Procédures légères
Endothélium et immunité au cœur de l’effet FLASH après radiothérapie thoracique à ultra-haut débit de dose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Transportées trente minutes vers le site d'irradiation, anesthésiées, irradiées au thorax, puis ramenées, 1 280 souris seront gardées une semaine, deux semaines, trois mois ou six mois avant d'être tuées pour prélèvements. 416 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 416 un niveau modéré et 448 un niveau léger. Le porteur écrit que la radiothérapie est imperceptible et ne peut causer de souffrance, tout en décrivant une fibrose pulmonaire tardive qui provoque fatigue, atteinte de la mobilité et modification de la respiration chez environ 10 % des animaux. Il annonce un suivi quotidien et une mise à mort si les signes persistent plus de trois jours, sans préciser combien de souris atteindront les six mois d'observation.
Objectifs
La radiothérapie est un traitement souvent utilisé contre le cancer, car elle permet de détruire les cellules malades. Mais elle touche aussi les tissus sains autour de la tumeur, ce qui peut provoquer des effets secondaires parfois importants et limiter l’efficacité du traitement. Pour améliorer cela, une nouvelle méthode appelée radiothérapie FLASH attire beaucoup d’attention. Contrairement à la radiothérapie classique, elle envoie les rayons à une intensité très forte, mais pendant un temps très court. Les premières recherches montrent que cette technique pourrait mieux protéger les tissus sains tout en restant efficace contre la tumeur. Cet effet protecteur, appelé « effet FLASH », n’est pas encore bien compris. Parmi les explications possibles, le rôle du système immunitaire semble important. Il est possible que la réaction du corps aux rayons change selon la méthode utilisée. Ce projet cherche donc à savoir si la façon dont le système immunitaire réagit pourrait expliquer pourquoi la méthode FLASH provoque moins d’effets secondaires. L’étude se concentre sur les cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux sanguins, appelées cellules endothéliales. Elles jouent un rôle clé dans les réactions aux rayons et dans la défense du corps. Elles aident aussi les cellules de défense à atteindre les zones abîmées. Nous voulons observer comment ces cellules réagissent à la radiothérapie FLASH chez la souris, en particulier dans les poumons, et voir si cette technique change leur comportement, leur capacité à attirer les cellules de défense et la nature de la réaction inflammatoire, par rapport à la radiothérapie classique. Ce travail s’appuie sur des recherches précédentes faites chez la souris avec des rayons classiques. Cette nouvelle étape aidera à mieux comprendre comment limiter les effets secondaires de la radiothérapie sans réduire son efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mieux comprendre comment certaines cellules des vaisseaux sanguins des poumons réagissent à une nouvelle forme de radiothérapie appelée FLASH. Cette technique envoie des doses très fortes de rayons en un temps très court. Elle pourrait permettre de soigner les tumeurs tout en limitant les dégâts sur les tissus sains. L’objectif est d’observer, chez la souris, comment ces cellules réagissent après une irradiation FLASH et comment elles interagissent avec le système immunitaire. Cela aidera à savoir si cette méthode protège mieux les tissus sains. Ce projet apportera plusieurs bénéfices. Sur le plan scientifique, il permettra de mieux comprendre le rôle de ces cellules dans la réaction du corps à la radiothérapie, notamment leur influence sur l’activation et l’arrivée des cellules de défense. Comprendre leur rôle dans l’effet FLASH, c’est-à-dire la protection des tissus sains malgré un traitement efficace, pourrait ouvrir la voie à de nouvelles façons d’améliorer la radiothérapie. Ces découvertes pourraient aussi inspirer de nouveaux traitements qui protègent mieux les tissus sains tout en renforçant la défense du corps contre la tumeur. Ce projet pourrait aider à réduire les effets secondaires parfois graves de la radiothérapie, comme les cicatrices dans les poumons ou les inflammations chroniques, et ainsi améliorer la qualité de vie des patients. Sur le plan médical, mieux comprendre les mécanismes responsables des dommages causés par les rayons permettra de créer des traitements plus ciblés pour les éviter ou les soigner. Cela rendra la radiothérapie plus sûre et plus facile à supporter.
Procédures
Les animaux seront d’abord transportés vers le site d’irradiation (30 min). Les animaux seront anesthésiés et irradiés localement (durée max de 20 min par irradiation). Puis ils reviendront sur le site d’hébergement (30 min de transport). Les animaux seront gardés 1 semaine, 2 semaines, 3 mois ou 6 mois en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie avant euthanasie. Certains animaux seront imagés avec un scanner sous anesthésie juste avant l’euthanasie (durée max de 10-15 minutes). D’autres animaux seront analysés par échographie sous anesthésie à plusieurs temps après l’irradiation (suivi longitudinal, cinq fois en tout). Ces examens seront réalisés au site d’hébergement des animaux, la phase de transfert n’excédera donc pas 5 min. Aucune autre manipulation ne sera réalisée.
Impact sur les animaux
Lors des phases de transport vers le lieu d’irradiation ou vers les locaux d’imagerie, mais également lors de la préhension, de la contention ou de l’anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La radiothérapie en elle-même est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. Dans les temps précoces, des rougeurs et irritations peuvent apparaitre au niveau cutané chez certains animaux. Le développement de fibrose au niveau pulmonaire dans les temps tardifs après irradiation peut engendrer une détresse telle que : atteinte de la mobilité, fatigue, modification de la respiration. Ces signes sont facilement détectables et concernent environ 10% des animaux.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Pour l’instant, il n’existe pas de méthode sans utiliser d’animaux qui permette d’étudier précisément comment les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins réagissent dans leur environnement naturel. Cet environnement est important, car il influence leur comportement ainsi que la façon dont les cellules endothéliales attirent les cellules du système immunitaire. C’est pourquoi il est encore indispensable d’utiliser des animaux vivants pour cette étude. Toutefois, ce projet participe au développement d’un modèle en laboratoire, sans animaux, capable de prédire les risques de toxicité liés à la radiothérapie. Ce modèle utilisera des cellules cultivées en laboratoire pour simuler la réaction aux rayons, ce qui pourrait, à terme, diminuer voire remplacer certaines expériences sur les animaux. De plus, certaines idées issues de ce projet seront testées directement sur des modèles cellulaires en laboratoire, notamment pour étudier comment les cellules endothéliales interagissent avec les cellules immunitaires. Cela permettra de mieux cibler les expériences à faire ensuite sur les animaux, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour la suite des recherches.
Réduction
Les résultats des expériences sur les lésions pulmonaires causées par la radiothérapie dépendent beaucoup de la physiologie des animaux utilisés. Pour pouvoir faire des analyses fiables, il faut travailler avec un certain nombre d’animaux. Par exemple, pour les analyses des tissus au microscope, on a besoin de groupes d’environ 10 à 12 animaux. Pour étudier les molécules à l’aide d’une technique appelée cytométrie de flux, des groupes de 6 à 8 animaux suffisent. Pour des analyses plus fines, comme le séquençage de l’ARN à l’échelle de chaque cellule ou l’étude de l’expression des gènes dans les tissus, moins d’animaux sont nécessaires (entre 4 et 6), car ces méthodes étudient des milliers de cellules par échantillon, ce qui améliore la précision des résultats. Enfin, pour tester les interactions entre les cellules des vaisseaux sanguins et les cellules du système immunitaire, il faut aussi des groupes de 6 à 8 animaux afin de collecter assez de cellules pour les expériences.
Raffinement
Lors des séances d’irradiation, les souris seront anesthésiées pour qu’elles restent immobiles et ne ressentent aucune douleur. Pour certains examens nécessitant l’injection d’un produit dans le sang avant le prélèvement final, un analgésique sera administré afin de garantir l'absence de douleur chez l’animal. Pendant toute la durée de l’étude, elles seront logées dans de bonnes conditions, avec des jouets comme des tubes ou des caches, de la nourriture et de l’eau à volonté, ainsi qu’une température et une humidité contrôlées. Les animaux seront surveillés chaque jour pour s’assurer qu’ils restent en bonne santé. Ils seront pesés plusieurs fois par semaine au début, puis une fois par semaine pendant plusieurs mois, pour vérifier qu’ils ne perdent pas trop de poids. Nous observerons aussi leur comportement et leur état de santé, en vérifiant par exemple s’ils bougent normalement ou s’ils montrent des signes de souffrance, comme des difficultés à respirer. Si un animal présente des signes inquiétants pendant plus de trois jours, il sera euthanasié pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 8 à 10 semaines, un âge correspondant à l’âge adulte, ce qui permet de limiter la variabilité liée à la croissance. Cette tranche d’âge est d’ailleurs celle couramment utilisée pour les modèles d’irradiation localisée. Pour garantir une certaine homogénéité, nous travaillerons avec des souris mâles, qui ont un poids d’environ 20 à 22 grammes à cet âge. Ce choix s’appuie aussi sur notre expérience préalable, puisque notre laboratoire dispose déjà d’un solide recul sur ce modèle chez les mâles. Nous prévoyons néanmoins d’étendre nos recherches aux femelles dans un projet futur, afin d’étudier les effets du débit de dose selon le sexe. La souris est un modèle bien connu et largement utilisé dans les études précliniques, notamment au sein de notre laboratoire pour étudier l’irradiation thoracique et le rôle des cellules endothéliales vasculaires dans les lésions radio-induites. Cette expérience accumulée nous assure une bonne maîtrise des conséquences de l’irradiation dans ce modèle.
Épidémiologie descriptive et biocontrôle des mouches gastérophiles dans un contexte de réduction de l’usage des traitements chimiques MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Maintenus à jeun vingt-quatre heures, puis sédatés pour qu'une sonde passe de la narine à l'estomac, 104 chevaux et ânes subissent trois gastroscopies par an ainsi que des prélèvements de matière fécale par le rectum. Après vermifugation, ils passent 96 heures isolés dans des boxes sans paille, sur des tapis en mousse, le temps de compter les larves de gastérophiles qu'ils excrètent. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger et le porteur affirme que ce protocole n'engendre "dans aucun cas" un danger pour la santé de l'animal, tout en décrivant l'inconfort de l'isolement et du sol nu. Aucun équidé n'est tué, le porteur rangeant ces interventions parmi les actes d'élevage courants qui ne remettent pas en cause leur bien-être.
Objectifs
Par manque de diagnostic spécifique et efficace, le contrôle des endoparasites des chevaux se fait en utilisant des antiparasitaires de synthèse en routine et sans évaluation préalable. Cette utilisation non raisonnée des vermifuges sélectionne des isolats parasitaires résistants. De plus, les résidus de ces traitements sont relargués dans l’environnement et constituent une source importante de pollution. Une réduction de leur usage est donc souhaitable mais il n'existe pas de solutions alternatives de contrôle pour la gestion de ces mouches. Ces mouches sont responsables d'ulcères de l'estomac des chevaux. Pour mieux raisonner les usages, nous proposons d’associer le statut physiologique et parasitaire de l’hôte à la signature odorante des équidés. Les composés odorants isolés permettront d’identifier les animaux ayant un besoin de traitement ou de mettre en place des stratégies de piégeage des mouches dans les prairies.
Bénéfices attendus
Les connaissances qui seront acquises à la fin de ce projet seront très originales et apporteront des solutions innovantes à la filière équine en santé animale. L’innovation de notre projet et notre ambition sont d’établir les bases pour un diagnostic du parasitisme grâce aux odeurs émises par les équidés parasités. Nos résultats combleront également l’ignorance sur des sujets comme les interactions de la faune gastrointestinale des équidés et proposeront des mesures concrètes pour évaluer le parasitisme. Jusqu’à présent, le problème émergent des gastérophiles restait invisible grâce à leur traitement opportuniste en même temps que le traitement des nématodes gastrointestinaux. Ainsi, nous n’avions à disposition aucun moyen diagnostique du problème. Le suivi du changement des odeurs lorsqu’un animal est parasité aidera aussi à définir de nouveaux seuils de parasitisme acceptables pour le bien-être animal. Cette nouvelle approche de gestion du parasitisme se veut adaptée à l’état physiologique de l’animal et à ses besoins de traitement. Ceci nous permettra de limiter l’utilisation de molécules chimiques. Dans le cadre du concept One Health, notre équipe proposera des nouvelles molécules naturelles, issues de la chimiosensation des parasites (habilité de détecter des molécules présentes dans l’environnement et pour la plupart impliquées dans des fonctions vitales pour l’organisme), qui viendront appuyer les efforts pour le développement de moyens de lutte plus respectueux de l’environnement et du bien-être animal. Ces stratégies alternatives de lutte ne sont pas incompatibles avec les traitements actuels et aideront à diminuer progressivement les traitements pharmacologiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des gastroscopies sous sédation (intervention de 20 min) et des prélèvements de matière fécale intra-rectale. Chaque acte sera effectuée 3 fois dans l'année pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Les actes prévus par ce projet sont des actes d’élevage couramment utilisés (coproscopies, vermifugations, gastroscopies, tonte). Les effets indésirables pour les animaux pourraient venir des gastroscopies qui nous obligent de maintenir à jeun les chevaux pendant 24 heures. Les animaux sont ensuite sédatés pour pouvoir passer la sonde du gastroscope de la narine jusqu’à leur estomac. Avec la sédation nous essayons de minimiser les effets désagréables de l’endoscopie mais dans aucun cas ce protocole n’engendre un danger pour la santé de l’animal. Un autre effet désagréable pour les animaux est le maintien pendant 96h dans des boxes lors du comptage des larves de gastérophiles excrétées suite à la vermifugation. Des tapis en mousse sont fournies aux chevaux pour minimiser leur inconfort. L’inconfort peut venir de l’isolement de l’individu de son groupe et le manque de paillage au sol. Cette procédure ne se produit qu’une fois par an pour chaque cheval impliqué mais elle est nécessaire pour avoir le nombre exact de larves présentes dans l’estomac de chaque animal avant la vermifugation et établir ainsi la charge parasitaire qui caractérise chaque individu. L’animal a du foin ad libitum et il est sorti dans un paddock sablé tous les jours durant le protocole. Il voit plusieurs fois par jours les animaliers et les expérimentateurs qui surveillent de près son comportement.
Devenir
Les interventions réalisées dans ce projet correspondent à des actes d'élevage couramment utilisés, qui ne remettent pas en cause le bien-être ou la santé de l'animal.
Remplacement
Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle alternatif de maintien du cycle d’infestation des gastérophiles in vitro. De plus, nos activités consiste à évaluer la charge parasitaire des animaux en lien avec différentts modes de lutte, ce qui n’est pas possible sans animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire pour mettre en évidence les effets recherchés. En revanche, chaque période de vermifugation recquiert des chevaux différents.
Raffinement
Suite à la vermifugation les animaux seront maintenus dans des boxes tapissés avec des tapis en mousse pour réduire leur inconfort dû à l’absence de paillage. Des visites régulières (toutes les heures durant la journée et une fois dans la nuit) seront effectuée par les animaliers pour surveiller le comportement des animaux et détecter d’éventuels signes de stress accru. La gastroscopies sont réalisées après sédation par deux vétérinaires spécialistes en médecine équine, référents pour le troupeau de l'établissement utilisateur.
Choix des espèces
Les gastérophiles sont des parasites inféodés aux chevaux. Notre projet porte sur toutes les classes d'âge rencontrées en élevage.
MODIFICATION Production d’anticorps spécifiques de protéines recombinantes et EVALUATION de candidats vaccins contre le paludisme CHEZ LES RONGEURS.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 230
Une injection de protéines de Plasmodium avec adjuvant complet de Freund, des rappels, une prise de sang pour vérifier le titre d'anticorps, puis une exsanguination par ponction intracardiaque sous anesthésie : 2 770 souris et 230 rats vont être utilisés, la plupart dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît que des alternatives non animales existent pour produire des anticorps, anticorps recombinants et aptamères, et écarte cette voie parce qu'une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée. Les animaux dont le titre d'anticorps satisfait sont tués pour récupérer leur sérum, ceux dont le titre ne convient pas sont tués aussi, ayant déjà reçu une injection. Le texte ajoute qu'ils pourraient tout de même être réutilisés dans d'autres projets, "dans la mesure du possible".
Objectifs
Le paludisme est un problème de santé publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 627 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludiques et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludiques. La maladie est causée par le parasite du genre Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 5 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus répandues : Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anopheles, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Notre laboratoire étudie les mécanismes d’invasion des globules rouges humains par Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire, pour Plasmodium falciparum, peut être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez la souris, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons d’inhiber ces protéines à la surface du mérozoïte (forme du parasite permettant d’infecter un nouveau globule rouge) ainsi que de déterminer la réponse immunitaire des candidats vaccins contre Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax.
Bénéfices attendus
Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces de Plasmodium disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, l’inhibition de la croissance parasitaire, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de l’invasion chez P. falciparum, P. vivax et P. knowlesi. De plus, les infections de souris par des candidats vaccins permettront un criblage des préparations vaccinales.
Procédures
1) Une prise de sang (une minute). 2) Une injection (une minute). 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés à l’injection des protéines avec adjuvant et des candidats vaccins. Dans des très rares cas les souris peuvent mal supporter les protéines recombinantes et les candidats vaccins à ARNm. Elles peuvent montrer une réaction inflammatoire. Les souris recevront les protéines recombinantes en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres injections. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie sous-cutanée peut induire des effets indésirables. Les injections des candidats vaccins à ARNm se feront par la voie intra-musculaire sans adjuvant. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse.
Devenir
Toutes les souris et tous les rats ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mises à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant pour l’études des protéines d’invasion ou déterminer les candidats vaccins permettant la meilleure immunisation possible contre P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi. Toutes les souris n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant lors de prélèvements intermédiaires seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de protéines recombinantes ou une dose de candidats vaccins à ARNm. Elles ne peuvent donc pas être réutilisés dans notre projet. Cependant, elles peuvent être réutilisées dans d’autre projets dans la mesure du possible.
Remplacement
L’alternative possible à l’emploi de sérums serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêt et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale. Cependant, pour chaque protéine identifiée avec certitude dans l’invasion du globule rouge par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi, nous ferons des hybridomes permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux. Ce qui nous permettra de bénéficier d’une banque d’anticorps pour l’étude des mécanismes d’invasion du globule rouge par les Plasmodium. De plus, l’utilisation de souris préalablement infectées par du Plasmodium berghei permet de valider les préparations vaccinales avant d’envisager de futur développement de ces vaccins.
Réduction
LE NOMBRE DE SOURIS ET DE RATS POUR CHAQUE EXPERIMENTATION A ETE CALCULE AU PLUS JUSTE POUR PERMETTRE L’UTILISATION D’UN NOMBRE MINIMUM D’ANIMAUX. CETTE ESTIMATION A ETE REALISEE EN CONCERTATION AVEC UN BIOSTATISTICIEN. AINSI, NOUS AVONS CHOISI DES GROUPES DE 7 SOURIS ET 5 RATS DONT LES SERUMS SERONT POOLÉS AFIN D’AVOIR UNE QUANTITE DE SERUMS SUFFISANTE POUR UNE ETUDE APPROFONDIE ET REPETEE. IL N’EXISTE PAS ACTUELLEMENT DE SYSTEME QUI PERMETTE DE REPRODUIRE LE CYCLE DE VIE COMPLET DE PLASMODIUM IN VITRO. PAR CONSEQUENT, POUR REALISER CE PROJET, DES INFECTIONS HEBDOMADAIRES DE RONGEURS ET DE MOUSTIQUES SONT NECESSAIRES. LES PROTOCOLES UTILISES ONT ETE MIS AU POINT DANS DIFFERENTS LABORATOIRES Y COMPRIS LE NOTRE ET TOUTES LES ETAPES SONT BIEN MAITRISEES NOUS UTILISONS LE NOMBRE MINIMAL POSSIBLE D’ANIMAUX POUR NOS EXPERIENCES. POUR LES PROCEDURES 1, 2 ET 3, EVALUATION DES CANDIDATS VACCINS A ARNM, NOUS UTILISERONS DES SOURIS ET DES RATS POUR TESTER LA REPONSE IMMUNITAIRE. POUR LA PROCEDURE 4, PREPARATION DE STOCKS DE SANG INFECTE POUR P. BERGHEI, NOUS UTILISONS DES RATS CAR LEUR VOLUME SANGUIN EST PLUS IMPORTANT QUE CELUI DES SOURIS. AINSI NOUS REDUISONS LE NOMBRE D’ANIMAUX UTILISES.
Raffinement
Si signes de détresse ou de souffrance pendant les prélèvements nous pouvons utiliser une anesthésie gazeuse sous isoflurane. Une surveillance accrue pendant 3 jours suivant les injections et puis 2 fois par semaine entre les injections et les prélèvements ainsi que des soins post manipulation. 1) Les souris ET LES RATS sont hébergés dans des animaleries agrées de l’Institut Pasteur dans des conditions optimales répondant aux normes européennes, avec une surveillance quotidienne. La température, l’hygrométrie et la photopériodicité sont très rigoureusement contrôlées par le système d’alarmes informatisé. L’accès est strictement contrôlé (badge) et les animaux sont manipulés par des techniciens qualifiés et par des expérimentateurs formés. 2) Les souris ET LES RATS sont inoculés avec P. berghei, espèce adaptée aux rongeurs de laboratoire, par voie intrapéritonéale ou intra-veineuse. Il s’agit de gestes rapides. Le niveau de parasitémie durant la phase sanguine est suivi quotidiennement à partir du jour 3. De plus et si nécessaire, nous utiliserons la grille standard comportementale/clinique de la SBEA pour évaluer l’état de santé des animaux. Les critères principaux évalués seront les suivant : poils hérissés, motricité lente, prostration, pâleur des pattes (anémie). LES ANIMAUX OBTENANT UN SCORE DE 2 POURRONT BENEFICIER DE MESURES D’AMELIORATION DES CONDITIONS D’HEBERGEMENT (ENRICHISSEMENT, CHAUFFERETTE) ET DE L’ALIMENTATION (GEL DIETETIQUE). POUR UN SCORE SUPERIEUR A 2, ILS SERONT MIS A MORT. 3) POUR EVITER LA DOULEUR ET LA SOUFFRANCE PENDANT CERTAINES MANIPULATIONS, LES SOURIS SONT ANESTHESIEES..
Choix des espèces
Nous avons choisi de produire nos anticorps ET D’EVALUER NOS CANDIDATS VACCINS chez la souris ET LE RAT car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de Plasmodium sont très immunogènes CHEZ CES ANIMAUX. De plus il est indispensable de tester des candidats vaccins sur des souris ET DES RATS avant de continuer leurs développements. LES HOTES NATURELS DES PARASITES P. BERGHEI SONT DES ESPECES DE RONGEURS SAUVAGES D’AFRIQUE CENTRALE. DES ISOLATS DE CE PARASITE ONT ETE TRANSMIS ET ADAPTES AUX SOURIS ET RATS DE LABORATOIRE DEPUIS DE NOMBREUSES ANNEES PAR PLUSIEURS EQUIPES. IL EST RECONNU DANS LA COMMUNAUTE SCIENTIFIQUE QUE L’INFECTION DES RONGEURS AVEC CES PARASITES EST UN MODELE BIOLOGIQUEMENT PERTINENT POUR ETUDIER PLUSIEURS ASPECTS DU PALUDISME CHEZ L’HOMME. Les souris ET LES RATS utilisés pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.
Formation du personnel à l’anesthésie et mise au point d’un protocole de suivi anatomique et fonctionnel par IRM chez le cochon
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Six des douze cochons repartiront vivants chez leur fournisseur, les six autres seront tués après leur deuxième IRM puis serviront à des formations à l'autopsie et à l'entraînement chirurgical sur cadavre. Les douze animaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, soumis jusqu'à deux fois à une anesthésie pouvant durer six heures, espacée d'au moins deux jours. Le projet ne produit aucune connaissance sur les cochons eux-mêmes, il sert à former le personnel de l'établissement à l'anesthésie, à l'analgésie et au réveil, et à caler un protocole d'imagerie. Le porteur juge l'usage d'animaux vivants "indispensable" à cette formation et inscrit le projet au crédit de la réduction et du raffinement, puisqu'un même cochon peut passer deux examens.
Objectifs
Le projet vise à établir un protocole de suivi anatomique et fonctionnel non invasif du cochon par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). Pour de nombreux projets, un suivi anatomique et fonctionnel de certains organes se révèle nécessaire. L’IRM est un outil non invasif doté d’une résolution spatiale importante permettant une caractérisation anatomique précise des organes d’intérêt. Outre sa fonction anatomique, il permet également de suivre des fonctions précises de ces organes. L’obtention d’images de qualité nécessite cependant l’absence de mouvement du sujet étudié. Dans le cadre de l’expérimentation animale, l’anesthésie se révèle donc indispensable pour l’acquisition de ces images. Il est donc nécessaire que le personnel de l’établissement utilisateur soit formé à l’anesthésie/analgésie, ainsi qu’au suivi de constantes physiologiques des animaux. Le cochon est un modèle particulièrement pertinent pour beaucoup de recherche, sa physiologie étant proche de celle de l’homme. Notre objectif est double : former le personnel à la prise en charge de cochons du point de vue de l’anesthésie, de l’analgésie, du suivi de constantes et du réveil, ainsi que de mettre en place un protocole d’acquisition d’images IRM sur le cochon.
Bénéfices attendus
Ce projet aura pour principal bénéfice d’établir un protocole d’acquisition IRM standardisé en participant à la formation des personnels de l’établissement utilisateurs aux procédures d’anesthésie, analgésie, au réveil, ainsi que suivi de constantes physiologiques des animaux. De ce point de vue, nous estimons pouvoir agir sur les items Réduction et Raffinement de la règle des 3R. La Réduction est permise par l’accès à un suivi temporel facilité de l’animal. L’examen étant non-invasif, un animal peut faire l’objet de deux acquisitions, en respectant une période de récupération inter-anesthésie, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Le Raffinement est favorisé par la nature non-invasive et atraumatique de cet examen d’imagerie et par une formation adaptée du personnel à la bonne conduite des procédures expérimentales, limitant ainsi autant que possible le stress des animaux que ce soit pour ce projet ou pour de futurs projets.
Procédures
Les animaux (n=12) seront soumis à un protocole d’anesthésie/analgésie dans le but de faire des acquisitions d’image IRM pour une durée de 6 h maximum. Ce protocole sera réalisé au maximum deux fois par animal avec espacement de 2 jours minimum (un jour de repos complet minimum entre les deux acquisitions).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels pour les animaux sont principalement lié à l’anesthésie : faiblesse après le réveil, stress, déshydratation ou baisse d’appétit dans les heures qui suivent l’anesthésie. La procédure d’IRM étant non invasive, aucun effet indésirable liée à celle-ci n’est attendu.
Devenir
Les animaux (minipigs) seront gardés en vie et rendu au fournisseur sur avis du vétérinaire ou du responsable du projet. Les animaux (porcs fermiers) seront euthanasiés après la deuxième IRM. Ces animaux serviront pour des formations à l’autopsie et à l’entrainement au geste chirurgicaux sur animaux euthanasiés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivant est indispensable à la formation à l’anesthésie, analgésie, suivi de constante et réveil, qui, par définition, se réalisent sur animal vivant. La mise en place du protocole d’acquisition d’image nécessite lui aussi l’utilisation d’animaux vivant.
Réduction
Ce projet se justifiant d’un point de vue scientifique et de formation, le nombre d’animaux a été limité au minimum assurant la formation du personnel compétent pour suivre le tutorat du vétérinaire désigné de l’établissement utilisateur. Nous estimons que l’utilisation de 12 animaux permettra aux personnels actuels et futurs d’être formés. L’acquisition d’IRM étant non-invasive, elle pourra être réalisée deux fois par animal avec un délai de récupération de 2 jours minimums. La réalisation de l’imagerie deux fois par animal permets de réduire le nombre total d’animaux nécessaires.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés par 2. Chaque cage bénéficiera d’un enrichissement adapté (corde naturelle, rondins de bois non traités, chaînes métalliques, jouets en plastique). Les animaux seront dirigés et gardés contre les grilles du box par des plaques de tirage pour porc pour l'anesthésie et l'analgésie. Une attention particulière sera apportée au maintien de leur température corporelle pendant l’anesthésie. Les animaux seront maintenus à la table d’examen par des blocs de mousse et des sangles pour éviter toute chute. Des points limites précoces seront appliqués pour éviter toute souffrance (absence de reprise d’alimentation ou d’abreuvement ; immobilité persistante ; comportement anormal ou signes de mal être persistants malgré les traitement décidé par le vétérinaire).
Choix des espèces
Le porc a été choisi pour ce projet en raison de son anatomie et de sa physiologie comparable à l’humain. Étant donné que ce projet a une vocation de formation du personnel sur la gestion de l’anesthésie/analgésie, il est pertinent de le réaliser sur une espèce souvent utilisée en recherche pour sa proximité biologique avec l’humain.
Caractérisation d’un modèle murin de trouble bipolaire par injection chronique de roténone à faible dose MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tenter de reproduire chez la souris l'alternance entre phases maniaques et dépressives du trouble bipolaire, 600 souris vont être utilisées, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour récupérer leur cerveau. Elles reçoivent chaque jour pendant huit semaines une injection sous-cutanée de roténone, un pesticide neurotoxique, puis passent trois fois chaque test comportemental, à quatre semaines d'intervalle. Le porteur reconnaît qu'il n'existe aujourd'hui aucun modèle expérimental reproduisant les principaux aspects de la maladie, et indique d'après la littérature que la roténone provoque une hypoanxiété à un mois puis de l'anxiété à deux mois. En cas de blessure, un analgésique est prévu et la mise à mort décidée s'il n'y a pas d'amélioration au bout de quarante-huit heures.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété, mais aussi des troubles somatiques telles que les maladies cardiovasculaires). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. L’objectif de ce projet est à d’établir des méthodes d’étude des phases maniaques et dépressives du trouble bipolaire au niveau comportemental, puis de se focaliser sur les transitions entre phase, un aspect méconnu de la maladie qui pourrait amener à une meilleure compréhension de sa biologie et à de nouvelles pistes thérapeutiques. Pour cela, nous avons besoin d’un modèle de la maladie récapitulant les deux phases à l’échelle individuelle. Notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, et nous sommes en train de mettre au point des tests pour évaluer les phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir et de caractériser un modèle récent de trouble bipolaire basé sur une des hypothèses majeures du domaine, à savoir l’hypothèse mitochondriale. Celle-ci se base sur un ensemble de données suggérant qu’une dysfonction mitochondriale légère serait au centre de cette pathologie. La première phase de caractérisation est de reproduire et d’étendre les résultats comportementaux suite à un traitement chronique de roténone, un inhibiteur de la chaîne mitochondriale.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude permettra d’évaluer la reproductibilité d’un modèle murin prometteur de la pathologie, et de développer de nouvelles pistes de compréhension de la maladie avec un suivi longitudinal et individuel des animaux.
Procédures
Une injection sous-cutanée est réalisée quotidiennement pendant 8 semaines. Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test comportemental a lieu 3 fois (une fois pendant la phase sans symptômes, une fois en phase maniaque et une fois en phase dépressive) à 4 semaines d'intervalle. Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanée (7 fois par semaine sur 8 semaines), sont espacées de 24h. Les doses de roténone sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. La roténone en elle-même ne semble pas induire de phénotypes comportementaux à court terme (au moins jusqu’à deux semaines) d’après la littérature. A un mois, la roténone semble induire une hypoanxiété, puis de l’anxiété à 2 mois.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). La stratégie des 8 groupes avec deux groupes (contrôles et traités) se base sur un effet attendu relativement important. Nous faisons le choix de travailler chez les animaux des deux sexes en accord avec les directives d'intégrer le sexe comme variable biologique dans les recherches : en effet, les troubles psychiatriques dont le trouble bipolaire sont un facteur majeur d'invalidité dans le monde et peuvent s'exprimer différemment chez les hommes et les femmes. Il est donc essentiel de s'intéresser aux deux sexes pour une meilleure compréhension du trouble et développer des approches thérapeutiques adaptées.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En complément, une friandise (sous la forme d'un morceau de gâteau) sera distribuée après chaque injection et après les tests comportementaux afin de diminuer le stress en faisant associer les manipulations à un événement positif. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur . En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout de 48h. Dans ce cas, une euthanasie sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 7 semaines ou plus. Le modèle roténone ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Maintien de modèles souris de cancer pancréatique pour l’étude et la mise en place de lignées cellulaires et d’un archivage tissulaire visant à réduire l’utilisation d’animaux (1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
630 souris élevées pour développer un cancer du pancréas vont être utilisées, dont 138 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées, y compris celles qui ne servent qu'à l'élevage, mises à mort à huit mois. Un quart d'entre elles développera des lésions cancéreuses avec l'âge, accompagnées de gêne abdominale, de prostration, de perte de poids et de fonte musculaire, et les souriceaux subissent une biopsie de l'oreille entre sept et dix jours. Le titre du projet annonce une réduction de l'utilisation des animaux non-humains, obtenue en constituant à partir de ces souris une banque de tissus et des lignées cellulaires. Le porteur qualifie pourtant d'"indispensable" le maintien des deux lignées, dont il prévoit quatre accouplements par an.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer au diagnostic tardif qui dispose de peu de traitements thérapeutiques. Bien que des modèles alternatifs existent, certains travaux comme l’étude de nouveaux composés thérapeutiques validés in vitro ou la caractérisation de nouvelles mutations nécessite de maintenir et d’étudier des lignées de souris génétiquement modifiées qui récapitulent les étapes de la progression cancéreuse pancréatique. Notre projet s’appuie sur la nécessité de maintenir 2 modèles expérimentaux pour mettre en place une banque d’échantillons et plusieurs outils cellulaires qui permettront de mieux comprendre le rôle de nouveaux gènes dans les cancers pancréatiques tout en réduisant nos besoins d’utiliser inutilement des modèles animaux. Le projet sera réalisé au sein de 2 établissements où seront respectivement élevés et étudiés les animaux.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre la cancérogénèse pancréatique et d’établir des approches de remplacement (banques histologiques de tissus et lignées cellulaires) qui permettront de réduire l’utilisation d’animaux pour nos travaux biologiques et la caractérisation des lésions invalidées pour un nouveau gène dont l’implication est rapportée chez certains patients.
Procédures
Dans l’établissement 1, les animaux seront manipulés : - Lors du change, effectué une fois par semaine et dure 1 minute. - A leur mise en accouplement, une fois au début de la procédure, et dure 1 minute. - A l’identification des nouveau-nés, 1 à 2 fois par mois pendant 01 à 20 minutes en fonction du nombre de nouveau-nés. La biopsie tissulaire à l’oreille, réalisée sur animaux à 7-10 jours pour identification génétique sera réalisée une seule fois et durera quelques secondes. Dans l’établissement 2, les animaux seront manipulés : - Lors du change, effectué deux fois par mois et dure 1 minute. - Lors des pesées, effectuées deux fois par semaine et durent moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Un stress sera induit chez les animaux lors des manipulations nécessaires à leur mise en accouplement ou à l’identification des nouveau-nés. Les animaux âgés de 7 à 10 jours pourront ressentir une légère douleur lors de la biopsie tissulaire d’un bout d’oreille nécessaire à leur identification génétique. Le risque de saignement est très faible. Selon nos schémas d’accouplements optimisés, 25% des animaux développeront des lésions cancéreuses pancréatiques avec l’âge, ces lésions pourraient se caractériser par une gêne abdominale, des douleurs qui pourront se retranscrire par une prostration, une perte de poids associée à un affaiblissement musculaire (cachexie) ainsi qu’une absence de toilettage ou l’identification de signe de douleur par l’observation d’yeux clos ou mi-clos des animaux. Des signes cliniques liés à des lésions cancéreuses pancréatiques pourraient se développer chez certaines souris âgées de plus de 8 mois. Cet inconfort pourrait se caractériser par une perte de poids, une gêne ou des douleurs abdominales qui pourraient se retranscrire par une prostration, une perte d’appétit ou de comportement social.
Devenir
Toutes les souris génétiquement modifiées qui présentent le risque de développer un cancer pancréatique seront mis à mort pour collecter des échantillons qui permettront d’établir une banque d’échantillons et des lignées cellulaires. Les autres animaux expérimentaux ne développant pas de tumeurs seront également mis à mort et leur pancréas utilisé comme contrôle dans nos analyses. Les animaux servant à maintenir les élevages seront eux mis à mort à l’âge de 8 mois si leur replacement n’avait pu être mis en place au sein de l’établissement d’élevage.
Remplacement
La caractérisation et l’étude des mécanismes de progression tumorale pancréatique ne peuvent pas être totalement modélisées par des outils cellulaires. Il en est de même pour l’étude des conséquences d’une nouvelle mutation que nous souhaitons étudier dans ces cancers. Le maintien de modèles génétiques de souris permettant leur étude dans le contexte des mécanismes d’initiation et de progression tumorale est donc indispensable. Les objectifs de notre projet visent en partie à réduire la nécessité du recours aux animaux en permettant l’établissement d’une banque histologique d’échantillons collectés à différents stades de progression tumorale mais également de lignées cellulaires dérivées des tumeurs développées par les modèles murins générés.
Réduction
Notre procédure vise à établir des lignées cellulaires ainsi qu’une banque d’échantillons histologiques permettant d’étudier in vitro et ex vivo la progression tumorale de 2 modèles de souris de cancers pancréatiques. Ces outils devraient nous permettre de mieux comprendre les conséquences liées à l’invalidation d’une nouvelle mutation rapportée chez l’homme. Ils permettront également de réduire la nécessite de maintenir inutilement des expérimentations animales pour nos travaux de recherche. Nous avons réduit au maximum les élevages nécessaires à l’obtention des nombres d’animaux pour atteindre cet objectif, nous limiterons à 4 le nombre d’accouplements annuels nécessaires au maintien de nos modèles. Cette stratégie devrait limiter le besoin en une banque tissulaire utile à la mise en place de nos accouplements et la maintenance de 2 modèles précliniques différents. Par cette approche nous pourrons constituer une banque tissulaire pour les 2 sexes à quatre stades de progression cancéreuse qui ne devrait pas impliquer plus de 256 animaux. A ce nombre nous estimons que 5 animaux supplémentaires permettront l’établissement de 3 lignées cellulaires pour chaque modèle. Dès que possible nous tenterons au maximum de limiter la génération des animaux non nécessaires à nos travaux et nous n’hésiterons pas à archiver par congélation de paillettes de sperme les souches d’animaux non nécessaires à nos recherches.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi (coton pour le nid, tunnels ou maison en plastique) afin de créer un environnement familier et réconfortant. Les animaux seront habitués à être manipulés pour réduire leur stress tout au long de leur vie Un suivi sera réalisé afin d’identifier d’éventuels signes qui laisseraient envisager une souffrance ou une douleur. En cas de blessure locale, nous appliquerons un traitement désinfectant. Pour le suivi des animaux, nous mettrons en place une surveillance rigoureuse et individuelle pour chaque individu afin d’assurer que les animaux développant des tumeurs pancréatiques ne subissent pas de souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance au travers d’une grille d’évaluation détaillée. Cette évaluation de multiples critères et de points limites adaptés nous conduira à ne pas maintenir des animaux ayant atteint un score de souffrance non acceptable. Nous optimiserons au maximum la quantité d’information biologique à collecter et étudier sur chaque souris.
Choix des espèces
Les souris que nous utilisons sont porteuses de mutations rapportées chez l’homme. Elles permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale du cancer du pancréas et d’étudier sa progression. Des animaux des 2 sexes seront étudiés car les cancers pancréatiques se développent aussi bien chez l’homme que la femme. Les animaux en reproduction ont entre 2 et 8 mois et les animaux utilisés à des fins de prélèvements seront mis à mort à 2, 5, 8 et 12 mois.
Protection antibactérienne et de réparation du foie lors d’une inflammation intestinale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
La surveillance s'intensifie à mesure que les souris perdent du poids, et une grille de score décide du moment de la mise à mort. 2 874 souris vont être utilisées, dont 1 140 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyses post-mortem. Elles reçoivent jusqu'à six administrations forcées en deux semaines, puis un produit inflammatoire dans l'eau de boisson par cycles d'une semaine sur deux, et pour une partie d'entre elles une chirurgie de quinze minutes. Le porteur décrit une diarrhée, du sang dans les selles et des signes de déshydratation, et affirme dans le même temps qu'aucun effet indésirable lié aux traitements n'est attendu.
Objectifs
Le foie sert comme une barrière qui protège l’organisme de la diffusion des bactéries qui colonisent et habitent dans l’intestin. Lors d’une maladie inflammatoire de l’intestin cette protection peut malheureusement être perdue. Des cellules du système immunitaire sont responsables de cette fonction barrière du foie, où Il y a, entre autres cellules immunitaires, des lymphocytes T résidentes qui ont des fonctions antibactériennes et de réparation tissulaire. Néanmoins, leur rôle barrière contre les bactéries de l’intestin n’est pas bien compris. L’objectif de ce projet est donc de découvrir quels lymphocytes sont important pour assurer la fonction barrière antibactérienne du foie et comment elles participent dans l’élimination des bactéries et la réparation tissulaire pendant inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Le foie confère une protection importante contre des bactéries intestinales qui réussissent à entrer dans la circulation. Cette translocation bactérienne est plus importante pendant des maladies intestinales inflammatoires lorsque la perméabilité intestinale est augmentée. Les cellules et mécanismes impliqués dans cette fonction du foie ne sont pas bien compris. Ce projet permettra de mieux comprendre les cellules du système immunitaire présentes dans le foie qui nous protègent des infections par des bactéries intestinales. Cela pourra inclure l’identification de nouvelles molécules avec des rôles antibactériens et de réparation des tissus qui, dans le long terme, pourraient être utilisées pour les thérapies dans des maladies infectieuses, notamment bactériennes, ou inflammatoires comme la colite.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des souris vigiles (souris non anesthésiées) recevront un traitement à raison de maximum de 6 administrations au cours de 2 semaines. Chaque administration dure au max 1 minute avec contention de l’animal. Dans un second lot d’animaux les animaux vigiles recevront un traitement à raison d’ 1 fois par jour pendant une semaine. Chaque administration dure au max 1 minute avec contention de l’animal. Dans un troisième lot d’animaux, des souris vigiles recevront un premier traitement à raison de maximum de 6 administrations au cours de 2 semaines. Chaque administration dure au max 1 minute avec contention de l’animal. Puis les animaux recevront un second traitement administré dans l’eau de boisson pendant 1 semaine (traitement 1 semaine sur deux), 3 cycles de traitements. Pendant la dernière semaine de traitement les animaux vigiles recevront un troisième traitement à raison d’1fois par jour pendant 1 semaine. Chaque traitement dure au max 1 minute avec contention de l’animal. Dans un quatrième lot d’animaux, les souris recevront un traitement administré dans l’eau de boisson pendant 1 semaine (traitement 1 semaine sur deux), 3 cycles de traitements. Pendant la dernière semaine de traitement, les animaux subiront une chirurgie . Chaque chirurgie dure au maximum 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements sont liés aux gavages et aux injections (gène de courte durée). Aucun effet indésirable lié aux traitements n’est attendu. Lors de l’induction de l’inflammation intestinale les souris peuvent perdre du poids, avoir de la diarrhée ou sang dans les selles et présenter des signes de déshydratation. Ces signes cliniques se développent pendant la semaine d’induction d’inflammation et s’améliore pendant la semaine de récupération. Les chirurgies étant de courte durée, les animaux récupèrent vite et normalement ne montrent plus signes de douleur le lendemain de la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mises à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Ce projet étudie un phénomène qui implique la communication et migration de cellules et des bacteries entre plusieurs organes (intestin, foie et système immune) et les bactéries de l’intestin. Ce système complexe ne peut pas etre bien reproduit en culture. D’ailleur les cellules du système immune que nous etudions existent que chez les mamimeferes (souris, homme…) et ne sont pas presentes chez le zebrafish. Il n’y a donc pas d’autres modèles qui permettront de remplacer des souris.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris utilisées : - Un partage du groupe contrôle avec plusieurs groupes expérimentaux sera privilégié ; - Des expériences de validation de plusieurs modelés (e.g. efficacité des substances à tester, validation du succès des chirurgies…) avec des souris saines. Des critères de « go/no go » sont en place avant de passer sur les souris avec inflammation intestinale. Nous utiliserons de façon générale 18 souris par groupe expérimental (6 souris par répétitions pour un total de 3 répétitions). Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé pour permettre des analyses statistiques et une interprétation biologique des résultats valides.
Raffinement
Afin de limiter au maximum les nuisances sur l’animal : - Surveillance 3 fois par semaine pour surveiller l’état général des souris sous traitement inflammation. la fréquence de surveillance augmentera avec la chute de poids pour adapter au mieux la prise en charge - Si signes de déshydratation, les souris seront réhydratées. - Avant les chirurgies, l’expérimentateur viendra manipuler sans douleur les animaux pour qu’ils puissent s’habituer à la préhension. Cela permet de limiter le stress lié à l’expérimentation. - De l’alimentation gélifiée et de la nourriture imbibée d’eau sera disposée sur la litière facilement accessible pour les animaux après chirurgie ou si signes de déshydratation lors des inductions d’inflammation intestinale en plus d’une réhydratation parentérale. - L’analgésie sera garantie pendant la chirurgie et durant 2 jours après les chirurgies. - Crème vaseline oculaire déposée à l’aide d’un coton tige pour éviter l’assèchement de l’œil durant et après l’anesthésie. - Surveillance de l’animal dès le lendemain de la chirurgie puis 2 fois par semaine pour surveiller l’état général des souris. - Tous les souris seront évaluées régulièrement en relation avec une grille de score permettant d’évaluer la souffrance des animaux et indiquant les actions à suivre.
Choix des espèces
La souris est ici un modèle de choix du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins et la fonction barrière antibactérienne du foie. De plus, nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet de créer des souris génétiquement modifiées pour des gènes d’intérêts pour notre projet de recherche. Enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris.
Impact d’une manipulation des contrôles inhibiteurs des neurones dopaminergiques en modèles de maladie de Parkinson EU1/2 (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une biopsie de tissu est pratiquée sur des souriceaux éveillés vers le sixième jour après la naissance, puis les animaux subissent une chirurgie crânienne pouvant durer quatre heures. 1 396 souris vont être utilisées, 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 160 sous anesthésie sans réveil, et toutes tuées pour prélèvement de tissus. Le protocole prévoit jusqu'à 36 tests comportementaux par animal sur 20 semaines, 20 prélèvements sanguins à la queue et deux examens IRM de deux heures. Le porteur annonce une prise en charge de la douleur, tout en indiquant que les altérations des seuils de douleur provoquées par la lésion ne seront pas soulagées puisqu'elles constituent l'objet de l'étude.
Objectifs
La perte des neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson s’accompagne d’un dysfonctionnement de certains circuits cérébraux et de symptômes moteurs et non-moteurs qui restent difficiles à prendre en charge. La lésion d’une région cérébrale incluant une structure qui est un contrôle de ces neurones dopaminergiques peut améliorer certains symptômes. L’identification récente d’un marqueur moléculaire sélectif de cette structure permet désormais d’étudier les conséquences d’une modulation de l’activité de cette structure dans un modèle de la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est ainsi de tester si l’inhibition sélective de cette structure transitoire et chronique peut soulager les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs. Les patients Parkinsoniens présentent par ailleurs des altérations structurelles et fonctionnelles de leur réseaux cérébraux, visibles par imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces altérations de la connectivité cérébrale pourraient être modifiées par l’inactivation de notre structure d’intérêt. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
La structure cérébrale ciblée par ce projet exerce un contrôle inhibiteur sur les systèmes dopaminergiques, qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson. Ce projet doit permettre de tester si une inhibition aigüe et chronique de cette structure peut améliorer les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs, apportant ainsi une preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de cette cible anatomique. La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Connue pour ses symptômes moteurs, cette maladie a aussi des conséquences délétères non-motrices, incluant douleur, troubles de l’humeur et déficits cognitifs. Les patients présentent en moyenne 14 symptômes dans les phases précoces de la maladie et plus de 20 dans des phases plus tardives, mettant en évidence le besoin de prendre cette complexité en considération dans la recherche préclinique.
Procédures
Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Des animaux sont soumis à 1 chirurgie d’au maximum 1h30 ou 4h, et un maximum de 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes chaque, répartis sur 20 semaines avec au moins un jour de repos entre chaque test. Les animaux sont soumis à un prélèvement par semaine sur la veine caudale localisée sur la queue, d’une durée de 2 minutes par animal (20 prélèvements maximum). Les animaux sont soumis à deux examens IRM sous anesthésie, incluant chacun au plus une séquence d'IRM fonctionnelle de 16min, une d'IRM anatomique de 10 min et une d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures maximum par examen) (EU2).
Impact sur les animaux
Une douleur légère et de courte durée peut être provoquée par la biopsie de tissus. La chirurgie peut entraîner une perte de poids transitoire, une douleur postopératoire modérée, une inflammation locale transitoire autour du dispositif des points de suture (peau du crâne). Les tests comportementaux peuvent s’accompagner d’un stress léger. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude. Le transport et l’environnement inconnu de la nouvelle animalerie peuvent également entrainer un stress chez les animaux au moment du changement d’EU.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les comportements étudiés et la connectivité cérébrale nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal. Toutefois, des tests in-vitro par spectrométrie de masse seront réalisés en amont de l’inhibition chronique de notre structure.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton, tunnel, coton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils sont habitués à la manipulation avant la chirurgie, ainsi qu’aux environnements des tests comportementaux avant leur réalisation. Les animaux seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. La lésion des neurones dopaminergiques est partielle, se rapprochant du stade précoce de la maladie de Parkinson. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Le transport entre les 2 EU se fera dans des cages sécurisées avec nourriture et eau gélifiée et une période de 1 semaine sera respectée avant le début des examens IRM. Durant celui-ci, une anesthésie sera utilisée pour réduire au maximum le stress de l'animal. Leurs yeux seront protégés du dessèchement par l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage et maintenue par un système de chauffage du berceau de l’IRM et un tapis chauffant. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera placé dans une enceinte chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours, et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.
Prélèvements biologiques sur animaux de rente (vaches, chèvres, poules) et sur rongeurs (souris, rats) pour répondre à des activités de recherche et de référence nationale et internationale de diagnostic
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 50
Chèvres : 12
Bovins : 6
Poules : 10
Sur 278 animaux, 100 souris seront tuées par ponction cardiaque, 168 autres animaux réutilisés dans d'autres projets et 10 poules rendues à l'élevage. Vaches, chèvres, poules, rats et souris subissent des prises de sang répétées et des écouvillonnages, dans des procédures déclarées légères, sauf le prélèvement terminal des souris, mené sous anesthésie sans réveil. Les vaches sont piquées à la jugulaire ou à la veine de la queue jusqu'à quatre fois par semaine, les chèvres deux fois, les poules deux fois à la veine de l'aile, avec en plus des écouvillons nasaux, buccaux, oculaires et auriculaires. Le sang collecté sert de réactif de référence pour des tests de diagnostic vétérinaire, et le sang de bovin à nourrir des insectes piqueurs sur membrane, ce que le porteur décrit comme un "raffinement" du protocole de nourrissage.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de réaliser régulièrement des prélèvements de matériel biologique (sang et écouvillonnages) non disponibles auprès des fournisseurs agréés, afin de permettre au laboratoire de disposer des échantillons biologiques nécessaires à ses activités de recherche et de référence, de diagnostic sur les maladies animales. L’utilisation de sang et/ou de sécrétions corporelles est routinière dans les laboratoires non seulement développeurs de vaccins vétérinaires et de techniques de diagnostic de maladies animales mais aussi pour les activités de recherche sur les maladies animales (vaches, chèvres, poules). Ces produits organiques constituent des réactifs biologiques nécessaires pour, par exemple, l’évaluation de l’efficacité de vaccins, l’étude des cellules du système immunitaire, le développement de modèle ex-vivo, de tests de diagnostic de maladies, l’élaboration des réactifs de référence pour les tests de diagnostic ou bien encore le nourrissage artificiel des vecteurs hématophages de ces maladies. Les espèces animales choisies (vaches, chèvres, poules, rongeurs) pour ce projet sont les espèces cibles ou les modèles animaux des maladies étudiées. Le nombre d’animaux utilisés sera adapté à l’activité, aux projets et à la capacité d’hébergement de notre établissement. Le volume et fréquence des prélèvements sanguins seront minimisés et contrôlés dans les limites recommandées pour chaque espèce. Toutes les procédures seront adaptées à l’espèce animale choisie et réalisées par du personnel expérimenté et qualifié. Le respect des 5 libertés du bien-être animal sera pris en compte tout au long de leur hébergement : absence de faim et de soif, absence d’inconfort, absence de douleurs ou blessures, liberté d’exprimer le comportement propre à l’espèce, absence de peur et /ou d’anxiété.
Bénéfices attendus
Le sang de bovin permet le raffinement du protocole de nourrissage des insectes hématophages sur membrane. Ce projet apporte plusieurs avantages et bénéfices à notre établissement. En effet, dans le cadre des activités de recherche sur ces maladies, le sang des animaux de rente (vaches, chèvres) est aussi la source première pour la préparation les cellules de l’immunité pour les études in vitro de la réponse immunitaire. Le laboratoire se doit de fournir des réactifs biologiques de référence de qualité (issus des prélèvements de sang ou d’écouvillons) 1/ pour le diagnostic des maladies sur lesquelles il travaille, 2/ pour la réalisation des panels d’échantillons pour les essais inter-laboratoires 3/ pour la qualification des kits de diagnostic et la formation du personnel habilité à réaliser les analyses sous accréditation. Le sang des rongeurs (rats et souris) sert à développer de nouvelles techniques de purification en remplacement de celles utilisées jusqu’à maintenant et devenues indisponibles. Enfin, le sang de souris est également utilisé pour enrichir le milieu de culture in vitro de nouvelles souches de parasites sur lesquels travaille le laboratoire, ce qui réduira le nombre de rongeurs nécessaires à la production en grand nombre de ces parasites.
Procédures
Les animaux sont soumis à des prélèvements réguliers et sont réalisés le plus souvent sur animaux vigiles. Les vaches sont prélevées à la veine jugulaire ou caudale en fonction des besoins pour les études réalisées à partir du sang. Les prélèvements ont lieu jusqu’à quatre fois par semaine. Les chèvres sont prélevées à la veine jugulaire en moyenne deux fois par semaine. La durée du prélèvement dépend du volume nécessaire mais n’excède en aucun cas 5 minutes. Des écouvillons (nasaux, buccaux, oculaires et auriculaires) sont également réalisés sur les vaches et chèvres afin d’obtenir le matériel biologique utile pour les études. Ces prélèvements sont rapides (< 5 min). Les poules sont prélevées à l’aile (veine alaire) jusqu’à deux fois par semaine en fonction des besoins. La durée du prélèvement pour les animaux de rente dépend du volume nécessaire mais n’excède en aucun cas 5 minutes. Pour les rats, le prélèvement se fait à la veine caudale sous anesthésie générale et la durée maximale est de 5 minutes. Le volume maximal du prélèvement est de 500 µL à raison de deux fois maximum par semaine. Pour les souris, le prélèvement (75 µL maximum), d’une durée maximale de 3 min, se fait à l’extrémité de la queue sur souris vigile, est effectué une fois par semaine pendant 4 semaines. Les prélèvements de sang terminaux sur souris sont réalisés par ponction cardiaque sous anesthésie générale et dure moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
La seule nuisance qui peut survenir est un léger stress de l’animal lors du prélèvement sanguin, dû à la contention et à l’introduction de l’aiguille. Aucun effet indésirable post prélèvement n’est attendu sur les animaux de ce projet. Les procédures 1 à 4 sont décrites comme des procédures de « classe légère ». La procédure 5 est en classe sans réveil car le volume total du sang est prélevé par ponction cardiaque sous anesthésie générale.
Devenir
Animaux de rente (vaches, chèvres, poules) : Ces animaux restant plus longtemps dans notre établissement que la durée de ce projet, ils seront réutilisés sur un futur projet de prélèvements sanguins. À l'issue du temps d’hébergement au sein de notre établissement, préalablement défini par rapport à la durée de vie de chaque espèce, ces animaux n’ayant uniquement fait l'objet que de prélèvements (sang, mucus) seront proposés à l'adoption. Les adoptants, qu'ils soient professionnels ou particuliers, seront sélectionnés selon des critères stricts garantissant le respect des 5 libertés fondamentales du bien-être animal. Cette démarche permet aux animaux de terminer leur vie dans des conditions optimales et conformes à leur nature. Rongeurs de laboratoire : Rats : L'ensemble des rats sera réutilisé dans un autre projet de recherche dont la procédure est classée modérée, conformément au principe de réduction des animaux utilisés. Souris : 50% des souris seront réutilisées dans un autre projet de recherche (classée modérée) et 50% des souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure expérimentale (classée sans réveil) dans laquelle elles sont intégrées.
Remplacement
Le matériel biologique prélevé (sang et/ou écouvillons) n’est pas disponible et ne peut pas être remplacé par une méthode alternative, ce qui rend indispensable le recours à l’utilisation d’animaux. Les espèces animales choisies dans ce projet correspondent aux espèces cibles ou aux modèles animaux expérimentaux des maladies étudiées au laboratoire.
Réduction
Pour les études en immunologie, le nombre d’animaux utilisés est réduit à son maximum, sans pour autant nuire à la significativité des résultats qui en découleront : un nombre minimum de 3 vaches et 4 chèvres est nécessaire pour montrer la répétabilité, la fiabilité et la robustesse des résultats des études. Le nombre de poules, souris et de rats indiqué est un nombre maximum qui a été estimé au plus juste pour permettre de réaliser les différentes procédures de ce projet.
Raffinement
Pour les animaux de rente, le raffinement consiste à une habituation à la contention pendant quelques semaines avant la réalisation des prélèvements. L’animal est amené régulièrement dans l’espace dédié au prélèvement et mis en contention sans réalisation de prélèvement, afin de l’habituer et de le conditionner. Lorsque l'animal s'est familiarisé avec le processus, la phase de contention ne provoque plus de réaction de stress, permettant ainsi de réaliser les prélèvements sanguins ou par écouvillon dans un contexte serein et favorable. Pour les rongeurs, une manipulation quotidienne (une fois par jour) sur plusieurs jours (2 jours à une semaine) avant le prélèvement est réalisée pour diminuer le stress de l’animal en l’habituant à être manipuler.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies dans ce projet sont les espèces cibles ou les modèles animaux expérimentaux des maladies étudiées au laboratoire. Les animaux de rente (vaches, chèvres) seront âgés de 1 à 2 ans à l’entrée dans notre établissement et entre 6 mois et 1 an pour les poules. Ils restent un maximum de 8 ans puis ils sont replacés dans le cas où que des prélèvements sanguins sont réalisés. Les souris seront âgées d’au moins 3 semaines au moment de leur entrée en stabulation, et les rats de 4 semaines. Lors des prélèvements, les souris auront au moins 6 semaines et les rats 5 semaines. Pour chaque espèce animale, une quarantaine est appliquée 1 mois pour les animaux de rente, deux semaines pour les poules et une semaine pour les rongeurs. Le prélèvement sanguin est réalisé au stade adulte car, à ce stade, l’animal présente un système physiologique pleinement développé, permettant d’obtenir des paramètres hématologiques et immunologiques fiables et représentatifs. Les volumes de sang requis pour les analyses ne peuvent pas être prélevés de manière sûre sur des individus immatures, chez lesquels les capacités de régénération et le volume sanguin total sont insuffisants. Le prélèvement chez l’adulte garantit ainsi la validité scientifique des données tout en limitant les risques pour l’animal conformément aux principes du bien-être animal.
Production de lait de lapines entrant dans la fabrication d’un médicament humain
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Tests réglementaires
134 800 lapins et lapines vont être utilisés dans ce projet, déclaré d'un niveau de souffrance léger, aucun n'étant gardé vivant à l'issue. Les femelles transgéniques sont traites trois à cinq jours par semaine pendant trois semaines, sous injection d'ocytocine, remises en lactation après quarante-six jours de repos, et tuées quand elles atteignent dix-huit lactations ou de "mauvais résultats zootechniques". Les lapereaux sont utilisés pour déclencher et maintenir la lactation de leur mère, huit étant gardés au nid, puis tués à la fin des trois semaines de traite. Le lait entre dans la fabrication d'un médicament pour les hémophiles, et le porteur écrit qu'il n'existe pas de modèle alternatif au lapin pour produire cette protéine, l'autorisation de mise sur le marché imposant l'usage exclusif de cette espèce.
Objectifs
L'objectif de ce projet est la production de lait de lapine entrant dans la fabrication d'un médicament à usage humain, destiné aux hémophiles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est la production d'un médicament à usage humain.
Procédures
Identification des animaux : à la naissance apposition d'une boucle puis vers 8-9 jours, d'une puce électronique et enfin entre 28 et 35 jours les animaux sont tatoués. Prélèvement de lait, traite des lapines et injection d'ocytocine (3 à 5 jours par semaine pendant 3 semaines, les lapines sont réutilisées plusieurs fois pour la traite après un temps minimum de repos de 46 jours). Lors du renouvellement des mâles homozygotes, réalisation de biopsies de queue sur environ 120 animaux tous les 3-4 ans.
Impact sur les animaux
La traite (10 minutes environ, 3 à 5 jours par semaine sur 3 semaines) et l'injection d'ocytocine de la procédure "Lait" peuvent induire un léger stress. Les étapes de la procédure "élevage" peuvent également entrainer : - un léger stress sur les animaux lors des différentes manipulations : une douleur légère lors de l'identification des animaux (apposition d'une boucle puis d'une puce électronique et enfin réalisation d'un tatouage) - une douleur modérée lors de la réalisation de biopsie. une douleur légère lors des prélèvements sanguins effectués sur chaque mâle homozygote.
Devenir
Les animaux peuvent être utilisés pour le renouvellement des animaux ou dans le cadre de la traite des lapines et dans plusieurs lots. Dans la procédure "élevage", les animaux ayant atteint un point limite tel que défini dans la grille, les animaux reproducteurs ayant de mauvais résultats zootechniques ou ayant atteint la limite zootechnique d'âge ou de nombre de mise-bas pour être maintenus dans la procédure "traite" seront mis à mort. Dans la procédure "traite", à la fin des 3 semaines de traite, les lapereaux des femelles en traite seront mis à mort. De même, au cours de la procédure, les animaux ayant atteint un point limite tel que défini dans la grille et les animaux reproducteurs ayant de mauvais résultats zootechniques ou ayant atteint la limite de nombre de lactations (maximum 18) pour être maintenus dans la procédure de production de lait seront également mis à mort.
Remplacement
A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe pas de modèle alternatif au lapin pour la production de cette protéine thérapeutique.
Réduction
Depuis le début de cette activité, les méthodes de production ont constamment été améliorées et continuent de l'être afin d'obtenir la plus grande quantité de matière active par animal et donc de limiter le nombre de sujets utilisés. De plus, l'utilisation de mâles homozygotes (en remplacement des hétérozygotes) pour le renouvellement des femelles productrices de lait permet de produire 100 % d'animaux transgéniques.
Raffinement
Les lapins sont hébergés dans des cages adaptées, conformes aux exigences de la règlementation et de respect du bien être animal. Ils disposent d'un enrichissement adapté (diffusion de radio, mise à disposition de bûchettes de bois à ronger). Le suivi quotidien des animaux est assuré par des personnes expérimentées et formées régulièrement. Des fiches de suivi permettent d’enregistrer les soins adaptés prodigués aux animaux et de suivre l’évolution de l’état de santé des animaux. Une évaluation de la souffrance animale en référence à une grille établie est réalisée chaque jour. La grille permet également de fixer les points limites et de cesser immédiatement l'expérimentation sur tout lapin présentant des signes de souffrance dépassée.
Choix des espèces
La lapine est dotée d'une glande mammaire qui possède toute la machinerie cellulaire permettant d'apporter les modifications post-traductionnelles, nécessaires à l'activité biologique des protéines recombinantes humaines. De plus, le médicament est sous autorisation de mise sur le marché avec utilisation exclusive du lapin. Les mâles et femelles WT et Tg sont utilisés à l'âge adulte de la façon suivante : - mâles WT pour le renouvellement de nos cheptels WT et / ou pour la reproduction des femelles transgéniques productrices de lait, - femelles WT pour le renouvellement des cheptels WT et Tg, - mâles Tg homozygotes pour le renouvellement des cheptels Tg, - femelles Tg hétérozygotes pour la traite ainsi que pour le renouvellement du cheptel de mâles Tg homozygotes (1 fois tous les 3-4 ans). Les lapereaux des femelles en traite sont utilisés pour le déclenchement, l'induction de la production laitière des femelles puis 8 lapereaux sont conservés au nid pour le maintien de la lactation (qui dure 3 semaines). A la fin des 3 semaines, les lapereaux sont euthanasiés. Voir l'annexe "Scheme genetic for milk production" indiquant les différents cheptels nécessaires et les différents croisements réalisés.
Utilisation d’agents d’imagerie TEP (radiotraceurs) dans le diagnostic et le suivi de traitements-MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 1100
1 100 souris et 1 100 rats reçoivent des injections de traceurs radioactifs sous anesthésie générale, puis passent des séances d'imagerie pouvant durer deux heures, jusqu'à six fois en six semaines. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et tous les animaux sont tués à l'issue, la mise à mort étant justifiée par une seule phrase sur des "analyses post-mortem". Le porteur qualifie la technique de "non invasive" et affirme qu'aucune toxicité n'a été mise en évidence sur la répétition des injections, tout en prévoyant d'examiner les images pour vérifier "des changements possibles". Le projet sert aussi à caractériser des modèles tumoraux, la souris pour les tumeurs spontanées, le rat pour les cancers de petits organes comme la prostate.
Objectifs
L'imagerie par Tomographie par Émission de Positons (TEP) en préclinique est une technique très précieuse pour la recherche biomédicale. Elle permet d'observer et de suivre en détail des radiotraceurs. Un radiotraceur est substance fixée à un atome radioactif. Cette substance est choisie parce qu’elle va se diriger vers un organe ou un tissu particulier. Une fois injectée dans le corps, elle émet de très faibles rayonnements qu’on peut détecter avec la TEP.. Ainsi, les chercheurs peuvent visualiser la distribution de substances radioactives dans le corps, ce qui est particulièrement utile pour étudier des maladies comme le cancer. Cette méthode offre une image précise en 3D, permettant d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements, de comprendre la progression des maladies, ou encore de tester de nouvelles molécules.La TEP est donc un outil essentiel pour faire avancer la recherche médicale de manière sûre et efficace, tout en réduisant la nécessité d'expériences invasives. La TEP est couplée à de l’imagerie de tomodensitométrie (TDM), permettant d’avoir une cartographie complète de la molécule dans l’organisme. L’utilisation de cette technique permet : • De révéler des mécanismes biologiques, comme le métabolisme glucidique ou lipidique ou encore la prolifération cellulaire • De révéler et de suivre la réponse aux traitements dans différentes pathologies • Etudier la biodistribution (c’est-à-dire la répartition de la molécule dans les différents organes) de médicaments Par aillleurs, cette technologie est aujourd’hui largement utilisée chez les patients atteints de cancer pour le diagnostic et le suivi de réponse au traitement. Cependant les radiotraceurs disponibles sont limités (le [18F]FDG est utilisé dans 90% des cas en clinique. Analogue du glucose, il permet de voir les cellules surconssomatrices de glucose mais son utilisation est limitée dans les organes où il y a une fixation physiologique, comme le cerveau . De plus le [18F]FDG peut marquer des cellules inflammatoires ou infectieuses donnant des faux positifs dans le cas de détection de cancer. Le développement de nouveaux radiotraceurs est donc nécessaire pour une meilleure prise en charge des patients atteints de cancers et d’autres pathologies.
Bénéfices attendus
L’imagerie TEP va permettre de valider des radiotraceurs pour leur utilisation à la fois dans les projets scientifiques précliniques et cliniques. Elle va participer à l’amélioration de l’exploration physiologique et fonctionnelle en recherche, à la détection de tumeur et à la visualisation des réponses tumorales suite aux traitements. Cela va permettre des avancées majeures dans la compréhension du vivant. Le développement de nouveaux radiotraceurs plus spécifiques que ceux déjà disponibles va permettre une meilleure prise en charge des patients. Il est essentiel pour améliorer le diagnostic et le traitement des cancers tout en augmentant la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans diverses pathologies. Les cibles innovantes pour le développement de radiotraceurs en TEP se diversifient et s’adaptent aux besoins de détection et de traitement des maladies complexes. Nos recherches se concentrent sur des biomarqueurs et des mécanismes biologiques spécifiques pour permettre une imagerie plus précise, une détection précoce des maladies, et une meilleure évaluation de l'efficacité des traitements.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, un radiotraceur est injecté en intra-veineux aux animaux anesthésiés (1 fois par animal). Après injection du radiotraceur, l’animal est positionné sous la TEP/TDM (TDM, tomodensitomètre : scanner). Des images dynamiques (plusieurs acquisitions pouvant aller de 1h à 2h, réalisés une seule fois par animal) sont réalisées permettant d’évaluer et quantifier la distribution de la molécule marquée dans les organes au cours du temps (2h max) Dans un deuxième lot d’animaux, un radiotraceur est injecté en intra-veineux aux animaux anesthésiés, puis l’animal est réveillé. Après un intervalle de temps adéquat (défini grâce au premier lot d’animaux), l’animal est de nouveau anesthésié puis positionné sous la caméra pour un scanner, suivi de l’acquisition TEP (max 20min). Cette manipulation pourra être répétée 3 à 4 fois sur une période de 6 semaines maximum (avec administration de traitements ou non en parallèle), afin de suivre l’évolution des pathologies chez les animaux.
Impact sur les animaux
L’injection du radiotraceur par voie intraveineuse n’est pas douloureuse pour l’animal. Une gêne de courte durée liée à la piqûre elle-même est attendue. L’animal est imagé sous anesthésie générale pour avoir une parfaite immobilité, Les nuisances attendues sont celles d’une très légère hypothermie (contrecarrée par les systèmes de maintien de chaleur dans l’appareil d’imagerie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
En premier lieu, des expérimentations in vitro se déroulent sur des cellules ou des tissus isolés, pour tester la spécificité, la liaison et la stabilité du radiotraceur. Cela permet de vérifier que la substance fixée avec un atome radioactif cible bien toujours la molécule ou le récepteur d’intérêt, tout en gardant les mêmes propriétés. Les atomes radioactifs sont choisis afin de garantir une absence de toxicité de la molécule elle même. Des résultats satisfaisants in vitro conditionnent le passage à la phase in vivo, c’est-à-dire sur des modèles animaux. Cette étape permet d’observer comment le radiotraceur se comporte dans un organisme vivant : sa distribution dans les différents tissus, sa capacité à atteindre la cible, sa dégradation et son élimination par l’organisme. Cela donne une image plus réaliste de son efficacité et de sa sécurité, en tenant compte des processus physiologiques complexes. En résumé, le passage de l’in vitro à l’in vivo permet de valider la pertinence du radiotraceur dans un contexte biologique complet, étape essentielle avant toute application clinique. Des tests sur animaux sont nécessaires afin de caractériser la biodistribution de la molécule, son activité en lien avec le métabolisme de l’organisme et sa quantification dans les tissus cibles. Il n’y a pas d’approche à ce jour qui puisse se substituer à ce type d'imagerie.
Réduction
L’objet de la demande vise à valider l’utilisation de radiotraceurs pour de l’imagerie TEP préclinique et à aider à caractériser des modèles tumoraux de façon non invasive. Ce type d’imagerie permet la réduction d’animaux puisqu’elle permet un suivi longitudinal du même animal au cours du temps Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental grâce à des approches statstiques robustes. A la fin de toutes les expériences, les tissus d’intérêt sont prélevés. Le maximum d’informations est récolté afin de répondre aux mieux aux questions scientifiques posées.
Raffinement
Les animaux seront suivis 3 fois par semaine afin d'assurer leur bien-être et mettre en place des soins si besoin. Les expérimentations seront arrêtées dès l’atteinte d’un point limite tel que décrit dans une grille de score. Lors de l’injection des radiotraceurs, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale. Un tapis et un lit chauffant permettent un maintien continu de leur température corporelle, leur évitant ainsi une hypothermie. De plus, les constantes vitales des animaux sont mesurées des, facilitant le monitoring durant les phases d’acquisition des images (scanner et TEP). Cette technique est dite « non invasive », l’injection du radiotraceur est uniquement sous forme de « trace ». Les doses de traceurs injectés n’induiront pas d’effets néfastes sur les animaux car la quantité de molécule est trop faible pour induire une modification conséquente des mécanismes biologiques. MODIFICATION : Pour ce qu’il est de la doses de radioactivité injectées, pour le suivi d’un animal il peut être injecté jusqu’à 6 fois sur une période de 6 semaines maximum. Nous respecterons le plus souvent, un délais de 7 jours minimum entre chaque injection de radiotraceur. Dans la littérature (préclinique et clinique) et par notre expérience aucune toxicité n’a encore été mise en évidence sur la répétition d’injection sur 6 semaines. Cependant les images TEP et TDM seront étudiées pour s’assurer des changements possibles. Si une étude demande plus d’injection et / ou imagerie sur un temps plus long, alors un suivi accru sera réalisé pour vérifier l’induction d’une quelconque toxicité (étude des images TEP et TDM histologie).
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont particulièrement utilisés en cancérologie : les souches sont génétiquement caractérisées et la parenté biologique avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Le choix du modèle murin ou rat sera dépendant de sa pertinence pour la question scientifique et son imagerie. Par exemple, les modèles de rat seront préferentiellement choisis lors de cancers ciblant des organes petits, comme la prostate ou dans l’étude de métastases. En revanche, dans le cas de tumeur spontanée développée sur un modèle murin mimant la pathologie humaine, alors la souris sera utilisée. Les études sont réalisées sur des animaux adultes afin de favoriser la reproductibilité des résultats (métabolisme différent à différents stades de développement, …)
Mise en évidence de l’activité immunostimulante de produits pharmaceutiques sur la réponse immunitaire humorale
- Production de routine
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
12 000 souris vont être utilisées pour contrôler des lots de médicaments avant leur mise sur le marché, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur rate. Elles reçoivent le médicament par gavage cinq jours de suite, puis un stimulant injecté dans la veine de la queue. Le porteur écrit qu'une méthode sur cellules "est en cours de développement" mais que le test sur animaux reste le seul validé dans les autorisations de mise sur le marché, certains pays n'acceptant pas encore les alternatives in vitro. La réduction obtenue tient à deux décisions : passer de dix à huit souris par groupe, et faire accepter que le contrôle ne porte plus que sur les produits finis, ce qui divise par plus de deux le nombre de tests.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer l'activité immunostimulante des produits pharmaceutiques, conformément au dossier d'Autorisation de Mise sur le Marché approuvé par les autorités compétentes. L'objectif est d'assurer la qualité, l’efficacité et la sécurité des médicaments lors de leur libération.
Bénéfices attendus
Ce projet permet la libération de lots de médicaments dont les effets thérapeutiques sont approuvés pour le traitement des infections respiratoires ou urinaires. Ces produits ont également la particularité d'être utilisés comme des stimulants du système immunitaire, afin d'augmenter les défenses naturelles de l'individu. Au total, une vingtaine de tests au maximum sont programmés sur une année, soit une centaine de tests seront effectués au maximum au cours du projet.
Procédures
Les animaux ne sont soumis à aucun prélèvement ni à aucune procédure chirurgicale. Ils reçoivent uniquement des administrations par voie orale (traitement médicamenteux pendant 5 jours consécutifs) ou par voie intraveineuse dans la veine de la queue (injection d’un stimulant). Chaque intervention dure moins de 30 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les produits testés ne causent pas de nuisances ni d'effets indésirables sur les animaux. Cependant, la contention de l’animal et l’administration du médicament par gavage oral peuvent entraîner un léger stress et le passage de la sonde de gavage peut occasionner une légère irritation. L’introduction d’une aiguille, lorsqu'elle est effectuée selon les bonnes pratiques vétérinaires, entraîne une douleur légère de courte durée ainsi qu’un léger saignement.
Devenir
A la fin de chaque protocole les animaux seront mis à mort pour récupérer la rate afin d’analyser pour évaluer l’efficacité du médicament testé.
Remplacement
Une méthode alternative sur cellules est en cours de développement, mais les résultats ne sont pas encore suffisants pour remplacer le modèle animal. Actuellement, la technique d'analyse des plages de lyse reste la seule validée dans les autorisations de mise sur le marché, et certains pays n’ont pas encore accepté les alternatives de tests in vitro.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, une analyse statistique a été réalisée par des statisticiens à l'aide d'un logiciel spécialisé. Cette étude, basée sur les données collectées entre 2015 et 2016, visait à simuler la probabilité de détecter une différence, existante ou non. Un groupe de 8 souris permet d'obtenir une probabilité d'erreur très faible, tandis qu'un groupe de 7 souris est acceptable mais limite. Grâce à cette analyse, il a été possible de réduire le nombre de souris par groupe de 10 à 8. En dessous de ce seuil, le risque d'obtenir des résultats faussement conformes ou non conformes augmente. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, l’entreprise a réussi à faire accepter, par les pays dans lesquels le produit est commercialisé, que l’analyse soit faite exclusivement sur les produits finis et plus sur les intermédiaires de production (Cela expose le fabricant au risque de découvrir une non-conformité seulement à la fin de la production). Par conséquent, le nombre de tests a été réduit de plus de la moitié.
Raffinement
Les produits administrés sont des médicaments dont nous devons vérifier l’activité thérapeutique immunostimulante. Bien qu'ils soient également formulés pour une administration orale chez l'homme, il n'a jamais été constaté de signes de douleur, de toxicité ou de mortalité des souris à la suite de leur administration. Les gestes techniques sont maîtrisés par le personnel pour minimiser l’angoisse des animaux. L'injection dans la veine de la queue de la souris est réalisée sans contention ni contrainte de l’animal. Pour réduire l'angoisse, les souris seront maintenues en groupes. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement validé, qui favorise leur bien-être et réduit les conflits entre mâles. Si un animal présente des signes de détresse ou un comportement anormal, il sera écarté du protocole et pourra recevoir des soins supplémentaires. Dans le cas d’une constatation de mal-être ou de douleur, un suivi sur 5 jours avec une grille de scoring évaluant l’état de la souris sera effectué. Si l'état est trop sévère, et/ou ne s’améliore pas dans les deux jours après constatation du mal être ou douleur, l'animal sera mis à mort par dislocation cervicale avec sédation préalablement.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet sont âgées de 5 à 6 semaines au début du protocole. On estime qu’à cet âge adulte le système immunitaire des souris est bien développé pour atteindre une réponse immunitaire optimale. La souche des souris est connue pour sa capacité à produire une quantité importante d’anticorps à cet âge-là. De plus, elle a l’avantage d’avoir une génétique similaire à celle de l’Homme.