Procédures légères

Une puce électronique posée sur animal vigile, une biopsie pour le génotypage, puis jusqu'à 240 prélèvements de sang à la queue sur la durée du protocole, voilà ce que subissent 30 000 souris et 30 000 rats élevés pour fournir des lignées diabétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le champ structuré du devenir compte ces 60 000 individus comme morts, alors que le texte écrit qu'ils sont "soit expédiés dans un autre établissement utilisateur soit utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort pour la gestion de l'élevage", sans indiquer la part de chacun de ces sorts. Ceux qui ne portent pas le génotype recherché sont tués, le porteur précisant qu'aucune autre utilisation n'est possible. Sur la justification de ces 60 000 individus, il écrit s'appuyer sur son savoir-faire et ses données historiques, et ajoute que "Aucune approche statistique n'a été réalisée".

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique caractérisée par un excès de sucre dans le sang et donc un taux de glucose (glycémie) trop élevé (hyperglycémie). Le diabète est un trouble de l’assimilation, de l’utilisation et du stockage des sucres provenant de l'alimentation. En France, plus de 4 millions de personnes vivent avec un diabète qu’il soit de type 1 (maladie auto-immune entrainant un arrêt de la production d’insuline) ou de type 2 (manque d’insuline ou résistance à l’insuline). Les symptômes du diabète sont multiples : urines abondantes (polyurie), augmentation de la soif (polydipsie), amaigrissent malgré une augmentation de l’appétit, fatigue, problème de cicatrisation… Les hyperglycémies répétées et prolongées entrainent des altérations des nerfs et des vaisseaux. Les complications sont multiples, altérations des nerfs, atteintes oculaires, complications rénales, problèmes de vascularisation. Elles peuvent conduire à des cécités, des insuffisances rénales, des amputations, des accidents vasculaires cérébraux… L’objectif de ce projet est d’élever des rongeurs modèles pertinents pour l’étude de cette pathologie et des complications qui lui sont associées. Ces modèles peuvent développer spontanément ou via des altérations génétiques une ou plusieurs caractéristiques du diabète. Les animaux issus de ces développements seront utilisés afin d’étudier l’apparition, le développement et les complications associées au diabète mais également de tester de nouveaux traitements. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.

Bénéfices attendus

L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles murins, au plus proche de la maladie humaine, sont donc très pertinents pour l’étude de l’apparition, du développement et des complications associées au diabète mais également le développement de traitements pharmacologiques.

Procédures

Une puce électronique sera posée sur animal vigile afin de l’identifier. Une biopsie sera réalisée sur animal vigile afin de génotyper l’ensemble des animaux obtenus. Chacune de ces interventions ne durera pas plus de 30 secondes. En règle générale, une seule puce et une seule biopsie suffisent pour identifier un animal et établir son génotype. Des prélèvements sanguins pour mesurer la glycémie pourront être faits et consisteront en un prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur les animaux en aigue (maximum 2 mesures par jour par animal, avec 3 jours de récupération entre 2 séries de mesures, ce qui fait 240 prélèvements sur toute la durée du protocole) ou en chronique (une mesure par animal par semaine, ce qui fait 60 prélèvements sur toute la durée du protocole). La durée du prélèvement ne dépassera pas 1 minute. Ces prélèvements pourront être réalisées, en fonction du besoin, avec ou sans mise à jeun préalable (4 à 6 heures maximum).

Impact sur les animaux

Une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies et de la pose associée d’une puce électronique en vue de l’identification et du génotypage de l’animal. En fonction des besoins et afin d’améliorer l’indice de productivité de la lignée, il pourrait être nécessaire d’héberger individuellement des mâles pour une période ne dépassant pas 7 jours avant qu’ils soient présentés aux femelles afin de mettre en place des accouplements. Cela pourrait générer un stress léger. Le prélèvement sanguin nécessaire aux mesures de glycémie pourrait induire un léger stress transitoire ainsi qu’une légère douleur. Les animaux diabétiques pourraient présenter une masse corporelle plus faible que leurs congénères et être polyuriques.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur soit utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes). Les animaux ne présentant pas de génotype d’intérêt pour la poursuite du projet seront mis à mort (pas d’autre utilisation possible).

Remplacement

Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de diabète, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Les animaux présentant un diabète peuvent produire de grandes quantités d’urine (polyurie). Le cas échéant, afin de les maintenir dans un environnement confortable, nous serons amenés à utiliser une litière hyper-absorbante et à changer la litière plus fréquemment pour ces animaux. La même litière sera utilisée au cours du transport. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique et leur comportement selon une grille d’observation indiquant les points limites. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux. Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi chez nos partenaires ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovules, des adultes matures sexuellement seront utilisés.

Mettre au point trois techniques d'imagerie médicale sur des oiseaux vivants pour prédire la qualité marchande du foie gras : 20 oiseaux, 10 poules de réforme et 10 canards mulards, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chaque individu subit trente minutes de contention vigile pour une échographie, une prise de sang au sinus occipital, une anesthésie par injection intramusculaire, une intubation, puis deux heures trente à deux heures quarante-cinq d'examens d'imagerie. La mise à mort intervient en fin d'anesthésie, le porteur indiquant que les produits de contraste et les anesthésiques rendent les oiseaux "impropres à l'élevage et à la consommation ultérieure". Les marqueurs recherchés sont le taux de fonte lipidique, le poids du foie entre 450 et 550 grammes et l'absence des veinules que "le consommateur" juge dépréciantes, et le porteur annonce que ces résultats alimenteront les débats sur le "bien-être animal".

Objectifs

La production de foie gras fait l’objet de débats sociétaux et scientifiques grandissants. Elle reste néanmoins une activité économique importante en France (80% de la production mondiale). Cette production repose sur une phase d’engraissement par gavage de courte durée (entre 12 et 14 jours) et la qualité du foie gras obtenu à la suite de ce processus de gavage repose classiquement sur trois critères principaux : (i) le taux de fonte lipidique qui doit être < 30%, idéalement

Bénéfices attendus

Le projet apportera de nouvelles connaissances sur : - les mécanismes d'installation et de réversibilité de la modification physiologique du foie induite par le gavage chez le canard Mulard - l’identification de biomarqueurs d'imagerie susceptibles de prédire la qualité technologique des foies, notamment leur poids, leur qualité vasculaire et leur taux de fonte lipidique - la comparaison des performances de l'IRM, du scanner avec celles de l'échographie, une technique beaucoup plus accessible et potentiellement utilisable en élevage - les conséquences physiologiques du gavage et la capacité du foie à retrouver un état proche de son état initial après l'arrêt de l'engraissement. Dans un contexte où la production de foie gras fait l'objet de nombreux débats sociétaux relatifs au bien-être animal, ces résultats permettront d'alimenter les discussions avec des données expérimentales objectives et quantitatives, fondées sur des méthodes d'imagerie non invasives. Cette étude pilote permettra d'optimiser les protocoles expérimentaux avant la mise en œuvre d'une étude de plus grande ampleur. Elle servira à ajuster les paramètres d'imagerie, à valider les séquences IRM les plus pertinentes, à optimiser les modalités d'observation et les interventions sur les animaux, ainsi qu'à évaluer la faisabilité du suivi longitudinal. Cette étape préparatoire contribuera à améliorer la qualité scientifique des futures expérimentations tout en limitant le nombre d'animaux nécessaires, conformément au principe des 3R.

Procédures

Chaque animal subira : une contention vigile pour un examend'échographie (30 minutes), puis une prise de sang (1 minute, voire 2 si un deuxième essai est réalisé), puis une injection pour induire l'anesthésie (30 secondes). Sous anesthésie, il sera intubé (30 secondes), une voie veineuse sera posée (5 minutes), puis 2 examens d'imagerie seront effectués (2h30 à 2h45).

Impact sur les animaux

Le transport entre les deux sites peut entrainer du stress léger. La contention lors des prises de sang, des injections et de l’examen d’échographie peut engendrer du stress pour l’animal. Les prises de sang et la pose d’une voie veineuse peut provoquer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’induction de l’anesthésie par injection intra-musculaire peut être légèrement douloureuse.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'anesthésie d’imagerie car l’injection des produits de contraste et des anesthésiques rend les animaux impropres à l’élevage et à la consommation ultérieure. Ce seront des animaux de réforme, sans retour prévu à l’élevage.

Remplacement

Afin de déterminer les paramètres optimums pour l’imagerie (IRM + scanner + échographe 3D), et de maîtriser les gestes techniques inclus dans le projet principal, cette étude pilote doit être réalisée in vivo d’abord chez la poule, puis chez le canard. Il n’y a pas de méthode de remplacement. Nous avons choisi des poules de réforme pour ne pas utiliser des animaux qui auraient pu avoir un autre sort. Des autopsies sur poules et canards réalisées au préalable nous permettront de mieux connaître les structures anatomiques d'intérêt.

Réduction

20 animaux au maximum seront utilisés (10 poules et 10 canards) dans cette expérimentation pilote. Cela est suffisant pour le paramétrage des 3 outils d’imagerie, et l'entrainement aux gestes sur les animaux. Si les objectfis sont atteints avec un nombre inférieur d’animaux, les animaux surnuméraires ne seront pas utilisés. L'intérêt de l'imagerie est de pouvoir sérier les examens et donc de pouvoir utiliser les animaux comme leur propre témoin. De plus cette étude permettrait de mettre à jour des données anciennes. L'utilisation de cadavres au préalable permettra de limiter le nombre d’animaux vivants utilisés. Les poules seront des animaux de réforme.

Raffinement

Tous les gestes et examens seront d’abord testés sur cadavres, d’abord de poule (plus faciles à se procurer), puis de canard (si possible). Ensuite seulement nous utiliserons des animaux vivants. Les animaux seront amenés sur la plateforme et laissés au calme quelques heures, dans une pièce chauffée si besoin. Ils seront ensuite manipulés avec douceur lors de la séquence d'examen vigile (échographie 3D, prise de sang, induction de l’anesthésie). Raffinement des prises de sang : elles seront réalisées au sinus occipital toujours en binôme, avec une contention calme et précise. Pour le sinus occipital, une garde sur l’aiguille limitera les risques de pénétration excessive et de lésions cérébrales. Un point de compression de 30 à 60 secondes sera appliqué pour prévenir les hématomes. L’anesthésie sera induite par injection intra-musculaire, et le relai gazeux sera fait après intubation oro-trachéale. L'anesthésie sera complétée par une administration d'analgésique. Du gel anesthésiant sera appliqué sur la sonde avant l’intubation. L'euthanasie suivra les examens d’imagerie (les animaux sont destinés à la réforme).

Choix des espèces

Le projet cible porte sur le canard mulard. Néanmoins, cette espèce n’est pas élevée au sein de la structure concernée. Les mises au point seront donc réalisées sur poules, une espèce proche. La structure peut nous fournir facilement des animaux morts et des animaux de réforme. Une fois les gestes maîtrisés chez la poule, nous utiliserons quelques canards issus de l’élevage partenaire, prévus à cet effet, pour valider dans l’espèce cible du projet. Les poules seront des adultes de réforme, pour se rapprocher au maximum du format des canards utilisés dans le projet, et pour rentabiliser au maximum leur utilisation. Les canards seront des individus prêts à gaver (soit 14 semaines d'âge), car ce sont les cibles du projet.

Tuées à l'issue pour prélever leur cœur, 40 souris génétiquement modifiées pour la perte de fonction du principal gène impliqué dans deux maladies cardiaques héréditaires humaines sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le protocole tient en deux électrocardiogrammes de trois minutes sous anesthésie générale, à huit puis à onze semaines, séparés par trois semaines d'empagliflozine ou de placebo dans l'eau de boisson. Ce médicament est déjà prescrit à des humains contre certaines formes de diabète, et le porteur en attend une réduction des anomalies électriques cardiaques. Il écrit : "Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur les paramètres électrocardiographiques", et cite deux études récentes montrant des effets du médicament sur des cellules cardiaques en culture.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer si un médicament déjà utilisé chez l'humain pour traiter certaines formes de diabète peut également réduire les anomalies de l'activité électrique cardiaque d'un modèle de souris transgénique de deux pathologies cardiaques héréditaires humaines caractérisées par ces anomalies. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement préventif médicamenteux pour les patient.e.s affecté.e.s par ces pathologies, dont les plus séverement touché.e.s doivent être implanté.e.s avec un stimulateur et/ou un défibrillateur cardiaque.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une réduction, voire une prévention, des anomalies de l'activité électrique cardiaque de ce modèle.

Procédures

A l'âge de 8 semaines et de 11 semaines, les souris seront soumises à un enregistrement de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) réalisé sous anesthésie générale. Pendant les 3 semaines séparant ces deux enregistrements, le médicament (ou le placebo) sera ajouté à l'eau de boisson à une dose thérapeutique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les souris que l'on peut anticiper lors de cette étude sont le stress susceptible d'être induit lors la manipulation des souris, les risques liés à l'anesthésie (profondeur excessive ou insuffisante) mise en place pour l'enregistrement de l'électrocardiogramme et une augmentation modérée de la diurèse pendant la prise du médicament.

Devenir

Les souris seront mises à mort à l'issue de l'étude afin de prélever leur coeur pour des études de l'activité électrique cardiaque ex vivo.

Remplacement

Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur les paramètres électrocardiographiques. Deux études récentes montrent des effets positifsdu médicament sur l'activité électrique de cellules cardiaques en culture. Mais aucune étude n'a montré un effet in vivo, de surcroit sur un modèle pathologique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. La taille des lots de souris a été déterminée à l'aide d'un logiciel de statistique sur la base de notre expérience antérieure en termes de dispersion des valeurs des paramètres électrocardiographiques. Une analyse statistique des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels ou de cabanes pour se camoufler et/ou de frisottis pour fabriquer des nids. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux seront sous anesthésie générale. Lors des enregistrement électrocardiographiques, la température corporelle sera maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des enregistrements, les souris seront placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Des tunnels sont utilisés pour manipuler les souris lors de l'induction de l'anesthésie ou pour les remettre dans leur cage après réveil, de façon à limiter le stress induit par la manipluation. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, peu probables dans le contexte de cette étude, des signes cliniques ont été identifiés et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est interrompue.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du principal gène impliqué dans les deux pathologies humaines d'intérêt pour ce projet. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 7 semaines, jusqu'à l'âge de 11 semaines.

Tatouage d'un ou deux coussinets des pattes et biopsie de la queue, sous une contention d'environ cinq minutes : voilà ce que subissent les souriceaux de cet élevage de lignées génétiquement modifiées. 15 360 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour fournir des souris aux études sur les cellules souches de l'intestin. Le champ structuré du devenir annonce 15 360 souris réutilisées et aucune mise à mort, alors que le texte du projet écrit que "Les animaux adultes surnuméraires seront mis à mort", sans que leur nombre apparaisse nulle part. Sur le raffinement, le porteur tient en une phrase, un environnement enrichi et un maintien en groupe social.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de permettre l'élevage et la caractérisation génétique de lignées de souris génétiquement modifiées, afin de fournir des modèles pertinents pour l'étude des cellules souches intestinales au cours du développement, de la régénération et des pathologies pédiatriques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, d'une part, de fournir des animaux ayants des gènes spécifiques d'intérêt pour nos études et, d'autre part, de comprendre les signaux qui régulent le développement et le maintien des cellules souches pour comprendre comment l'intestin se régénère après blessure.

Procédures

Les souriceaux subiront une contention d'environ 5 minutes pendant laquelle un ou deux coussinets des pattes seront tatoués et une biopsie de queue sera prélevée.

Impact sur les animaux

La contention peut provoquer un stress léger de courte durée chez l’animal. Par ailleurs, le prélèvement de tissu peut provoquer une légère douleur au moment du geste.

Devenir

Les animaux seront utilisés dans des projets scientifiques ou pour renouveler les accouplements. Les animaux adultes surnuméraires seront mis à mort.

Remplacement

Le projet étudiera comment le microenvironnement de l'intestin influence sa santé. Réduire le projet à un modèle de cellules isolées en culture pourrait nous priver de découvertes pertinentes liées à la complexité des interactions systémiques présentes dans l'intestin et il est donc essentiel d'étudier les cellules dans leurs conditions physiologiques.

Réduction

Les stratégies d’accouplement ont été élaborées selon des expériences antérieures pour générer un nombre restreint mais suffisant d’animaux pour réaliser au mieux les expériences. De plus, chaque souris fera l'objet de multiples analyses et les tissus prélevés seront exploités pour plusieurs types d'expériences. Les animaux ne portant pas le génotype d'intérêt seront eux aussi utilisés pour des expériences n'impliquant pas le besoin de marquage cellulaire.

Raffinement

les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi et en groupe social.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est un modèle largement reconnu et particulièrement avantageux pour la recherche sur l'intestin grâce à ses similiratités avec la physiologie humaine. Ceci en fait un excellent modèle translationnel, promettant des avancées inestimables pour la compréhension des fonctions intestinales en santé comme en maladie. De plus, de nombreux modèles transgéniques d'intérêt pour notre étude ont déjà été établis chez la souris. Les souriceaux ont entre 7 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets. Le prélèvement caudal est fait en meme temps pour permettre une caractérisation génétique avant le sevrage.

Une solution colorée est administrée par sonde buccale à 96 souris pour mesurer leur temps de transit intestinal, après deux semaines d'exposition à une molécule bactérienne dans l'eau de boisson. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance léger, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélever organes et tissus, le porteur indiquant qu'elles ne pourraient pas être réutilisées sans fausser d'autres résultats. Un test impose cinq heures de privation de nourriture, un autre une heure seule dans une cage propre pour compter les crottes. Le projet annonce des tests de comportement portant sur les interactions sociales, les déplacements, les comportements répétitifs et l'anxiété, sans préciser lesquels seront employés, et le porteur souligne lui-même qu'il ne cherche pas à reproduire la complexité de l'autisme chez la souris.

Objectifs

Certains troubles du développement du cerveau, comme les troubles du spectre de l’autisme, peuvent être associés à des difficultés dans les interactions sociales, à des comportements répétitifs, à de l’anxiété, mais aussi à des troubles digestifs. On sait aujourd’hui que l’intestin et le cerveau communiquent entre eux. Dans l’intestin, les bactéries participent à la digestion et peuvent produire de petites molécules qui passent dans l’organisme. Certaines de ces molécules pourraient agir à la fois sur l’intestin et sur le cerveau. Dans ce projet, nous étudions une de ces petites molécules produites par des bactéries intestinales lors de la transformation de certains composants de l’alimentation. Le but du projet est de savoir si une exposition prolongée à cette molécule peut modifier le comportement et le fonctionnement intestinal chez la souris. Pour cela, des souris recevront cette molécule dans leur eau de boisson, puis leur comportement et leur transit intestinal seront étudiés. Nous regarderons notamment si cette molécule modifie les interactions sociales, les comportements répétitifs, l’anxiété ou le fonctionnement de l’intestin. Ce projet ne vise pas à reproduire toute la complexité de l’autisme chez la souris, mais à mieux comprendre si une molécule produite par les bactéries intestinales peut influencer à la fois l’intestin et le comportement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment une molécule produite par les bactéries intestinales peut influencer à la fois le comportement et le fonctionnement de l’intestin. Les résultats permettront de savoir si une exposition prolongée à cette molécule modifie les interactions sociales, les comportements répétitifs, l’anxiété ou le transit intestinal chez la souris. Ils aideront ainsi à mieux comprendre les liens possibles entre l’intestin, les bactéries qui le colonisent et le cerveau. Ce projet présente un intérêt pour la recherche sur les troubles du neurodéveloppement, comme les troubles du spectre de l’autisme, car ces troubles peuvent être associés à la fois à des difficultés de comportement et à des troubles digestifs. À plus long terme, ces connaissances pourront orienter de nouvelles recherches visant à mieux comprendre le rôle du microbiote intestinal et des molécules qu’il produit dans le fonctionnement du cerveau et de l’intestin.

Procédures

Les souris recevront la molécule étudiée dans leur eau de boisson. Cette étape ne nécessite pas de geste direct sur les animaux. Après deux semaines, les souris passeront plusieurs tests de comportement. Chaque test sera réalisé une seule fois par animal. Ces tests permettront d’observer les interactions sociales, les déplacements, les comportements répétitifs et l’anxiété. Leur durée sera courte : environ 5 à 10 minutes selon les tests. Un test nécessitera une privation de nourriture de 5 heures avant de mesurer le temps mis par la souris pour manger dans un nouvel environnement. Les souris auront ensuite deux tests pour étudier le fonctionnement de l’intestin. Pour mesurer la production de crottes, chaque souris sera placée seule pendant 1 heure dans une cage propre. Pour mesurer le transit intestinal, une solution colorée sera administrée par la bouche à l’aide d’une petite sonde. Le temps d’apparition des premières crottes colorées sera ensuite mesuré. Ce test durera au maximum 6 heures. Aucune chirurgie ne sera réalisée. Aucun prélèvement sanguin ne sera effectué.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont surtout liés aux tests réalisés sur les souris, et non à la molécule donnée dans l’eau de boisson. L’exposition prolongée à cette molécule ne devrait pas provoquer d’effet indésirable important. Dans les conditions prévues, les collaborateurs du projet n’ont pas observé de signe préoccupant chez les souris exposées. Les tests de comportement peuvent provoquer un stress bref, par exemple lorsque la souris est manipulée, placée dans un nouvel environnement, isolée temporairement ou mise en présence d’une autre souris inconnue. Ces tests ne sont pas douloureux, mais ils peuvent entraîner une gêne ou une anxiété passagère. Les tests du fonctionnement intestinal nécessitent une administration par la bouche à l’aide d’une petite sonde. Ce geste peut provoquer un stress bref lié à la contention et, plus rarement, une irritation digestive. Ces effets sont attendus comme temporaires. Les animaux seront surveillés afin de détecter tout signe de douleur, de stress prolongé ou d’altération de leur état général.

Devenir

À la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort par une méthode réglementaire. Cette mise à mort est nécessaire car les souris auront reçu la molécule étudiée pendant plusieurs semaines et auront réalisé l’ensemble des tests prévus. Elles ne pourront donc pas être réutilisées dans une autre étude sans risque de fausser de nouveaux résultats. La mise à mort permettra aussi de récupérer des organes ou des tissus après la mort, afin de réaliser des analyses complémentaires. Ces analyses aideront à mieux comprendre les effets de la molécule étudiée sur l’organisme.

Remplacement

Ce projet ne peut pas être réalisé uniquement avec des cellules, des organes isolés ou des modèles informatiques. La question posée concerne à la fois le comportement et le fonctionnement de l’intestin. Pour y répondre, il faut pouvoir étudier un animal vivant, dans lequel l’intestin et le cerveau communiquent entre eux. Des cellules en culture peuvent aider à comprendre certains mécanismes simples, mais elles ne permettent pas d’observer des interactions sociales, des comportements répétitifs, de l’anxiété ou le transit intestinal. Le recours à la souris est donc nécessaire pour savoir si une exposition prolongée à une molécule produite par des bactéries intestinales peut modifier à la fois le comportement et le fonctionnement de l’intestin.

Réduction

Le nombre de souris a été limité au minimum nécessaire pour répondre à la question scientifique. Le projet utilisera 96 souris au total. Les animaux seront répartis en groupes permettant de comparer les souris recevant la molécule étudiée et les souris contrôles, chez les mâles et chez les femelles. Les mêmes souris seront utilisées pour les tests de comportement puis pour les tests du fonctionnement intestinal. Cela évite d’utiliser des groupes différents pour chaque type de test. Cette organisation permet de réduire le nombre total d’animaux tout en obtenant les informations nécessaires pour étudier les effets de la molécule sur le comportement et l’intestin.

Raffinement

Tout sera fait pour limiter le stress et l’inconfort des souris. Les animaux seront hébergés en groupes, avec du matériel pour faire un nid et un abri. Ils auront une période d’acclimatation d’au moins 7 jours après leur arrivée. Les souris seront habituées progressivement aux manipulations avant les tests, afin de réduire le stress lié à la prise en main et à la contention. Les tests seront réalisés dans un environnement calme, dans des conditions standardisées. Les animaux seront replacés dans leur cage d’origine après chaque test. Lorsque cela sera possible, un seul test sera réalisé par jour afin de limiter la fatigue et le stress. Les gestes nécessitant une contention, comme l’administration orale utilisée pour le test du transit intestinal, seront réalisés par du personnel formé. L’état général des animaux sera surveillé au cours de la procédure. Tout animal présentant un signe de douleur, de stress prolongé ou d’altération importante de son état général sera retiré de la procédure.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle permet d’étudier à la fois le comportement et le fonctionnement de l’intestin chez un animal vivant. Ces deux aspects sont importants dans ce projet, car nous voulons savoir si une molécule produite par des bactéries intestinales peut agir à la fois sur l’intestin et sur certains comportements. La souris est aussi une espèce adaptée pour observer les interactions sociales. Elle vit naturellement avec d’autres souris et son comportement peut être étudié avec des tests simples et bien connus. Elle permet donc d’évaluer si la molécule étudiée modifie les contacts avec les autres souris, l’anxiété, les comportements répétitifs ou le transit intestinal. Les souris seront utilisées après le sevrage, à l’âge de 3 à 4 semaines. Le traitement commencera vers l’âge de 4 semaines, une période où l’animal est encore en développement et où le cerveau et le comportement continuent de mûrir. Les tests seront ensuite réalisés après plusieurs semaines de traitement. Ce choix permet d’étudier si l’exposition à cette molécule pendant une période importante du développement peut modifier le comportement et le fonctionnement de l’intestin.

Tuées pour alimenter une biobanque de tissus, ou parce que leur fécondité baisse vers douze mois, 1 686 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. À partir de douze jours de vie, les souriceaux subissent sous anesthésie gazeuse une biopsie d'oreille de 2 mm et un tatouage de phalange, la mère étant séparée de sa portée le temps du geste. L'élevage entretient une lignée porteuse d'une maladie neurodégénérative humaine, et le porteur précise qu'aucune nuisance liée au génotype n'est attendue parce que les souris n'atteindront pas l'âge d'apparition des symptômes. Il justifie le choix de l'espèce par "98% d'identité protéique avec l'Homme", une croissance rapide qui fournit des cohortes en quelques semaines et une petite taille adaptée aux travaux d'histologie.

Objectifs

Ce projet, déployé sur deux établissements utilisateurs, a pour objectif de permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement d’une maladie neurodégénérative fatale chez l’Homme. Cette maladie génétique entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance et affecte plusieurs organes du système nerveux et neuromusculaire comme le cerveau, le cervelet, la moelle épinière, les nerfs et les muscles. Pour mieux comprendre les mécanismes de cette pathologie et tester de nouvelles approches thérapeutiques, nous avons développé chez la souris, un modèle de la maladie qui reproduit les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Afin de poursuivre ces recherches, nous devons produire et maintenir cette lignée de souris ainsi que génotyper les animaux afin de savoir s’ils sont exempts, porteurs ou atteints de la maladie. Nous réalisons également des prélèvements de tissus à différents stades de développement pour identifier les mécanismes physiopathologiques et investiguer l’évolution de la maladie ainsi qu’évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies développées au laboratoire.

Bénéfices attendus

L'étude de modèles pour cette maladie neurologique est essentielle pour mieux la comprendre et développer de futurs traitements. Grâce à ces recherches, plusieurs avancées sont attendues : 1) Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans cette maladie rare. 2) Une connaissance sur le développement du système nerveux normal et dans le cadre de cette maladie 3) L’identification de nouvelles cibles et, potentiellement, de futurs traitements. Ces travaux sont une étape clé pour progresser vers des solutions thérapeutiques adaptées aux patients concernés.

Procédures

Prélèvement d’une biopsie d’oreille de 2 mm maximum sur animaux anesthésiés à partir de 12 jours de vie au sein de l’établissement utilisateur 1 (manipulation nécessitant quelques secondes par individu).

Impact sur les animaux

- Les souriceaux, à partir de 12 jours de vie, subiront une biopsie à l’oreille et un tatouage de phalange pour l’identification. Les souriceaux manipulés peuvent ressentir un court stress dû à leur brève contention, ainsi que la mère, séparée de sa portée le temps de la procédure. Le prélèvement de la biopsie et le tatouage, réalisés sous anesthésie gazeuse, peuvent générer une courte et légère douleur. - La manipulation répétée pour l’identification des géniteurs, leur mise en accouplements et la vérification des bouchons vaginaux et des gestations causent un stress léger et court, qui s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. - Nuisances dues au phénotype : Il n’y a aucune nuisance liée au génotype car les animaux n’atteindront pas l’âge d’apparition des symptômes phénotypiques.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être adoptés. Après génotypage, les animaux alimenteront les cohortes de reproducteurs selon leur génotype. Les femelles et les embryons/souriceaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus désirés. Lorsque leur âge approchera 12 mois ou si une baisse importante de la fécondité est constatée, les animaux reproducteurs seront mis à mort, avec prélèvement de tissus alimentant une biobanque selon le génotype.

Remplacement

Les mécanismes physiopathologiques de cette neuropathie rare sont encore mal compris et les recherches se poursuivent pour mieux les caractériser. Les interactions cellulaires complexes du cervelet ou des ganglions rachidiens dorsaux (par exemple interaction entre différents types cellulaires du système nerveux) ne peuvent pas être reproduites en laboratoire sur des cellules isolées ou par des simulations informatiques. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux est essentielle : elle permet d’étudier les mécanismes de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques. En parallèle, notre équipe se concentre toutefois également sur des modèles alternatifs de culture cellulaire (tels que les cultures de lignée ou des cultures à partir de cellules souches reprogrammées) et de modélisation permettant de déterminer certains mécanismes in vitro. Malgré cela, il n’est pas possible à l’heure actuelle de remplacer totalement les modèles murins ou les cultures primaires par des modèles purement in vitro, en particulier pour les neurones qui ne peuvent être congelés ou immortalisés.

Réduction

Pour mener nos recherches, nous appliquons une gestion rigoureuse du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de croisement et la sélection de reproducteurs, afin de favoriser au mieux l’obtention d’animaux de génotypes désirés. Lorsque c’est possible, les mêmes reproducteurs sont réutilisés. Les modèles animaux sont utilisés uniquement lorsque cela est indispensable pour nos études en cours. Nous ajustons le nombre d’animaux en fonction des analyses nécessaires pour garantir les résultats scientifiques en utilisant le nombre minimum d’animaux. De plus, nous utilisons des souris des deux sexes, ce qui permet de réduire le nombre de portées nécessaires. Les tissus prélevés sur les animaux permettront de réaliser des expériences ex-vivo / in vitro et de multiplier les conditions expérimentales à partir d’un seul prélèvement / un seul animal. Les tissus issus des animaux sont systématiquement conservés dans une biobanque et partagés avec d’autres projets de recherche compatibles, maximisant ainsi leur utilité. Nous avons mis en place un programme de cryoconservation pour éviter de maintenir des lignées qui ne sont pas utilisées activement dans nos études. Cela nous permet de ne pas conserver des animaux plus de 9 mois si leur utilisation n’est pas nécessaire.

Raffinement

Pour réaliser les analyses génétiques nécessaires sur les animaux, une petite biopsie de l’oreille (2 mm maximum) sera prélevée. Cette méthode permet d’éviter les complications couramment associées aux bagues numérotées et les contaminations entre échantillons lors de l’analyse (notamment observées pour la collecte de poils qui n’est pas adaptée pour un grand nombre d’animaux). Le prélèvement est rapide (quelques secondes par animal), réalisé sous anesthésie par le personnel de l’établissement utilisateur 1. La douleur et le stress sont minimes. Chaque animal est surveillé de façon individuelle et quotidienne. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place pour soustraire l’animal à la souffrance. Des enrichissements et de la nourriture gélifiée pourront également être proposés pour améliorer leur confort. Lorsque cela est possible, les mâles reproducteurs seront placés avec leurs descendants après le sevrage pour limiter leur isolement. De plus, certains animaux non destinés aux expériences seront conservés jusqu’à un an d’âge maximum afin d’accompagner les animaux d’intérêt et éviter qu’ils restent seuls avant leur utilisation.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme et une physiologie comparable à l’humain, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les désordres moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation pour avancer sur la compréhension des mécanismes pathologiques et sur des approches thérapeutiques. Le développement embryonnaire et post-natal rapide permet d’obtenir des cohortes en quelques semaines et la petite taille des animaux est adaptée aux travaux en histologie. Les animaux pour la reproduction seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (8 semaines pour les mâles, 6 semaines pour les femelles). Les individus reproducteurs seront utilisés jusqu’à l’âge de 12 mois maximum (sauf baisse de la fertilité importante avant ce repère). Les tissus sont prélevés à partir à des stades embryonnaires et jusqu’à 28 jours post-natal. L’utilisation d’animaux à ces stades précoces de développement nous permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement neuronal.