Procédures légères
Impact d’une manipulation des contrôles inhibiteurs des neurones dopaminergiques en modèles de maladie de Parkinson EU1/2 (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une biopsie de tissu est pratiquée sur des souriceaux éveillés vers le sixième jour après la naissance, puis les animaux subissent une chirurgie crânienne pouvant durer quatre heures. 1 396 souris vont être utilisées, 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 160 sous anesthésie sans réveil, et toutes tuées pour prélèvement de tissus. Le protocole prévoit jusqu'à 36 tests comportementaux par animal sur 20 semaines, 20 prélèvements sanguins à la queue et deux examens IRM de deux heures. Le porteur annonce une prise en charge de la douleur, tout en indiquant que les altérations des seuils de douleur provoquées par la lésion ne seront pas soulagées puisqu'elles constituent l'objet de l'étude.
Objectifs
La perte des neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson s’accompagne d’un dysfonctionnement de certains circuits cérébraux et de symptômes moteurs et non-moteurs qui restent difficiles à prendre en charge. La lésion d’une région cérébrale incluant une structure qui est un contrôle de ces neurones dopaminergiques peut améliorer certains symptômes. L’identification récente d’un marqueur moléculaire sélectif de cette structure permet désormais d’étudier les conséquences d’une modulation de l’activité de cette structure dans un modèle de la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est ainsi de tester si l’inhibition sélective de cette structure transitoire et chronique peut soulager les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs. Les patients Parkinsoniens présentent par ailleurs des altérations structurelles et fonctionnelles de leur réseaux cérébraux, visibles par imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces altérations de la connectivité cérébrale pourraient être modifiées par l’inactivation de notre structure d’intérêt. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
La structure cérébrale ciblée par ce projet exerce un contrôle inhibiteur sur les systèmes dopaminergiques, qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson. Ce projet doit permettre de tester si une inhibition aigüe et chronique de cette structure peut améliorer les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs, apportant ainsi une preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de cette cible anatomique. La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Connue pour ses symptômes moteurs, cette maladie a aussi des conséquences délétères non-motrices, incluant douleur, troubles de l’humeur et déficits cognitifs. Les patients présentent en moyenne 14 symptômes dans les phases précoces de la maladie et plus de 20 dans des phases plus tardives, mettant en évidence le besoin de prendre cette complexité en considération dans la recherche préclinique.
Procédures
Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Des animaux sont soumis à 1 chirurgie d’au maximum 1h30 ou 4h, et un maximum de 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes chaque, répartis sur 20 semaines avec au moins un jour de repos entre chaque test. Les animaux sont soumis à un prélèvement par semaine sur la veine caudale localisée sur la queue, d’une durée de 2 minutes par animal (20 prélèvements maximum). Les animaux sont soumis à deux examens IRM sous anesthésie, incluant chacun au plus une séquence d'IRM fonctionnelle de 16min, une d'IRM anatomique de 10 min et une d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures maximum par examen) (EU2).
Impact sur les animaux
Une douleur légère et de courte durée peut être provoquée par la biopsie de tissus. La chirurgie peut entraîner une perte de poids transitoire, une douleur postopératoire modérée, une inflammation locale transitoire autour du dispositif des points de suture (peau du crâne). Les tests comportementaux peuvent s’accompagner d’un stress léger. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude. Le transport et l’environnement inconnu de la nouvelle animalerie peuvent également entrainer un stress chez les animaux au moment du changement d’EU.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les comportements étudiés et la connectivité cérébrale nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal. Toutefois, des tests in-vitro par spectrométrie de masse seront réalisés en amont de l’inhibition chronique de notre structure.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton, tunnel, coton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils sont habitués à la manipulation avant la chirurgie, ainsi qu’aux environnements des tests comportementaux avant leur réalisation. Les animaux seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. La lésion des neurones dopaminergiques est partielle, se rapprochant du stade précoce de la maladie de Parkinson. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Le transport entre les 2 EU se fera dans des cages sécurisées avec nourriture et eau gélifiée et une période de 1 semaine sera respectée avant le début des examens IRM. Durant celui-ci, une anesthésie sera utilisée pour réduire au maximum le stress de l'animal. Leurs yeux seront protégés du dessèchement par l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage et maintenue par un système de chauffage du berceau de l’IRM et un tapis chauffant. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera placé dans une enceinte chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours, et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.
Prélèvements biologiques sur animaux de rente (vaches, chèvres, poules) et sur rongeurs (souris, rats) pour répondre à des activités de recherche et de référence nationale et internationale de diagnostic
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 50
Chèvres : 12
Bovins : 6
Poules : 10
Sur 278 animaux, 100 souris seront tuées par ponction cardiaque, 168 autres animaux réutilisés dans d'autres projets et 10 poules rendues à l'élevage. Vaches, chèvres, poules, rats et souris subissent des prises de sang répétées et des écouvillonnages, dans des procédures déclarées légères, sauf le prélèvement terminal des souris, mené sous anesthésie sans réveil. Les vaches sont piquées à la jugulaire ou à la veine de la queue jusqu'à quatre fois par semaine, les chèvres deux fois, les poules deux fois à la veine de l'aile, avec en plus des écouvillons nasaux, buccaux, oculaires et auriculaires. Le sang collecté sert de réactif de référence pour des tests de diagnostic vétérinaire, et le sang de bovin à nourrir des insectes piqueurs sur membrane, ce que le porteur décrit comme un "raffinement" du protocole de nourrissage.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de réaliser régulièrement des prélèvements de matériel biologique (sang et écouvillonnages) non disponibles auprès des fournisseurs agréés, afin de permettre au laboratoire de disposer des échantillons biologiques nécessaires à ses activités de recherche et de référence, de diagnostic sur les maladies animales. L’utilisation de sang et/ou de sécrétions corporelles est routinière dans les laboratoires non seulement développeurs de vaccins vétérinaires et de techniques de diagnostic de maladies animales mais aussi pour les activités de recherche sur les maladies animales (vaches, chèvres, poules). Ces produits organiques constituent des réactifs biologiques nécessaires pour, par exemple, l’évaluation de l’efficacité de vaccins, l’étude des cellules du système immunitaire, le développement de modèle ex-vivo, de tests de diagnostic de maladies, l’élaboration des réactifs de référence pour les tests de diagnostic ou bien encore le nourrissage artificiel des vecteurs hématophages de ces maladies. Les espèces animales choisies (vaches, chèvres, poules, rongeurs) pour ce projet sont les espèces cibles ou les modèles animaux des maladies étudiées. Le nombre d’animaux utilisés sera adapté à l’activité, aux projets et à la capacité d’hébergement de notre établissement. Le volume et fréquence des prélèvements sanguins seront minimisés et contrôlés dans les limites recommandées pour chaque espèce. Toutes les procédures seront adaptées à l’espèce animale choisie et réalisées par du personnel expérimenté et qualifié. Le respect des 5 libertés du bien-être animal sera pris en compte tout au long de leur hébergement : absence de faim et de soif, absence d’inconfort, absence de douleurs ou blessures, liberté d’exprimer le comportement propre à l’espèce, absence de peur et /ou d’anxiété.
Bénéfices attendus
Le sang de bovin permet le raffinement du protocole de nourrissage des insectes hématophages sur membrane. Ce projet apporte plusieurs avantages et bénéfices à notre établissement. En effet, dans le cadre des activités de recherche sur ces maladies, le sang des animaux de rente (vaches, chèvres) est aussi la source première pour la préparation les cellules de l’immunité pour les études in vitro de la réponse immunitaire. Le laboratoire se doit de fournir des réactifs biologiques de référence de qualité (issus des prélèvements de sang ou d’écouvillons) 1/ pour le diagnostic des maladies sur lesquelles il travaille, 2/ pour la réalisation des panels d’échantillons pour les essais inter-laboratoires 3/ pour la qualification des kits de diagnostic et la formation du personnel habilité à réaliser les analyses sous accréditation. Le sang des rongeurs (rats et souris) sert à développer de nouvelles techniques de purification en remplacement de celles utilisées jusqu’à maintenant et devenues indisponibles. Enfin, le sang de souris est également utilisé pour enrichir le milieu de culture in vitro de nouvelles souches de parasites sur lesquels travaille le laboratoire, ce qui réduira le nombre de rongeurs nécessaires à la production en grand nombre de ces parasites.
Procédures
Les animaux sont soumis à des prélèvements réguliers et sont réalisés le plus souvent sur animaux vigiles. Les vaches sont prélevées à la veine jugulaire ou caudale en fonction des besoins pour les études réalisées à partir du sang. Les prélèvements ont lieu jusqu’à quatre fois par semaine. Les chèvres sont prélevées à la veine jugulaire en moyenne deux fois par semaine. La durée du prélèvement dépend du volume nécessaire mais n’excède en aucun cas 5 minutes. Des écouvillons (nasaux, buccaux, oculaires et auriculaires) sont également réalisés sur les vaches et chèvres afin d’obtenir le matériel biologique utile pour les études. Ces prélèvements sont rapides (< 5 min). Les poules sont prélevées à l’aile (veine alaire) jusqu’à deux fois par semaine en fonction des besoins. La durée du prélèvement pour les animaux de rente dépend du volume nécessaire mais n’excède en aucun cas 5 minutes. Pour les rats, le prélèvement se fait à la veine caudale sous anesthésie générale et la durée maximale est de 5 minutes. Le volume maximal du prélèvement est de 500 µL à raison de deux fois maximum par semaine. Pour les souris, le prélèvement (75 µL maximum), d’une durée maximale de 3 min, se fait à l’extrémité de la queue sur souris vigile, est effectué une fois par semaine pendant 4 semaines. Les prélèvements de sang terminaux sur souris sont réalisés par ponction cardiaque sous anesthésie générale et dure moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
La seule nuisance qui peut survenir est un léger stress de l’animal lors du prélèvement sanguin, dû à la contention et à l’introduction de l’aiguille. Aucun effet indésirable post prélèvement n’est attendu sur les animaux de ce projet. Les procédures 1 à 4 sont décrites comme des procédures de « classe légère ». La procédure 5 est en classe sans réveil car le volume total du sang est prélevé par ponction cardiaque sous anesthésie générale.
Devenir
Animaux de rente (vaches, chèvres, poules) : Ces animaux restant plus longtemps dans notre établissement que la durée de ce projet, ils seront réutilisés sur un futur projet de prélèvements sanguins. À l'issue du temps d’hébergement au sein de notre établissement, préalablement défini par rapport à la durée de vie de chaque espèce, ces animaux n’ayant uniquement fait l'objet que de prélèvements (sang, mucus) seront proposés à l'adoption. Les adoptants, qu'ils soient professionnels ou particuliers, seront sélectionnés selon des critères stricts garantissant le respect des 5 libertés fondamentales du bien-être animal. Cette démarche permet aux animaux de terminer leur vie dans des conditions optimales et conformes à leur nature. Rongeurs de laboratoire : Rats : L'ensemble des rats sera réutilisé dans un autre projet de recherche dont la procédure est classée modérée, conformément au principe de réduction des animaux utilisés. Souris : 50% des souris seront réutilisées dans un autre projet de recherche (classée modérée) et 50% des souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure expérimentale (classée sans réveil) dans laquelle elles sont intégrées.
Remplacement
Le matériel biologique prélevé (sang et/ou écouvillons) n’est pas disponible et ne peut pas être remplacé par une méthode alternative, ce qui rend indispensable le recours à l’utilisation d’animaux. Les espèces animales choisies dans ce projet correspondent aux espèces cibles ou aux modèles animaux expérimentaux des maladies étudiées au laboratoire.
Réduction
Pour les études en immunologie, le nombre d’animaux utilisés est réduit à son maximum, sans pour autant nuire à la significativité des résultats qui en découleront : un nombre minimum de 3 vaches et 4 chèvres est nécessaire pour montrer la répétabilité, la fiabilité et la robustesse des résultats des études. Le nombre de poules, souris et de rats indiqué est un nombre maximum qui a été estimé au plus juste pour permettre de réaliser les différentes procédures de ce projet.
Raffinement
Pour les animaux de rente, le raffinement consiste à une habituation à la contention pendant quelques semaines avant la réalisation des prélèvements. L’animal est amené régulièrement dans l’espace dédié au prélèvement et mis en contention sans réalisation de prélèvement, afin de l’habituer et de le conditionner. Lorsque l'animal s'est familiarisé avec le processus, la phase de contention ne provoque plus de réaction de stress, permettant ainsi de réaliser les prélèvements sanguins ou par écouvillon dans un contexte serein et favorable. Pour les rongeurs, une manipulation quotidienne (une fois par jour) sur plusieurs jours (2 jours à une semaine) avant le prélèvement est réalisée pour diminuer le stress de l’animal en l’habituant à être manipuler.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies dans ce projet sont les espèces cibles ou les modèles animaux expérimentaux des maladies étudiées au laboratoire. Les animaux de rente (vaches, chèvres) seront âgés de 1 à 2 ans à l’entrée dans notre établissement et entre 6 mois et 1 an pour les poules. Ils restent un maximum de 8 ans puis ils sont replacés dans le cas où que des prélèvements sanguins sont réalisés. Les souris seront âgées d’au moins 3 semaines au moment de leur entrée en stabulation, et les rats de 4 semaines. Lors des prélèvements, les souris auront au moins 6 semaines et les rats 5 semaines. Pour chaque espèce animale, une quarantaine est appliquée 1 mois pour les animaux de rente, deux semaines pour les poules et une semaine pour les rongeurs. Le prélèvement sanguin est réalisé au stade adulte car, à ce stade, l’animal présente un système physiologique pleinement développé, permettant d’obtenir des paramètres hématologiques et immunologiques fiables et représentatifs. Les volumes de sang requis pour les analyses ne peuvent pas être prélevés de manière sûre sur des individus immatures, chez lesquels les capacités de régénération et le volume sanguin total sont insuffisants. Le prélèvement chez l’adulte garantit ainsi la validité scientifique des données tout en limitant les risques pour l’animal conformément aux principes du bien-être animal.
Production de lait de lapines entrant dans la fabrication d’un médicament humain
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Tests réglementaires
134 800 lapins et lapines vont être utilisés dans ce projet, déclaré d'un niveau de souffrance léger, aucun n'étant gardé vivant à l'issue. Les femelles transgéniques sont traites trois à cinq jours par semaine pendant trois semaines, sous injection d'ocytocine, remises en lactation après quarante-six jours de repos, et tuées quand elles atteignent dix-huit lactations ou de "mauvais résultats zootechniques". Les lapereaux sont utilisés pour déclencher et maintenir la lactation de leur mère, huit étant gardés au nid, puis tués à la fin des trois semaines de traite. Le lait entre dans la fabrication d'un médicament pour les hémophiles, et le porteur écrit qu'il n'existe pas de modèle alternatif au lapin pour produire cette protéine, l'autorisation de mise sur le marché imposant l'usage exclusif de cette espèce.
Objectifs
L'objectif de ce projet est la production de lait de lapine entrant dans la fabrication d'un médicament à usage humain, destiné aux hémophiles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est la production d'un médicament à usage humain.
Procédures
Identification des animaux : à la naissance apposition d'une boucle puis vers 8-9 jours, d'une puce électronique et enfin entre 28 et 35 jours les animaux sont tatoués. Prélèvement de lait, traite des lapines et injection d'ocytocine (3 à 5 jours par semaine pendant 3 semaines, les lapines sont réutilisées plusieurs fois pour la traite après un temps minimum de repos de 46 jours). Lors du renouvellement des mâles homozygotes, réalisation de biopsies de queue sur environ 120 animaux tous les 3-4 ans.
Impact sur les animaux
La traite (10 minutes environ, 3 à 5 jours par semaine sur 3 semaines) et l'injection d'ocytocine de la procédure "Lait" peuvent induire un léger stress. Les étapes de la procédure "élevage" peuvent également entrainer : - un léger stress sur les animaux lors des différentes manipulations : une douleur légère lors de l'identification des animaux (apposition d'une boucle puis d'une puce électronique et enfin réalisation d'un tatouage) - une douleur modérée lors de la réalisation de biopsie. une douleur légère lors des prélèvements sanguins effectués sur chaque mâle homozygote.
Devenir
Les animaux peuvent être utilisés pour le renouvellement des animaux ou dans le cadre de la traite des lapines et dans plusieurs lots. Dans la procédure "élevage", les animaux ayant atteint un point limite tel que défini dans la grille, les animaux reproducteurs ayant de mauvais résultats zootechniques ou ayant atteint la limite zootechnique d'âge ou de nombre de mise-bas pour être maintenus dans la procédure "traite" seront mis à mort. Dans la procédure "traite", à la fin des 3 semaines de traite, les lapereaux des femelles en traite seront mis à mort. De même, au cours de la procédure, les animaux ayant atteint un point limite tel que défini dans la grille et les animaux reproducteurs ayant de mauvais résultats zootechniques ou ayant atteint la limite de nombre de lactations (maximum 18) pour être maintenus dans la procédure de production de lait seront également mis à mort.
Remplacement
A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe pas de modèle alternatif au lapin pour la production de cette protéine thérapeutique.
Réduction
Depuis le début de cette activité, les méthodes de production ont constamment été améliorées et continuent de l'être afin d'obtenir la plus grande quantité de matière active par animal et donc de limiter le nombre de sujets utilisés. De plus, l'utilisation de mâles homozygotes (en remplacement des hétérozygotes) pour le renouvellement des femelles productrices de lait permet de produire 100 % d'animaux transgéniques.
Raffinement
Les lapins sont hébergés dans des cages adaptées, conformes aux exigences de la règlementation et de respect du bien être animal. Ils disposent d'un enrichissement adapté (diffusion de radio, mise à disposition de bûchettes de bois à ronger). Le suivi quotidien des animaux est assuré par des personnes expérimentées et formées régulièrement. Des fiches de suivi permettent d’enregistrer les soins adaptés prodigués aux animaux et de suivre l’évolution de l’état de santé des animaux. Une évaluation de la souffrance animale en référence à une grille établie est réalisée chaque jour. La grille permet également de fixer les points limites et de cesser immédiatement l'expérimentation sur tout lapin présentant des signes de souffrance dépassée.
Choix des espèces
La lapine est dotée d'une glande mammaire qui possède toute la machinerie cellulaire permettant d'apporter les modifications post-traductionnelles, nécessaires à l'activité biologique des protéines recombinantes humaines. De plus, le médicament est sous autorisation de mise sur le marché avec utilisation exclusive du lapin. Les mâles et femelles WT et Tg sont utilisés à l'âge adulte de la façon suivante : - mâles WT pour le renouvellement de nos cheptels WT et / ou pour la reproduction des femelles transgéniques productrices de lait, - femelles WT pour le renouvellement des cheptels WT et Tg, - mâles Tg homozygotes pour le renouvellement des cheptels Tg, - femelles Tg hétérozygotes pour la traite ainsi que pour le renouvellement du cheptel de mâles Tg homozygotes (1 fois tous les 3-4 ans). Les lapereaux des femelles en traite sont utilisés pour le déclenchement, l'induction de la production laitière des femelles puis 8 lapereaux sont conservés au nid pour le maintien de la lactation (qui dure 3 semaines). A la fin des 3 semaines, les lapereaux sont euthanasiés. Voir l'annexe "Scheme genetic for milk production" indiquant les différents cheptels nécessaires et les différents croisements réalisés.
Utilisation d’agents d’imagerie TEP (radiotraceurs) dans le diagnostic et le suivi de traitements-MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 1100
1 100 souris et 1 100 rats reçoivent des injections de traceurs radioactifs sous anesthésie générale, puis passent des séances d'imagerie pouvant durer deux heures, jusqu'à six fois en six semaines. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et tous les animaux sont tués à l'issue, la mise à mort étant justifiée par une seule phrase sur des "analyses post-mortem". Le porteur qualifie la technique de "non invasive" et affirme qu'aucune toxicité n'a été mise en évidence sur la répétition des injections, tout en prévoyant d'examiner les images pour vérifier "des changements possibles". Le projet sert aussi à caractériser des modèles tumoraux, la souris pour les tumeurs spontanées, le rat pour les cancers de petits organes comme la prostate.
Objectifs
L'imagerie par Tomographie par Émission de Positons (TEP) en préclinique est une technique très précieuse pour la recherche biomédicale. Elle permet d'observer et de suivre en détail des radiotraceurs. Un radiotraceur est substance fixée à un atome radioactif. Cette substance est choisie parce qu’elle va se diriger vers un organe ou un tissu particulier. Une fois injectée dans le corps, elle émet de très faibles rayonnements qu’on peut détecter avec la TEP.. Ainsi, les chercheurs peuvent visualiser la distribution de substances radioactives dans le corps, ce qui est particulièrement utile pour étudier des maladies comme le cancer. Cette méthode offre une image précise en 3D, permettant d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements, de comprendre la progression des maladies, ou encore de tester de nouvelles molécules.La TEP est donc un outil essentiel pour faire avancer la recherche médicale de manière sûre et efficace, tout en réduisant la nécessité d'expériences invasives. La TEP est couplée à de l’imagerie de tomodensitométrie (TDM), permettant d’avoir une cartographie complète de la molécule dans l’organisme. L’utilisation de cette technique permet : • De révéler des mécanismes biologiques, comme le métabolisme glucidique ou lipidique ou encore la prolifération cellulaire • De révéler et de suivre la réponse aux traitements dans différentes pathologies • Etudier la biodistribution (c’est-à-dire la répartition de la molécule dans les différents organes) de médicaments Par aillleurs, cette technologie est aujourd’hui largement utilisée chez les patients atteints de cancer pour le diagnostic et le suivi de réponse au traitement. Cependant les radiotraceurs disponibles sont limités (le [18F]FDG est utilisé dans 90% des cas en clinique. Analogue du glucose, il permet de voir les cellules surconssomatrices de glucose mais son utilisation est limitée dans les organes où il y a une fixation physiologique, comme le cerveau . De plus le [18F]FDG peut marquer des cellules inflammatoires ou infectieuses donnant des faux positifs dans le cas de détection de cancer. Le développement de nouveaux radiotraceurs est donc nécessaire pour une meilleure prise en charge des patients atteints de cancers et d’autres pathologies.
Bénéfices attendus
L’imagerie TEP va permettre de valider des radiotraceurs pour leur utilisation à la fois dans les projets scientifiques précliniques et cliniques. Elle va participer à l’amélioration de l’exploration physiologique et fonctionnelle en recherche, à la détection de tumeur et à la visualisation des réponses tumorales suite aux traitements. Cela va permettre des avancées majeures dans la compréhension du vivant. Le développement de nouveaux radiotraceurs plus spécifiques que ceux déjà disponibles va permettre une meilleure prise en charge des patients. Il est essentiel pour améliorer le diagnostic et le traitement des cancers tout en augmentant la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans diverses pathologies. Les cibles innovantes pour le développement de radiotraceurs en TEP se diversifient et s’adaptent aux besoins de détection et de traitement des maladies complexes. Nos recherches se concentrent sur des biomarqueurs et des mécanismes biologiques spécifiques pour permettre une imagerie plus précise, une détection précoce des maladies, et une meilleure évaluation de l'efficacité des traitements.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, un radiotraceur est injecté en intra-veineux aux animaux anesthésiés (1 fois par animal). Après injection du radiotraceur, l’animal est positionné sous la TEP/TDM (TDM, tomodensitomètre : scanner). Des images dynamiques (plusieurs acquisitions pouvant aller de 1h à 2h, réalisés une seule fois par animal) sont réalisées permettant d’évaluer et quantifier la distribution de la molécule marquée dans les organes au cours du temps (2h max) Dans un deuxième lot d’animaux, un radiotraceur est injecté en intra-veineux aux animaux anesthésiés, puis l’animal est réveillé. Après un intervalle de temps adéquat (défini grâce au premier lot d’animaux), l’animal est de nouveau anesthésié puis positionné sous la caméra pour un scanner, suivi de l’acquisition TEP (max 20min). Cette manipulation pourra être répétée 3 à 4 fois sur une période de 6 semaines maximum (avec administration de traitements ou non en parallèle), afin de suivre l’évolution des pathologies chez les animaux.
Impact sur les animaux
L’injection du radiotraceur par voie intraveineuse n’est pas douloureuse pour l’animal. Une gêne de courte durée liée à la piqûre elle-même est attendue. L’animal est imagé sous anesthésie générale pour avoir une parfaite immobilité, Les nuisances attendues sont celles d’une très légère hypothermie (contrecarrée par les systèmes de maintien de chaleur dans l’appareil d’imagerie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
En premier lieu, des expérimentations in vitro se déroulent sur des cellules ou des tissus isolés, pour tester la spécificité, la liaison et la stabilité du radiotraceur. Cela permet de vérifier que la substance fixée avec un atome radioactif cible bien toujours la molécule ou le récepteur d’intérêt, tout en gardant les mêmes propriétés. Les atomes radioactifs sont choisis afin de garantir une absence de toxicité de la molécule elle même. Des résultats satisfaisants in vitro conditionnent le passage à la phase in vivo, c’est-à-dire sur des modèles animaux. Cette étape permet d’observer comment le radiotraceur se comporte dans un organisme vivant : sa distribution dans les différents tissus, sa capacité à atteindre la cible, sa dégradation et son élimination par l’organisme. Cela donne une image plus réaliste de son efficacité et de sa sécurité, en tenant compte des processus physiologiques complexes. En résumé, le passage de l’in vitro à l’in vivo permet de valider la pertinence du radiotraceur dans un contexte biologique complet, étape essentielle avant toute application clinique. Des tests sur animaux sont nécessaires afin de caractériser la biodistribution de la molécule, son activité en lien avec le métabolisme de l’organisme et sa quantification dans les tissus cibles. Il n’y a pas d’approche à ce jour qui puisse se substituer à ce type d'imagerie.
Réduction
L’objet de la demande vise à valider l’utilisation de radiotraceurs pour de l’imagerie TEP préclinique et à aider à caractériser des modèles tumoraux de façon non invasive. Ce type d’imagerie permet la réduction d’animaux puisqu’elle permet un suivi longitudinal du même animal au cours du temps Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental grâce à des approches statstiques robustes. A la fin de toutes les expériences, les tissus d’intérêt sont prélevés. Le maximum d’informations est récolté afin de répondre aux mieux aux questions scientifiques posées.
Raffinement
Les animaux seront suivis 3 fois par semaine afin d'assurer leur bien-être et mettre en place des soins si besoin. Les expérimentations seront arrêtées dès l’atteinte d’un point limite tel que décrit dans une grille de score. Lors de l’injection des radiotraceurs, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale. Un tapis et un lit chauffant permettent un maintien continu de leur température corporelle, leur évitant ainsi une hypothermie. De plus, les constantes vitales des animaux sont mesurées des, facilitant le monitoring durant les phases d’acquisition des images (scanner et TEP). Cette technique est dite « non invasive », l’injection du radiotraceur est uniquement sous forme de « trace ». Les doses de traceurs injectés n’induiront pas d’effets néfastes sur les animaux car la quantité de molécule est trop faible pour induire une modification conséquente des mécanismes biologiques. MODIFICATION : Pour ce qu’il est de la doses de radioactivité injectées, pour le suivi d’un animal il peut être injecté jusqu’à 6 fois sur une période de 6 semaines maximum. Nous respecterons le plus souvent, un délais de 7 jours minimum entre chaque injection de radiotraceur. Dans la littérature (préclinique et clinique) et par notre expérience aucune toxicité n’a encore été mise en évidence sur la répétition d’injection sur 6 semaines. Cependant les images TEP et TDM seront étudiées pour s’assurer des changements possibles. Si une étude demande plus d’injection et / ou imagerie sur un temps plus long, alors un suivi accru sera réalisé pour vérifier l’induction d’une quelconque toxicité (étude des images TEP et TDM histologie).
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont particulièrement utilisés en cancérologie : les souches sont génétiquement caractérisées et la parenté biologique avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Le choix du modèle murin ou rat sera dépendant de sa pertinence pour la question scientifique et son imagerie. Par exemple, les modèles de rat seront préferentiellement choisis lors de cancers ciblant des organes petits, comme la prostate ou dans l’étude de métastases. En revanche, dans le cas de tumeur spontanée développée sur un modèle murin mimant la pathologie humaine, alors la souris sera utilisée. Les études sont réalisées sur des animaux adultes afin de favoriser la reproductibilité des résultats (métabolisme différent à différents stades de développement, …)
Mise en évidence de l’activité immunostimulante de produits pharmaceutiques sur la réponse immunitaire humorale
- Production de routine
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
12 000 souris vont être utilisées pour contrôler des lots de médicaments avant leur mise sur le marché, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur rate. Elles reçoivent le médicament par gavage cinq jours de suite, puis un stimulant injecté dans la veine de la queue. Le porteur écrit qu'une méthode sur cellules "est en cours de développement" mais que le test sur animaux reste le seul validé dans les autorisations de mise sur le marché, certains pays n'acceptant pas encore les alternatives in vitro. La réduction obtenue tient à deux décisions : passer de dix à huit souris par groupe, et faire accepter que le contrôle ne porte plus que sur les produits finis, ce qui divise par plus de deux le nombre de tests.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer l'activité immunostimulante des produits pharmaceutiques, conformément au dossier d'Autorisation de Mise sur le Marché approuvé par les autorités compétentes. L'objectif est d'assurer la qualité, l’efficacité et la sécurité des médicaments lors de leur libération.
Bénéfices attendus
Ce projet permet la libération de lots de médicaments dont les effets thérapeutiques sont approuvés pour le traitement des infections respiratoires ou urinaires. Ces produits ont également la particularité d'être utilisés comme des stimulants du système immunitaire, afin d'augmenter les défenses naturelles de l'individu. Au total, une vingtaine de tests au maximum sont programmés sur une année, soit une centaine de tests seront effectués au maximum au cours du projet.
Procédures
Les animaux ne sont soumis à aucun prélèvement ni à aucune procédure chirurgicale. Ils reçoivent uniquement des administrations par voie orale (traitement médicamenteux pendant 5 jours consécutifs) ou par voie intraveineuse dans la veine de la queue (injection d’un stimulant). Chaque intervention dure moins de 30 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les produits testés ne causent pas de nuisances ni d'effets indésirables sur les animaux. Cependant, la contention de l’animal et l’administration du médicament par gavage oral peuvent entraîner un léger stress et le passage de la sonde de gavage peut occasionner une légère irritation. L’introduction d’une aiguille, lorsqu'elle est effectuée selon les bonnes pratiques vétérinaires, entraîne une douleur légère de courte durée ainsi qu’un léger saignement.
Devenir
A la fin de chaque protocole les animaux seront mis à mort pour récupérer la rate afin d’analyser pour évaluer l’efficacité du médicament testé.
Remplacement
Une méthode alternative sur cellules est en cours de développement, mais les résultats ne sont pas encore suffisants pour remplacer le modèle animal. Actuellement, la technique d'analyse des plages de lyse reste la seule validée dans les autorisations de mise sur le marché, et certains pays n’ont pas encore accepté les alternatives de tests in vitro.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, une analyse statistique a été réalisée par des statisticiens à l'aide d'un logiciel spécialisé. Cette étude, basée sur les données collectées entre 2015 et 2016, visait à simuler la probabilité de détecter une différence, existante ou non. Un groupe de 8 souris permet d'obtenir une probabilité d'erreur très faible, tandis qu'un groupe de 7 souris est acceptable mais limite. Grâce à cette analyse, il a été possible de réduire le nombre de souris par groupe de 10 à 8. En dessous de ce seuil, le risque d'obtenir des résultats faussement conformes ou non conformes augmente. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, l’entreprise a réussi à faire accepter, par les pays dans lesquels le produit est commercialisé, que l’analyse soit faite exclusivement sur les produits finis et plus sur les intermédiaires de production (Cela expose le fabricant au risque de découvrir une non-conformité seulement à la fin de la production). Par conséquent, le nombre de tests a été réduit de plus de la moitié.
Raffinement
Les produits administrés sont des médicaments dont nous devons vérifier l’activité thérapeutique immunostimulante. Bien qu'ils soient également formulés pour une administration orale chez l'homme, il n'a jamais été constaté de signes de douleur, de toxicité ou de mortalité des souris à la suite de leur administration. Les gestes techniques sont maîtrisés par le personnel pour minimiser l’angoisse des animaux. L'injection dans la veine de la queue de la souris est réalisée sans contention ni contrainte de l’animal. Pour réduire l'angoisse, les souris seront maintenues en groupes. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement validé, qui favorise leur bien-être et réduit les conflits entre mâles. Si un animal présente des signes de détresse ou un comportement anormal, il sera écarté du protocole et pourra recevoir des soins supplémentaires. Dans le cas d’une constatation de mal-être ou de douleur, un suivi sur 5 jours avec une grille de scoring évaluant l’état de la souris sera effectué. Si l'état est trop sévère, et/ou ne s’améliore pas dans les deux jours après constatation du mal être ou douleur, l'animal sera mis à mort par dislocation cervicale avec sédation préalablement.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet sont âgées de 5 à 6 semaines au début du protocole. On estime qu’à cet âge adulte le système immunitaire des souris est bien développé pour atteindre une réponse immunitaire optimale. La souche des souris est connue pour sa capacité à produire une quantité importante d’anticorps à cet âge-là. De plus, elle a l’avantage d’avoir une génétique similaire à celle de l’Homme.
Évaluation de nouvelles thérapies dans le domaine des maladies inflammatoires de l’intestin induit par l’indométacine
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 2880
5 760 rongeurs, 2 880 souris et 2 880 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 920 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite leur est provoquée par administration répétée d'indométacine, jusqu'à sept fois, par la bouche, sous la peau ou dans le ventre, puis ils reçoivent les composés à tester jusqu'à trois fois par jour pendant quinze jours par sonde gastrique, avec des prélèvements de sang dans l'orbite de l'œil et une ponction cardiaque terminale. Le porteur décrit des diarrhées, du sang dans les fèces et au rectum, et une mise à mort immédiate au-delà de 20 % de perte de poids en vingt-quatre heures. Les données serviront à fixer les doses des études toxicologiques puis des essais chez le volontaire sain, l'effectif de 5 760 animaux étant renvoyé à des "données de la littérature" et à des analyses de puissance.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements sur un modèle de colite chez le rongeur induit par un anti-inflammatoire non stéroïdien utilisé pour soulager les douleur et l’inflammation dans l’arthrose, l’arthrite rhumatoïde, la goute et les tendinites mais conduit souvent à des effets secondaires indésirables gastro-intestinaux. En inhibant la production de prostaglandines, cet anti-inflammatoire réduit l’inflammation et la douleur, mais cette inhibition entraîne une altération de la barrière intestinale et une augmentation de la perméabilité, favorisant des lésions et une inflammation locale pouvant conduire à des complications : ulcères, perforations et saignements entrainant une urgence chirurgicale. Ainsi par ces observations, cet anti-inflammatoire est utilisée pour induire une colite expérimentale chez les rongeurs qui mime par certaines aspects les maladies chroniques inflammatoires de l’intestin comme la maladie de Crohn. Les informations qui seront générées par le biais de ces études seront utilisées pour préparer les phases précliniques et cliniques du développement pharmaceutique de ces nouveaux traitements. Ces informations comprennent entre autres : • Dose minimale produisant un effet thérapeutique • Dose minimale pour lequel l’effet thérapeutique est le plus élevé. • Déterminant pharmacocinétique qui conduit à l’efficacité thérapeutique. • Régime de doses pour les études toxicologiques exploratoires et règlementaires. • Régime de doses pour les essais cliniques chez le volontaire sain, puis chez le patient.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un modèle de colite chimiquement induite chez la souris présente un intérêt majeur en recherche préclinique. Ce modèle reproduit des lésions intestinales et une inflammation similaires à celles observées dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, comme la maladie de Crohn. La maladie de Crohn est une pathologie chronique incurable qui entraîne des lésions intestinales évoluant par poussées et rémissions, avec un fort impact sur la qualité de vie. Les traitements actuels, tels que les corticoïdes, immunosuppresseurs et biothérapies, présentent des limites importantes : échecs thérapeutiques fréquents, perte de réponse au fil du temps et effets secondaires sévères. De plus, la maladie s’accompagne souvent de complications psychologiques comme la dépression et l’anxiété, liées à la douleur, la fatigue et la stigmatisation sociale. Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques (anti-inflammatoires, immunomodulateurs, antioxydants, probiotiques) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués, tels que l’altération de la barrière intestinale, le rôle des prostaglandines et l’impact du microbiote. Enfin, il contribue au développement de biomarqueurs pour le suivi de l’inflammation et de la réponse aux traitements, offrant ainsi une plateforme essentielle pour la découverte de stratégies innovantes contre les Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études soit jusqu’à 15 fois par animal . • Administration d’indométacine, 3 possibilités : o par voie orale : Durée 10 secondes, une à 7 fois sur animal vigile o par voie sous-cutanée : Durée 10 secondes, une à 7 fois sur animal vigile o par voie intrapéritonéale : Durée 10 secondes, une à 7 fois sur animal vigile • Prélèvement de sang par voie retro-orbitale au cours des procédures : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse, 1 fois par œil et par animal. Le prélèvement retro-orbital sera utilisé en dernier recours, seulement dans le cas où un volume plus large et un prélèvement rapide est nécessaire pour garantir l’intégrité des analytes. • Prélèvements de sang via la veine caudale : Durée 30 secondes, 3 fois par animal, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. • Prélèvements de sang terminaux par ponction cardiaque ou veine abdominale : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale profonde par injection ou gazeuse. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques (plusieurs choix possibles): o Par voir orale à l’aide d’une sonde gastrique : Durée 10 secondes sur animal vigile, jusqu’à 3 fois par jour, pendant 15 jours. o Par voie intrapéritonéale : Durée 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, jusqu’à 15 jours. o Sous-cutanée : Durée 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, pendant 15 jours. o Par voie intraveineuse retro-orbitale : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Une fois par œil et par animal. o Par voie intraveineuse via veine caudale : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Une fois par semaine pendant 2 semaines. • Test de perméabilité intestinale/administration de dextran par voie orale : Durée 10 secondes sur animal vigile, une fois toute les 2 semaines soit 1 à 2 fois par animal. • Mise à jeun avant administration orale de l’indométacine et mise à jeun pour le test de perméabilité intestinale. Durée 12h. Deux fois par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus des modèles de colite sont une perte de poids, des diarrhées, la présence de sang au niveau des fèces et/ou du rectum. Une piloérection, une réduction de la mobilité et une perte de poids > à 20% en 24h ou 25% depuis le jour 0 justifieraient une mise à mort immédiate.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. L’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différents tissus et du système immunitaire.
Remplacement
Il existe des modèles ex-vivo d’organoïdes intestinaux permettant un premier criblage pour évaluer l’efficacité des composés permettant de limiter le recours à l’animal dans les premières phases de développement. Cependant, ce système dépourvu d’autres organes et de structures immunologiques clés (ganglions mésentérique, rate, système lymphatique, hépatique, rénale et circulatoire) ne peut pas à ce jour constituer un environnement fiable pour prédire la pharmacologie in vivo. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des entités à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes impliquant entre autres la migration de cellules immunitaires vers l’intestin. Cependant, des tests in vitro et in silico qui permettent de prédire les profils pharmacocinétiques et les interactions avec la cible moléculaire d’intérêt seront utilisés en amont des études de ce projet. Ceci permettra de limiter le recours à l’animal.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évaluées de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent par exemple de prédire le profil pharmacocinétique d’un composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. Ainsi, les tests sur animaux sont réduits au minimum nécessaire. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet (2880 souris et 2880 rats, total 5760) se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux. Des analyses rétrospectives seront conduites pour s’assurer de la bonne adéquation du nombre d’animaux par groupe et de la puissance statistique recherché. Dans la plupart des cas, nous utiliserons l'approche conventionnelle du calcul de l'échantillon nécessaire pour une étude et qui repose sur quatre éléments (1) : l'erreur de type I, la puissance d'étude (80% au minimum), les suppositions dans le groupe contrôle pour la fréquence de réponse et la variabilité de celle-ci, et, enfin, l'effet attendu pour le traitement. L'erreur de type I (erreur alpha) consiste, dans une étude de supériorité d'un traitement versus un autre, à rejeter à tort l'hypothèse nulle (absence de différence) c'est-à-dire de conclure à tort qu'une différence existe entre les 2 traitements. Il sera accepté un risque de 5% comme c’est la convention en pharmacologie préclinique, soit une valeur p < 0,05.
Raffinement
Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des études en utilisant exclusivement des techniques non-aversives (ex : prélèvement de l’animal de sa cage avec l’aide d’un tunnel). Les procédures potentiellement douloureuses ou sources d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique a minima journalière sur la durée de la procédure. Les locaux et systèmes d'hébergement suivront un programme de contrôle d’hygiène et sanitaire afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adapté sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet, par ou sous l'autorité du vétérinaire. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car le stress lié à la manipulation non seulement affecte le bien être mais peu aussi impacter la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris. De nombreuses données sur les modèles de Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour l’avancement des projets. Adulte : Les données de la littérature indiquent que les rats (min. 5 semaines) et les souris (min. 7 semaines) adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine des Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin car ils disposent d'un système immunitaire mature.
Etude de l’innocuité et de l’efficacité d’un autovaccin bivalent contre la lactococcose et la furonculose chez la Truite Arc en ciel.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Un furoncle ouvert de plus de 1,5 cm, une exophtalmie sévère ou une nage sur le dos : ce sont les seuils au-delà desquels les poissons seront retirés de l'expérience et tués. 1 120 truites arc-en-ciel vont être utilisées, dont 504 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont exposées seize heures à une suspension de bactéries dans un volume d'eau restreint, ou saignées sous anesthésie, pour évaluer un autovaccin contre la furonculose et la lactococcose. Le porteur rappelle que ces deux maladies entraînent des "pertes économiques importantes" et que la truite arc-en-ciel est l'espèce de poisson la plus élevée en France.
Objectifs
La furonculose et la lactococcose sont deux maladies bactériennes des Salmonidés dues respectivement aux bactéries Aeromonas salmonicida sub. salmonicida et Lactococcus sp (L. petauri, L. garvieae). Elles entraînent des pertes économiques importantes en raison de la mortalité observée lors des formes suraiguës ou aiguës et des coûts liés à leur contrôle. Elles sont toutes les deux saisonnières et touchent toutes les classes d’âges des poissons, particulièrement en période estivale du fait de l’augmentation de la temperature de l’eau. Les vaccins et antibiotiques actuellement utilisés pour prévenir et traiter ces maladies présentent des limites en termes d’efficacité, de lutte contre l’antibiorésistance et de prévention des contaminations environnementales. Actuellement, ce sont des autovaccins qui sont utilisés (vaccin préparé sur mesure à partir du ou des bactéries isolées directement dans l’élevage et destiné uniquement à ce même élevage). Ce projet vise à optimiser les stratégies vaccinales en évaluant un autovaccin bivalent contre ces 2 maladies bactériennes majeures, ce qui permettrait de limiter le nombre d’injections. Outre l’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité de cet autovaccin, il inclut une évaluation des interactions entre les valences vaccinales sur le plan immunitaire.
Bénéfices attendus
L’administration de vaccins bivalents contre deux maladies bactériennes nécessitant l’utilisation d’antibiotiques lors des épisodes cliniques, contribuera à la lutte contre l’antibiorésistance en favorisant des pratiques d’élevage durables et en améliorant le bien-être des poissons via la réduction des impacts des maladies infectieuses et du stress des animaux. L’évaluation de l’efficacité et de l’innocuité de ces vaccins est une attente des professionnels, vétérinaires et éleveurs.
Procédures
Prises de sang : Un prélèvement par animal sera réalisé sur animaux anesthésiés. Chaque intervention, incluant l’induction de l’anesthésie, le prélèvement et l'euthanasie, durera environ 30 minutes. Infection par balnéation : les poissons seront exposés à une suspension bactérienne de A. salmonicida ou L. petauri pendant 16 h, dans un volume d’eau restreint mais oxygéné en continu
Impact sur les animaux
L'évaluation de l'efficacité vaccinale nécessite de réaliser des challenges infectieux chez les animaux. Les manifestations cliniques de l'infection expérimentale peuvent entrainer de la douleur chez les poissons. Le protocole sera arrêté dès l'observation de poissons moribonds (poissons avec déséquilibre sévère (nage sur le dos) et/ou absence de réaction au test de l’épuisette (apathie)) ou de signes caractéristiques des maladies (présence d’un furoncle ouvert dont le diamètre est supérieur à 1,5 cm, exophtalmie sévère).
Devenir
tous les animaux seront euthanasiés -soit après les prélèvements sanguins : du fait de l'utilisation de poissons < 50g, une mortalité élevée des animaux est observée, malgré l'expérience des manipulateurs -ou après l'infection des animaux : il n'est pas possible, pour des raisons sanitaires, de maintenir en vie des animaux protentiellement infectés.
Remplacement
L'objectif du projet étant d'évaluer l'efficacité de la vaccination contre la furonculose, cela ne peut se faire que sur animaux vivants. L'expérimentation animale est nécessaire car il n'existe pas encore de modèle in vitro pour l’étude de l'immunité post-vaccinale chez les poissons.
Réduction
Lors de la phase 1 durant laquelle le niveau de protection post vaccinale sera testé par la mesure de la production d'anticorps spécifiques, chaque lot sera constitué de 30 poissons. Ce nombre a été calculé en utilisant l'outil statistique en ligne https://biostatgv.sentiweb.fr avec le module "comparer 2 moyennes" et les paramètres suivant : μ1 = 0,15 ; μ2 = 1 ; ecart-type = 0,4 ; risque alpha = 0,05 et puissance = 0,9. Lors de la phase 2 durant laquelle certains lots de poissons seront soumis à un challenge infectieux pour mesurer l'efficacité vaccinale, les lots de poissons infectés seront constitués de 48 poissons alors que les lots témoins non infectés seront de 24 poissons. Ce nombre de 48 poissons a été déterminé avec le même outil que précedemment, en faisant l'hypothèse d'obtenir un RPS (relative percent survival) de 60 %, sachant que le RPS d'un protocole vaccinal est calculé par la formule suivante : (1 - (nombre de morts dans le lot vacciné et infecté / nombre de morts dans le lot non vacciné et infecté)) x 100. Dans les lots non infectés, nous faisons l'hypothèse que nous n'observerons pas de mortalité, nous avons ainsi réduit de moitié l'effectif de ces lots. Ces effectifs permettent d’obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés dans l’expérimentation. Une analyse immunologique sera réalisée en fin d’expérimentation sur l’ensemble des poissons survivants, afin de vérifier l'infection et de documenter la réponse immune. Les tests statistiques utilisés incluront des ANOVA, des tests non paramétriques (Kruskal-Wallis), et des modèles de régression linéaire.
Raffinement
Une observation quotidienne des poissons est assurée. Lors des procédures de challenge infectieux, les poissons font l’objet d’une observation plus rigoureuse deux fois par jour, chaque jour, de manière systématique. • Seuils d’alarme liés aux paramètres d’ambiance : Température de l’eau : si >20°C et non rectifiable, arrêt de l’expérimentation. Oxygène dissous : si
Choix des espèces
La truite arc en Ciel est un hôte naturel d'Aeromonas salmonicida et de Lactococcus sp. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France et donc pour laquelle il est important d'améliorer l'efficacité vaccinale Les truites utilisées seront de 5 g à l’arrivée à la station aquacole d'Oniris en Février, atteignant 20 à 30 g au début de l’expérimentation. La furonculose et la lactococcose sont des maladies observées à différents stades d'élevage. Sur le terrain, les éleveurs peuvent commencer à vacciner par voie intrapéritonéale les poissons de 30 à 50 g.
Etude des mécanismes physiopathologiques de maladies musculo-squelettiques chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Un prélèvement de tissu, trois injections, deux prises de sang, une radiographie et jusqu'à 22 tests comportementaux par animal : 2 334 souris subissent ces procédures, dont 791 dans un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Les femelles gestantes sont anesthésiées au gaz puis tuées par dislocation cervicale. Le porteur signale une tétanie et une mort subite possibles lors d'efforts ou de situations de stress, ainsi qu'une brûlure légère par le froid sur certaines souris, dans un projet portant sur des maladies musculo-squelettiques rares sans traitement. Les 22 tests comportementaux ne sont nommés nulle part.
Objectifs
Les maladies musculo-squelettiques sont principalement caractérisées par une petite taille, des extrémités courtes, une raideur articulaire et des atteintes musculaires. Elles sont liées à des mutations génétiques affectant des protéines essentielles au bon développement et fonctionnement d’un être vivant. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces protéines au cours du développement et leur implication dans les processus de croissance osseuse et musculaire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont i) une meilleure caractérisation des maladies musculo-squelettiques et ii) la validation d’essais thérapeutiques visant à réduire la fibrose et améliorer la force musculaire. L’observation d’un effet thérapeutique permettrait d’envisager un essai clinique et donc de valider une thérapie pour ces maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.
Procédures
Identification et prélèvement de tissus (5 minutes). Trois injections (1 à 5 minutes) ; deux prélèvements de sang (1 à 5 minutes) ; un examen radiographique (5 minutes). Tests comportementaux (maximum 22 tests ; 1 à 5 minutes). Femelles gestantes : trois pesées (30 secondes) ; une anesthésie gazeuse (5 minutes) ; une dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de tissus peut entraîner une douleur légère et localisée de courte durée. Les injections et prélèvement peuvent entraîner une douleur légère et localisée de courte durée. Une sécheresse oculaire pourra être constatée pendant l’examen radiographique. Tétanie et mort subite possible lors d'efforts et situations de stress. Une légère brûlure par le froid pourrait être constatée sur les souris à J0 et J4.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement d’organes et analyses prévues.
Remplacement
Dans les maladies musculo-squelettiques, la mortalité précoce liée à l'association d'atteintes cardiaques, respiratoires et des voies aériennes supérieures, ne peut être étudiée que in vivo. Pour valider l'effet d’un traitement utilisant des cellules immunitaires reprogrammées sur la fibrose associée aux maladies musculo-squelettiques, un modèle murin mimant l’une de ces maladies sera utilisé ; aucun modèle in vitro n'est capable de développer cet aspect de la pathologie. Il n'existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et l'interaction ainsi que l'élimination des cellules fibrotiques nécessitent un milieu physiologique où la réponse immunitaire peut avoir lieu.
Réduction
Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l’exploitation maximale des données obtenues. La mise en place de tests statistiques a permis de réduire au maximum le nombre de souris utilisées dans ce projet. Si le traitement ne permet pas d'améliorer le phénotype, les tests comportementaux ne seront pas réalisés.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un enrichissement de leur environnement et des mesures de raffinement ont été mises en place avec une surveillance quotidienne par les membres qualifiés de l'animalerie. L'application de points limites stricts et spécifiques au projet sera respectée par les responsables du projet qui tiendront une fiche d'observation pour chaque souris. Tous les gestes réalisés sur les souris se feront sous anesthésie.
Choix des espèces
La souris a une forte proximité génétique et de fonctionnement avec l’homme. Animaux grégaires, avec un cycle de reproduction et un développement rapide, les modèle souris utilisés pour ce projet, permettrons dans un organisme complet d’étudier les phénotypes et d’analyser les mécanismes biologiques impliqués dans certaines maladies musculo-squelettiques rares à phénotypes évolutifs et invalidants ; différents temps clés du développement seront étudiés (stades prénataux, juvéniles et adultes). De plus, aucun modèle in vitro n'est capable de développer ces aspects des pathologies étudiées.
Formation aux gestes médicaux vétérinaires chez les oiseaux basée sur le modèle de la Poule_[MODIF]
- Formation professionnelle
Contenues et examinées deux fois par des vétérinaires en formation, puis placées sous anesthésie profonde, 78 poules subissent deux prises de sang, deux poses de cathéter dans la veine de l'aile, deux sondages du jabot, des écouvillonnages de l'œil, du palais et du cloaque, deux rinçages nasaux, la coupe de cinq rémiges sur chaque aile et quatre bandages. Une poule sert à deux participants, et les gestes ne visent aucune connaissance nouvelle : ils entretiennent les compétences de vétérinaires déjà diplômés sur des patients aviaires. Le porteur écrit que les procédures ne portent aucune conséquence à la santé future des animaux, et le champ structuré annonce 24 poules adoptées. La modification du projet remplace cette issue, les animaux étant désormais mis à mort à la fin de la séance pour servir ensuite à une formation de chirurgie des tissus mous.
Objectifs
L’objectif est la formation pratique de vétérinaires diplômés pour divers gestes médicaux cliniques vétérinaires chez les oiseaux en prenant la Poule comme modèle. Cette formation vise à renforcer les compétences techniques des vétérinaires dans la prise en charge des patients aviaires car ces compétences sont très peu abordées et pratiquées durant le cursus vétérinaire de formation initiale. Ceci vise donc à augmenter la qualité de soin pouvant être offerte pour les patients aviaires et augmenter le nombre de vétérinaires compétents pour la prise en charge de ces patients.
Bénéfices attendus
Acquisition par les participants des compétences nécessaires pour pratiquer les gestes cliniques de base en médecine aviaire dans leur pratique quotidienne de la médecine vétérinaire.
Procédures
Vigile, les animaux sont soumis à 2 contentions et 2 examens cliniques (1 par participant, 15 min pour chacun des 2 participants). [MODIF] [Sous anesthésie profonde], les animaux sont soumis à 2 prélèvements sanguins (1 par participant, 5 min pour chacun des 2 participants), 2 poses de cathéter IV aux veines ulnaires (1 par participant, 5 min pour chacun des 2 participants), 2 sondages du jabot à l’aide d’une sonde souple en caoutchouc (1 par participant, 2 min pour chacun des 2 participants), 2 écouvillonnages conjonctivaux, choanaux et cloacaux (1 de chaque par participant, 5 min pour chacun des 2 participants), 2 flush nasaux (1 par participant, 5 min pour chacun des 2 participants), 2 coupes de 5 rémiges primaires bilatéralement (un côté par participant, 7 min pour chacun des 2 participants), 2 bandages en huit + bandages de corps (un par participant, 10 min pour chacun des 2 participants), 2 bandages de pied (un par participant, 10 min pour chacun des 2 participants).
Impact sur les animaux
Aucun, si ce n'est le stress de la première contention et la douleur légère liée à la première injection pour l'induction de l'anesthésie.
Devenir
Les procédures prévues ne portent aucune conséquence à la santé future des animaux. A la fin de la sédation, les animaux peuvent donc être adoptés. [En raison de la modification de projet], les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure pour inclusion ultérieure dans une formation de chirurgie des tissus mous chez la Poule].
Remplacement
Tous les gestes techniques pouvant être réalisés sur des cadavres (ex : cathétérisation intra-osseuse, intubation, taille de bec et de griffe) le seront lors d’une autre formation pratique sur cadavre. Ne sont conservés ici que les gestes techniques pour lesquels l’animal vivant est absolument nécessaire (impossibilité de ponction veineuse ou de cathétérisation intra-veineuse en l’absence de flux sanguin par exemple).
Réduction
Il est choisi d’utiliser une seule poule pour deux participants pour limiter le nombre d’animaux nécessaire. Ce chiffre semble le minimum pour que la qualité de l'apprentissage soit suffisante. Aucune analyse statistique n'est nécessaire.
Raffinement
La douleur, le stress et le risque de lésion sont réduits au maximum grâce à un encadrement de qualité, tourné vers l’accompagnement des participants et le respect des animaux, et au fait que les gestes techniques stressants ou nécessitant une contention manuelle ferme et/ou pouvant induire une légère douleur sont réalisés sous sédation (tranquillisation et analgésie). Les protocoles d’analgésie et d’anesthésie sont optimisés pour les gestes réalisés. L’accent est mis tout au long du projet sur le respect des animaux et la réalisation des gestes dans les meilleures conditions possibles. L’objectif est clairement énoncé aux participants que ces formations doivent leur servir à réaliser par la suite l’ensemble de ces gestes nécessaires dans les meilleures conditions possibles pour le respect de l’animal. Pendant la phase d’acclimatation d’un minimum de 5 jours, les poules sont hébergées en box collectif sur litière de copeaux, avec accès à des perchoirs en bois, des pondoirs. les paramètres d'ambiance sont contrôlés.
Choix des espèces
Il s’agit d’une espèce aviaire présenté etrès fréquemment en clinique pour des soins vétérinaires. S’agissant d’une espèce domestique son tempérament plus docile permet de réaliser les manipulations avec un stress limité. Elles ne présentent pas de danger physique pour les participants (pas de risque de morsures ou griffures). Leur grande taille facilite la réalisation des gestes techniques donc plus propice dans le cadre d’un apprentissage. Son tempérament docile et son incapacité à voler diminue les risques de fuite et de collision. Adulte correspondant à ce qui est le plus souvent rencontré en pratique vétérinaire.
Influence des hormones sexuelles sur le développement et la fonction du système immunitaire : exploration du thymus à la peau.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Toute souris présentant une léthargie, une piloérection ou une perte de plus de 20 % de son poids est mise à mort immédiatement. 12 288 souris vont être utilisées dans ce projet, dont 10 224 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leurs cellules immunitaires. Selon les groupes, elles subissent une ablation des ovaires, des testicules ou du thymus, une greffe de peau, la transplantation d'un lobe thymique sous la capsule du rein, des implants hormonaux, des injections de busulfan, une rupture de la barrière cutanée suivie d'une exposition à des micro-organismes, et un prélèvement de sang par semaine pendant onze semaines. L'objet déclaré est de comprendre comment les hormones sexuelles façonnent l'immunité du thymus à la peau, sans qu'aucun élément ne rende compte de l'écart entre cette question et un effectif de 12 288 individus.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de comprendre comment les hormones sexuelles modulent les réponses immunitaires à travers les interactions entre les organes centraux et périphériques, en se concentrant sur le thymus et la peau. Les réponses immunitaires diffèrent souvent entre les femelles et les mâles : les femmes développent généralement des réponses immunitaires plus fortes, ce qui se traduit par une incidence plus élevée de maladies auto-immunes, tandis que les hommes sont plus sensibles à certaines infections et à certains cancers. Cependant, les mécanismes sous-jacents à ces différences restent mal définis, notamment en ce qui concerne les contributions relatives des hormones sexuelles et des chromosomes sexuels, ainsi que le ou les moments critiques au cours du développement à partir duquel ces différences apparaissent. Ce projet poursuivra trois objectifs principaux : 1. Définir le rôle des androgènes et des oestrogènes dans la régulation du fonctionnement du thymus et des réponses immunitaires cutanées avant et après la puberté, à la suite d’une colonisation cutanée avec un microoganisme commensal, d’une infection ou d’une vaccination. 2. Évaluer la contribution du thymus à l’établissement des différences immunitaires liées au sexe dans les tissus périphériques (e.g. la peau). 3. Tester la plasticité du dimorphisme sexuel immunitaire par des interventions hormonales locales et systémiques afin de déterminer si ces différences peuvent être reprogrammées. En intégrant des approches développementales, endocriniennes et immunologiques, ce projet fournira un cadre mécanistique reliant la programmation immunitaire centrale dans le thymus à l’immunité fonctionnelle dans la peau. Il permettra d’identifier les fenêtres critiques du développement au cours desquelles les hormones influencent le système immunitaire, et de déterminer si les différences immunitaires entre les sexes sont fixes ou peuvent être modulées plus tard dans la vie. Les résultats attendus incluent le changement conceptuel d’une vision statique du dimorphisme sexuel immunitaire à une compréhension de celui-ci comme un processus dynamique et régulé par les hormones. Ces connaissances contribueront à une compréhension plus globale de la régulation immunitaire et orienteront le développment futur de stratégies thérapeutiques et vaccinales plus sûres, plus efficaces et tenant compte du sexe biologique.
Bénéfices attendus
Ce projet générera des connaissances fondamentales sur la manière dont les hormones sexuelles façonnent la fonction immunitaire, en se concentrant sur les interactions entre le thymus et la peau. Comprendre comment l’environnement hormonal influence le développement et le fonctionnement du système immunitaire est essentiel pour expliquer pourquoi les femmes et les hommes diffèrent dans leur susceptibilité aux infections, aux maladies auto-immunes et à certains cancers et identifier les mécanismes sous-jacents. En identifiant quand et où les hormones sexuelles agissent sur le système immunitaire, ce projet permettra de déterminer les fenêtres critiques du développement au cours desquelles le dimorphisme sexuel immunitaire s’établit. Il mettra en évidence si les signaux hormonaux agissent principalement via des mécanismes centraux (dans le thymus) ou par une régulation locale au niveau des tissus barrières tels que la peau. De plus, en testant les effets d’interventions hormonales, ce projet évaluera si les différences immunitaires entre les sexes sont réversibles, une question clé tant pour la biologie fondamentale que la médecine clinique. Les bénefices scientifiques attendus sont multiples : - définition des mécanisques permettant la traduction des signaux endocriniens en programmes immunitaires aux niveaux central et périphérique ; - identification de la façon dont la puberté et les transitions hormonales déterminent l’identité immunitaire à long terme ; - évolution de la vision du dimorphisme sexuel immunitaire, considéré non plus comme un trait fixe, mais comme un état dynamique régulé par les hormones. Ce projet aura également des retombées biomédicales majeures en améliorant la compréhension des différences entre les sexes face aux maladies auto-immunes, aux infections et à certains cancers. Il fournira aussi des bases scientifiques essentielles pour un usage plus sûr et efficaces des traitements hormonaux dans divers contextes médicaux, tels que la ménopause, la contraception, les troubles endocriniens ou les thérapies hormonales d’affirmation de genre. À long terme, il contribuera à promouvoir une approche plus inclusive et fondée sur des données objectives de la santé immunitaire contribuant à réduire les biais dans la recherche biomédicale et à favoriser des stratégies thérapeutiques plus personnalisées et équitables pour les deux sexes.
Procédures
- Ablation des ovaires : femelles anesthésiées, 10-20 min. - Ablation des testicules : mâles anesthésiées, 5-15 min. - Ablation du thymus : souris anesthésiées, 25-35 min. - Transplantation sous-capsulaire rénale d’un lobe thymique : souris anesthésiées, 25-35 min. - Greffe de peau : souris anesthésiées, 25-35 min. - Implantation sous-cutanée d’un granulé hormonal : souris anesthésiées, 5-10 min. - Injections : . sous-cutanée préopératoire de buprémorphine ou métacam : souris vigiles, quelques secondes. . intrapéritonéale de fentanyl/diazepan/médétomidine avant thymectomie ou transplantation thymique : souris vigilesl, quelques secondes. . sous-cutanée d’atipamézole ou flumazénil après thymectomie/transplantation thymique : souris anesthésiées, quelques secondes. . sous-cutanée de lidocaïne avant incision : souris anesthésiées, quelques secondes. . sous-cutanée post-opératoire de buprémorphine : souris vigiles, quelques secondes, renouvelable toutes les 8-12 hours pendant 24h si nécessaire. . intraveineuse unique de précurseurs thymiques : souris anesthésiées, quelques secondes. . intrapéritonéale de busulfan : souris vigiles, quelques secondes, jusqu’à 4 injections espacées de 24 heures. . intraveineuse unique de cellules de la moelle osseuse : souris anesthésiées, quelques secondes. . intrapéritonéale d’hormones sexuelles : souris vigiles, quelques secondes, répétée au minimum tous les 4 jours pendant 8 semaines maximum. . sous-cutanée unique d’hormones sexuelles ou d’inhibiteurs hormonaux : souris vigiles, quelques secondes. - Application topique cutanée . d’hormones sexuelles ou d’inhibiteurs hormonaux : souris vigiles, 1-2 min, quotidienne pendant 3 semaines maximum. . incluant les pavillons auriculaires d’une culture de micro-organismes : souris vigiles, 1-2 min, jusqu’à 4 applications espacées de 48 heures maximum. - Injection intradermique unique avec un micro-organisme : souris anesthésiées, quelques secondes. - Exposition cutanée unique avec un micro-organisme après rupture de la barrière cutanée (scarification ou tape stripping) : souris anesthésiées, 1 min. - Injection intradermique unique d’un vaccin : souris anesthésiées, quelques secondes. - Prélèvement sanguin : . au sinus sous-mandibulaire ou à la veine caudale latérale : souris vigiles, quelques secondes, au maximum 1 fois par semaine pendant 11 semaines maximum. . terminal au sinus sous-mandibulaire : souris anesthésiées.
Impact sur les animaux
Ce projet sera attentif aux 5 libertés individuelles de l’animal. Cependant, certaines procédures décrites dans ce projet peuvent induire divers effets indésirables, dont l’intensité et la durée dépendent de la nature de l’intervention. De manière générale, les effets les plus fréquemment observés sont la douleur postopératoire, l’inflammation locale, une détresse transitoire liée à la manipulation ou la contention, ainsi que des altérations temporaires de la mobilité, des comportements exploratoires et des comportements liés à la prise alimentaire et au toilettage. Ces effets sont habituellement de courte durée et compatibles avec un rétablissement complet en quelques jours. Les procédures chirurgicales listées dans ce projet (ablation des testicules, des ovaires, du thymus, transplantation sous-capsulaire rénale d’un lobe du thymus, greffe de peau; pose d’implants sous-cutanée) peuvent entraîner une douleur post-opératoire aigüe et une inflammation locale au niveau du site opératoire ; un inconfort fonctionnel temporaire ou une réduction de la mobilité souvent associés à une diminution transitoire de l’activité, du toilettage ou de la prise alimentaire ; une fatigue passagère particulièrement marquée après l’ablation du thymus, éventuellement aussi associée à un ralentissement ou une légère difficulté respiratoire durant les premières 24 à 48 heures. La phase de récupération post-opératoire s’étend en général sur 3 à 7 jours, période durant laquelle une légère perte de poids ou une diminution des interactions sociales peuvent également être observées. Les traitements hormonaux locaux (application topique) ou systémiques (injection ou implants sous-cutanés) peuvent entraîner un changement de l’aspect du pelage ainsi que des modifications progressives du comportement (irritabilité accrue), du niveau d’activité (légère léthargie) ou de la prise alimentaire avec pour conséquence des variations du poids corporel. Ces effets sont généralement réversibles dans un délai d’environ 7 jours après l’initiation ou l’arrêt du traitement.
Devenir
Toutes les procédures expérimentales nécessitent l’analyse des cellules immunitaires présentes dans diffréents organes. La seule façon d’effectuer ces analyses est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.
Remplacement
Les objectifs scientifiques de ce projet nécessitent l’étude des systèmes immunitaire, endocrinien et épithélial et de leurs interactions qui ne peuvent être reproduites ni in vitro ni in silico. Des modèles de culture cellulaire, des organoïdes et des simulations informatiques pourront être utilisés pour apporter des informations complémentaires. Cependant, ils ne permettront pas de reproduire la dynamique systémique et développementale des signaux hormonaux sexuels sur le fonctionnement du thymus et sur l’immunité cutanée. En particulier, les questions liées au moment de l’intervention (prépuberté versus âge adulte), aux interactions entre tissus et à la plasticité à long terme du dimorphisme sexuel immunitaire ne peuvent être étudiées qu’in vivo. L’utilisation d’animaux vivants est donc indispensable à la réalisation de ces travaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été soigneusement déterminé à partir d’analyses de puissance statistiques basées sur des jeux de donnée antérieures, afin de garantir l’utilisation du nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats valides et fiables. Des groupes témoins seront partagés entre différents procédures chaque fois que possible. Les lignées de souris génétiquement modifiées seront élevées de manière à limiter les surplus, et des animaux contrôles issus de la même portée seront utilisés afin d’optimiser les données recueillis pour chaque cohorte. Toutes les expériences seront réalisées avec un nombre suffisant de réplicats biologiques pour tenir compte de la variabilité, tout en évitant toute répétition inutile.
Raffinement
Toutes les interventions chirurgicales (ablation des testicules, des ovaires, du thymus ; transplantation sous-capsulaire rénale d’un lobe du thymus, greffe de peau; implantation sous-cutanée) seront réalisés sous anesthésie générale, complétée par une analgésie pré-, péri et postopératoire multimodale appropriée et optimisée afin de prévenir toute douleur peri- et post-opératoire. Les animaux feront l’objet d’un suivi rapproché pendant la période de récupération : maintien en température, soins locaux appropriés et observation quotidienne de l’état général, de l’activité, du comportement de toilettage et du poids corporel. Au besoin, des mesures d’optimisation du raffinement des conditions de vie (litière douce à base de cellulose, gel alimentaire, renforcement de l’enrichissement) seront mises en place pour aider les animaux en période de récupération. Pour les manipulations répétées (prélèvements sanguins, injections), des méthodes peu invasives seront privilégiées et les sites d’injection ou de prélèvement seront alternés afin de limiter les irritations locales. Des points limites précis, spécifiques et précoces pour chaque protocole experimentale seront établis : tout animal présentant des signes de détresse ou de douleur persistante (léthargie, piloérection, perte de poids supérieure à 20%) sera mis à mort immédiatement selon les procédures appropriées.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier la modulation du fonctionnement du thymus et des réponses immunitaires cutanées par les hormones sexuelles, en raison de sa pertinence scientifique et de son utilisation largement répandue dans les domaines de l’immunologie et de l’endocrinologie. Les systèmes immunitaire et endrocrinien chez la souris sont bien caractérisés et présentent de nombreuses similitudes avec ceux de l’être humain. De plus, une large gamme de lignées de souris génétiquement modifiées est disponible, permettant d’examiner spécifiquement le rôle des hormones sexuelles dans le fonctionnement du thymus et des cellules immunitaires. La petite taille des souris facilite également la constitution de cohortes expérimentales de taille appropriée tout en limitant l’impact sur le bien-être animal, comparativement à des espèces de plus grande taille. Les souris seront utilisées à deux stades de développement : prépubère (3-5 semaines) et jeune adulte (7-10 semaines). Le stade prépubère est essentiel pour étudier l’influence des hormones sexuelles sur le développement thymique et sur l’établissement du dimorphisme immunitaire entre femelles et mâles à la puberté. Le stade adulte est nécessaire pour déterminer comment un environnement hormonal déjà établi et l’involution thymique affectent l’immunité cutanée et la plasticité du système immunitaire. L’utilisation de ces deux fenêtres développementales nous permettra de comprendre comment les programmes immunitaires spécifiques au sexe se mettent en place et s’il est possible de les modifier ultérieurement au cours de la vie.
Évaluation de l’effet antalgique de traitements innovants dans l’endométriose
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
Une sonde à ballonnet gonflée dans le côlon et le vagin, quatre fois trente secondes, et des filaments appliqués sur la patte tous les sept jours pour mesurer la douleur : 3 120 souris femelles subissent ces procédures, dont 1 044 dans un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. L'endométriose leur est provoquée par greffe de cellules endométriales prélevées sur des souris donneuses, elles-mêmes tuées pour retirer leur utérus. Douze molécules sont testées pour leur effet antalgique aigu, six étant ensuite retenues pour une administration prolongée. Le porteur reconnaît que le projet n'apportera aucun bénéfice à court terme aux deux millions de femmes concernées en France, et que l'induction de l'endométriose constitue "une nuisance à part entière".
Objectifs
En France, l'endométriose touche environ deux millions de femmes, soit une femme sur dix. Elle se caractérise par l'extension hors de la cavité utérine d'un tissu endométrial responsable, en outre, de douleurs aigües particulièrement invalidantes. L'émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à contrôler cette différenciation tissulaire ainsi que les douleurs qui en résultent sont une priorité de santé publique. Nous possédons différents composés pouvant moduler deux cibles impliquées dans la douleur : des composés agissant sur le récepteur des estrogènes, connue pour lier l'estradiol, et des composés agissant sur le système endocannabinoïde. Ces composés présentent des effets antalgiques dans d’autres modèles de douleurs et seraient impliquées dans l’endométriose. Nous n'avons pas encore exploré l'action de ces molécules sur l'endométriose mais nous suspectons fortement une action bénéfique de celles-ci sur l'endométriose. Nous souhaitons réaliser une étude qui permettra 1) de caractériser le modèle murin d’endométriose et valider sa pertinence par rapport à la clinique, 2) d’évaluer l’effet antalgique de 12 molécules administrées par voie systémique de manière aigue, ainsi que 3) l’effet de l’administration chronique par voie systémique des 6 molécules les plus antalgiques (3 molécules par cibles) sur l’inflammation, la douleur, la progression de la pathologie et les comorbidités associées.
Bénéfices attendus
Les résultats nous permettrons de montrer l’intérêt de différents composés en tant que traitements de l’endométriose permettant de soulager symptômes douloureux, la pathologie en elle-même et l’atteinte de la qualité de vie des patientes. En effet, il n’existe actuellement aucun traitement efficace hormis l’hystérectomie, impactant définitivement la fertilité des patientes. Bien que ce projet ne montre pas de bénéfice chez la patiente à court terme, il pourra en avoir à long terme. Bien que les composés évalués dans ce projet ont déjà été testés dans des modèles in vitro afin de ne sélectionner que les candidats ayant la meilleure réponse pharmacologique, cela ne prédit pas l’action thérapeutique. S'agissant d'étude sur la douleur, l’anxiété, la dépression, la locomotion et le bien-être général, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles du comportement par le biais de tests comportementaux. Les approches alternatives in vitro ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux pour ce projet. Ce type d'étude sur modèle animal est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Procédures
*L’ensemble des animaux subiront des injections pour administrer l’estradiol benzoate (chez les souris donneuses), les cellules endométriales et des composés à tester. La piqure d'aiguille pour l’injection est réalisée sur animal vigil et entraîne une douleur légère de courte durée. *L’application de filaments au niveau de la patte de l’animal vigile sera réalisée tous les 7 jours afin d’évaluer la douleur. Ce test est susceptible d’entrainer une douleur faible de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. *Certains animaux subiront une distension colorectale et vaginale consistant, après insertion de sonde sous anesthésie gazeuse, à évaluer les contractions réflexes dues au gonflement du ballonnet. Cela sera réalisé une seule fois. Durée : 4 x 30 secondes.
Impact sur les animaux
L’induction de l’endométriose chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La pathologie sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle pourra aussi être responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. À noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre l’endométriose nécessite un bon état général des animaux. Il pourra être noté un inconfort, un stress lié aux injections.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort. En effet, la mise à mort des animaux donneurs est indispensable avant de prélever leur utérus. La mise à mort des animaux receveurs (modèle d'endométriose) sera nécessaire afin d'évaluer le développement de l'endométriose par le biais du prélèvement de tissus. Les 2 groupes ne subissant pas d’induction de modèles d’endométriose (36 animaux) seront également mis à mort pour prélèvement de la moelle épinière et observation de l’absence de lésions dans la cavité abdominal afin d’avoir une référence contre qui comparer les autres groupes.
Remplacement
L’étude de l’endométriose repose sur 2 types de modèles, les modèles précliniques in vitro, impliquant la culture de tissus humain et permettant d’évaluer l’action de composés sur la vascularisation et la survie des lésions endométriales, ainsi que sur des modèles in vivo, reposant sur l’utilisations de rats, souris ou primates, et permettant d’évaluer le bien être général par l’interaction des lésions avec le reste de l’organisme. Les composés évalués dans ce projet ont déjà été testés dans des modèles in vitro afin de ne sélectionner que les candidats ayant la meilleure réponse pharmacologique. S'agissant d'étude sur la douleur, l’anxiété, la dépression, la locomotion et le bien-être général, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles du comportement par le biais de tests comportementaux. Les approches alternatives in vitro ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux pour ce projet. Ce type d'étude sur modèle animal est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
Ces travaux ont été précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes (effectif de n=12 par groupe). La mise en place du modèle d’endométriose fait l’objet d’une collaboration avec une autre équipe qui maitrise ce modèle, et les expérimentateurs de notre équipe ont été formé au sein de cette équipe. De plus, Une première expérimentation préliminaire est une étape de validation du modèle, permettant de caractériser le modèle murin et de vérifier sa pertinence clinique, afin d’éviter l’induction d’un modèle d’endométriose induisant un phénotype éloigné de ce qui est observé chez la femme. Plusieurs expérimentations sont des étapes de GoNoGo, c’est-à-dire que si les résultats de celles-ci sont négatifs (pas de douleur dans le modèle ou pas d’effet antalgique de chaque composé) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées. Les lésions et moelle épinières des animaux seront prélevés afin d’évaluer par coloration histologique et immuno histologique la progression de la pathologie et l’activité des neurones impliqué dans la douleur. De plus, les lésions et ganglions rachidiens de certains animaux seront également prélevés pour archivage et partage des tissus. Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule), et les toutes les procédures seront menées par un expérimentateur en aveugle. L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation (5 souris de 20-30 g dans une cage de 530 cm2). De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton et sizzle), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Afin de limiter la souffrance liée au tatouage des animaux, ils sont identifiés par un marquage sur la queue réalisé une fois par semaine, suivi de la proposition de Régilait pour réduire le stress des animaux par renforcement positif. Enfin, le poids des animaux et leur aspect général (mobilité, comportement social/isolement, fréquence respiratoire, aspect de la fourrure, hydratation, réaction à la contention) sera suivi 3 fois par semaine à l’aide d’une grille d’évaluation.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur l’endométriose. D’autres travaux antérieurs internationaux sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures, sans utilisation de primates. Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de l’endométriose. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet. La souris femelle est utilisée dans toute les procédures car l’endométriose est une pathologie liée au sexe se développant chez les sujets de sexe féminin.
Etude de la pénétration intestinale de nanoparticules chez la souris dans le cadre de la vaccination muqueuse
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sur 1 232 souris, 714 subissent une ouverture de l'abdomen, une manipulation de leurs organes et une ligature de l'intestin sous une anesthésie pouvant durer une heure quarante-cinq, sans jamais se réveiller. Les 518 autres reçoivent un gavage unique après six heures de jeûne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Toutes sont tuées pour prélever les organes et mesurer si des nanoparticules franchissent la muqueuse intestinale. Le vaccin à ARN messager pris par la bouche, qui justifie ces expériences, reste annoncé comme un bénéfice à long terme, aucun n'existant aujourd'hui.
Objectifs
Développer des vaccins plus efficaces contre les infections au niveau des muqueuses est un enjeu important, notamment celles qui commencent au niveau des muqueuses. Les muqueuses sont en effet la porte d’entrée de nombreux virus et bactéries. Parmi elles, la muqueuse intestinale est particulièrement intéressante, car elle contient de nombreux éléments du système immunitaire et peut déclencher une forte défense directement à l’endroit où l’infection débute. Cependant, administrer un vaccin par voie orale est difficile à cause de l’acidité de l’estomac, des enzymes digestives et de la couche de mucus qui protège l’intestin. La pandémie du Covid-19 a permis le développement de nouveaux vaccins utilisant l’ARN messager (ARNm), une molécule naturellement présente dans notre organisme qui donne aux cellules les instructions pour fabriquer des protéines. Cet ARNm est transporté par des nanoparticules composées de lipides. Néanmoins, il n’existe encore aucun vaccin à ARNm pouvant être pris par voie orale. Pour relever ce défi, des nanoparticules combinant des lipides et des polymères pourrait offrir une meilleure protection de l’ARNm et faciliter son passage jusqu’à la muqueuse intestinale. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer si ces nanoparticules peuvent atteindre et traverser la muqueuse intestinale, que ce soit après une administration directe dans l’intestin ou après une administration orale.
Bénéfices attendus
Ce modèle expérimental permet d’étudier comment les nanoparticules peuvent traverser la paroi de l’intestin. De plus, la résistance des nanoparticules à l’environnement digestif et leur répartition dans l’intestin seront évaluées après administration orale. Cette étude vise également à mieux comprendre la relation entre la composition des nanoparticules et leur comportement au contact de la muqueuse intestinale, afin de sélectionner les vaccins candidats les plus prometteurs. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à ARNm administré par voie orale, pouvant être adapté à différents agents infectieux touchant le système digestif.
Procédures
Un groupe de 714 souris sera soumis à une chirurgie abdominale sans réveil et recevra donc une anesthésie générale d’une durée maximale de 1h45. Un autre groupe, composé de 518 souris, recevra une administration orale par gavage (1 fois/animal, durée de moins d’une minute).
Impact sur les animaux
Six heures avant l’anesthésie, les souris seront mises à jeun, mais avec un accès libre à l’eau, ce qui entraîne un stress. Les effets liés à l’intervention chirurgicale comprennent : • l’injection d’un traitement contre la douleur ; • l’anesthésie générale ; • les effets d’une anesthésie générale : les troubles cardio-respiratoires, la baisse de température corporelle, une déshydration ou une sécheresse des yeux ; • l’ouverture de l’abdomen, la manipulation des organes, la ligature de l’intestin ; • la fermeture de l’abdomen et de la peau ; • la durée de l’intervention. Les effets attendus liés à l’administration par voir orale : • le stress lié à la contention de l’animal, • l’administration orale par gavage chez des animaux conscients, provoquant un stress et une possible gêne après administration.
Devenir
A l’issu des trois procédures, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêts.
Remplacement
Avant de tester les nanoparticules chez l’animal, des expériences ont été réalisées sur des cellules intestinales et immunitaires, ainsi que sur un modèle en trois dimensions reproduisant partiellement l’intestin humain. Cependant, ces modèles ne reflètent pas entièrement la réalité du corps vivant et ne possèdent pas certaines structures de la paroi intestinale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet tout en garantissant des résultats fiables. Au total, le projet prévoit l’utilisation de 1232 souris sur une période de 5 ans. Des tests préliminaires ont permis de sélectionner uniquement les formulations les plus prometteuses, ce qui réduit fortement le nombre d’animaux nécessaires. L’optimisation des conditions expérimentales permettra, si les résultats sont prometteurs, de diminuer encore ce nombre. Les formulations seront évaluées et comparées progressivement. Celles ne donnant pas de résultats satisfaisants seront écartées, afin de concentrer les études sur un nombre restreints de candidats. A terme, seules quatre formulations seront retenues pour les étapes finales. De plus, des temps d’étude optimisés seront sélectionnées afin de réduire davantage le nombre d’animaux utilisés. Cette approche progressive et sélective permettra de limiter au maximum le nombre d’animaux.
Raffinement
Pendant l’intervention, les souris seront placées sous anesthésie générale. Un médicament analgésique sera également administré avant la chirurgie. Une surveillance étroite des animaux sera assurée notamment pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Un tapis chauffant sera utilisé pour maintenir la température corporelle et un film protecteur recouvrira la zone afin de limiter la déshydratation. Un gel sera appliqué sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Des points limites sont définis afin de repérer rapidement tout signe de souffrance ou de problème chez les animaux. Si l’un de ces critères est atteint, des mesures seront prises immédiatement, et si nécessaire, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé dans la recherche afin d’étudier comment des nanoparticules traversent la muqueuse intestinale. Dans ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées afin d’analyser la pénétration et l’interaction des nanoparticules avec la muqueuse intestinale. Des souris de plus de 7 semaines seront utilisées afin d’assurer un système immunitaire mature.