Procédures légères

Après avoir reçu sous anesthésie, dans une première partie du projet décrite dans une autre demande, des particules virales instillées dans la trachée pour déclencher des tumeurs du poumon, les souris passent un scanner sous anesthésie gazeuse à 4, 6, 8, 10 et 12 semaines. 60 souris vont être utilisées dans cette seconde partie, dont 40 génétiquement modifiées pour le gène étudié, Atad2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger alors que des tumeurs se développent dans leurs poumons. Le porteur renvoie les effets indésirables à des "points limites" qu'il ne détaille nulle part. Au terme de ce suivi, toutes les souris sont tuées et leurs poumons prélevés.

Objectifs

La transformation maligne des cellules pourrait être considérée comme une série d'événements de reprogrammation cellulaire conduite par des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation en amont. La plasticité et la dynamique de la chromatine sont des déterminants critiques dans le contrôle de la reprogrammation cellulaire. Une augmentation de la dynamique de la chromatine pourrait donc constituer une étape essentielle dans la conduite de l'oncogenèse et dans la génération de l'hétérogénéité des cellules tumorales, ce qui est indispensable pour la sélection des propriétés agressives, y compris la capacité des cellules à se disséminer et à acquérir une résistance aux traitements. L'apport et le dosage d'histones sont les régulateurs les plus connus de la dynamique de la chromatine. En facilitant la reprogrammation cellulaire, le sous-dosage des histones devrait également être crucial dans la transformation cellulaire et les métastases tumorales. L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle d'un facteur à bromodomaine, dans la transformation tumorale et plus particulièrement dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC).

Bénéfices attendus

Notre gène d'intérêt est situé sur le chromosome 8q23 chez l'homme, dans une région instable proche de la région de l'oncogène Myc. Cette proximité avec Myc entraîne souvent son amplification dans différents types de cancer. Presque la totalité des études sur notre géne d'intérêt ont été réalisées in vitro avec des modèles de lignées cellulaires de différents cancers ou in vivo en utilisant des modèles de xénogreffes. Ceci rend difficile de conclure sur son degré d’implication dans l’initiation et la progression tumorales in vivo d’où la nécessité de développer des modèle (s) animaux de cancer. Les expériences entreprises dans ce projet devraient nous permettre de démontrer si l’activité d’Atad2 est nécessaire pour la réponse du génome à des facteurs oncogéniques. Ce travail devrait permettre non seulement de découvrir un mécanisme moléculaire de base essentiel mais constitue aussi une étape commune critique dans la transformation maligne.

Procédures

Durant toute la période de cette procédure, l'observation de développement des tumeurs pulmonaires chez les animaux sera réalisée par imagerie microCT sous anesthésie gazeuse. Cette procédure d’imagerie sera répétée à 4, 6, 8, 10 et 12 semaines post-induction. La durée d'un scan est d'environ 15 minutes, soit environ 20 minutes d'anesthésie au total.

Impact sur les animaux

Dans cette partie du projet, les souris qui ont préalablement reçu les particules d'adéno-Cre par voie intratrachéale (voir DAP Partie 1) seront suivies à l'animalerie de l'IAB et observées pour le développement tumoral. Les effets indésirables, décrits dans les points limites, seront surveillés.

Devenir

A l'issue de cette procédure, toutes les souris seront sacrifées et les poumons prélevés pour analyse histologique et biochimique.

Remplacement

Bien que les propriétés fonctionnelles du facteur que nous investigons dans cette étude aient été initialement abordées par des tests in vitro et dans des modèles de cultures cellulaires, ces derniers présentent néanmoins des limites considérables. Il n’est pas possible d’appréhender l’ensemble des mécanismes que nous étudions sans l’apport du modèle animal. A ce jour et à notre connaissance il n’existe pas de modèle animal qui permet de déterminer le rôle de notre protéine dans l’initiation et la progression tumorales. Nous avons développé des modèles alternatifs en invalidant des gènes d’intérêt dans des cellules souches de souris ou dans des lignées humaines ou encore l’utilisation de modèles de xénogreffes, mais ces systèmes basés sur la culture cellulaire in vitro présente plusieurs limites. Ce modèle de culture cellulaires est en effet très loin de la physiologie animale et ne reflète pas les évènements de dynamique de la chromatine qui ont lieu in vivo.

Réduction

Dans ce projet nous allons utiliser 40 souris modifiées génétiquement pour notre gène d'intérêt. Ce nombre maximal fera l'objet de tests statistiques.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 5 dans des cages à 22°C avec une alternance jour/nuit de 12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Du coton et des tubes en carton seront disposés dans toutes les cages. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. 4 à 5 jours d’acclimatation seront laissés avant le début des expérimentations. Les souris seront observées quotidiennement.

Choix des espèces

Afin de mieux comprendre les mécanismes de développement et d'aggessivité tumorales et pour découvrir de nouveaux moyens plus efficaces pour diagnostiquer et traiter le cancer, il est nécessaire de mener des recherches sur les animaux vivants plus particulièrement la souris. Les études sur les souris sont essentielles pour comprendre la complexité des processus fondamentaux qui sous-tendent le cancer dans les organismes vivants. Dans notre étude, nous pensons que le meilleur moyen d'évaluer le rôle de la protéine Atad2 dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules est d'utiliser des souris invalidées génétiquement pour Atad2 ainsi que des souris sauvages avec lee même fond génétique. Ce modèle murin est très puissant et devrait nous aider à mieux comprendre la liaison Les souris utilisées dans cette étude viennent d'un laboratoire de recherche américain. Le modèle a été validé sur des souris agées de 6 à12 semaines afin d'induire les tumeurs. Les souris de cet âge sont suffisement adultes pour se rétablir assez rapidement des effets de l'anesthésie, du volume des particules virales utilisé anisi que les effets de l'intubation intratrachéale.

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une dégénérescence de la rétine leur est provoquée, puis elles reçoivent sous anesthésie une injection dans l'œil et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, avant d'être tuées de 4 à 72 heures plus tard pour analyse de la rétine. Le porteur cherche à réveiller les capacités de régénération de la rétine en modulant l'inflammation, en s'appuyant sur ce qui s'observe chez le poisson. Les retombées pour les patients atteints de dégénérescence rétinienne sont renvoyées au conditionnel, le porteur jugeant la souris "indispensable" malgré un modèle d'explants qu'il utilise en amont.

Objectifs

La rétine est soumise à des pathologies dégénératives dont la plupart restent non traitables jusqu'à ce jour. La stimulation de la capacité de régénération des cellules souches de la rétine des mammifères, qui est naturellement limitée, pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante. Les cellules souches de la rétine, les cellules gliales de Müller, possèdent un potentiel de régénération extraordinaire chez les amphibiens et les téléostéens, mais celui-ci est très limité chez les mammifères. Cependant, elles ne sont pas dépourvues de propriétés régénératives puisque l’on peut les forcer à se reprogrammer et à générer de nouveaux neurones. L'une des différences entre les deux espèces est la réponse inflammatoire aux dommages. Dans le système nerveux central des mammifères (cerveau et rétine), il est considéré que l'inflammation empêche la régénération du tissu. Dans la rétine du poisson, les médiateurs de l’inflammation (e.g. les cytokines de la famille du TNF-α ou de l'interleukine 6 (IL-6)) favorisent la reprogrammation et la prolifération des cellules gliales de Müller après une blessure. En ce sens, il a été montré que les cellules immunes de la rétine (les microglies) favorisent la régénération chez le poisson, bien qu'elles deviennent préjudiciables si l’inflammation se prolonge. Chez les mammifères, l'inflammation favorise la gliose, la fibrose et la cicatrisation, mais pas la régénération. Ceci suggère une interaction microglie-Müller différente selon l’espèce. L’ensemble de ces résultats indiquent que chez la souris, des propriétés régénératives existent mais sont restreintes soit par des mécanismes intrinsèques aux cellules de Müller, soit par leur environnement (par exemple environnement pro- ou anti-inflammatoire défavorable). Dans ce contexte, nous souhaitons chez la souris moduler l’inflammation via l’injection intraoculaire de molécules pro- ou anti-inflammatoires, et étudier les conséquences sur le réveil régénératif des cellules de Müller.

Bénéfices attendus

A ce jour, les différences d'efficacité de régénération observées entre espèces restent inexpliquées. La régénération rétinienne très efficace des espèces telle que les poissons nécessite une régulation fine de l'inflammation. Notre projet vise à reproduire des conditions inflammatoires favorisant la régénération chez la souris. Notre ambition est de réussir à débloquer les propriétés régénératives latentes des cellules souches de la rétine en modulant l'inflammation. Si le projet abouti, cela ouvrirait la voie vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soigner les patients atteints de dégénérescence rétinienne.

Procédures

Les animaux du présent projet seront soumis à quatre actes expérimentaux: (i) anesthésie : une fois pendant la procédure juste avant l'injection intraoculaire afin d'éviter la douleur qui aurait été générée par l'injection. La durée de l'anesthésie est d'environ 20 minutes. (ii)- injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en 5 minutes maximum en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal pour réaliser l'injection. (iii) injection intrapéritonéale : selon l'expérience, chaque animal recevra entre 2 (MNU, puis EdU) et 5 injections intrapéritonéales (MNU, puis de façon journalière 1 à 4 injections d'EdU) selon le nombre de jours nécessaires à la procédure. (iv) alimentation formulée : de P45 à la fin de l'expérience (P60+4h, P61, P62, ou P63).

Impact sur les animaux

(i) Les phénotypes des animaux utilisés dans nos expériences sont restreints à la rétine. (ii) Les différentes procédures ont un niveau de sévérité de classe légère et sont couramment utilisées dans le domaine de la recherche ophtalmologique. La technique d’injection intraoculaire est utilisée couramment en clinique chez l’homme dans le cadre du traitement de la forme humide de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et n’a pas de conséquence néfaste.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront gardés en vie un certain temps (4h, 24h, 48h, 72h) selon l'expérience puis euthnasiés pour réaliser des expériences d'analyses phénotypiques.

Remplacement

Préalablement aux expériences in vivo nous validerons nos hypothèses grâce à la technique de culture d’explants rétiniens issus de souris euthanasiées n’ayant subi aucune procédure préalable. Les explants rétiniens cultivés ex vivo dégénèrent progressivement. Ils sont un excellent modèle pour tester l’effet de molécules anti- ou pro-inflammatoires, ou à potentiel régénératif. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que l’œil est un organe complexe composés de différents tissus en communication permanente les uns avec les autres ainsi qu’avec la circulation sanguine systémique et le cerveau via le nerf optique. Ces interactions sont cruciales pour l’obtention d’un signal visuel correct et participent à tous les processus cellulaires y compris la réparation et la régénération. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales sans utilisation d'animaux vivants n’apportent pas la même pertinence d'information.

Réduction

Nous avons estimé à 12 souris le nombre minimum d’animaux par groupe. Ce nombre correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des effets biologiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides et prenant en compte les aléas techniques. A noter également que dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses en même temps, de sorte que les deux rétines de chaque individu seront utilisées.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Nous aurons recours aux procédures anesthésiques appropriées. Les points limites de nos expériences sont déterminés grâce au suivi de l’état des yeux suite à l’injection, et en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Les doses d’agents inflammatoires injectés seront réajustées à la suite de la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Nous nous baserons sur les doses définies précédemment dans la littérature. Chacune des injections intraoculaires sera effectuée sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress des animaux.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La lignée de souris sauvages C57BL/6JRj choisie ne présente aucune mutation induisant une dégénérescence rétinienne contrairement à la lignée C57BL/6NRj qui développe spontanément une dégénérescence des photorécepteurs. Nos expériences visent à tester la capacité de l’inflammation à réveiller les propriétés régénératives des cellules gliales de Müller dans différents contextes dégénératifs. Pour déterminer le stade auquel nos expériences seront réalisées, il nous faut prendre en compte les contraintes liées au développement de la rétine et du système immunitaire chez la souris, ainsi que les contraintes techniques. Les souris de la lignée C57BL /6J seront utilisés à partir de P45 quand la rétine est totalement mature pour les expériences nécessitant l'utilisation d'une alimentation formulée. Il faut un minimum d'une dizaine de jour pour obtenir une diminution significative du nombre de microglies. Afin d'induire la dégénérescence rétinienne, le MNU sera injecté à P59 puis la suite des actes expérimentaux aura lieu 16h après (temps nécessaire à l'enclenchement du processus de dégénérescence).

125 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réutilisés comme reproducteurs ou proposés à l'adoption à l'issue. 50 jeunes sont logés seuls en cages métaboliques quinze jours pour mesurer la digestibilité, et 75 femelles sont maintenues en cage individuelle pendant un an de reproduction, pour tester une alimentation enrichie en dérivés du lin. Le porteur reconnaît que ce logement individuel limite fortement les comportements naturels de l'espèce et peut provoquer des stéréotypies. Sur le remplacement, il affirme seulement que les objectifs du projet ne peuvent être atteints sans lapins.

Objectifs

Le projet a pour objectifs d'étudier : 1. Des aliments spécifiques pour la reproduction et la croissance des lapins basés sur la supplémentation en sous-produits riches en acides gras du type omega-3 dérivés de la production du lin. 2. La fertilité, la prolificité et la survie des lapines pour rendre plus efficaces les systèmes d'élevage cunicole.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance des valeurs nutritives des sous-produits du lin, riches en omega-3, pour l’alimentation du lapin contribuera à : (1) la constitution des régimes alimentaires plus adaptés aux besoins des lapins et (2) à la valorisation de ces sous-produits. La réalisation d’essais avec des lapines adultes en reproduction alimentées avec des aliments contenant des sous-produits du lin riches en omega-3, apportera des informations quantifiables sur le bénéfice de ses sous-produits pour la fertilité, la prolificité (nombre de lapereaux nées) et la longévité des lapines.

Procédures

Le logement individuel des animaux dans des cages métaboliques (500 mm longueur x 400 mm largeur x 310 mm hauteur) pendant 15 jours (de 35 à 50 jours de vie). Cette condition de logement est nécessaire pour la récupération des crottes et de l’urine pour la quantification de la digestibilité des aliments testés. Le logement des femelles en cages individuelles pendant la durée de leur de reproduction projet (1 an dans le cadre de ce projet) pour éviter des bagarres et des blessures.

Impact sur les animaux

Le logement individuel des jeunes lapins dans des cages de digestibilité limite considérablement l’expression des comportements naturels de l’espèce, ce qui pourra entrainer l’apparition de stéréotypies. Les femelles seront également logées en cage individuelle, mais de grandes dimensions. Leur isolement est partiel car chaque femelle partage son milieu de vie avec sa portée (pendant 35 jours entre la naissance et le sevrage des lapereaux). Elles peuvent également avoir un contact physique limité, si elles le souhaitent, avec leurs voisines à travers les grilles. Elles peuvent également se voir et se sentir.

Devenir

Les 75 femelles reproductrices seront réutilisées comme reproductricespour d'autres projets. Parmi les 50 lapereaux de 50 jours (procédure 2) : les 25 femelles seront réutilisées comme femelles reproductrices, les 25 mâles seront mis à l'adoption à la fin de l'essai de digestibilité.

Remplacement

Les objectifs du projet Omega-Rabbit ne pourront pas être atteints sans l’utilisation de lapins.

Réduction

L’ensemble du projet prévoit l’utilisation de 75 lapines reproductrices. Le nombre de femelle a été calculé pour avoir 25 femelles par aliments (3 aliments). Le recours à 50 lapereaux pour l’essai de digestibilité a été calculé à partir des données de la littérature, où sont décrit la nécessité de 10 lapins par régime alimentaire dans l’obtention des résultats scientifiques tangibles. Ici nous testerons 5 aliments différents avec des teneurs de sous-produits de lin différentes.

Raffinement

L’essai de digestibilité constitue le point de départ du projet. Le temps d’isolement social et les conditions d’hébergement des 50 lapins pour l’essai de digestibilité sera de 15 jours, réduisant ainsi cette contrainte. Par ailleurs les animaux peuvent se voir et se sentir à travers les grilles. Chacune des 75 femelles reproductrices disposera d’un enrichissement de son milieu de vie : plateforme, repose pattes et bloc à ronger. Les dimensions des cages respectent les normes expérimentation animales. Tous les animaux seront manipulés par du personnel entrainé à la manipulation sécure des lapins. Des gestes doux et précis seront déployés. Chaque animal disposera d’un suivi quotidien de son état de santé.

Choix des espèces

O-Rabbit vise l’obtention d’un produit très spécifique : la viande de lapin riche en omega-3. Il été conçu également pour favoriser la compétitivité de la cuniculture (circuits courts et longs) dans les pays de la zone méditerranéenne. Vu les objectifs et enjeux du projet, O-Rabbit ne pourra pas se dérouler avec une autre espèce que le lapin. 75 femelles reproductrices pour évaluer l'impact d'une alimentation enrichie en lin sur la santé et la reproduction des femelles, 50 lapereaux de 35 jours pour réaliser un essai de digestibilité sur des lapereaux en croissance.

200 souris génétiquement modifiées, modèles de la maladie d'Alzheimer, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent jusqu'à cinq anesthésies pour des séances d'IRM entre deux et douze mois, puis la plupart sont tuées par perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau tandis que d'autres sont gardées vivantes et transférées vers le laboratoire d'origine. Le porteur nomme des tests comportementaux fondés sur l'exploration spontanée pour étudier les différences entre mâles et femelles. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in silico ne reproduit assez fidèlement les processus cognitifs et juge le recours au modèle animal nécessaire.

Objectifs

La variété de profils cliniques observés dans la maladie d’Alzheimer plaide en faveur d’une prise en charge personnalisée de la prévention, du diagnostic et du traitement de cette affection. Le sexe est un facteur critique à prendre en compte car les femmes ont un déclin cognitif plus marqué que les hommes à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer. Des travaux suggèrent que les interactions entre certaines régions cérébrales sont plus affectées chez les femmes que chez les hommes lors de l’émergence d’une maladie d’Alzheimer. Dans un nouveau modèle de souris de la maladie d’Alzheimer, les femelles peinent à reconnaitre un objet au bout de 24h à un âge où les mâles n’ont pas ce problème. Or cette forme de mémoire s’instaure pendant les phases de sommeil. Ainsi, une perturbation des cycles veille sommeil, comme celle observée chez le patient Alzheimer, pourrait contribuer aux déficits observés des femelles. Quelques mois plus tard, les deux sexes ont des difficultés à reconnaître une association objet-place. Notre but dans cette étude, est donc de vérifier que dans un premier temps, la connexion impliquée dans la reconnaissance d’objet à 24h est effectivement perturbée chez les femelles mais pas chez les mâles. Par la suite, la communication sous-tendant la mémoire d’association objet-place serait à son tour altérée, cette fois chez les deux sexes. Pour mettre en évidence ces altérations différentielles de la connectivité en fonction du sexe et du développement de la maladie dès les stades les plus précoces, nous étudierons l'évolution au cours du temps de la connectivité entre différentes régions cérébrale à la fois fonctionnelle et structurelle, des souris modèle de la maladie d’Alzheimer via une approche en Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM). Les données d'imagerie seront ensuite corrélées a des investigations histopathologiques, ainsi qu'à des approches comportementales visant à étudier l'efficacité de difféntes connexions dans des tâches de mémoire. Nos travaux devraient donc contribuer à mieux comprendre l’origine des différences liées au sexe au début d’une pathologie Alzheimer et plaideront en faveur de la mise en place de diagnostic et/ou de traitement personnalisés en fonction du sexe.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude devraient contribuer à mieux comprendre l’origine des différences homme-femme au début de la MA et plaideront en faveur de la mise en place de traitements personnalisés en fonction du sexe.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie sous cutanée (par médétomodine) et gazeuse (isoflurane) à 2, 4 et 12 mois lors de l'IRM. Les animaux subiront au maximum 5 anesthésies de 1h30 correspondant au maximum 5 examens IRM de 1h30, espacés d'au minimum de 2 semaines entre chaque IRM. Ils seront également soumis à une perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde, pour le prélèvement du cerveau à raison de 5 souris par groupe à 2 mois (n=20), 5 souris par groupe à 4 mois (n=20) et toutes les souris à 12 mois (n=140). Cette perfusion intracardiaque se fait sous anesthésie et la durée totale de l’intervention est de 15min.

Impact sur les animaux

L’apparition éventuelle de signes de détresse seront surveillés, tels qu’une difficulté à récupérer de l’anesthésie, observable par des déplacements lents, l’absence de toilettage, l’aspect du pelage, une posture voutée, une diminution de l’abreuvement et de l’alimentation de l’animal, une potentielle altération des yeux en dépit du gel oculaire utilisé au cours de l’examen IRM, ainsi que l’état du point d’insertion de la voie d’infusion sous-cutanée.

Devenir

Les animaux non concernés par la perfusion seront gardés en vie et transférés dans le laboratoire d’origine EU1/2 pour la poursuite de l’étude. Les animaux concernés par la perfusion seront gardés dans les locaux de l’EU 2/2 pour le prélèvement des cerveaux. Si ces locaux ne sont pas prêts pour ces prélèvements, les souris seront gardées en vie et retournées dans l'EU1/2 pour réaliser ces prélèvements.

Remplacement

L'étude des animaux modèles de la maladie d'Alzheimer est encore indispensable pour progresser dans la compréhension de cette pathologie. Il n'est pas encore possible de nos jours de modéliser les processus cognitifs de façon assez fiable et complète dans un modèle in silico de la pathologie. Il est donc nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie, la connectivité cérébrale et les performances cognitives.

Réduction

Les résultats obtenus précedemment montrent une grande variabilité inter-individuelle en comportement et en IRM fonctionnelle. En conséquence nous voudrions augmenter la puissance statistique par l’augmentation du nombre d’animaux. 200 souris seront finalement nécessaires dans cette étude. Le projet étant une étude longitudinale impliquant des procédures non-invasives, il permet donc le suivi d'un même animal plusieurs fois et par conséquent une réduction du nombre d'animaux à inclure. Le nombre de souris est donc réduit au minimum d’animaux nécessaire afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables en fonction des expériences réalisées: optimisation de l’anesthésie pour l’IRM, suivi IRM et analyse histopathologique.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’éléments d’enrichissement dans leur cage (matériel de construction du nid, un tube refuge et des boulettes de nourriture à manipuler dans la cage), ainsi qu’un suivi quotidien de leur état général. Ellesseront maintenues en groupe sociaux sauf pour la durée des tests de comportement. Tous les tests comportementaux sont basés sur le comportement d’exploration spontanée de la souris. Un suivi plus spécifique sera réalisé pour chaque procédure avec des points limites adaptés pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

L’IRM préclinique 7T est un appareil dédié aux études sur les rongeurs. A ce jour, les modèles animaux de la Maladie d'Alzheimer ont essentiellement été créés chez la souris. Le modèle utilisé dans l'étude présente un dimorphisme sexuel dans l'apparition des premiers troubles de la mémoire qui est réminiscent de celui trouvé au stade préclinique de la Maladie d'Alzheimer, c'est-à-dire 5 à 10 ans avant le diagnostic. Les souris seront utilisées à 2, 4 et 12 mois (jeunes adultes) car c’est l’âge où apparaissent les premiers déficits de mémoire. Cela permettra de réaliser une évaluation longitudinale des différences mâles versus femelles.

7 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit des injections de vecteurs-médicaments et des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tué par une dose létale d'anesthésique pour prélever sang et organes et mesurer la distribution des composés. Le projet, mené par une société, prévoit d'utiliser environ 1 200 souris par an pour valider ses candidats-médicaments. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune modélisation prédictive ne remplace le modèle murin et le présente comme "l'idéal" et le plus facile à mettre en place.

Objectifs

Plusieurs stratégies sont en cours d’exploration pour faciliter le passage et l'adressage de biomolécules vers les tissus et organes cibles. Parmi ces stratégies, on trouve le développement de molécules-vecteurs qui améliorent la biodisponibilité et le passage d’agents thérapeutiques, notamment à travers la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) du cerveau. Ainsi, grâce à la reconnaissance spécifique d’un partenaire ou d’un récepteur (protéine), le complexe vecteur-médicament pourra reconnaître sa cible et franchir cette barrière pour agir dans le parenchyme nerveux. Le réseau sanguin irrigant étroitement la totalité de l’organisme, ce principe de délivrance pharmacologique peut s’appliquer à tout type de tissu ou organe périphérique. Notre société développe de peptides vecteurs (peptides, fragments d’anticorps), conjugués avec différentes classes de molécules (agents d'imagerie, drogues thérapeutiques, siRNA) et proposés comme potentiels candidat-médicaments VHH. Dans notre cas, des peptides, drogues, ou dernièrement de petits ARN interférents (siRNA), dont la finalité sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de certaines protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Les études sur sujets sains permettent notamment de mieux comprendre et appréhender leurs disfonctionnements, sans que pour autant elles n’aient à court termes d’effets sur la santé et le bien-être animal. Dans ce projet (procédure 1) nous proposons d’étudier à différents temps d’incubation, la biodistribution de nos vecteurs conjugués (VHH) et/ou leurs efficacités, par mesure des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. L'assurance de l'innocuité de nos conjugués VHH par des études d'immunogénicité, nous amène à doser certaines protéines plasmatiques et, rapporté à une gamme de référence (procédure 2), à quantifier et identifier toute apparition d'une inflammation.

Bénéfices attendus

Parmi les avantages de nos procédures, on retrouve la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (posologies), qui seront de fait dans ce projet, revues à la baisse par rapport aux autres thérapies plus lourdes, actuellement utilisées (3R : raffinement). Egalement, qui dit doses moindres, dit, risques de toxicités moindres pour les animaux. Le potentiel de ciblage thérapeutique et l'innocuité de nos Vecteurs médicaments constituent en soit les principaux objectifs de nos recherches, dont les conséquences, par le bénéfice thérapeutique, peuvent jouer un rôle considérable dans le milieu médical et surtout, à terme, sur le quotidien des patients.

Procédures

Au cours des 2 procédures, nous allons manipuler les animaux en vigile, au cours des administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) et des prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement codal ≤50 µl). Puis, dans un deuxième temps; en post-mortem, pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. -Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou bolus répétés. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. -De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois, sur un temps intermédiare : L'animal sera placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes 20 microlitres de sang. Nb : Seuls les temps longs nécessitent un prélèvement intermédiaire. Par la suite, les prélèvements (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié en post-mortem : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg); Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm) environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.

Impact sur les animaux

Les composé VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité avérée. En cas de souffrances, choc, ou effets indésirables en cours de cinétique (les animaux sont quotidiennement suivits et annotés), une procédure spéciale d'euthanasie à forte dose d'anesthésiques est prévue (cf. 5.6.1). Pour notre 2ème procédure, les quantités de LPS administrées sont largement inférieures au quantitiés rapportées comme toxiques voire létales dans la bibliographie et ces tests communs et standardisés restent significativements en dessous de la DL50, de 10mg/kg.

Devenir

A l'issue de la procédure (fin cinétique d'incubation des vecteurs médicaments ou de cinétique d'endotoxémie) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg); Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm)

Remplacement

Pour mener à bien notre modèle préclinique, nous envisageons après validation in vitro de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, indispensable pour l’étude de ces mécanismes (3R : remplacement). Actuellement, le modèle murin ne peut pas encore être remplacé par des modélisations prédictives ou autres alternatives de remplacement. Seul le modèle animal mammalien et proche de l'homme permets de prendre en compte les mécanismes physiologiques pour prédire du comportement d'un médicament, d'un modèle thérapeutique et de son efficacité. Dans ce contexte, le modèle murin, ici la souris, reste l'idéal et surtout, le plus facile à mettre en pace pour ce genre de procédures.

Réduction

Procédure : Le nombre d’animaux ou groupe expérimental nécessaire à l’obtention d’une significativité statistique (Réduction, règle des 3Rs) se fera sur de petits groupes (n=4 à raison de 1200 souris/an en procédure 1 et 240 souris/an en procédure 2), suffisant pour appréhender un effet des conjugués sur les souris. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec.

Raffinement

Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclisée (12h/12h), insonorisée, ventilée, sous température et hygrométrie contrôlée, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage, litières et raffinements (dômes, tunels). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires.

Choix des espèces

Toutes études de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos VHH ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des conjugués développés. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 1200 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations (Article R. 214-105, code rural et pêche maritime) et cahier des charges.

20 chiens Beagle vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants et réutilisés à l'issue. Ils reçoivent chaque jour pendant trois mois un extrait végétal par voie orale et subissent des prélèvements de sang à la veine jugulaire à cinq reprises, pour en tester la tolérance et l'effet sur le comportement. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance et prévoit de replacer les chiens dans leur environnement d'étude à la fin. Sur le remplacement, il indique que le chien est l'espèce visée par le produit et qu'il n'existe donc pas d'alternative.

Objectifs

La plante constitue une solution de santé curative et/ou préventive pour les maladies multi-factorielles en raison de la nature multimoléculaire des bioactifs dont elle est composée. Parmi les plantes d’intérêt, une est traditionnellement utilisée pour ses propriétés sédative ou antispasmodique. Bien que des recherches récentes aient étudié les effets bénéfiques d'un des composants majeurs de cette plante, peu ou pas d’études ont exploré directement le potentiel anti-antioxydant et anxiolytique de l’extrait standardisé de la feuille de cette plante chez le chien. Cet extrait contient les principaux constituants biochimiques de cette plante (acides phénoliques incluant l’ensemble des dérivés cinnamiques, flavonoïdes, triterpènes) dont l’action combinée et/ou synergique pourrait lui conférer des effets bénéfiques supérieurs à ceux susceptibles d’être exercés par le composant actif majeur. Ces effets restent globalement, jusqu’à présent, inconnus et peu ou pas explorés notamment chez les carnivores domestiques. Les données relatives à l’action calmante ou anxiolytique de l’extrait standardisé chez le chien restent limitées à ce jour. L'objectif de ce projet sera d'abord d’évaluer la tolérance hémato-biochimique de notre extrait botanique standardisé et de son traceur chez le Chien Beagle sain. Seront également étudiés les effets de cet extrait et de son traceur sur le comportement (à l’aide de grille de scoring) et le statut oxydant. Notre principale hypothèse est que la richesse et la diversité moléculaire de l'extrait botanique étudié (flavonoïdes, acides phénols, dérivés cinnamiques, etc.) et surtout la potentielle action synergique et/ou additive de ses molécules bioactives pourrait lui conférer une action comportementale plus marquée, en impliquant certains mécanismes, comme une action inhibitrice de l’activité de la GABA-T plaquettaire (reflet de la GABA-T centrale, augmentation de la concentration sanguine du GABA). Le traceur testé correspond à un des constituants actifs majeurs de l'extrait végétal étudié. Il appartient au groupe chimique des acides phénols ; il possède des propriétés anti-oxydante, anti-inflammatoire, sédative et organo-protectrice (hépatique et rénal). Dans ce projet, il sera incorporé dans l’aliment à une dose 300 fois inférieure à la dose maximale de sécurité recommandée par l’EFSA.

Bénéfices attendus

Les travaux conduits dans le cadre de ce projet devraient permettre de mettre en évidence d'abord l'acceptabilité de l'extrait botanique étudié et ses effets sur le comportement et le statut oxydant chez le Chien Beagle sain. Le design adopté permettrait de déterminer si l’extrait botanique testé exerce une action supérieure à celle conférée par son traceur. L’hypothèse testée est basée sur la potentielle nécessaire synergie d’action des principes actifs présents dans le totum de l’extrait végéal. La validation des effets de l'extrait botanique étudié permettrait d'envisager son utilisation comme alternative aux traitements chimiques allopathiques dans le cas d'altération du bien-être et/ou du comportement.

Procédures

Aucune nuisance n'est attendue de l'extrait standardisé testé, les données concernant les doses maximales à ne pas dépasser chez le Chien sont disponibles et publiées par l'EFSA. Dans tous les cas, toute souffrance ou toute altération de l'état général, l’animal sera mis en observation pour lui apporter d'éventuels soins. Si la souffrance, pour des raisons inconnues, persiste, il sera exclu de l'étude. Les chiens seront exposés à trois types d'intervention nutritionnelle pendant une durée de 3 mois : un lot de 5 chiens recevant le régime standard et une administration orale quotidienne de l'extrait végétal étudié ; un lot de 5 chiens recevant le régime standard et une administration orale quotidienne du traceur actif de l'extrait végétal étudié; et un lot de 5 chiens recevant le régime standard et une administration orale quotidienne d'un aliment complémentaire à visée comportementale. Un prélèvement sanguin de 8 ml au niveau de la veine jugulaire sera réalisé par une personne expérimentée sur tous le chiens pendant la durée du protocole (J0; J15 ; J30 ; J60 ; J90). L'acte de prélèvement dure 2 minutes environ (contention par un tiers, rasage et désinfection du site de prélèvement).

Impact sur les animaux

Aucune nuisance n'est attendue de l'extrait standardisé testé, les données concernant les doses maximales à ne pas dépasser chez le Chien sont disponibles et publiées par l'EFSA. Il n' y a pas risque de douleur ou de souffrance associé à l'acte de prélèvement sanguin. Cet acte dure 2 minutes environ (contention par un tiers, rasage et désinfection du site de prélèvement).

Devenir

Les animaux sont replacés dans leur environnement d'étude après chaque procédure. Le comportement des animaux est surveillé (par la SBEA) à la fin du projet pour s'assurer de leur bonne santé.

Remplacement

Le Chien est l'espèce cible des résultats du projet. Il n'y a donc pas d'alternative qui permettrait son remplacement.

Réduction

Nous utilisons 5 chiens par groupe afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélévement étant répété sur chaque chien, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.

Raffinement

L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (balade et moments en liberté , jeux...). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.

Choix des espèces

Les chiens sont des adultes de 2 ans, en bonne sant et n'ayant pas reçu de traitement antibiotique ou tout autre traitement pouvant modifier le comportement, depuis au moins 3 mois. Le Chien est l'espèce cible des résultats du projet. Il n'y a donc pas d'alternative qui permettrait son remplacement.

98 rats, dont 14 femelles gestantes et 84 ratons, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes sont exposées aux radiofréquences du téléphone portable de la gestation au sevrage, puis mères et descendants reçoivent une injection de BrdU et sont mis à mort deux heures après pour prélever le cerveau et mesurer la neurogenèse. Le porteur nomme les tests comportementaux imposés, réflexes néonataux, activité exploratoire en open-field et test de retournement, pour évaluer l'effet de l'exposition sur la maturation cérébrale. Sur le remplacement, il affirme que les approches in vitro et in silico ne peuvent pas répondre à la question sur un organisme en interaction avec son environnement et conclut à la nécessité du recours au rat.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact d’expositions aux champs électromagnétiques (CEM) des télécommunications (comme le téléphone portable) sur la neurogenèse. Ce projet sera réalisé sur 98 rats Sprague-Dawley (14 femelles gestantes et 84 ratons, en considérant que 6 ratons/portée seront obtenus) répartis en deux groupes expérimentaux, exposés ou non aux CEM (cf. ANNEXE 1). Une procédure est considérée dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des réponses aux questions scientifiques et aux préoccupations sociétales concernant les possibles effets neurobiologiques des expositions développementales aux champs électromagnétiques avec le minimum de rats pour le projet.

Procédures

Aucune intervention de type prélèvement sur animal vigile ou chirurgie n'est prévue. Deux heures avant leur mise à mort, les rats recevront une seule injection intrapéritonéale de BrdU (150 mg/kg pour les mères et 50 mg/kg pour les descendants à PND9, 21 et 44 dans un volume maximum injecté de 6 ml/kg pour les animaux traités à PND9 et de 10 ml/kg aux autres âges). Préalablement à leur sacrifice, le cas échéant (en cas d'atteinte de point limite nécessitant la mise à mort après l’âge de PND15), les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital (EXAGON, 400 mg/kg, ou traitement équivalent recommandé par le vétérinaire référent). Préalablement à leur mise à mort, les rats seront sédatés par inhalation d’isoflurane. Au bout de quelques minutes, l'anesthésie profonde sera vérifiée et les rats seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Nous n'attendons pas de nuisance ou d'effet indésirable sur les animaux suite à la réalisation de la procédure n°1 de ce projet. Néanmoins, des signes critiques et les actions correctives qui seront menées en conséquence sont envisagés afin d’être en mesure de pallier toute manifestation inopinée de souffrance des animaux hébergés dans notre animalerie même si sa cause n’est pas prévisible et est indépendante des actions de la procédure n°1.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort aux temps de sacrifices définis pour effectuer des prélèvements biologiques post-mortem qui permettront de réaliser des analyses biochimiques et de biomarqueurs cérébraux.

Remplacement

Pour ce qui est du remplacement, les approches cliniques, in vitro et in silico, par leurs limitations éthiques et techniques, ne peuvent pas répondre au questionnement concernant l’impact des expositions aux CEM-RF sur le positionnement et la morphologie des nouveaux neurones sur un organisme en interaction sensorielle avec son environnement et doué de thermorégulation, nécessitant de fait le recours aux études in vivo.

Réduction

Au plan de la réduction, plusieurs paramètres biologiques seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés. Les coupes de cerveau qui seront réalisées ex vivo seront exploitées pour l’analyse de plusieurs marqueurs (marquage du BrdU, marqueurs neurotrophiques, de l’inflammation et du stress oxydant) fortement questionnés dans les effets in vivo des CEM. Les variables quantitatives (marqueurs ex vivo, poids, …), seront analysées par 4-ways ANOVA ou 3-ways ANOVA suivi d’un test post-hoc avec la correction de Bonferroni, en fonction de paramètres inter-sujet (sexe, niveau de champs électromagnétique, âge) et intra-sujet (le temps pour les variables mesurées plusieurs fois chez un même rat (poids, tranches de 5 minutes pour l’activité locomotrice,…)). Les variables de rang (mesure du délai de retournement dans le « surface righting » sur un maximum de 60 secondes, …) seront analysées par le test du log Rank.

Raffinement

Concernant le raffinement, chaque animal sera observé quotidiennement et pesé tous les 2 jours. Des feuilles d’observation permettront de consigner les signes anormaux concernant l’apparence, le comportement, les signes cliniques, etc. En période périnatale, une attention particulière sera portée au bien-être des mères et de leur portée et à la nidification. L’état de santé des animaux sera suivi à l’aide d’une grille de scores (cf. ANNEXE 2) qui indiquera l’action à mener de prise en charge de la douleur. De plus, les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être. Pendant la période périnatale, les rates seront hébergées seules puis avec leur portée. A partir du sevrage, tous les rats seront hébergés par sexe par groupe à plusieurs par cage pour leur socialisation. Un fond sonore musical sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, et éventuellement des bâtons en bois à ronger, seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Une sédation par inhalation d’isoflurane sera pratiquée préalablement à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Le rat est un animal de référence pour les études de toxicologie. En particulier, ses systèmes neurobiologiques et physiologiques ont été largement étudiés en laboratoire. Il existe une documentation très complète dans le domaine, dans la littérature et les ouvrages spécialisés. L’UMR PériTox possède une expertise en recherche en toxicologie expérimentale. Ces recherches ont été effectuées majoritairement chez le rat. Dans un souci de comparer nos résultats avec les résultats obtenus précédemment concernant les effets des CEM sur les fonctions cérébrales, nous avons choisi la même espèce. De plus, le personnel qui sera en charge des expérimentations est formé et possède une expérience reconnue pour l’entretien et l’observation des rats. Les femelles gestantes arriveront à l’animalerie au jour gestationnel (G) 3 et seront exposées à partir de G8 aux CEM-RF jusqu’au sevrage de la descendance, au jour postnatal (PND) 21, soit approximativement durant 35 jours. Elles seront sacrifiées à PND21 pour évaluer les effets de l’exposition sur leur neurogenèse. Les effets de l’exposition sur la mise en place de la fonction cérébrale seront évalués sur la descendance au stade néonatal (réflexes néonataux évalués de PND3 à 10), au stade juvénile et à l’adolescence (activité exploratoire évaluée dans l’open-field respectivement entre PND17 et 19, et entre PND41 et 43). Les femelles gestantes recevront une injection de BrdU à PND21 et la descendance aux stades néonatal (PND9), juvénile (PND21) et adolescent (PND44), et seront mis à mort 2h après pour examiner la neurogenèse. Cette analyse permettra d’identifier le stade développemental le plus sensible aux expositions aux CEM-RF et les effets à court/long terme et transitoire/permanent sur la neurogenèse et la fonction cérébrale tout au long de la maturation cérébrale.