Procédures légères
Effets de la cécité sur le développement et la plasticité du système olfactif chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la moitié des petits naissant aveugles, un phénotype que le porteur qualifie lui-même de "dommageable". Les animaux testés subissent trois chirurgies du crâne sous anesthésie, avec incision au-dessus des bulbes olfactifs pour de l'imagerie optique, répétées à un mois d'intervalle, puis sont tués à la dernière séance. Quinze reproducteurs voyants n'ayant subi aucune chirurgie sont réutilisés dans un autre projet, les souris aveugles ne pouvant l'être. Le projet vise à comprendre la plasticité de l'odorat après une cécité précoce, le porteur affirmant que cette imagerie ne peut s'envisager sur modèle in vitro.
Objectifs
À l’échelle mondiale, environ 2,2 milliards de personnes présentent une déficience visuelle, touchant aussi bien les nouveau-nés prématurés que les personnes de plus de 50 ans (OMS). La théorie du «darwinisme neuronal» stipule que l'absence d'une modalité sensorielle, comme la vision, induit une plasticité cérébrale permettant la potentialisation des autres sens afin d’aider l’individu à s’adapter à son environnement. Si ce phénomène de potentialisation sensorielle a été largement décrit, son évolution au cours du développement et ses mécanismes font encore l’objet de nombreuses questions. Ainsi, une des questions principales est d’étudier comment se met en place au cours du temps cette plasticité chez un individu privé de la vision, à la fois du point de vue comportemental, mais également au niveau des processus cérébraux sous-jacents. À ce jour, l’impact de la cécité sur la fonction olfactive, qui est un sens invisible mais critique dans notre quotidien, reste peu étudié, en particulier au niveau des mécanismes de réorganisation sensorielle cérébrale. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le développement et la plasticité fonctionnelle du système olfactif induite par l’absence de système visuel périphérique au cours du développement. Nous avons choisi d’aborder cette question chez les rongeurs, des macrosmates qui utilisent principalement leur sens olfactif pour la perception de leur environnement (interactions sociales, recherche de nourriture, détection des prédateurs). Nous allons ainsi utiliser un modèle murin de cécité congénitale afin d’appréhender les mécanismes liés au développement et à la plasticité des systèmes sensoriels. Grace à la combinaison de plusieurs approches expérimentales, nous allons chercher à quel niveau et avec quel décours temporel interviennent les mécanismes de plasticité cérébrale afin d’apporter de nouvelles données pour mieux comprendre comment cette plasticité se met en place chez l’humain privé d’un sens.
Bénéfices attendus
Ce projet innovant répond à l’un des enjeux clés des neurosciences : la compréhension des mécanismes de plasticité cérébrale. Il est bien établi que la cécité précoce entraîne une amélioration des modalités sensorielles résiduelles non visuelles qui est accompagnée d'une plasticité cérébrale fonctionnelle et anatomique. Alors que les fonctions auditives et tactiles ont été largement étudiées, les données concernant les fonctions olfactives sont moins documentées et les résultats moins cohérents. Le but de la présente étude est d’évaluer, sur un modèle de souris présentant une cécité congénitale, les performances olfactives et de corréler les changements observés à l’activité des aires cérébrales impliquées dans la perception des odeurs. Cette étude sera menée à différents stades de développement afin d’évaluer comment ces modifications se mettent en place au cours du temps. Étant donné que les données concernant les fonctions olfactives chez les humains aveugles sont controversées, ce modèle murin nous permettra d’approfondir nos connaissances de la plasticité du système olfactif et de clarifier, avec des approches de pointe, l’effet de la cécité sur les fonctions olfactives. De nombreuses études ont montré qu’il était possible d’éduquer notre fonction olfactive comme l’illustre parfaitement l’exemple des parfumeurs, mais également de la rééduquer après une perte olfactive. Ce projet, en étudiant comment la plasticité se met en place au cours du développement, pourra fournir des données sur les périodes critiques au cours desquelles on pourrait proposer une éducation olfactive chez les enfants aveugles congénitaux visant à améliorer encore leur perception du monde qui les entoure.
Procédures
La procédure 1 concerne la mise en reproduction des souris et il n’y a donc aucune intervention sur ces dernières. La procédure 2 comprend deux session expérimentale. La première vise à enregistrer la respiration des souris dans un pléthysmographe corps entier. Afin de limiter le stress des animaux lié au changement d’environnement par rapport à leur cage d’hébergement, ils seront habitués à l’appareil pendant 10 minutes les deux jours précédant cette session. La durée totale de cette session sera de 30 minutes. La deuxième session expérimentale a lieu de lendemain de la première. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis placés dans un cadre stéréotaxique. Suite à un traitement anesthésique local, la peau du crâne sera incisée au niveau des bulbes olfactifs (ouverture de 0,5 cm environ). Une session d’imagerie optique sera alors réalisée pendant 30 minutes et en présentant différentes odeurs. L’anesthésie et l’analgésie seront maintenues tout au long de la procédure. La peau du crâne sera ensuite recousue et l’animal replacé dans sa cage d’hébergement. La durée de cette session n’excédera pas 60 minutes. Cette procédure sera répétée 3 fois pour chaque animal à 9/11 jours post-natal (P9/11) à P30 et à P60. Après chaque session expérimentale, les souris (en particulier les plus jeunes à P9) seront replacés le plus rapidement possible avec leur mère ou leurs congénères. A la suite de la dernière session d’imagerie (P60), les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
La procédure 1, qui concerne la reproduction des animaux, va engendrer la naissance (la moitié de la portée) de souris aveugles qui est un phénotype dommageable. La procédure 2 comprend deux sessions expérimentales sur chaque animal. La première, qui concerne l’enregistrement dans la cage de pléthysmographie peut potentiellement générer un léger stress pour le jeune animal séparé de sa mère. La deuxième nécessite une chirurgie de gravité modérée réalisée sous anesthésie qui consiste en l’incision de peau au-dessus des bulbes olfactifs puis a la suture de celle-ci. Cette intervention peut engendrer une douleur post-opératoire. Cette intervention sera répétée à 30 jours d’intervalle.
Devenir
Procédure 1 : les souris reproducteurs et reproductrices voyantes (soit 15 souris) n’ayant subies aucune chirurgie ni geste invasif pourront, comme leur progéniture excédentaire, être réutilisés dans un autre projet de recherche. Il est difficile d’envisager la réutilisation des souris de phénotype aveugle dans une autre procédure, la plupart de celles-ci nécessitant un animal « voyant ». Si nous avons des pertes des juvéniles lors de la procédures 2, nous pourrons considérer utiliser ces animaux pour nos enregistrements chez l’adulte. Procédures 2: les animaux ayant subis 3 chirurgies au cours de leur développement et ayant été testé avec des odeurs dans le pléthysmographe ne pourront pas être réutilisés. Ils seront donc mis à mort à la fin de la procédure après la 3ème et dernière session d’imagerie.
Remplacement
L’étude de l’activité fonctionnelle du bulbe olfactif et du cerveau ainsi que des fonctions respiratoires et olfactives nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro. Les enregistrements optiques, s’ils ne sont pas invasifs au niveau cérébral, nécessitent la réalisation d’une fenêtre dans l’os du crane et rendent donc ces expériences non envisageables chez le sujet humain.
Réduction
Pour mener ce projet, nous aurons besoin d’utiliser 80 souris pendant la durée du projet. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum et choisi en fonction 1) du calcul de la puissance statistique (avec alpha =0.05 et puissance statistique de 0.8) et 2) de nos travaux antérieurs et des données bibliographiques d’autres groupes. Les tests statistiques seront basés sur des ANOVA factorielles (aveugle VS voyant) (comparaison des fréquence respiratoires, surface des aires activées en imagerie optique) et des ANOVA à mesures répétées (test d’habituation/cross habituation). De plus et de façon critique, les approches expérimentales choisies (pléthysmographie et imagerie optique) permettent une approche longitudinale sur les mêmes animaux au cours du développement, réduisant ainsi le nombre total d’animaux utilisés. De plus, nous allons utiliser les mêmes animaux pour les mesures physiologiques (mesure de la respiration) et l’imagerie optique dans la procédure 2. Pour limiter tout effet de portée, seules 2 souris par phénotype seront testées à l'intérieur de la même portée, soit 2 souris aveugles (1 femelle et 1 mâle) et 2 souris voyantes (1 femelle et 1 mâle) pour un total de 4. Les animaux surnuméraires seront proposés pour être réutilisés dans d’autres procédures au sein de l’établissement. Si ce nombre idéal n’est pas possible dans une portée (par exemple une femelle aveugle et 2 mâles, 1 aveugle, 1 voyant), nous inclurons ces animaux dans notre procédure et inclurons 1 animal supplémentaire d’une autre portée pour compléter notre groupe).
Raffinement
Nous avons choisi d’enregistrer la respiration de façon non-invasive en utilisant une cage de pléthysmographie. Cette technique permet d’étudier très finement un ensemble de paramètres respiratoires comme la fréquence et les volumes inspiratoires et expiratoires de manière spontanée ou en présence d’une stimulation odorante. Ces enregistrements ont lieu sans aucune contrainte chez l’animal comme c’est le cas, par exemple, avec l’utilisation d’une ceinture placée autour de la cage thoracique. L’animal est libre de ses mouvements. Pour les expériences d’imagerie optique, l’anesthésie et l’analgésie seront maintenues tout au long de la chirurgie ou de l’enregistrement. La douleur post-opératoire sera quantifiée et une couverture analgésique sera mise en place. Étant donné que la moitié des souris présentera un phénotype dommageable dû à l’absence de perception visuelle, un milieu d’hébergement ultra-enrichi est préconisé. Le matériel utilisé sera le suivant : une grande cage, hébergement en groupe, la nourriture est mélangée avec la litière, un tunnel et une roulette / cage, et du matériel de nidification. Cette souche de souris, en offrant la possibilité d’avoir nos deux phénotypes d’intérêt au sein d’une même portée, permet de ne réaliser qu’un seul élevage.
Choix des espèces
Les rongeurs et en particulier les souris sont un modèle de choix pour l’étude du système olfactif en général et pour cette étude en particulier pour plusieurs raisons : (1) Les souris nouveau-nées naissent sans entrées auditives et visuelles (jusqu'aux jours 9 et 14-15, respectivement); Elles sont donc d'abord guidées par la chimioréception; (2) Le système olfactif de la souris fonctionne avant la naissance, contribuant ainsi très tôt à l'induction expérientielle de phénotypes comportementaux ; (3) Après la naissance et à l’âge adulte, les souris utilisent de façon critique les indices olfactifs pour guider leur comportement ; (4) Des tests comportementaux standardisés sont conçus pour évaluer les fonctions cérébrales et le comportement chez les souris adultes et en développement ; (5) L'accès à de nombreux génotypes obtenus par mutation ou par manipulation génétique permettent de disséquer de nombreuses fonctions cérébrales et notamment la plasticité. Pour répondre à la question des effets de la cécité sur la plasticité cérébrale et les performances sensorielles non visuelles, nous avons choisi d'utiliser une souche de souris mutante (la souche de souris ZRDBA). Lors de la reproduction, cette souche permet d’obtenir, au sein d’une même portée, une moitié de congénères aveugles et l'autre moitié voyants normalement. C’est un critère majeur lorsque l’on étudie le développement puisque l’on peut comparer des animaux de phénotypes différents issus d’une même portée. Ces animaux ont donc reçu les mêmes soins maternels et ont été exposés aux mêmes stimuli lors de leur développement. L’objectif est de tester l’impact de l’absence du système visuel périphérique sur l’activité du système olfactif au cours du développement. Nous utiliserons donc des souris à 3 stades développementaux différents : avant qu’elles n’ouvrent les yeux à un âge post-natal compris entre P9 et P11, quand elles ont ouvert les yeux et sont séparées de leur mère entre P30 et P32 et à l’âge adulte (>P60).
Etude de l’efficacité anti-tumorale de différents formats d’anticorps anti-B7-H3
- Recherche appliquée
- Cancers
10 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 950 dans des procédures classées sévères. Elles reçoivent des injections répétées et des greffes de cellules tumorales sous la peau ou dans le sang, pour tester différents formats d'anticorps anti-B7-H3 en cancérologie. Le porteur indique que les greffes peuvent provoquer nécrose, saignement, ulcération et perte de poids, et que les animaux sont tués à l'atteinte des points limites ou en fin de protocole par dislocation cervicale. Il conclut au "besoin de nouveaux traitements innovants" et affirme que l'efficacité ne peut être évaluée que dans un modèle vivant, impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde, responsables de plus de 9 millions de décès. L’immuno-oncologie est aujourd’hui une approche thérapeutique prometteuse. Sa particularité n’est pas uniquement de cibler la tumeur comme les autres stratégies thérapeutiques mais aussi d’aider le système immunitaire à reconnaitre et détruire les cellules tumorales. L’utilisation d’anticorps dans le traitement des cancers est l’une des stratégies approuvées et en continuel développement. Différents formats d’anticorps ont été approuvés en clinique : les anticorps monoclonaux présentant une action cytotoxique par ADCC via l’engagement des récepteurs Fc sur les cellules cytotoxiques (Rituximab, Cetuximab,…) ; les anticorps multi-spécifiques liant les cellules tumorales et les cellules effectrices de l’immunité, favorisant l’élimination des cellules tumorales par les cellules immunitaires (Blinatumomab) ; les anticorps conjugués à un agent cytotoxique appelés ADC (Antibody Drug Conjugate) qui est libéré au niveau du site tumoral (Padcev, Enhertu..). Notre laboratoire travaille sur le développement d’anticorps thérapeutiques équivalents sur les formats monoclonaux (mAb), ADC mais également sur le format multi-spécifiques. Les anticorps multi-spécifiques développés par notre laboratoire engagent les cellules effectrices de l’immunité anti-tumorale ainsi que les cellules tumorales (via un antigène tumoral). Dans le cadre de ce projet, l’antigène ciblé est une molécule que l’on retrouve exprimée à la surface des cellules présentatrices d’antigène ainsi qu’à la surface de cellules tumorales. Des anticorps de la concurrence, dirigés contre cette molécule, sont actuellement en cours d’évaluation clinique. Les premiers essais montrent des signes d’efficacité, ce qui nous conforte dans le choix de cibler cette molécule. L’objectif de ce projet consistera à évaluer chez la souris l’efficacité d’anticorps anti-antigène tumoral sous différents formats (ADCC, multi-spécifique ou ADC).
Bénéfices attendus
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, on dénombre plus de 9 millions de décès par an. Ce chiffre démontre le besoin de nouveaux traitements innovants. Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de l’efficacité anti-tumorale de nouveaux anticorps dans des modèles pré-cliniques, une meilleure connaissance de leur mode d’action et de leur potentiel d’efficacité en combinaison avec des traitements de références. Tout ceci afin d’amener ces anticorps dans des phases de tests cliniques sur des patients atteints de cancer. Le bénéfice à long-terme est le traitement et l’augmentation de l’espérance de vie de patients atteints de cancer exprimant la cible à la surface de leurs cellules tumorales.
Procédures
Pharmacodynamie / pharmacocinétique : a. 1 injection IV de composés thérapeutiques avec aiguille 30G 1/2 via la veine caudale sur animaux vigiles ou via le sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse. Volume ≤100 µL et pouvant aller jusqu’à 200 µL ; b. 1 injection IP de composés thérapeutiques avec aiguilles 30G 1/2, sur animaux vigiles, volume ≤400 µL. Test fonctionnel ex-vivo : a. 1 injection en IP de poly(I:C) avec aiguille 26G, sur animaux vigiles, volume ≤400 µL ; b. prélèvement de rate post-mortem après dislocation cervicale. Test d’efficacité modèle sous-cutané (SC) : a. injection sous-cutané de cellules tumorales avec aiguille 26G, sur animaux vigiles, une à deux injections SC par animal, volume ≤200 µL par injection ; b. prélèvement de tumeurs et/ou organes en post mortem après dislocation cervicale. Test d’efficacité modèle intra-veineux (IV) : a. 1 injection intra-veineuse de cellules tumorales via veine caudale avec aiguilles 30G 1/2, sur animaux vigile, volume ≤100 µL pouvant aller jusqu’à 200 µL ; b. prèlèvement de poumons et/ou foie post-mortem après dislocation cervicale ou surdosage chimique d’anesthésique. Test d’efficacité modèles SC et IV : a. injections IV de composés thérapeutiques ou de composés déplétant 1 population immunitaire avec aiguille 30G 1/2 via la veine caudale sur animaux vigiles ou via le sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Volume ≤100 µL et pouvant aller jusqu’à 200 µL. A doses et fréquences variables. Si les injections IV sont réalisées via le sinus rétro-orbital, maximum de 1 injection par œil et par jour sera réalisé avec un maximum de 5 injections par œil ; b. injections IP de composés thérapeutiques ou de composés déplétant une population immunitaire avec aiguilles 30G 1/2 ou 26G, sur animaux vigiles. Doses et fréquences variables dans un volume ≤400 µL ; c. injections per os de composés thérapeutiques avec sondes de gavage, sur animaux vigiles. Volume ≤200 µL et pouvant aller jusqu’à 400 µL. A doses et fréquences variables. Etude de pharmacodynamie et pharmacocinétique + test d’efficacité dans modèles SC et IV : a. prélèvement de sang au sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Volume de sang prélevé par animal < à 7.5% du volume sanguin total par semaine. Si prélèvements à la fin de la procédure expérimentale, volume prélevé pouvant aller jusqu’à 600µL et l’animal sera sacrifié par dislocation cervicale avant réveil.
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés sur les animaux inclus dans les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique sont de gravité légère. Aucune incidence significative sur le bien-être ou l’état général ne devrait être observée. Les gestes réalisés sur les animaux inclus dans les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique, les études d’efficacité en modèle sous-cutané et les études d’efficacité en modèle intra-veineux bien que répétés et/ou multiples, sont de gravité modérée. Cependant, les composés thérapeutiques injectés dans études de pharmacodynamie et pharmacocinétique, les études d’efficacité en modèle sous-cutané et les études d’efficacité en modèle intra-veineux peuvent induire une toxicité dans les jours suivant l’administration. Celle-ci se traduisant par une perte de poids sur 4-5 jours. Les animaux revenant en phase de prise de poids et donc à un état général normal au maximum 7 jours après l’injection. Les modèles de greffe réalisés lors des études d’efficacité en modèles sous-cutané peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, une nécrose importante et/ou saignement et/ou ulcération et/ou inflammation très importante, une tumeur altérant la mobilité des animaux, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme). Les modèles de greffe réalisés lors des études d’efficacité en modèle intra-veineux peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme).
Devenir
Les animaux de la procédure 1, ayant subit un nombre répété de gestes techniques (injection et prélèvement), seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux de la procédure 2 doivent être sacrifiés pour prélèvement de rate post-mortem. Les animaux de la procédure 3 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de réduire les nuisances sur le bien-être des animaux et d’éviter tout effet indésirable. Les animaux exclus lors de la randomisation seront sacrifiés avant atteinte des points limites et pour certains un prélèvement d’organes/de sang sera effectué pour des analyses ex-vivo et de caractérisation du mode d’action du composé thérapeutique. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux de la procédure 4 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable.
Remplacement
Evaluer des stratégies d’immuno-oncologie implique d’être dans un système biologique complexe qui rassemble tumeur, environnement tumoral et système immunitaire. Compte tenu de l’interaction étroite entre ces différents systèmes, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro, il est nécessaire d’obtenir des preuves de concept chez l’animal dans le processus de développement d’anticorps thérapeutiques. Le remplacement des animaux est donc impossible à mettre en place du fait de la nécessité d’étudier l’efficacité dans un modèle vivo complexe, impossible à mimer in vitro.
Réduction
Le nombre nécessaire de souris a été calculé afin de couvrir les différentes études qui permettront d’investiguer les effets anti-tumoraux des anticorps développés par notre laboratoire et de fournir des résultats statistiquement significatifs. Les données obtenues pour chaque paramètre sur des animaux traités seront comparées aux données obtenues sur des animaux ayant reçu un traitement placebo et/ou traitement de référence et permettre ainsi l’évaluation précise de l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. Pour les études d’efficacité, le nombre moyen de 10 souris par groupe a été préalablement déterminé sur la base des moyennes et déviations mesurées pour chaque paramètre. C’est le nombre minimum de souris nécessaire afin d’obtenir des données statistiquement interprétables. Si plusieurs composés candidats ou plusieurs doses du même composé doivent être testés dans le cadre de la même série expérimentale, les groupes contrôles ne seront réalisés qu’une seule fois. Pour l’utilisation des souris transgéniques, animaux mâles et femelles d’âges différents pourront être utilisés, afin de réduire le nombre d’animaux générés.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours sera respectée à la réception des animaux. Les animaux seront hébergés de 2 à 5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans la mesure du possible, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage en cours d’expérimentation, sinon un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse à l’isoflurane) et les volumes ainsi que les fréquences de prélèvement suivront les recommandations du CEEA et de la SBEA. Les schémas d’injections des traitements de déplétion de populations immunitaires seront établis et l’absence de toxicité vérifiée lors de mise au point préalable sur un petit nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, des aiguilles de diamètre 30G 1/2 seront utilisées afin de limiter la douleur lors des injections. Le poids des animaux sera suivi une fois par semaine. Certains composés thérapeutiques peuvent induire une perte de poids transitoire des animaux intervenant généralement entre 1 à 6 jours après le traitement. Lorsqu’une perte de poids sera initiée (10% de perte de poids), les souris seront pesées 3 fois par semaine. Dès l'atteinte de 15% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. De plus, dès l'atteinte de 15% de perte de poids, il sera ajouté de la nourriture humidifiée ou gélifiée, au fond de la cage, afin de faciliter l’accès à la nourriture. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou de volume tumoraux (classiquement deux fois par semaine). Si une tumeur commence à montrer des signes de nécrose modérée (inflammation importante et/ou croute), les souris seront surveillées tous les deux jours. Dans le cas d’un modèle agressif avec signe de nécrose modérée, les souris seront surveillées quotidiennement. De plus, si l’aspect général et le comportement de l’animal se dégrade (yeux plissés, oreilles rabattues, prostration, isolement) mais ne nécessitant pas son euthanasie, la surveillance des animaux sera réalisée tous les deux jours. Les points limites relatifs à la perte de poids, à l’apparence et au comportement des animaux, à l’aspect et aux volumes des tumeurs sont des critères qui justifieront l’euthanasie des animaux.
Choix des espèces
La majorité des modèles animaux en immuno-oncologie ont été développés chez la souris. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité d’anticorps thérapeutiques et l’activation du système immunitaire. Des modèles murins de tumeurs solides et hématologiques sont à disposition dans différentes souches. Dans les souches de souris immuno-déficientes : xénogreffes pour tester le candidat médicament sur des cellules tumorales humaines. Le système immunitaire de ces souris bien que déficient, possède tout de même des macrophages ainsi que des cellules NK permettant l’évaluation de nos molécules. Dans les souches de souris immuno-compétentes : modèles syngéniques via la greffe de cellules tumorales murines exprimant l’antigène humain permettant ainsi de tester le candidat médicament en évaluant l’impact de la réponse immunitaire. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études auront un âge minimal de 7 semaines, âge auquel le système immunitaire est décrit comme mature.
Etude de l’immunogénicité de pseudo-particules virales de SARS-COV2 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, réparties entre un niveau de souffrance léger et modéré. Elles reçoivent un candidat vaccin à pseudo-particules virales de SARS-CoV-2 par voie sous-cutanée ou nasale à trois reprises, avec quatre prélèvements sanguins à la veine sub-mandibulaire, avant mise à mort pour prélever les organes lymphoïdes. Le porteur indique n'avoir jamais observé de signe clinique avec des protocoles similaires. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne mime la complexité de la réponse immunitaire des mammifères.
Objectifs
La disponibilité d'un vaccin efficace et permettant une cross-protection contre les variants de SARS-CoV-2 reste une urgence. Les pseudo-particules virales (virus-like particles ou VLPs)ont montré dans de nombreux modèles d'infection leur grande qualité d'antigène vaccinal. Le vaccin candidat composé de ces VLPs doit permettre de générer une réponse immunitaire humorale et cellulaire contre l'ensemble des protéines de structure du coronavirus (protéines S, E, M, N) contrairement aux vaccins actuellement disponibles ne contenant que l'antigène ou des séquences codant la protéine SPIKE à l'exception des vaccins basés sur des virus inactivés. Pour cela, notre équipe a développé des pseudo-particules virales de SARS-COV2 contenant la protéine S du variant delta ainsi que les protéines M, N et E de la souche originelle de Wuhan. En effet, ces trois dernières protéines structurales sont beaucoup moins sujettes à l'apparition de mutations et peuvent donc induire des protections croisées. Notre objectif est d'évaluer l'immunogénicité humorale et cellulaire de ce candidat vaccin de seconde génération en évaluant deux voies d'administration : sous-cutanée et nasale.
Bénéfices attendus
En cette période de pandémie de COVID-19 , la disponibilité d'un vaccin efficace et permettant une cross-protection contre les variants de SARS-CoV-2 reste une urgence. Ce projet va permettre de valider l'immunogénicité de notre candidat vaccin basé sur des pseudo-particules virales (virus-like particles ou VLPs) selon deux voies d'administration, l'une classique, la voie sous cutannée et l'autre plus adaptée à des pathogènes respiratoire, la voie nasale.
Procédures
Les animaux seront soumis à des : 1/ Prélèvements sanguins à J0 , J14, J28 et J45 à la veine sub-mandibulaire avec un volume cible de 200 μL 2/ Injections sous-cutanées du candidat vaccin sous un volume de 200 μl à J0, J7 et J28 3/ Instillations nasales du candidat vaccin sous un volume de 20 μl (10 μl par naseau) à J0, J7 et J28
Impact sur les animaux
Des protocoles similaires que ce soit d'immunisation sous-cutanée ou nasale ont été mis en oeuvre au sein de notre laboratoire et n’ont jamais montré de signes cliniques ou de changement de comportement suite à la vaccination. Les animaux seront tout de même surveillés de manière quotidienne pour détecter toute nécrose au point d'injection (groupe recevant les immunogènes par voie sous cutanée), tout inconfort respiratoire (groupe recevant les immunogènes par voie nasale). Tout animal présentant un de ces signes cliniques sera euthanasié. Toutes les procédures sont effectuées sous le controle d'un expérimentateur/concepteur expérimenté qui saura limiter ou le cas échéant évaluer le stress et/ou la douleur engendrée par la procédure.
Devenir
A J42, fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes lymphoïdes secondaires.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution pour mimer la complexité de la réponse immunitaire chez les mammifères.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et de notre expérience.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives en vigueur et bénéficient d'un enrichissement social (3 animaux /cage) et physique (maisonnette en plexiglas, papier absorbant, boîte à oeuf en carton) dans la zone d'hébergement définie par la SBEA de l’établissement. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites (prostration des animaux, poils hérissés). Tout traitement pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt en lien avec les points limites sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus.
Choix des espèces
La souris Balb/c est la souris la plus utilisée pour valider l'immunogénicité d'un candidat vaccin. De plus, tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire humorale et cellulaire chez la souris. Ce modèle murin permettra de faire la preuve concept de l’induction d’une réponse immunitaire avant de passer sur un modèle d’infection comme la souris K18-hACE2 et le hamster. 7 semaines incluant une semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance
Exploration d’une nouvelle stratégie vaccinale par thérapie cellulaire pour les patients immunodéprimés
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 444 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent selon les groupes une greffe de peau sous anesthésie, des traitements immunosuppresseurs répétés et jusqu'à douze prélèvements sanguins, pour tester une stratégie vaccinale par thérapie cellulaire chez des patients immunodéprimés. Le porteur indique que l'immunosuppresseur employé peut provoquer une toxicité rénale, suivie par la perte de poids. Il affirme que la production d'anticorps ne peut avoir lieu qu'au sein d'un ganglion ou de la rate, impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Afin d'éviter les rejets de greffe, les patients transplantés sont traités avec des immunosuppresseurs. Malheureusement, ces traitements affaiblissent l'ensemble du système immunitaire, les patients sont plus sujets aux infection et cancers et ils répondent moins éfficacement aux vaccinations. L'objectif de ce projet est de mettre en place une nouvelle statégie vaccinale par thérapie cellulaire. Il est prévu de vacciner les animaux avec des schéma vaccinaux classiques (injection sous cutanée de l’antigène avec adjuvant), ou par l’injection de cellules T vaccinales modifiées par voie intraveineuse après anesthésie. Différentes souches de souris, présentant des défauts plus ou moins importants du système immunitaire seront utilisées. Ces modèles de souris permettront de répondre sur les interactions entre différentes populations immunitaires, présentes ou non dans ces modèles. Afin d’évaluer les doses d’immunosuppresseurs optimales, une expérience de greffe de peau sera réalisée. La greffe de peau a été choisi dans un premier temps comme modèle de transplantation car elle est beaucoup moins invasive que le greffe d’organe tel que cœur ou rein. La production d’anticorps ainsi que les différentes populations immunitaires seront étudiées chez les souris receveuses., c’est-à-dire ayant recu les cellules vaccinales.
Bénéfices attendus
Cette nouvelle approche vaccinale par thérapie cellulaire permettrait de surmonter les effets délétères des immunosuppressions chez les patients transplantés mais aussi de manière plus générale chez les patients présentant des défauts de réponse immunitaire, et qui ne répondent pas aux stratégies de vaccnations conventionnelles.
Procédures
IV : intraveineux/ SC : sous-cutané / IP : intrapéritonéal Procédure 1 : injection IV de cellules à des souris anesthésiées puis 1 seul prelevement sanguin avec anésthésique local en fin de procédure. Durée 24-48h. Procédure 2 : les souris subiront 2 injections SC et 5 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée 42 jours. Procédure 3 : greffe de peau sous anesthésie gazeuse + analgésie morphinique, traitements immunosuppresseurs 2 à 3 fois par semaine par injection IP sous isoflurane, 7 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée 42 jours. Procédure 4 : les souris seront sous traitements immunosuppresseurs (ou contrôle placebo) (2 à 3 fois par semaine par injection IP) et vaccinées par 2 injections SC à 28 jours d’intervalle. 10 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée 98 jours. Procédure 5 : injection de cellules par voie IV sous anesthésie gazeuse et 10 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée de 42 jours. Un groupe sera en plus sous traitements immunosuppresseurs (2 à 3 fois par semaine par injection IP) Procédure 6 : les souris seront vaccinées soit par 2 injections SC à 28 jours d’intervalle soit par injection de cellules par voie IV sous anesthésie gazeuse. Un groupe sera en plus sous traitements immunosuppresseurs (2 à 3 fois par semaine par injection IP). Au total, 12 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée de 102 jours. Prélèvement sang total sous anesthésie générale à la fin de plusieurs procédures, juste avant mise à mort. Les injections durent moins d'1 minute, la greffe de peau environ 20 minutes, un prelevement de l'ordre de 30 Secondes (contention comprise).
Impact sur les animaux
Les doses d’immunosuppresseurs utilisées dans ce projet sont décrites dans la littérature. L’immunosuppresseur (appelé tacrolimus ou FK506) que nous utiliserons peut engendrer une toxicité rénale chez les patients. Nous avons pu montrer au laboratoire que, chez la souris, la perte de poids est un bon indicateur de cette toxicité rénale, les pesées sont donc adaptées dans les procédures ad hoc. Nous n’attendons pas d’effets indésirables dus aux injections : intrapéritonéales, sous cutanées ou intraveineuses) ni lors prélèvements repetés au niveau du sinus retro-orbital ou par voie submandibulaire. La greffe de peau est un geste bien documenté, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie (non reveil de l'animal malgré des doses d'analgésie et anésthésie adaptées). De manière générale, les procédures ne doivent pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux (hormis la greffe de peau). Les points cliniques généraux (aspect du poil, comportement, pesée) seront observés selon une fréquence déterminée pour chaque procédure ou étape au sein d’une même procédure. Des points limites propres à chaque procédure ont été définis pour éviter toute souffrance.
Devenir
Les souris de la procédure 1 seront mises à mort avec une méthode reglementaire en fin de procédure pour récupération des organes lymphoïdes Les souris des 5 autres procédures seront anesthésiées pour un prélèvement de sang maximum puis mises à mort avec une méthode reglementaire pour récupération des organes lymphoïdes. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite seront mises à mort avec une méthode reglementaire.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent à la production d’anticorps ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro.
Réduction
Des expériences préliminaires seront réalisées pour établir les paramètres optimaux, le nombre de cellules, ou encore les doses d’immunosuppresseurs. Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs. Les procédures dites « pilotes » permettront d’établir les conditions / protocoles optimaux pour les procédures suivantes, afin de réduire égaiement le nombre de groupe. Les groupes controles comporteront 3 animaux alors que les groupes experimentaux seront de 5 ou 10 selon les procédures. (10 animaux pour les groupes d’interet, 5 pour les groupes controles). Nous prévoyons des duplicats experimentaux pour valider la reproductibilité des transferts de cellules, cellules qui sont au préalable modifiées, ce qui peut augmenter la variabilité des transferts adoptifs de cellules thérapeutiques. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 480 souris (mus musculus). Les analyses statistiques se feront par un test non paramétrique de mann -whitney.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement aspect general). Les douleurs attendues dans ce protocole sont anticipées et devront etre évitées grâce à l’administration d’analgésiques lors des gestes tels que greffe de peau ou prélèvements, les points limites ont tout de même été définis afin d’intervenir en cas de nécessité. Différents traitements seront administrés : anesthésie gazeuse pour l’injection intraveineuse des cellules et la greffe de peau et pour le suivi du greffon . Analgésie (morphinique) pour la greffe de peau, local pour les prélèvements sanguins. Pesée hebdomadaire, et fréquence augmentée à 2 fois par semaine si perte de poids > 10%. La taille du greffon cutané, couleur, necrose seront des indicateurs de la perte de greffe et l’infection éventuelle du greffon sera considéré comme point limite. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement (Si un animal prend pour habitude de retirer les bandages de ces congenères, alors cet animal sera isolé, de meme s'il présente des signes d'agressivité sur les autres souris.)
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire allogénique, c’est-à-dire entre souris de fond génétique différent. Notre projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiés précédemment développés et disponibles présentant des défauts immunitaires plus ou moins importants. De tels modèles n'existent que dans l'espèce souris. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature capable de répondre aux vaccinations. Il n'y a pas de variabilité liée au sexe attendue dans ces protocoles. Mais pour éviter les rejets liés à l’antigène mineur d'histocompatibilité sexuel (HY), toutes les souris donneuses utilisées seront des femelles. Les receveuses pourront être des mâles ou des femelles.
Biodistributions nouveaux de vecteurs radiomarqués sur des modèles tumoraux de souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et une injection intraveineuse de produits radiomarqués, puis une imagerie sous anesthésie et un prélèvement sanguin terminal, pour étudier la distribution de nouveaux radiopharmaceutiques anticancéreux. Le porteur décrit l'arme du projet comme le radioélément destiné à détruire la cellule tumorale et affirme n'attendre aucune douleur. Il indique qu'aucune méthode alternative n'existe à ce jour pour cette pathologie complexe.
Objectifs
L’objectif de notre projet est de développer de nouveaux traitements contre le cancer. Divers radiopharmaceutiques élaborés par notre équipe serons testés : nous disposons de différents vecteurs et de différents radioéléments. La cible à détruire est la cellule tumorale, l’arme est le radioélément qui va émettre un rayon «toxique» pour cette cellule. Le radioélément est lié à un vecteur spécifique de la tumeur afin de former un radiopharmaceutique, qui doit cibler et détruire la tumeur, tout en minimisant l’impact sur les tissus sains. L’objectif de l’étude de la biodistribution de nos radiopharmaceutiques est d’appréhender leur distribution dans l’organisme au cours du temps.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre le développement de nouveaux radiopharmaceutiques ciblant les tumeurs, utilisables soit en thérapie soit en imagerie.
Procédures
810 souris vigiles reçoivent une injection sc de cellules tumorales (100µl) : douleur légère Ces mêmes souris vigiles reçoivent une injection iv de radiopharmaceutique dans la veine latérale de la queue : douleur légère. Puis elles sont anesthésiées sous isoflurane pour 10 minutes d’imagerie (dans cellule d’imagerie chauffante avec du gel de protection occulaire), sans douleur. A la fin de la cession d’imagerie les souris endormies subissent un prélèvement sanguin (200µl) dans le sinus orbital puis sont mises à mort. L'ensemble de la procédure durera 2 semaines à 3 semaines et demi. (pousse tumorale 2 à 3 semaines, biodistribution du traceur 72h maximum, imagerie 10 minutes).
Impact sur les animaux
Ce projet ne devrait pas engendrer de douleur. La procédure 1 : greffe de tumeur en sous cutané n’entraine pas de douleur. On ne laisse pousser la tumeur que jusqu’à 100mm 3 (équivalent d’un petit kyste sur le flanc qui n’entraîne pas de gène ni de douleur). La procédure 2 d’injection du radiopharmaceutique en iv pour la biodistribution n’est pas douloureuse. Enfin la procédure 3 d’imagerie TEP/CT sous anesthésie gazeuse et lit chauffant est sans douleur. Le prélèvement sanguin terminal est fait sur souris endormies et analgésiées avant leur mise à mort.
Devenir
Les 810 souris de la procédure 1 (greffe de cellules tumorales) sont toutes gardées en vie pour la procédure 2 (injection du radiopharmaceutique) et la procédure 3 (imagerie de la biodistribution du radiopharmaceutique injecté). Il s’agit des 3 étapes nécessaires pour quantifier la distribution du radiopharmaceutique dans la tumeur et les différents organes des souris.
Remplacement
Remplacer : la pathologie cancéreuse étant une pathologie complexe, il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives à l’expérimentation animale
Réduction
Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. L’apport de l’imagerie permet de réduire le nombre de souris utilisées. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism.
Raffinement
L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par trois, avec des frisotis pour pouvoir faire un nid. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé. Par ailleurs, les animaux seront anesthésiés pendant la procédure 3.
Choix des espèces
Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. De plus, de nombreux modèles de tumeurs syngéniques ont été développés chez la souris. Par ailleurs, l’existence de souches de souris immunodéprimées permet de développer des modèles de tumeurs à partir de cellules humaines. Les souris sont utilisées à 7 semaines, au stade jeune adultes.
Ciblage spécifique de cellules de la rétine à l’aide du système CRISPR Cas9 et évaluation d’une immunité dirigée contre la protéine Cas9 pour la maladie de Stargardt.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
142 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 132 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections sous la rétine ou dans le vitré des deux yeux sous anesthésie, une imagerie rétinienne répétée et des prélèvements sanguins, avant une ponction intracardiaque terminale, pour tester une édition génique CRISPR-Cas9 contre la maladie de Stargardt. Le porteur indique aussi que le projet sert à mettre au point des gestes techniques et à valider les compétences des personnels. Il affirme qu'il est impossible de reconstituer la rétine in vitro.
Objectifs
Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les plates-formes les plus performantes pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. Parmi les différents sérotypes d’AAV connu, le sérotype AAV2/8 avec les ITRs d’AAV2 encapsidés dans la capside d’AAV8 montre une grande efficacité en termes de tropisme et de niveau d’expression dans les photorécepteurs de la rétine. Par ailleurs, les vecteurs AAV pouvant donner lieu à une réponse immunitaire suite à une pré-exposition au virus, nous souhaitons également tester les nanoparticules lipidiques (LNP) afin de délivrer la nucléase Cas9. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel d’une stratégie d’édition génique en ciblant l’intégration d’un minigène correctif dans un site de coupure d’ADN double-brin induit par la nucléase Cas9. Ce minigène permet la correction des mutations du gène ABCA4 qui impactent le fonctionnement de la protéine ABCA4, transporteur essentiel pour le métabolisme des rétinoïdes dans les photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. Avec une preuve de concept déjà établie in vitro et avec des résultats préliminaires in vivo, la valeur thérapeutique de cette approche est réalisable. L’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. Pour cela, les praticiens et concepteurs en recherche sur la cécité doivent acquérir les compétences nécessaires à la réalisation de leurs projets de recherche impliquant des animaux selon la Directive Européenne (arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques). C’est dans ce cadre que nous souhaitons mettre au point les techniques d’injections sous rétinienne et intravitréenne sur le modèle rat. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce.
Bénéfices attendus
L’immunogénicité de la protéine Cas9 a été décrite dans quelques études. Il est cependant à noter qu’en transfert de gène, plusieurs facteurs peuvent influencer l’initiation d’une réponse immune ; parmi eux, la dose de vecteur, la nature du transgène ou encore la voie d’administration. Dans cette étude, le but est d’étudier la présence d’une réponse immune après transfert de gène dans l’œil qui est un site décrit comme immunoprivilégié et ce, à une dose cliniquement pertinente. Concernant la détection d’une réponse immune dirigée contre la protéine Cas9, les techniques d’analyse décrites dans la littérature ne sont pas standardisées et aucun kit n’est, à ce jour, commercialisé. Notre étude permettra d’établir un protocole adéquat pour la détection de la réponse immune anti-Cas9. De plus, l’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. L’évaluation in vivo de notre stratégie d’édition génique nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. En effet, l’utilisation d’un minigène codant plusieurs exons à la fois, si efficace, permettra de corriger une large partie du gène, ce qui sera utile pour de nombreux patients, même avec des mutations différentes. Enfin si notre approche se révèle efficace, elle pourrait être utilisée pour soigner les pathologies liées à d’autres gènes de la famille ABCA.
Procédures
Phases 1 et 2 : (i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 à 3 µL injectés dans les 2 yeux des animaux, durée de la chirurgie 30 minutes maximum. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis une fois par mois, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’examen 20 minutes maximum. (iii) Imagerie rétinienne (ERG) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis avant l’euthanasie de l’animal, soit 2 fois au total. Durée de l’examen 30 minutes maximum. (iv) Prélèvements sanguins (Phase 2) : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection puis toutes les deux semaines post-injection, soit au maximum 7 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. Phase 3 (v) Injection sous cutanée de 50μg de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund : Geste réalisé sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vi) Injections en intramusculaire : 1 semaine après l’injection SC. Geste réalisé sous anesthésie générale, 200μL de vecteur en 4 sites d’injection, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vii) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection SC, soit une fois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. (viii) Ponction intracardiaque terminale : Geste réalisé sous anesthésie générale avec renforcement analgésique. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
(i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : A ce jour, l’administration sous rétinienne de vecteurs AAV chez le rat n’a pas d’effet délétère notable sur la morphologie et la fonction rétinienne ni sur l’état de santé général de l’animal. Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection. Une pommade ophtalmique composée de dexaméthasone et d’oxytétracycline est appliquée à la suite de l’intervention pour minimiser l’irritation de la cornée. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT et ERG) : Aucune douleur n’est attendue lors des examens d’imagerie (non invasifs). En effet, afin que l’animal soit immobilisé, cet examen est fait sous anesthésie générale n’entrainant pas de stress ou de douleur que pourrait entrainer une contention physique de l’animal et permettant ainsi d'assurer une qualité optimale d'acquisition des images. (iii) Prélèvements sanguins : un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. (iv) Injection sous cutanée de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund et injections en intramusculaire : afin de limiter le stress de ces injections et que l’asepsie soit optimale, ces gestes seront réalisés sous anesthésie général de l’animal. Aucune douleur n’est attendue suite à ces injections. (v) Ponction intracardiaque terminale : Une ponction intracardiaque terminale sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux. De plus, les anesthésies répétées seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur, la récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie gazeuse ou recevront un réversif pour accélérer le réveil et la récupération de l’animal.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.
Remplacement
La rétine est une structure complexe composée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières. Il n’est pas possible de reconstituer parfaitement cet organe complexe in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire, nous utiliserons au maximum des animaux de réforme pour la phase 1. Nous avons calculé nos estimations sur les séances précédentes d’injections sous rétiniennes. D'après une revue des publications d'études similaires ainsi que l’expérience du laboratoire notamment sur la reproductibilité des ERG, 8 animaux par groupe seront suffisants pour réaliser des analyses statistiques pertinentes (comparaison des groupes à l’aide d’un test non paramétrique ‘one-way ANOVA’). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales. Nous ne pouvons pas raisonnablement supposer que les données seront normalement distribuées, par conséquent, nous pensons essentiellement utiliser des tests statistiques de type Mann-Whitney U pour analyser les données générées par l’expérience. Pour réduire le nombre d’animaux au minimum nous avons mis en place des mesures pour limiter la variabilité des données, y compris l’effet de la lumière. La luminosité est normalisée entre toutes les cages (mesurée par luxmètre chaque semaine). La détermination du nombre d’animaux pour l’évaluation de l’immunogénicité de Cas9 a été réalisée par approche statistique et sur la base de l'expérience d'études similaires en thérapie génique des maladies de la vision. Une analyse de puissance été effectuée avec le logiciel R et le package pwr en utilisant l'écart-type que nous observons dans les mesures d’ERG chez nos rats WT. De là, nous avons sélectionné une taille d’échantillon n=8 animaux/lot comme maximum.
Raffinement
Les études antérieures de notre équipe ont été faites sur d’autres modèles pour des études précliniques. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce. Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie
Choix des espèces
Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt : la lignée, issue de rats Sprague Dawley, que nous utilisons ici, a été créée par la technologie de CRISPR/Cas9. Cette technologie nous a permis de produire, lors du même projet de transgénèse, des rats « knock-out » pour ABCR4 (ABCR-/-). Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. L'augmentation du niveau de bis-rétinoïdes est mis en évidence dès l'âge de 3 mois et augmente avec l'âge comme le montrent nos résultats préliminaires par HPLC et spectrométrie de masse. Il semble donc pertinent de commencer le traitement entre l'âge de 2 et 3 mois : à cet âge le risque de décollement de la rétine est faible et on se situe dans la fenêtre thérapeutique. Pour l’évaluation de la réponse immunitaire, nous souhaitons évaluer celle-ci sur des animaux ayant un système immunitaire mature, donc sur des rats adultes de 3 mois.
Apport de la thérapie génique pour traiter les déficits visuels, auditifs et d’équilibre dans des modèles murins du syndrome de Usher de type 1B
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
5 694 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 954 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 620 un niveau léger et 120 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections dans la cochlée ou sous la rétine sous anesthésie, puis des tests auditifs, des tests d'équilibre (rotarod, suspension par la queue, nage) et des électrorétinogrammes, pour évaluer une thérapie génique contre le syndrome de Usher. Le porteur indique que les souris déficientes présentent surdité et troubles de l'équilibre et n'attend aucune aggravation. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit le fonctionnement de la rétine et de l'oreille interne.
Objectifs
Le syndrome de Usher de type 1B (USH1B), causé par une mutation dans le gène MYO7A, représente plus de la moitié des formes héréditaires de surdicécité. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour prévenir et/ou corriger les déficits sensoriels responsables de ces atteintes auditives et visuelles. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner ces déficits. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une telle approche dans des modèles murins du syndrome de Usher de type 1B (USH1B). Nous testerons deux stratégies de transfert de gènes (via des vecteurs viraux ou via des liposomes) dans des souris génétiquement modifiées (déjà créées ou à créer, mâles et femelles, nouveau-nés et adultes).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables des pertes visuelles et auditives décrites dans le syndrome de Usher de type 1B et de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder la maladie. A court terme : - L’utilisation de souris humanisées nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la maladie dans les cellules sensorielles de la rétine et de l’oreille interne. - L’injection des formes courtes de la Myosine 7A (mini-MYO7A) nous permettra de mieux comprendre le rôle des différents domaines constituant la Myosine 7A et leur implication dans le syndrome de Usher de type 1B. - Nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour exprimer la protéine non mutée ou réparer la protéine mutée et déterminerons l’efficacité de la thérapie génique dans la correction des troubles auditifs, vestibulaires et visuels chez des souris porteuses de mutations dans le gène Myo7A. A long terme : Nous espérons avec ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques et qui permettront de prévenir ou retarder la cécité et la surdité chez les patients atteints du syndrome de Usher de type 1B. Ceci inclut : - la découverte d’un mini gène fonctionnel et prêt pour de potentiels essais cliniques, - la mise en évidence d’approches nouvelles pour le transfert de gène non viral, - la mise en évidence de l’efficacité in vivo de l’édition de gène pour la correction de mutations spécifiques, Les méthodes que nous allons développer pourraient permettre de traiter d’autres maladies affectant des gènes de grande taille.
Procédures
Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections intracochléaires ou à des injections sous-rétiniennes. Ces injections se feront sous anesthésie gazeuse et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes. Tests auditifs : Les souris injectés au niveau de l’oreille interne seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à 1, 2 et 3 mois. Les souris seront anesthésiées par voie intrapéritonéale puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Les potentiels auditifs évoqués seront enregistrés à l’aide d’électrodes sous-cutanées placées à proximité du nerf facial. Les produits de distorsion des oto-émissions acoustiques seront enregistrés à l’aide d’une sonde placées à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront également soumises à des tests comportementaux destinés à évaluer leur fonctions vestibulaires. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système de vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera quantifié à l’aide d’un système rotarod (31 minutes) et d’un test de maintien sur une plateforme surélevée (2 minutes). Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à un test de suspension par la queue (15 secondes) et par un test de retournement (15 secondes). Un test de nage sera finalement réalisé (30 secondes) avant le retour en cage d’hébergement. Tests Visuels : Les souris injectées au niveau de la rétine seront soumises à des électrorétinogrammes (ERG) entre 2 et 11 mois post-injection. Elles seront placées à l’obscurité 3 heures avant leur anesthésie par voie intrapéritonéale, puis exposées à de brefs flashes lumineux d’intensité croissante. Les réponses électriques générées par les photorécepteurs et neurones rétiniens seront enregistrés à l’aide d’électrodes placées sous les paupières. Des ERG seront également réalisés entre 0 et 60 minutes après désensibilisation à la lumière (exposition de 3 minutes à une intensité lumineuse déterminée). Prélèvement d’organes : Les tissus seront récupérés post-mortem.
Impact sur les animaux
Les souris déficientes en myosine VIIa (souris shaker-1) sont atteintes de surdités et présentent des troubles de l’équilibre. Les déficits visuels sont peu marqués et ne provoquent aucun changement comportemental. Les nouvelles lignées de souris que nous souhaitons créer pourraient présenter des phénotypes similaires. Aucune aggravation de phénotype n’est attendue pour ces nouvelles lignées de souris déficientes en Myosine-7a. Les injections intracochléaires et sous-rétiniennes seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue, hormis un risque limité de cataracte. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté Myo7a contribuera à rétablir les fonctions d’équilibre voire l’audition des souris injectées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car ne pouvant être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Nous ne disposons pas à ce jour de système in vitro capable d’intégrer les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de la rétine ou de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus visuel ou mécanique par les photorécepteurs ou les cellules ciliées sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux cellules ganglionnaires de la rétine ou aux neurones spiraux de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. Le modèle animal demeure donc le seul outil disponible pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la cécité ou la surdité et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs ou curatifs.
Réduction
Afin de déterminer le nombre minimum d’individus par groupe expérimental, nous avons retraité les données issues de souris normales et mutantes avec un outil statistique. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel. Selon la taille et la distribution des échantillons, nous utiliserons différents tests paramétriques ou non paramétriques. Pour certaines procédures, les mêmes animaux seront utilisés pour nos tests comportementaux et auditifs, puis mis à mort pour collecte des tissus.
Raffinement
Un igloo et des copeaux de carton seront ajoutés dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification. Nous renforcerons l’enrichissement des cages hébergeant des souris présentant un trouble de l’équilibre, par l’ajout de deux tubes en carton et de bâtonnets en bois. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’œil et de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Ces modèles, complétés de ceux que nous souhaitons créer, vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections sous-rétiennes se feront sur des animaux âgés de 30 jours, soit à un stade où l’espace sous-rétinien est bien formé. Les injections intracochléaires se feront sur des souris âgées de 1 jour, soit à un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. La mise à mort se fera entre 6 jours et 11 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long terme d’une correction génique.
Travaux Pratiques d’introduction à l’expérimentation animale et de physiologie animale
- Enseignement supérieur
Rats : 140
70 souris et 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, les souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et les rats dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Les souris servent à des étudiants pour apprendre la contention et une injection de sérum physiologique, les rats sont opérés sous anesthésie avec pose d'une canule dans la trachée et de cathéters dans la jugulaire et la vessie, pour des mesures de ventilation et de diurèse. Le porteur indique que le règlement de l'animalerie interdit toute réintroduction et que les corps sont congelés pour des travaux pratiques de dissection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive satisfaisante ne remplace ces séances.
Objectifs
Dans le cadre de notre formation universitaire, régi par un programme pédagogique national, nos étudiants sont amenés à "mettre en oeuvre les techniques d'expérimentation animale pour mieux comprendre le fonctionnement, la physiologie des systèmes/appareils des organismes animaux. Ils doivent ainsi acquérir les compétences suivantes: 1) Manipuler les animaux de laboratoire; 2) Respecter la réglementation, les règles de la bioéthique; 3) Maîtriser les techniques liées à l’expérimentation animale utilisées en physiologie animale. Ces compétences de base doivent leur permettre ensuite de mettre en œuvre les techniques d'expérimentation animale pour des études de toxicologie, de pharmaco-cinétique, ou encore des études du métabolisme.
Bénéfices attendus
Ces TP sont extrêmement importants dans le cursus de ces étudiants. La formation doit les amener à être directement opérationnels en laboratoire de recherche. Cette première approche permet ainsi de les confronter à la réalité de l’expérimentation animale, et de les sensibiliser au respect absolu de la réglementation, en particulier aux procédures de raffinement. Ils permettent de lever l’appréhension d’un certain nombre d’étudiants et de les conforter ou non dans leur désir de travailler sur l’animal et de s’engager dans cette démarche. Le 1er TP d'introduction au semestre 1 (sur la souris) leur permet d’aborder plus sereinement les TP de physiologie (sur le rat) qui ont lieu au semestre 2. Le résultat pédagogique est extrêmement satisfaisant, car les étudiants sont extrêmement impliqués et se montrent transformés (positivement) entre le début et la fin des TP. Les TP du semestre 2 représentent une réelle "plus value" pour nos étudiants qui peuvent être amenés à manipuler des animaux dans leurs fonctions ultérieures. Le retour des étudiants est unanime.
Procédures
Dans le cadre du TP d'introduction à l'expérimentation animale, les souris seront manipulées par les étudiants dans un premier temps pour se familiariser avec l'animal de laboratoire (30 minutes à 1 heure), puis pour apprendre la contention de base (1 heure à 1h30), mais également pour réaliser une injection sous cutannée ou intrapéritonéale de sérum physiologique (30 minutes). Dans le cadre des TP de physiologie animale, les rats seront manipulés selon une procédure d'anesthésie sans réveil. Différentes procédures seront menées sur ces animaux : pose d'une canule dans la trachée (30 minutes), pose d'un cathéter dans la veine jugulaire (1 heure), et pose d'un cathéter dans la vessie (30 minutes). Concernant le TP sur la ventilation, le protocole de mesure de la ventilation est ensuite estimé à environ 20 minutes maximum. Concernant le TP sur la diurèse et la pression artérielle, le protocole de mesure est ensuite estimé à environ 1 heure maximum. Dans tous les cas, aucun prélèvement ne sera effectué.
Impact sur les animaux
Concernant le TP d'introduction, hormis un stress lié à la manipulation des souris pour l'apprentissage de la contention, aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu. Concernant les TP de physiologie, la buprénorphine peut entrainer une faible dépression cardio-vasculaire.
Devenir
Le règlement de l’animalerie interdisant la ré-introduction d’animaux après expérimentation, tous les animaux sont euthanasiés (dose létale de pentobarbital) à l'issue des TP. Une fois euthanasiés, les animaux sont congelés et utilisés ultérieurement pour des TP d’anatomie/dissection.
Remplacement
Il n’existe actuellement aucune méthode substitutive satisfaisante qui permettrait le remplacement de ces séances telles qu’elles ont été conçues pour préparer les étudiants à la réalité des procédures en laboratoire de recherche et au respect de la règle des 3R.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernés pour l’ensemble des cinq années et 28 étudiants pas promotion (partagés en 2 groupes de 14 étudiants) est de 210, dont 70 souris et 140 rats. En effet, dans le cadre du TP d’introduction, chaque année, 14 souris seront utilisées (une souris par étudiant), les souris du groupe du matin étant ré-utilisées pour le groupe de l’après-midi. Afin de réduire le nombre de rats (28/an contre 42/an précédemment), nous avons décidé de supprimer une séance de TP par rapport aux années précédentes. La saisine actuelle ne comprend par conséquent que 2 protocoles expérimentaux sur les rats, contre 3 les années précédentes. Ainsi, sur 5 ans, 70 rats de moins seront utilisés dans le cadre de cette formation. Par ailleurs, les animaux euthanasiés seront congelés et utilisés pour des TP d’anatomie/dissection.
Raffinement
La formation ne dispose pas d’animalerie. Nous utilisons donc l’animalerie de l’UFR dédiée à la recherche qui existe sur le site. Les animaux sont réceptionnés au minimum 5 jours avant chaque TP. Les animaux sont stabulés dans des cages ayant une surface de 410 cm2 et une hauteur de 12cm (souris) ou ayant une surface de 820 cm2 et une hauteur de 15cm (rats) contenant de la litière mélangée à du coton. Des "maisons dômes" en carton et des tunnels en plexiglass rouge sont ajoutés aux cages des souris et des rats, respectivement. Une surveillance quotidienne est effectuée par le personnel de l'animalerie. Il y a 4 souris ou 2 rats par cage, la température de l'animalerie est de 21°C +/- 2, la nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Une alternance jour/nuit de 12h est respectée. Dans le cadre des TP d’introduction/contention, chaque étudiant est invité à faire une démonstration de contention à l’enseignant. Si l’enseignant estime la contention réalisée correctement, il invite ensuite l'étudiant (uniquement dans le cadre du volontariat) à pratiquer une injection de sérum physiologique par voie sous-cutanée ou par voie intrapéritonéale sous le contrôle exclusif de l’enseignant habilité et formé aux gestes garantissant le bien-être des animaux. Dans le cadre des TP de physiologie animale, les rats seront anesthésiés avant l'arrivée des étudiants selon un protocole mis au point avec l'aide d'un vétérinaire. Une prémédication permet de réduire la dose du mélange anesthésique administré, mais aussi de rendre l’anesthésie plus facile et surtout permet une analgésie plus efficace, plus profonde, et plus longue. Au cours de la séance, si le rat montre des signes de réveil, l'injection d'une dose supplémentaire d'anesthésiant sera pratiquée par les enseignants.
Choix des espèces
Le rat et la souris seront utilisés lors des séances de travaux pratiques. Ces deux espèces mammifères ont une physiologie assez proche de l’homme. La souris sera utilisée pour les travaux pratiques sur l’apprentissage de la contention car c’est un petit animal facile à appréhender pour des étudiants n’ayant pas l’habitude de manipuler les animaux. Par ailleurs, nous avons choisi de réaliser ce TP avec des souris de souche OF1 ou Swiss réputées calmes et non agressives. Pour les autres TP le rat sera utilisé car il y aura nécessité de réaliser des procédures au niveau des abords veineux et la taille du rat est mieux adaptée. Les animaux ne sont pas identifiés. Ils seront utilisés à maturité sexuelle afin de ne pas avoir des animaux trop petits et faciliter les expériences. Les rats utilisés ne proviennent pas de notre animalerie qui n'est pas une animalerie d'élevage. Il s'agit d'anciens mâles reproducteurs (animaux de réforme). Concernant les souris, nous ne sommes pas en mesure d'utiliser des souris de réforme de notre animalerie pour plusieurs raisons. En premier lieu, l'animalerie n'est pas une animalerie d'élevage et n'est donc pas en mesure de fournir 14 souris de réforme à une date précise. Le responsable de l'animalerie pourra le confirmer. Par ailleurs, la quasi totalité des souris de l'animalerie sont de la souche B6, connue pour être nerveuse et agressive, ce qui n'est pas idéal pour un TP d'initiation à l'expérimentation animale, à la contention.
Urbanisation et réponse inflammatoire chez les oiseaux
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
480 poussins de mésange charbonnière vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis laissés au nid jusqu'à l'envol. Ils reçoivent une injection de LPS dans l'abdomen et deux prélèvements sanguins par ponction de la veine brachiale sur deux jours, pour comparer la réponse inflammatoire entre sites urbains et forestiers. Le porteur indique que la nichée n'est dérangée que quinze minutes au plus et que la dose de LPS reste sous le seuil d'une souffrance visible. Il précise avoir déjà appliqué ce protocole sur la même espèce sans compromettre l'envol.
Objectifs
Les villes sont le lieu d’implantation souvent spontanée d’un nombre croissant d’espèces animales et végétales. L’habitat urbain impose portant aux organismes des contraintes environnementales très contrastées par rapport à leur habitat naturel d’origine, dans lequel elles ont évolué. La quasi disparition des milieux naturels, les pollutions sonores et lumineuses sont parmi les marqueurs les plus évidents de l’environnement urbain qui exerce donc des pressions écologiques a priori singulières sur les populations naturelles. Ces pressions impactent un grand nombre de facettes du phénotype des individus et de nombreux travaux montrent que le comportement, la morphologie ou certaines fonctions physiologiques des organismes sont affectés, de même que leur reproduction qui apparait moins dynamique par comparaison avec ce qui est observé en milieu naturel. L’immunité est une fonction majeure pour maintenir l’intégrité des organismes. Son rôle est prioritaire dans les interactions hôtes-pathogènes, et une modification de son expression sous l’effet de l’anthropisation des écosystèmes (dont l’urbanisation est un extrême) peut impacter les espèces, et également influencer la circulation d’agent infectieux. Lors d’un travail précédent sur la Mésange charbonnière (un oiseau forestier devenu très commun en ville), nous avons montré que la réponse inflammatoire était négativement affectée par l’habitat urbain par rapport à l’habitat forestier. L’objectif de ce projet est de retravailler une comparaison de la réponse inflammatoire chez cette espèce, mais à partir de 4 paires de sites villes/forêt situés dans 4 zones géographiques et des contextes biogéographiques différents (Strasbourg, Dijon, Toulouse, Montpellier). Nous comparerons donc la réponse inflammatoire des poussins au nid de mésanges charbonnières, entre un site urbain et un site forestier de référence, pour chacune des 4 zones géographiques mentionnées plus haut.
Bénéfices attendus
Nous proposons de tester l’influence de l’habitat urbain sur une composante de l’immunité chez une espèce d’oiseaux d’origine forestière et bien implantée en ville. L’ambition est de voir si les premiers résultats obtenus sont généralisables. Si nous détectons une réponse immunitaire plus faible en milieu urbain, cela ne permettra pas d’inférer sur le processus impliqué (« simple » impact d’un environnement difficile, réponse plastique ou/et adaptive des organismes à une modification des bénéfices et des coûts associés à l’immunité relativement à d’autres fonctions biologiques et à un risque environnemental propre à la ville ?). Mais cela permettra d’appréhender la sensibilité des populations urbaines au risque infectieux qui peut rapidement changer, avec des conséquences possible sur le statut des populations urbaines et leur rôle potentiel de réservoir à pathogènes dans des zones par définition densément peuplées par les humains.
Procédures
Les oiseaux seront l’objet d’une injection intrapéritonéale de 0.01 mg de LPS (soit en moyenne 0.06g/Kg) dilués dans 50 µl de PBS et de deux prélèvements sanguins sur deux jours, par effraction de la veine brachiale à l’aide d’un aiguille stérile 27G.
Impact sur les animaux
Deux effets indésirables sont en principe envisageables. La première est le dérangement de la nichée. Avant l’âge de 15 jours, les poussins qui sont déjà emplumés ne risquent pas de quitter prématurément le nid avec une faible aptitude au vol et une très faible probabilité de survie à très court terme. Par contre, l’activité de nourrissage des parents est interrompue. Les opérations réalisées sont organisées de manière à minimiser cela à quelques minutes (15 au plus) ce qui est sans conséquence dans la mesure où les parents reprennent leurs activités dès que l’observateur s’éloigne un peu du nichoir. La deuxième est l’inconfort lié à l’injection de LPS, mais la dose injectée est minimisée de manière à déclencher une réponse inflammatoire sans générer de syndrome comportemental signalant une souffrance. De nombreux travaux réalisés (et notre propre expérience) montrent cela. De plus, à dose équivalente, les oiseaux apparaissent moins affectés par une injection de LPS que les mammifères. Enfin, les poussins ne sachant pas voler et n’étant pas très habiles dans leurs mouvements, leur manipulation ne nécessite pas de contention particulière ce qui évite ou en tout cas réduit fortement les nuisances potentiellement associées à la manipulation. Notons que nous avons déjà appliqué un tel protocole il y a plusieurs années sur la même espèce sans que cela ne compromette la fin du séjour au nid et l’envol des poussins traités.
Devenir
Après la procédure expérimentale, les poussins sont laissés libres au sein de leur nichée (qu’ils n’ont pas quitté) pour poursuivre leur séjour au nid jusqu’à l’envol.
Remplacement
L'objectif étant de tester un phénomène en population naturelle, sous action de ensemble de facteurs environnementaux, les modèles de laboratoire et les modèles in vitro n’offrent pas les conditions favorables à la poursuite de cet objectif.
Réduction
Pour chaque site, nos nichoirs hébergent près d’une centaine de nichées de Mésange charbonnière, ce qui au total conduit à 800 nichées potentiellement utilisables. Chaque nichée comptant en moyenne 6 à 7 poussins, cela donne un effectif total d’au moins 4800 poussins. Avec au total 480 poussins (240 contrôles et 240 traités LPS) inclus dans l’expérience, nous appliquons une démarche de réduction à partir des deux leviers suivants : Quatre poussins (2 LPS et 2 PBS) sélectionné au hasard sont inclus dans l’expérience. Deux poussins par traitement par nichée représentent le minimum pour apprécier la variabilité intra-nichée qui a du sens d’un point de vie biologique et statistique. Quinze nichées dont la phénologie sera décalée dans le temps afin de manipuler au plus 2 nichées par site/jour représentent l’effectif calculé pour en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour la fiabilité des résultats.
Raffinement
Plusieurs choix de protocole relèvent d’une démarche de raffinement en plus du fait bien sûr que les poussins resteront au sein de leur nichée durant l’expérience. Au-delà du processus aléatoire de sélection des nichées expérimentales, les nichées contenant des poussins visiblement affaiblis ou/et chétifs pour leur âge (chose parfois observée) ne seront pas retenues pour l’expérience. Seuls des poussins ne présentant pas de signes d’affaiblissement seront donc inclus. L’âge (13/14 jours) auquel les poussins seront manipulés est suffisamment avancé pour qu’ils soient bien développés (thermorégulation effective, corps totalement couvert de plumes, masse très proche de la masse adulte, croissance osseuse quasi achevée) et supportent donc aisément les traitements, mais pas trop pour que la contention soit sans effort ni dispositif particulier. Les injections (LPS/PBS) et premiers prélèvements sanguins auront lieu en fin de journée, entre 18h et 20h, et les seconds prélèvements sanguins auront lieu 14h plus tard, donc entre 6h00 et 8h00. Ainsi, l’exposition au traitement dont l’action est courte aura lieu essentiellement pendant la phase nocturne, période naturellement sans activité (nourrissage ou autre). Les poussins inclus dans l’expérience seront traités les premiers au sein de leur fratrie. Les quelques minutes nécessaires à la manipulation du reste de la fratrie (pour baguage et mesures morphométriques) permettront de vérifier leur comportement (tonicité, « activité » avant de refermer le nichoir et de laisser les activités de la famille reprendre leur cours. Pour minimiser la durée de dérangement par poussin (maximum 15 minutes), la moitié de la nichée est retirée du nichoir (qui est refermé ensuite) et emmenée dans un véhicule climatisé situé à quelques dizaines de mètres. Cela permet (i) aux adultes de poursuivre très vite leur activité de nourrissage auprès de l’autre moitié de la nichée restée dans le nichoir, et (ii) de manipuler les poussins dans de bonnes conditions protégées des aléas extérieurs. Une fois manipulée, la première moitié des poussins et replacée dans le nichoir alors que la seconde moitié est retirée pour être à son tour manipulée (baguage, mesures) dans les mêmes conditions puis remise en place. Ainsi, l’interruption des activités des adultes au nichoir est réduite à quelques minutes et chaque poussin ne se trouve pas dans des conditions perturbées au-delà de 15 minutes.
Choix des espèces
La Mésange charbonnière représente une espèce d’oiseau modèle assez classique pour les études en populations naturelles car c’est une espèce très commune qui accepte volontiers les nichoirs artificiels. Comme la plupart des espèces d’oiseaux elle n’affiche supporte très bien les interventions des observateurs sur les nichées, sans risque de désertion pour peu que certaines règles de base soient respectées (en particulier, pas de capture des adultes au nid lorsque les poussins ont moins de 7 jours). Enfin, cette espèce d’origine forestière a colonisé les villes où elle est très abondante également ce qui offre la possibilité d’une comparaison entre populations urbaines te populations forestières. Les individus utilisés seront des poussins de 13/14 jours. A ce stade, les poussins seront suffisamment âgés pour être bien développés (thermorégulation effective, corps totalement couvert de plumes, masse très proche de la masse adulte, croissance osseuse quasi achevée, …), mais pas trop pour que la contention soit sans effort ni dispositif particulier et pour qu’ils risquent de quitter prématurément le nid suite à l’intervention.
Etude de l’impact d’un régime riche en gras et en sucre sur des rats à des fins d’enseignement en travaux pratiques.
- Enseignement supérieur
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent pendant huit semaines un régime riche en gras et en sucre pour induire un surpoids, sont mis à jeun, anesthésiés puis tués afin de prélever sang et organes pour des travaux pratiques d'étudiants. Le porteur qualifie l'expérience de peu douloureuse et affirme que la simulation n'est pas une alternative efficace pour la formation. Il revendique la "nécessité" de l'expérimentation animale en recherche.
Objectifs
Le projet consiste à faire prendre du poids à des rats en leur donnant plus de sucre et de gras qu'ils n'en ont besoin pour vivre, afin de mimer ce qu'on observe dans l'obésité chez l'homme. Le poids des rats est suivi chaque semaine le temps de l'expérimentation. Les effets du surpoids sur le métabolisme de ces rats seront étudiés par des étudiants grâce à des analyses biochimiques lors de leurs travaux pratiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet d'expérimentation animale sont multiples tant sur le plan de l'enseignement que de l'expérimentation en elle-même. Tout d'abord c'est le seul et unique projet impliquant ce type d'expérimentations lors des trois années de formationdes étudiants (80% des leurs autres TP ne font pas appel aux animaux/expérimentation animale). Les modèles animaux sont utilisés en recherche et sont pertinents pour étudier l'impact de l'alimentation sur la santé. On leur enseigne cet aspect là de la recherche et les analyses associées lors ce TP . De plus ils approfondissent et mettent en pratique des notions vues en cours. Les étudiants s'intéressent aux projets qui ont un sens et pour lesquels une problématique claire est annoncée (lien direct avec la santé humaine). Ils ne vont donc pas seulement faire des dosages mais verront les marqueurs dosés être modifiés et devront analyser cette variation et faire des recherches pour comprendre pourquoi ils évoluent. Nous avons choisi ce régime riche en graisses et en sucre (High fat High Sugar HFHS) car la thématique est abordée en cours (métabolisme des glucides, des lipides, stress oxydant, physiologie de la digestion, phyiologie cardiaque, physiologie hépatique...), et cette pratique n'est pas douloureuse pour les animaux. Ce projet d'expérimentation animale permettra de générer des tissus pour plusieurs années de travaux pratiques (réduction du nombre d'animaux utilisés). Pour résumer les étudiants bénéficieront d'une initiation à l’utilisation de modèle animaux pour tester les effets de l’alimentation sur la santé, à l'étude du métabolisme glucidique et lipidique (analyses associées), à la mise en place d’analyses à partir d’un protocole, à l'acquisition de compétences techniques (pipetage, préparation de tampons, de solutions à pH contrôlé ou non, mise pratique d’expériences à partir d’un protocole), à la mise en forme des résultats, à l'analyse des résultats, au traitement statistique, à la discussion critique des résultats et à la recherche bibliographique associée. Et grâce à une seule expérimentation peu douloureuse/invasive pour les animaux nous pourrons mettre en place ce TP pendant 4 années universitaire. Cette expérience animale ayant déjà été réalisée auparavant, nous savons que la prise de poids (bien que limitée) est significative chez les rats HFHS, et que les marqueurs proposés sont significativement modifiés grâce au régime HFHS.
Procédures
Les animaux seront alimentés avec une nourriture riche en gras et en sucres pendant 8 semaines. A la fin du protocole ils seront anesthésiés avant mise à mort pour prélèvement de sang et organes à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
Le régime riche en sucre et gras fera prendre du poids aux animaux et pourrait les rendre diabétiques (raremant sur une durée de 2 mois). La mise à jeun des animaux la veille du prélèvement pourrait être inconfortable pour les animaux. L'injection de l'anesthésique peut créer un stress pour les animaux.
Devenir
La veille de la fin de l'étude les animaux ne recoivent plus de nourriture. Le lendemain ils sont anesthésiés et mis à mort pour prélèvement de sang et des organes pour faire les travaux pratiques.
Remplacement
Les travaux pratiques ont été modifiés depuis quelques années. La plupart des TP nécessitant des animaux ont été remplacée soit par des modèles in vitro (exemple modélisation de la digestion in vitro, modèles cellulaires, analyse de données et bibliographie, enquêtes diététiques sur les étudiants eux-mêmes...). Les modèles animaux sont utilisés en recherche car nous connaissons leurs caractéristiques physiologiques et leur fonctionnement bien connu permet de mimer ce qui se passe chez l'homme. L'utilisation de l'expérimentation animale que nous pensons nécessaire en recherche, et qui donc doit être vue lors de la formation d'étudiants appliquée à la nutrition, a été réduit à une part minime. La modélisation quand elle est possible et concrète (impliquant des dosages biologiques) est intéressante; Par contre l'utilisation de la virtualisation et la simulation n'est pas une alternative efficace pour la formation des étudiants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude permet de faire l'étude seulement une fois tous les 3-4 ans et d'optimiser l'analyse des résultats obtenus par les étudiants. Le nombre d'animaux est donc relativement important (24 rats au total) pour une expérimentation mais cette expérimentation au lieu de se dérouler chaque année, se déroule une fois tous les 3-4 ans. Ce qui diminue de ce fait le nombre d'animaux et engendre une optimisation d'utilisation des tissus récoltés.
Raffinement
les animaux traités par le régime HFHS ont un suivi pondéral régulier et un changement de litière adapté en fonction de leurs besoins Les animaux sont anesthésiés pour éviter toute douleur à la fin de l'étude avant la mise à mort.
Choix des espèces
Les rats sont couramment utilisés pour développer des modèles d'obésité/maladies métaboliques grâce aux régimes riches en en graisses et en sucres, sujets développés en cours et lors du TP en question. Les mâles sont utilisés car le statut hormonal peut faire varier la réponse au régime HFHS. La même chose aurait pu être faite sur des femelles. Les mâles sont souvent retrouvés dans les études publiées . Tous les marqueurs qui seront étudiés en travaux pratiques sont fréquemment dosés et étudiés lors de divers travaux publiés sur l'impact d'une alimentation trop grasse et sucrés en santé humaine. En tant qu'enseignants nous avons donc des sources fiables auxquelles nous référer pour construire nos TP et les étudiants eux pourront après formation faire une bibliographie pertinente pour analyser les données lors des TP. Le rat est une espèce utilisée en laboratoire pour la recherche fondamentale et aussi appliquée en industrie. La formation aux techniques utilisées en laboratoire de recherche (publique/privé) fait partie intégrante du cursus des étudiants.
Evaluation des effets des champs électromagnétiques sur la thermorégulation selon les conditions d’expositions à différents âges chez des rats mâles et femelles
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
432 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés à un champ électromagnétique de type 5G deux heures par jour pendant une à trois semaines, avec des mesures non invasives de température de la queue et de prise alimentaire, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie. Le porteur cherche des effets sur la thermorégulation à différents âges et déclare n'avoir observé aucun effet indésirable notable lors d'expositions antérieures. Les retombées annoncées, revoir la législation ou "rassurer la population", restent conditionnelles et lointaines.
Objectifs
Depuis novembre 2020, les opérateurs ont l’autorisation d’émettre des champs électromagnétiques (CEM) de type 5G. Pour cela, en France, 3 bandes réparties entre les 4 opérateurs en 2020 pourront être utilisées, dont deux le sont déjà pour la 4G : 700 MHz et 2,1 GHz, auxquelles viendra s’ajouter la bande de 3,5 GHz. Au 1er novembre 2020, 54 000 sites d’émission contenant parfois plusieurs antennes étaient installés en France, soit 30 000 de plus qu’il y a 5 ans. L’extension de l’exposition à ces rayonnements pose la question des effets sanitaires, notamment au regard de la jeune population, qui pourrait présenter une vulnérabilité plus grande aux CEM en raison de la taille, l’immaturité tant cérébrale, que métabolique, endocrinienne ou immunitaire des enfants. Cette vulnérabilité anatomique conduit à ce que les ondes pénètrent plus profondément dans l’organisme d’un enfant que dans celui d’un adulte, majorant ainsi l’exposition. Il est donc important de rechercher si les expositions pourraient produire des effets susceptibles de se répercuter (voire s’accentuer) à l’âge adulte. Dans ce contexte, nous voulons tester si une exposition de type 5G induit des modifications physiologiques. Pour cela, nous étudierons les fonctions physiologiques pour lesquelles nous avons observé des modifications lors d’exposition à 900 MHz : la température cutanée de la queue et la prise alimentaire. Ainsi, dans ces précédents travaux, après 5 semaines d’exposition aux CEM de 900 MHz, les animaux présentaient une vasoconstriction périphérique et une prise alimentaire augmentée qui sont des réponses typiques au froid. Afin d’étudier les effets d’une exposition de type 5G à une intensité de 1,5 V/m (intensité estimée sur les bases des données d’exposition 4G), nous analyserons ces 2 fonctions physiologiques lors d’une exposition à 3,5 GHz en les comparant avec les résultats issus d’un groupe non exposé (groupe contrôle) et d’un groupe exposé à 900 MHz (groupe contrôle positif) lors de différentes durées d’exposition (d’une à trois semaines), à différents âges (3, 8 et 13 semaines) chez des animaux mâles et femelles. Au maximum, 432 animaux seront étudiés, répartis dans 54 groupes constitués de 8 animaux chacun.
Bénéfices attendus
Une précédente étude menée au laboratoire PériTox avait été une des premières études françaises à montrer des effets des CEM de faible intensité sur la régulation thermique. Cette étude avait été citée dans les rapports « Radiofréquences et santé » (ANSES, 2013) et « Radio Frequency fields: Environmental Health Criteria Monograph » (OMS, 2015). Pour ce projet à court terme, nous souhaitons développer la même stratégie en communiquant les résultats à une très large échelle auprès de la communauté scientifique (congrès scientifiques nationaux et internationaux, publication dans des revues scientifiques généralistes) et d’agences mandatées par l’Etat pour réaliser des expertises sur les avancées récentes des travaux sur les effets des CEM. A long terme, si des effets sont observés, nous espérons qu’ils permettront de revoir la législation et d’abaisser les valeurs limites d’exposition de la population. Au contraire, si aucun effet n’est observé, les résultats pourront rassurer la population et notamment les différents collectifs et associations des personnes hypersensibles aux champs électromagnétiques.
Procédures
Les animaux seront exposés à un champ électromagnétique 2h par jour (2 sessions d'une heure) pendant 1, 2 ou 3 semaines selon les groupes d'animaux. Les différentes mesures effectuées seront réalisées en utilisant des techniques non invasives (comportement alimentaire en pesant l'alimentation et température cutanée en utilisant une caméra infrarouge). Il n'y aura donc aucune procédure chirurgicale. Un seul prélèvement sanguin sera réalisé à la fin de la procédure sous anesthésie générale avant la mise à mort. Il faut moins d'une minute pour prélever le sang nécessaire avant l'arrêt cardiaque. Une fois l'animal déclaré mort, différents organes d'intérêt seront prélevés.
Impact sur les animaux
Dans le passé, nous avons exposé des rats à 900 MHz pendant 5 semaines afin d’étudier les effets sur différentes fonctions physiologiques. Durant l’exposition, aucun effet indésirable notable n’avait été observé (comportement, poids corporel, prise alimentaire).
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser un prélèvement sanguin intracardiaque qui induira la mort.
Remplacement
La fonction étudiée dans ce projet est la thermorégulation. Il existe des mannequins qui permettent d’étudier les échanges thermiques entre le corps et l’environnement mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les modifications de la régulation thermique. De plus, cette fonction est en étroite relation avec d’autres fonctions physiologiques (sommeil, fonction cardiovasculaire). Ces interactions ne peuvent être étudiées qu’à l’aide d’un modèle in vivo car il n’existe à ce jour pas de modèle in vitro capables de modéliser ces interactions.
Réduction
Le nombre de groupes se justifie afin d’étudier un maximum de paramètres pouvant influer sur les effets observés. Nous nous limitons à étudier 8 animaux par groupe. Ce nombre se justifie par de précédentes études menées dans le laboratoire : 4 animaux permettent d’observer une tendance à une diminution de la température de la queue sans atteindre le seuil de significativité alors qu’avec 8 animaux nous nous assurons d’observer une éventuelle diminution significative de la température de la queue. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel Statview. La normalité de la distribution des données sera vérifiée avec le test de Kolmogorov-Smirnov. Si les données suivent la loi normale, des tests paramétriques seront réalisés. L’analyse de variance (ANOVA) sera utilisée pour tester les effets des différents paramètres (âge, sexe, fréquence et durée d’exposition). Les différences entre les séries expérimentales seront également testées afin de s’assurer que tous les animaux d’un même groupe ont des réponses uniformes. Lorsque la valeur de F sera significative, un test de Fischer sera appliqué. S’il existe des interactions entre plusieurs facteurs, un test t des Student sera réalisé. Le seuil de significativité sera fixé à 0,05.
Raffinement
Pour assurer le raffinement des animaux dans ce projet, ils seront quotidiennement observés selon des critères bien précis qui permettront de déterminer un score. Selon la valeur du score, une action sera réalisée pour soulager au maximum l’animal. Pour diminuer le stress lié à l’hébergement individuel, différents enrichissements (cylindres en carton et lanières de papier kraft) seront présents dans chaque cage. Un fond sonore sera également présent afin de couvrir d’éventuels bruits extérieurs, brefs et bruyants, sources de stress pour les animaux. Les paramètres physiologiques étudiés in vivo seront mesurés sans contrainte pour l’animal : la température cutanée de la queue sera mesurée avec une caméra infrarouge et la prise alimentaire par une balance reliée à la mangeoire.
Choix des espèces
Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à une contrainte. - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude des systèmes neurophysiologiques (comme le sommeil) qui sont particulièrement bien référencés dans la littérature (Revel et al., 2009). - l’hébergement dans les chambres climatiques au sein du laboratoire sont adaptés depuis plusieurs années pour cette espèce. L’exposition sera évaluée chez des animaux ayant 3 âges différents. La population juvénile étant potentiellement plus sensible aux CEM, des animaux âgés de 3 semaines seront étudiés, âge minimum d’animaux sevrés. Afin d’évaluer les effets sur une population adolescente, des animaux âgés de 8 semaines seront étudiés, âge de la maturation sexuelle. Enfin des animaux adultes âgés de 13 semaines seront étudiés afin d’évaluer si les effets observés disparaissent à l’âge adulte.
Le métabolome sanguin, une nouvelle piste pour contrer les troubles psychiatriques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
810 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 660 tuées pour prélever leurs organes et 150 autres réutilisées ou tuées selon les besoins. Les souris subissent un protocole de défaite sociale de dix jours qui provoque des comportements de type anxieux, puis des tests comportementaux évaluant mémoire et émotions. Le porteur emploie des mâles "agresseurs" d'une seconde lignée pour infliger ce stress et affirme que le modèle murin est "nécessaire" pour tester des métabolites sanguins. La perfusion intracardiaque finale se fait sous anesthésie profonde.
Objectifs
Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, unique cellule immunitaire du cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques.
Bénéfices attendus
Ce projet est basé sur des découvertes récentes de l’implication de la communication entre les organes périphériques (intestin, microbiote intestinal, foie notamment) et le cerveau dans les maladies neurologiques et psychiatriques. Il va donc permettre de venir étayer ces nouveaux concepts en testant directement comment des molécules produites par les organes périphériques peuvent contrer la neuroinflammation et les troubles comportementaux. Ce projet va donc servir de base pour d’autres études visant à intervenir non plus uniquement sur le cerveau mais aussi sur le fonctionnement d’autres organes pour améliorer la santé mentale. Comme décrit en 3.3.2.1 (objectifs du projet) cette étude vise à proposer de nouvelles stratégies pour la prise en charge des maladies psychiatriques dont l’arsenal thérapeutique reste insuffisant. Ce projet va permettre de tester l’effet potentiellement protecteurs de molécules d’intérêts et donc de proposer de nouvelles stratégies curatives dans le contexte des maladies psychiatriques. Il va aussi permettre d’explorer les mécanismes par lesquels ces métabolites influencent la fonction cérébrale et le comportement. Cela permettra donc d’accroitre les connaissances dans un champ de recherche nouveau et prometteur.
Procédures
Les animaux subiront une perfusion intra-cardiaque de liquide physiologique ou de fixateur après anesthésie profonde (sans réveil).Les souris C57Bl6/j vont par ailleurs subir un protocole de stress validé d'une durée de 10 jours. Par ailleurs, ces souris seront amenées à réaliser des tests comportementaux visant à évaluer leurs capacités mnésiques et émotionnelles. Ces tests sont d'une durée de 5 à 15 minutes au maximum. Chaque souris sera soumise à 5 tests espacés d'au moins 4 jours.
Impact sur les animaux
De par sa nature et son objectif le protocole de stress de défaite sociale que nous allons utiliser pour modéliser les pathologies psychiatriques entraine un stress chez la souris. Celle-ci présente une élévation des comportements de types anxieux. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré d’après notre expérience et la littérature disponible. En effet, les animaux ne perdent pas de poids au cours du protocole et leur activité locomotrice n’est pas affectée. Les souris seront de toute façon suivi comme suit : Les animaux en cours de protocole sont surveillés chaque jour par l’expérimentateur et 2 fois par semaine par les animaliers. Les évaluations objectives de douleur après chaque session de défaite sociale sont effectuées systématiquement afin de déterminer si les animaux ont besoin d'analgésiques.
Devenir
L’ensemble des 660 souris mâles adultes C57Bl6/j ayant participé au procédure de défaite sociale ou de test d’acceptabilité seront mise à mort afin de prélever et étudier différents organes (cerveau, foie, rein, intestin…) Les 150 souris mâles adultes Swiss CD1 (procédure 2) seront soit mises à mort soit réutilisées par des membres du laboratoire dans d’autres expériences à chaque fois que ce sera possible.
Remplacement
La sélection des métabolites à tester a été drastiquement réduite par un travail in silico visant à ne sélectionner que les métabolites avec une haute probabilité d’action cérébrale. Par exemple, la présence de récepteurs au niveau cérébral et l’implication des molécules dans des voies de signalisation / métaboliques impliquées dans les troubles psychiatriques et neuroinflammatoires étaient des pré-requis à la sélection des molécules. L’objectif du projet étant de tester les effets comportementaux de ces molécules dans le contexte des maladies psychiatriques il est nécessaire d’utiliser un modèle murin.
Réduction
Le nombre total maximal d’animaux prévus dans le projet est de 810 Mais ce nombre est susceptible d’être revue à la baisse. L’étude d’acceptabilité aura pour objectif d’éliminer toute dose ayant des négatifs ou toxiques sur l’animal. Par ailleurs deux doses seront utilisées en commencant par la plus faible, si celle-ci a un effet alors la dose plus élevée ne sera pas testée. Cette approche permettra donc de supprimer des expériences inutiles et donc de réduire le nombre d’animaux utilisé. Pour respecter la règle de réduction du nombre d'animaux utilisés, les souris Swiss CD1 agresseurs seront employées durant plusieurs sessions consécutives de défaites sociales. A la fin des deux protocoles successifs, les CD1 seront proposées aux autres utilisateurs puisqu'elles n'auront pas reçu de traitements particuliers. Elles ne seront mises à mort que si nul n'en a l'utilité.
Raffinement
Concernant le raffinement différentes approches seront mises en œuvre. Les animaux seront hébergés en cages collectives avec un environnement enrichi (carré de coton ou maison en carton). Les animaux seront observés quotidiennement et pesés au moins 1 fois par semaine. Les animaux seront inspectés et si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin et coton), les animaux recevront une injection sous-cutanée de buprénorphine (0.05 mg/kg) si nécessaire et seront surveillés deux fois par jour. Si l’animal apparaît malade ou avoir des douleurs (voir définition des points limites en dans les procédures expérimentales), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera mis à mort dans les 24h. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. L’étude d’acceptabilité aura aussi pour objectif d’éliminer des métabolites ou des dosages qui pourraient entrainer un inconfort chez l’animal. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Par ailleurs pour les procédures induisant de la douleur comme la perfusion intracardiaque nous utiliserons des associations d’anesthésiques et analgésiques afin de limiter la douleur chez l’animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en oeuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre des études de défaite sociale notamment car c’est la souche communément utilisée, de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet. Les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie à l’âge de 8 semaines et auront donc 3 semaines d’acclimatation avant de démarrer les protocoles de défaite social. Les souris CD1 seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte.Les expériences de comportement démarreront sur des animaux agés de 12 semaines et plus. L’âge de 12 semaines est utilisé car la maturation cérébrale y est terminée. Cela permet de diminuer la variabilité qui pourrait être observée en utilisant des animaux plus jeunes. Par ailleurs, l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été mise au point sur des animaux de cet âge-là. Ce choix permet donc d’assurer une reproductibilité des procédures, de diminuer la variabilité inter-individuelle et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaire.