euthanasier les souris peuvent contenir des quantités élevées de métaux qui peuvent biaiser de manière significative les résultats chimiques et isotopiques réalisés dans cette étude. La décapitation est donc la technique alternative la plus appropriée au regard de son effet minimal de contamination chimique.

Impact sur les animaux

Au vu des études précédentes ayant fait appel à des protocoles expérimentaux relativement similaires et n'ayant reportés aucun symptômes de souffrance ou de stress, aucune nuisance ou effets indésirables significatifs ne sont attendus sur les animaux. Pour chaque expèrience, un suivi journalier sera néanmoins mis en place pour surveiller l'état sanitaire des souris. En détail, cela se concretisera par l'établissement et le respect de points limites reposant sur le suivi quotidien du poids et du suivi alimentiare ainsi qu'une analyse de signes cliniques indicatifs d'un état de souffrance et/ou de stress tels que les yeux plissés, un pelage de mauvaise qualité (critére: apparence), des cris ou des comportements anormaux comme l'isolation, le looping ou le tournoiement (critères: Comportements et mouvements).

Devenir

A l'issu de chaque procédure expérimentale, l'ensemble des animaux pour lesquels des analyses chimiques, isotopiques et biochimiques sont envisagées, seront mis à mort par décapitation. Comme détaillé précédemment, les anesthésiants chimiques (ex: le pentobarbital) et les gaz inhalés (ex: isoflurane, CO2), couramment utilisés pour euthanasier les souris peuvent contenir des quantités élevées de métaux qui peuvent biaiser de manière significative les résultats chimiques et isotopiques réalisés dans cette étude. La décapitation est donc la technique alternative la plus appropriée au regard de son effet minimal de contamination chimique . L'euthanasie par décapitation sera également employée sur les souris ayant fait l'objet d'une exclusion de la procédure scientifique suite à l'atteinte d'un point limite. Cela nous permettra de collecter et d'analyser les organes de souris soumises à un stress physiologique anormal voir excessif (en cas d'atteinte de point limite) et de comparer les résultats obtenus avec des souris saines et/ou exposées aux particules volcaniques sans atteintes de points limites. A l'inverse, toutes les souris femelles et surplus de mâles néonatales issues des portées exposées et non exposées aux particules volcaniques, et par conséquent non inclus dans les procédures expérimentales, seront euthanasiées via une anesthésie par surcharge d’agent chimique ou par asphyxie suivie d’une dislocation cervicale pour limiter leur souffrance (cas où les organes ne sont pas analysés). Les souris femelles adultes utilisées pour les tests de reproduction, n’ayant à aucun moment été en contact avec les particules volcaniques, seront quant à elles recyclées dans l’animalerie pour une utilisation future (ex: lot contrôle lors d'une prochaine procédure) et/ou dans l’optique de maintenir une cohorte stable de souris isotonique C57BL/6 au sein de l’équipe.

Remplacement

Ce projet a été réfléchi et construit dans l'entier respect de la règle des 3Rs. Au vu de l'intéret scientifique de ce projet visant à mieux comprendre le risque induit par une exposition chronique aux particules volcaniques et ce, à l'échelle de l'orgnisme, seule une approche in-vivo sur modèle souris s'avère adéquate. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative pour quantifier les effets néfastes induits à l'ensemble de l'organisme par une exposition chronique aux particules volcaniques et seul le modèle vivant intégré permet une compréhension et une quantifiaction intégrale du problème.

Réduction

Bien que le remplacement ne soit pas possible, ce projet à néanmoins été pensé dans une logique de réduction du nombre d'animaux. Pour cela, le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été minimisé et calculé de façon à obtenir des données statistiquement fiables. Toutes les données obtenues dans ce projet feront l'objet d'analyses statistiques de types non-paramétriques (exemple: ANOVA ou MAnn-Whitney U test) visant à contraindre l'impact des particules volcaniques sur la santé

Raffinement

Le stress tout comme la souffrance pouvant affecter l'homéostasie et le métabolisme des métaux et ainsi biaiser nos résultats, il est primordial d'éviter toutes sortes de souffrance des animaux. Pour cela, nous adopterons un raffinement adapté reposant sur un hébergement et une surveillance quotidienne des animaux ainsi que sur l'élaboration de protocoles optimisant le bien-être animal. Cela reposera également sur un enrichissement (exemple: tunnel en carton, appareil de nidification) des cages et un maintien de plusieurs animaux par cage pour maintenir l'interaction sociale. La taille des cages sera également adaptées au nombre de souris (i.e., 3 souris par cage de 300cm2 maximum) afin de respecter la législation.

Choix des espèces

Les fonctions biologiques tout comme le métabolisme des métaux chez l'homme sont conservés chez la souris qui de fait, font de cette espèce un modèle animal entièrement adapté pour conduire notre étude. Par ailleurs, la souris reste un modèle simple d'utilisation avec des besoins d'hébergement et d'entretien faciles à subvenir. Le modèle murin est par ailleurs un modèle déjà utilisé dans ce cadre d'étude ce qui nous permettra de comparer les résulats obtenus dans ce projet avec les résultats bibliographiques antèrieurs. Afin de définir la population la plus vulnérable, l'exposition aux particules volcaniques sera faite sur des souris d'âges variables à différents stade de croissance allant de la phase néonatale à celle de l'age adulte. Pour cela nous envisageons de tester: 1/ Une exposition néonatale qui sera réalisée de la naissance jusqu'à différentes périodes de temps à savoir 20 jours (sevrage) (groupe 1), 5 semaines (groupe 2) et 10 semaines (groupe 3). Par groupe, nous travaillerons sur 1 portées exposée auquel sera ajouté 1 portée non exposée pour le groupe controle. Avec en moyenne 6 bébés par portée de femelle C57BL/6, cela fera 24 petits issus de mères non exposées par groupe soit au total 28 souris mobilisées (24 bébés + 4 femmelles adultes) pour les 5 ans. 2/ Une exposition sur des souris adultes âgées de 5mois sur des periodes de temps de un et deux mois. Pour chaque exposition, 12 souris mâles C57BL/6 seront répartis en 2 groupes (exposé et non exposé) soit 6 animaux par groupe répartis dans deux cages distinctes (3 souris par cage). Cela représentera donc 24 souris au total sur les 5ans. Pour chaque expérience, des tests de reproduction seront également réalisés. Pour les expositions néonatales, trois souris de sexe masculin par groupe seront mises en accouplement avec des souris femelles C57BL/6 matures sexuellement ce qui mobilisera 12 souris femelles supplémentaires. Pour les expositions réalisées à l'age adulte, toutes les souris seront mises en accouplement soit 24 souris femelles supplémentaires. A noter que l'accouplement se fera dans des cages individuelles dépourvues de particules volcanqiues. Les souris femelles C57BL/6 ne seront ainsi jamais exposés à quelconque risque volcanique. L'ensemble de ces expériences (adulte et néonatale) seront dupliquées deux fois pour assurer la fiabilité des résultats. Au total, ces expériences nécessiteront l'utilisation de 176 souris sur l'ensemble des 5 années ce de projet.